KR102083408B1 - 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법 - Google Patents

줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법에 관한 것으로, 구체적으로 독성 및 발암 물질로 잘 알려져 있는 다이옥신을 인간 제대혈 유래 줄기세포에 처리한 후 DNA와 RNA의 분석을 통해 SERPINB2라는 표적 유전자를 발굴하고 이 유전자가 다이옥신에 의해 반응하는 것을 확인하여, 다이옥신을 처리한 마우스의 지방에서 분리한 줄기세포 및 암의 전이 및 재발에 중요한 역할을 하는 유방암, 대장암, 간암 유래의 암 줄기세포에서도 SERPINB2 유전자가 다이옥신에 의해 반응하는 것을 확인한 후, 인간 제대혈 유래 줄기세포 및 다양한 암 줄기세포에서도 SERPINB2 유전자가 다이옥신 외에도 다양한 독성 및 발암 물질에도 반응함을 확인하고, 인간 제대혈 유래 줄기세포에 SERPINB2 유전자 리포터 벡터를 삽입한 후 다이옥신을 처리하였을 때, 형광이 발현되는 것을 최종 확인함으로써, SERPINB2 유전자는 여러 가지 독성 및 발암 물질의 처리시 독성의 여부 및 정도를 신속하고 정확하며 효율적으로 예측할 수 있는 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법{Method for stem cell based toxicity screening}
본 발명은 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 10만 여종의 화학물질이 개발되었으며 실제로 상용화된 물질이 만종을 넘고 있기 때문에 이들 화학물질의 체계적인 관리와 위해성에 대한 체계적이며 대규모적인 연구가 요구되고 있다. 따라서 화학물질의 인체에 미치는 영향에 대한 독성 유전체 연구를 통해 독성 모니터링 및 예측 평가 기술의 구축이 필요하다.
과거 수십 년간 수행되어 오던 고전적인 독성평가 기법은 최근 동물의 권익보호를 위한 동물 보호론자들의 주장이 활발히 전개되고 있어 동물을 이용한 연구에 심각한 제약이 따르고 있어 동물실험을 대체하거나 최소의 동물 수를 이용한 실험법이 요구되고 있다. 그리고 무엇보다도 실험동물을 활용하여 특정 화합물의 발암성 및 독성을 평가하는 기존의 방법들은 기본적으로 인간의 체내 환경만을 모사한다는 한계가 있을 수 있다. 즉, 비록 실험 동물 모델을 기반으로 한 평가법에서는 특정 물질의 독성 및 발암성을 검출하지 못하였다 하더라도 인체에서는 독성 및 발암성을 유발할 수 있다. 또한 신약 후보물질의 안전성을 최종적으로 검사하는 과정이기 때문에 장기간, 고비용과 숙련된 많은 인력이 필요하고 많은 실험동물을 사용하게 되며, 실험동물 개체간의 차이 등의 많은 문제점을 내포하였다.
이러한 문제점을 극복하기 위해서 최근 줄기세포 기반의 특정 화학물질의 위해성 평가법이 사용되기 시작하였다.
줄기세포(stem cell)는 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있을 수 있으며, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능한 자가증식능 및 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성인 다분화능을 가진 세포를 말한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation, expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)등을 포함하는 인간 줄기세포(Human stem cells)는 다양한 특정 세포 종류로 분화할 수 있는 능력을 가져, 시험관 내의 분화 시스템을 사용하였을 때, 면역 거부반응의 낮은 위험도와 같은 치료 가능성(therapeutic potential) 뿐만 아니라, 기관 형성(organogenesis)의 초기 발달 동안에 복합적 질병의 메커니즘을 이해하는데 효과적인 평가자이자, 발암물질의 독성 등을 평가하는 유전 독성 시험법의 적합한 대상으로도 잘 알려져 있다(Muotri, A. R. (2009) Epilepsy Behav 14 Suppl 1: 81-85; Marchetto, M. C., B. Winner, et al. (2010) Hum Mol Genet 19(R1): R71-76).
이러한 줄기세포는 인체 조직의 재생 및 항상성의 유지에 중요한 역할을 하기 때문에 줄기세포가 각종 독성 물질에 의해 손상될 경우 인체의 항상성 유지에 심각한 위험이 될 수 있다. 최근 체내의 줄기세포로부터 암이 유발된다는 암의 줄기세포 기원설이 새롭게 각광받고 있는 것과 함께, 무엇보다도 줄기세포는 완전히 분화된 일반세포들과 확연히 다른 생리학적 특성을 갖고있기 때문에 분화된 일반 세포에서는 독성 및 발암성이 검출되지 않는다 하더라도 줄기세포에서는 독성 및 발암성이 새롭게 나타낼 수 있다.
이러한 이유로, 줄기세포가 질병과 관련 있는 세포의 종류로 분화되어 사용될뿐만 아니라, 배양 중인 줄기세포를 기반으로 한 약물의 효능 및 독성의 스크리닝(screening) 방법 등에 적용되어 각종 연구에 활용되고 있다.
한편, 이러한 줄기세포를 기반으로 한 독성 및 발암 물질의 스크리닝 평가방법이 현재 미국 및 유럽 등 선진국들 사이에서 기존의 ‘동물 시험법' 및 '유전독성 시험법'을 대체하는 차세대 핵심기술로 자리매김하였으나, 기존 줄기세포 기반의 위해성 평가방법들은 모두 줄기세포 자체의 증식 및 사멸의 여부만을 기준으로 특정 물질에 대한 독성 및 발암성을 평가하고 있는 한계성 역시 여전히 존재한다. 이들 방법은 줄기세포의 증식 및 사멸과 같은 종말 단계의 세포 현상만을 평가의 지표로 삼기 때문에 스크리닝의 민감도와 정확성 및 신속성이 크게 떨어지므로, 이의 단점을 보완해줄 수 있는 새로운 시험법의 확립이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은, 줄기세포 기반의 독성 및 발암성 평가의 새로운 방법을 탐색하던 중, 처리한 화학물질의 독성 및 발암성에 반응하는 표적 유전자인 SERPINB2(serpin family B member 2) 유전자를 발굴하고, 이 유전자를 이용한 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법이 다양한 화학물질의 독성 및 발암성을 신속하고 효과적으로 탐지하여, 보편적인 마커(universal marker)로 사용될 수 있음을 최종 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 SERPINB2 유전자를 이용한 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 줄기세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 줄기세포로부터 SERPINB2 유전자의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 SERPINB2 유전자의 발현이 무처리 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 SERPINB2 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 기반의 독성 물질 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에서 독성 및 발암 물질로 잘 알려져 있는 다이옥신을 인간 제대혈 유래 줄기세포에 처리한 후 DNA와 RNA의 분석을 통해 SERPINB2라는 표적 유전자를 발굴하고 이 유전자가 다이옥신에 의해 반응하는 것을 확인하여, 다이옥신을 처리한 마우스의 지방에서 분리한 줄기세포 및 암의 전이 및 재발에 중요한 역할을 하는 유방암, 대장암, 간암 유래의 암 줄기세포에서도 SERPINB2 유전자가 다이옥신에 의해 반응하는 것을 확인한 후, 인간 제대혈 유래 줄기세포 및 다양한 암 줄기세포에서도 SERPINB2 유전자가 다이옥신 외에도 다양한 독성 및 발암 물질에도 반응함을 확인하고, 인간 제대혈 유래 줄기세포에 SERPINB2 유전자 리포터 벡터를 삽입한 후 다이옥신을 처리하였을 때, 형광이 발현되는 것을 최종 확인함으로써, SERPINB2 유전자는 여러 가지 독성 및 발암 물질의 처리시 독성의 여부 및 정도를 신속하고 정확하며 효율적으로 예측할 수 있는 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 독성 및 발암 물질에 반응하는 표적 유전자를 발굴하기 위해 다이옥신을 인간 제대혈 유래 줄기세포에 처리한 후 DNA 마이크로 어레이(microarray), RNA 시퀀싱(sequencing) 및 다양한 생물정보학적 검사방법을 활용하여 표적 유전자 후보들 중에서 SERPINB2 표적 유전자를 발굴하였음을 나타낸 도이다:
A: 다이옥신을 처리한 인간 제대혈 유래 줄기세포에서 수행한 DNA 마이크로 어레이(microarray) 및 RNA 시퀀싱(sequencing)의 모식도; 및
B: 상기의 분석방법 및 생물정보학적 검사방법을 활용하여 SERPINB2 유전자를 발굴하였음을 나타내는 모식도.
도 2는 다이옥신을 처리한 인간 제대혈 유래 줄기세포 및 마우스 지방 유래 줄기세포에서 SERPINB2 유전자의 발현 변화를 나타낸 도이다:
A: 다이옥신을 처리한 인간 제대혈 유래 줄기세포에서의 SERPINB2 유전자 mRNA 및 단백질의 발현 변화; 및
B: 마우스 실험의 모식도 및 다이옥신을 처리한 마우스 지방 유래 줄기세포에서의 SERPINB2 유전자 mRNA 및 단백질의 발현 변화.
도 3은 다이옥신을 처리한 각각의 암 줄기세포에서 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화를 나타낸 도이다:
A: 다이옥신을 처리한 유방암 줄기세포(breast cancer cell)에서의 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
B: 다이옥신을 처리한 대장암 줄기세포(colorectal cancer cell)에서의 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화; 및
C: 다이옥신을 처리한 간암 줄기세포(liver cancer cell)에서의 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화.
도 4는 기존 알려져 있는 다양한 발암 및 독성 물질들에 의한 인간 제대혈 유래 줄기세포에서의 SERPINB2 유전자 mRNA 발현 변화를 나타낸 도이다:
A: Aristolochic acid I에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
B: Benzidine에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
C: Benzo[a]pyrene에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화; 및
D: Carbon tetrachloride에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화.
도 5는 기존 알려져 있는 다양한 발암 및 독성 물질들에 의한 인간 제대혈 유래 줄기세포에서의 SERPINB2 유전자 mRNA 발현 변화를 나타낸 도이다:
A: Semustine에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
B: 12-0 tetradecanoylphorbol-13 acatate(TPA)에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
C: 1,2-Dichlopropane에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
D: 1,3-Butadiene에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화; 및
E: 4,4-Methylenebis에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화.
도 6은 기존 알려져 있는 다양한 발암 및 독성 물질들에 의한 유방암 줄기세포(breast cancer cell)에서의 SERPINB2 유전자 mRNA 발현 변화를 나타낸 도이다:
A: Aristolochic acid I에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
B: Benzidine에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
C: Benzo[a]pyrene에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화; 및
D: Carbon tetrachloride에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화.
도 7은 기존 알려져 있는 다양한 발암 및 독성 물질들에 의한 유방암 줄기세포(breast cancer cell)에서의 SERPINB2 유전자 mRNA 발현 변화를 나타낸 도이다:
A: Semustine에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
B: 12-0 tetradecanoylphorbol-13 acatate(TPA)에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
C: 1,2-Dichlopropane에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
D: 1,3-Butadiene에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화; 및
E: 4,4-Methylenebis에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화.
도 8은 기존 알려져 있는 다양한 발암 및 독성 물질들에 의한 대장암 줄기세포(colorectal cancer cell)에서의 SERPINB2 유전자 mRNA 발현 변화를 나타낸 도이다:
A: Aristolochic acid I에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
B: Benzidine에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
C: Benzo[a]pyrene에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화; 및
D: Carbon tetrachloride에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화.
도 9는 기존 알려져 있는 다양한 발암 및 독성 물질들에 의한 대장암 줄기세포(colorectal cancer cell)에서의 SERPINB2 유전자 mRNA 발현 변화를 나타낸 도이다:
A: Semustine에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
B: 12-0 tetradecanoylphorbol-13 acatate(TPA)에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
C: 1,2-Dichlopropane에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
D: 1,3-Butadiene에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화; 및
E: 4,4-Methylenebis에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화.
도 10은 기존 알려져 있는 다양한 발암 및 독성 물질들에 의한 간암 줄기세포(liver cancer cell)에서의 SERPINB2 유전자 mRNA 발현 변화를 나타낸 도이다:
A: Aristolochic acid I에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
B: Benzidine에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
C: Benzo[a]pyrene에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화; 및
D: Carbon tetrachloride에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화.
도 11은 기존 알려져 있는 다양한 발암 및 독성 물질들에 의한 간암 줄기세포(liver cancer cell)에서의 SERPINB2 유전자 mRNA 발현 변화를 나타낸 도이다:
A: Semustine에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
B: 12-0 tetradecanoylphorbol-13 acatate(TPA)에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
C: 1,2-Dichlopropane에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화;
D: 1,3-Butadiene에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화; 및
E: 4,4-Methylenebis에 의한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 변화.
도 12는 인간 제대혈 유래 줄기세포에서 독성 및 발암물질에 반응하는 SERPINB2 유전자 리포터 시스템(reporter system)의 모식도 및 다이옥신의 독성 평가 결과를 나타낸 도이다:
A: SERPINB2 유전자 리포터 시스템(reporter system)의 모식도; 및
B: SERPINB2 유전자 리포터 시스템(reporter system)에 의한 다이옥신의 독성 평가 결과.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 줄기세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 줄기세포로부터 SERPINB2 유전자의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 SERPINB2 유전자의 발현이 무처리 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 줄기세포는 유방, 골수, 제대혈, 지방, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반 및 자궁으로 구성된 군에서 선택된 인간 조직 유래 줄기세포인 것이 바람직하며, 구체적으로는 인간 제대혈 유래 줄기세포인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 줄기세포는 유방암, 뇌암, 위장관암, 폐암, 간암, 자궁암, 대장암 및 혈액암으로 구성된 군에서 선택된 종양 유래 암 줄기세포인 것이 바람직하며, 구체적으로는 유방암 줄기세포, 대장암 줄기세포 또는 간암 줄기세포인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 피검물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 활성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 피검물질의 처리도 72시간 동안인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 상기 단계 2)의 발현은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합 효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩, 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linkedimmunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(FluorescenceActivated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 상기 유전자들의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합 효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 시연 가능한 키트는 마이크로 어레이(micro array)를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 마이크로 어레이 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있으며, 본 발명의 유전자를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 마이크로 어레이를 제작하기 위해서, 상기 탐색된 마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로 피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-Llysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명에서 시연 가능한 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실험예에서, 기존에 독성 및 발암 물질로도 잘 알려져 있는 다이옥신을 인간 제대혈 유래 줄기세포에 처리한 후 DNA와 RNA의 분석을 통해 SERPINB2라는 표적 유전자를 발굴하고(도 1 참조), 다이옥신에 의해 이 유전자의 mRNA 및 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하여(도 2 참조), 다이옥신을 처리한 마우스의 지방에서 분리한 줄기세포 및 암의 전이 및 재발에 중요한 역할을 하는 유방암, 대장암, 간암 유래의 암 줄기세포에서도 SERPINB2 유전자가 다이옥신에 의해 반응하는 것을 확인한 후(도 2 및 3 참조), 인간 제대혈 유래 줄기세포 및 다양한 암 줄기세포에서도 SERPINB2 유전자가 다이옥신 외에도 다양한 독성 및 발암 물질에도 반응함을 확인하여(도 4 ~ 11 참조), 인간 제대혈 유래 줄기세포에 SERPINB2 유전자 리포터 벡터를 삽입한 후 다이옥신을 처리하였을 때, 형광이 발현되는 것을 최종 확인하였다(도 12 참조).
따라서 SERPINB2 유전자는 여러 가지 독성 및 발암 물질의 처리시 독성의 여부 및 정도를 신속하고 정확하게 예측할 수 있는 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법으로써 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 SERPINB2 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 기반의 독성 물질 검출용 키트를 제공하며, 상기의 줄기세포로는 인간 제대혈 유래 줄기세포 또는 암 줄기세포인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 상기 검출용 키트는 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 또는 rNTPs(사전혼합형 또는 분리공급형), 표식시약 및 세척 완충용액으로 구성된 반응시약 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지는 않는다
본 발명의 실험예에서 줄기세포가 독성 및 발암성 물질에 노출되었을 경우, SERPINB2 유전자의 발현 여부와 발현 정도에 따라 명확한 독성 및 발암성의 여부를 쉽게 검출하고 평가할 수 있도록 줄기세포 탑재형 SERPINB2 유전자 리포터 시스템(reporter system)을 제작하였고, 또한 상기 시스템을 사용하여 독성 및 발암 물질을 선별할 수 있음을 최종 확인하였으므로, 본 발명은 독성 물질 검출용 키트로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 인간 제대혈 유래 줄기세포의 준비
인간 제대혈 유래 줄기세포의 준비를 위하여 제대혈 은행으로부터 승인 후 제대혈을 공급받아 이를 이용하여 줄기세포를 분리하였다. 먼저 제대혈을 50ml 팰콘 튜브(falcon tube)에 옮긴 후 Hetasep을 제대혈의 1/5 볼륨(volume)으로 넣은 후 상온에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 이 후 상층액(supernatant)만을 분리하여 15ml 팰콘 튜브(falcon tube)에 옮겨 담고 Lympoprep과 제대혈 상층액의 비율을 7 : 6이 되도록 넣어준다. 이때 Lympoprep은 상층액과 섞이지 않고 그 위에서 다른 층을 이루도록 천천히 넣어주었다. 2500rpm에서 20분간 원심분리 한 후, 가운데 층의 하얀색 세포들만 새 팰콘 튜브에 모았다. 세포 10ml 정도에 40ml DPBS를 넣어 다시 2500rpm에서 20분간 원심분리하였다. 다음으로 상층액을 제거한 후, 바닥에 가라앉은 세포에 배양액을 넣어 100mm 플레이트(plate)로 옮겨놓고 배양하였다.
< 실시예 2> 독성 및 발암물질에 반응하는 표적 유전자의 발굴
우선, 본 발명자들은 독성 및 발암 물질에 반응하는 표적 유전자를 발굴하기 위해, 이미 국제적으로 공인된 독성 및 발암 물질인 다이옥신(dioxin) 10 nM을 인간 제대혈 유래 줄기세포에 72시간 동안 처리하고 인간 제대혈 유래 줄기세포로부터 RNA를 분리해서 DNA 마이크로 어레이(microarray)와 RNA 시퀀싱(sequencing)을 진행하였다.
DNA 마이크로 어레이(microarray)는 mRNA를 기반으로 cDNA를 합성하여 인간 프로브(probe)를 붙인 후 DNA 마이크로 어레이 칩(chip)을 사용하여 분석하였으며. RNA 시퀀싱(sequencing)은 mRNA를 기반으로 cDNA를 합성한 후 어답터(adapter)와 결합시킨 cDNA 라이브러리(library)를 만들고 이를 증폭시켜 염기서열을 읽어내는 방법으로 진행하였다.
다음으로 DNA 마이크로 어레이(microarray)와 RNA 시퀀싱(sequencing) 결과 모두에서 다이옥신에 반응하는 공통 유전자 164개를 우선 발굴하였고, 생물 정보학(bioinformatics)적 분석방법들을 통하여 164개의 유전자 중 최종적으로 표적(target)유전자 SERPINB2 유전자를 발굴하였다(도 1의 A 및 B).
< 실시예 3> 암 줄기세포의 준비
본 실험에 사용된 암 줄기세포들은 유방암 줄기세포(breast cancer cell)로는 MDA-MB-231, 대장암 줄기세포(colorectal cancer cell)로는 HT-29, 간암 줄기세포(liver cancer cell)로는 Huh7 세포주를 사용하여 실험하였으며 이산화탄소 배양기(37℃, 5% CO2)에서 배양 중인 세포의 25 - 30 계대(passage) 세포를 실험에 사용하였다.
< 실험예 1> 줄기세포에서 다이옥신에 의한 SERPINB2 유전자의 반응 여부 확인
<1-1> Real-time PCR 을 이용한 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 여부 확인
본 발명자들은 최종적으로 발굴한 SERPINB2 유전자가 다이옥신(dioxin)에 의해 반응하는지 여부를 검증해보기 위해 Real-time PCR을 수행하였다.
우선 인간 제대혈 유래 줄기세포에 10 nM 다이옥신을 처리하고 72시간 동안 배양 후, 배양액을 제거하고 D-PBS를 10ml 넣어 세포를 세척하였다. 다음으로 500μl Tizol(6 well plate 기준)을 넣고 15분 동안 반응시킨 후 피펫팅(pipetting)으로 세포를 모아서 튜브에 옮기고 200μl 클로로포름(chloroform)을 넣었다. 4℃, 13000rpm에서 15분간 원심분리하고 투명한 상층액(supernatant)만을 분리하여 새 튜브에 옮겼다. 500μl 아이소프로판올(isopropanol)을 넣고 15분간 반응시킨 후 다시 4℃, 13000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 다음으로, 펠렛만 남기고 상층액은 버린 후 75% 에탄올(ethanol)로 세척하고 4℃, 13000rpm에서 다시 15분간 원심분리 하였다. 에탄올을 제거하고 완전히 말린 후 멸균수에 펠렛을 녹여 Nano-drop으로 RNA를 정량한 후, 희석한 RNA에 Random 6mers, dNTP 혼합물(mixture), Rnase 저해제 및 Primescript RTase가 첨가된 버퍼(Buffer)를 섞어서 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 1/10로 희석한 후 프라이머(Primer)와 SYBER Green mixture를 섞어서 RT-qPCR을 수행하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 인간 제대혈 유래 줄기세포에 다이옥신을 처리하였을 때 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 2의 A 좌).
<1-2> 웨스턴 블롯팅을 이용한 SERPINB2 유전자의 단백질 발현 여부 확인
다음으로, 본 발명자들은 최종적으로 발굴한 SERPINB2 유전자가 다이옥신(dioxin)에 의해 반응하여 단백질(protein)의 발현을 유도하는지 여부를 검증해보기 위해 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 수행하였다.
인간 제대혈 유래 줄기세포에 10 nM 다이옥신을 처리하고 72시간 동안 배양 후, 배양액을 제거하고 10ml D-PBS를 넣어 세포를 세척하였다. 300μl Lysis 버퍼(buffer)(60mm plate 기준)를 넣고 스크래퍼(scraper)로 세포를 모아서 얼음 속 새 튜브에 옮겨 15분간 반응시킨 후 4℃, 13000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 펠렛은 버리고 상층액만 새 튜브로 옮긴 후 BCA를 사용하여 단백질을 정량하였으며 10μg의 단백질에 증류수(DW)와 5X 염료(dye)를 섞어주고 99℃에서 5분간 끓였다. 다음으로 SDS-PAGE 젤(gel)에 샘플을 로딩(loading)한 후 전류를 걸어주어 단백질을 크기별로 분리시켰다. 젤(gel) 상에 존재하는 단백질을 니트로셀룰로오즈 막 (nitrocellulose membrane)으로 옮겨준 후 T-PBS로 세척하여 1차 항체가 포함된 T-PBS에 멤브레인(membrane)을 반응시켰다. 다음날 T-PBS로 10분씩 3번 멤브레인(membrane)을 세척한 후 2차 항체가 포함된 T-PBS에 멤브레인(membrane)을 반응시켰고 3시간 후 T-PBS로 10분씩 3번 세척하였다. 다음으로 ECL 용액에 멤브레인(membrane)을 반응시켜 단백질의 발현을 필름으로 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 인간 제대혈 유래 줄기세포에 다이옥신을 처리하였을 때 SERPINB2 유전자의 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 2의 A 우).
< 실험예 2> 실험동물 모델에서 다이옥신에 의한 SERPINB2 유전자의 발현 여부 확인
다음으로, 본 발명자들은 실험동물 모델에 다이옥신을 처리한 후 동물의 지방에서 분리한 줄기세포에서 다이옥신에 의해 SERPINB2 유전자가 발현하는지 여부를 확인하고자 다음과 같이 실험하였다.
우선 다이옥신을 전처리한 마우스에서 지방조직 유래의 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell (MSC))를 분리하기 위해, ICR 마우스에 15μg/kg의 다이옥신을 3일 동안 매일 투여한 후, 4일째 되는 날 마우스의 지방조직을 채취하였다. 채취된 지방조직을 미리 준비된 완충용액 D-PBS에서 세척하고, 지방조직에서 섬유질 성분(fibrus material)과 동맥혈관(red blood vessel)을 멸균된 핀셋과 수술용 가위로 제거하였다. 정리된 지방조직에 미리 준비한 콜라게네이즈(collagenase) 효소 절단 용액 10㎖을 첨가하여 수술용 가위로 1㎜3 이하의 크기로 잘게 절단하였다. 잘게 절단된 지방조직을 멸균한 500㎖ 삼각플라스크로 옮긴 후 30㎖ ~ 40㎖ 콜라게네이즈(collagenase) 효소 절단 용액을 첨가하였다. 37℃, 100rpm으로 고정된 항온 수조에서 하루 동안 효소 반응을 시켰다. 그리고 콜라게네이즈(collagenase) 효소 처리한 지방조직을 50㎖ 원심분리용 튜브에 옮겨 담고 2500rpm에서 10분 동안 원심분리 하였다. 상층의 세포외기질 및 노란색 기름층을 진공펌프를 이용하여 제거하였고 하층에 침전된 층 (SVF: stromal vascular cell fraction)에 배양 배지 DMEM을 넣고 부유시켰다. 새로운 50㎖ 원심분리용 튜브에 100μm cell strainer를 얹고 부유된 SVF를 천천히 통과시켰다. 여과된 SVF를 위와 같은 방법으로 40μm 세포 스트레이너(cell strainer)에 통과시켰다. 여과된 SVF에 배양배지 DMEM을 첨가하고 이산화탄소 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 세포가 부착할 때까지 배양하였다. 부착된 세포가 확인되면 계대 배양한 후 배양한 세포에서 RNA와 단백질을 추출하여 상기 <실험예 1>에서와 같이 웨스턴 블롯팅(Western blotting)과 real-time PCR을 수행하여 SERPINB2 유전자의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 마우스 지방 유래 줄기세포에서 다이옥신에 의해 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현 및 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 2의 B).
< 실험예 3> 암 줄기세포에서 다이옥신에 의한 SERPINB2 유전자의 발현 여부 확인
<3-1> 암 줄기세포의 부착 배양 조건(Attachment condition)에서의 실험
암의 전이 및 재발에 중요한 역할을 하는 암 줄기세포에 발암물질인 다이옥신을 처리하였을 때, 표적 유전자인 SERPINB2 유전자가 반응하는지 여부를 확인하기위해, 본 발명자들은 유방암, 대장암 및 간암 유래의 암 줄기세포를 부착 배양 조건(Attachment condition)에서 다음과 같은 방법으로 실험하였다.
우선 유방암 줄기세포(breast cancer cell), 대장암 줄기세포(colorectal cancer cell) 및 간암 줄기세포(liver cancer cell)에서 배양액을 제거한 후 10㎖ D-PBS를 첨가하고 손으로 흔들어 세포를 세척하였다. 1㎖ Trypsin-EDTA를 첨가한 후 가볍게 흔들어 주고, 이산화탄소 배양기에서 5분간 배양한 후, 세포액을 모아서 2000rpm에서 3분간 원심분리한 후 60mm plate에 세포 수가 약 1.2 X 105 이 되도록 분주하였다. 16시간 후, 1% FBS가 첨가된 배양액에 10 nM 다이옥신을 처리한 뒤 72시간이 지난 후 세포에서 RNA를 추출하여 상기 <실험예 1-1>과 같은 방법으로 RT-qPCR을 수행하여 SERPINB2 유전자의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 다이옥신을 처리한 각각의 암 줄기세포에서 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 3의 A, B 및 C).
<3-2> 암 줄기세포의 농축배양조건(cancer stem cell( CSC ) enriching condition)에서의 실험
다음으로, 유방암 줄기세포(breast cancer cell), 대장암 줄기세포(colorectal cancer cell) 및 간암 줄기세포(liver cancer cell)를 농축배양조건(cancer stem cell(CSC) enriching condition)에서 실험하기 위해, 먼저 poly-HEMA 코팅 플레이트(coating plate)를 준비하였다. poly(2-hydroxyethyl methacrylate)를 에탄올에 10mg/ml을 넣어 희석한 후. 가열 기능이 있는 교반기(stirrer)상의 50℃에서 poly-HEMA를 하루동안 녹였다. 잘 녹인 poly-HEMA를 6 웰(well) 바닥에 얇게 부어 깔아준 뒤 UV를 켠 클린벤치(clean bench)에 플레이트(plate)뚜껑을 반쯤 열어놓은 상태에서 하루 동안 말려 poly-HEMA 코팅 플레이트(coating plate)를 제작하였다. 그리고 구형성(sphere-forming)배양배지(culture media)도 준비하였다. 50ml 팰콘 튜브(falcon tube)에 무혈청 배지(serum free media)를 넣고 20 ng/ml EGF와 20 ng/ml bFGF 및 4 ug/ml Hep을 첨가하고, B27은 1:50으로 배지(media)에 희석(dilution)되도록 첨가하며, 페니실린(Penicillin) 및 스트렙토마이신(Streptomycin)도 배지의 1%가 되도록 첨가하여 구형성 배양배지(sphere-forming culture media)를 만들어 둔다. 이렇게 준비된 플레이트(plate)와 각각의 암 줄기세포(cancer stem cells) 배양 배지(media)를 먼저 준비해놓은 상태에서, 분주할 세포들을 먼저 PBS로 워싱(washing)처리하고 Trypsin-EDTA로 세포들을 떼어낸 후 세포 수가 1×106/ml이 되도록 암 줄기세포 배양 배지를 넣고 세포를 잘 풀어준 후 6 웰(well) 플레이트(plate)에 각각 2×10⁴개의 세포를 분주하고 웰(well)당 최종볼륨(volume)이 3ml가 되도록 만들어둔 암 줄기세포 배양 배지로 채워준다. 다음으로 10 nM 다이옥신을 처리하고 72시간이 지난 후 세포에서 RNA를 추출하여 상기 <실험예 1-1>과 같은 방법으로 RT-qPCR을 수행하여 SERPINB2 유전자의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 다이옥신을 처리한 각각의 암 줄기세포에서 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현이 크게 증가하는 것을 확인하였다(도 3의 A, B 및 C).
< 실험예 4> 줄기세포에서 다양한 독성물질에 의한 SERPINB2 유전자의 발현 여부 확인
다음으로, 본 발명자들은 앞선 실험에서 인간 제대혈 유래 줄기세포에 다이옥신을 처리하여 발굴한 표적 유전자인 SERPINB2 유전자가 다이옥신에만 특이적으로 반응하는 유전자가 아닌, 다양한 독성 및 발암 물질에 의해 반응할 수 있는 보편적 마커(universal marker)로서의 사용 가능성 여부를 확인하기 위해 다음과 같이 실험하였다.
우선 인간 제대혈 유래 줄기세포에서 배양액을 제거한 후 10㎖ D-PBS를 첨가하여 손으로 흔들어 세포를 세척하였다. 다음으로 1㎖ Trypsin-EDTA를 첨가한 후 가볍게 흔들어 주고 이산화탄소 배양기에서 5분간 배양한 뒤 세포액을 모아서 2000rpm에서 3분간 원심분리한 후 60mm plate에 세포 수가 1.2 X 105 이 되도록 분주하여 배양하였다. 16시간 후, 1% FBS가 첨가된 배양액에 이미 잘 알려져 있는 9가지의 독성 및 발암물질인 10μM Aristolochic acid I, 10μM Benzidine, 2μM Benzo[a]pyrene, 6.5μM Carbon tetrachloride, 0.5mM Semustine, 5nM 12-0 tetradecanoylphorbol-13 acatate(TPA), 100mM 1,2-Dichlopropane, 10mM 1,3-Butadiene 및 5μM 4,4-Methylenebis를 넣어 각각 세포에 처리하였다. 72시간이 지난 후, 세포에서 RNA를 추출하여 상기 <실험예 1-1>과 같은 방법으로 RT-qPCR을 수행하여 SERPINB2 유전자의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, 9가지 종류의 발암 및 독성 물질 중 carbon tetrachloride와 semustine을 제외한 나머지 7개의 물질에 의해 인간 제대혈 유래 줄기세포 SERPINB2 유전자의 mRNA 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 4의 A ~ D 및 도 5의 A ~ E)
이는 상기 <실험예 1-1>의 다이옥신 처리시험을 포함하여 총 10개의 발암 및 독성 물질 중 두 종류를 제외한 총 8개의 물질에서 SERPINB2 유전자가 반응하는 것을 확인한 실험으로, SERPINB2 유전자의 발암 및 독성 물질에 대한 반응성이 약 80%의 정확도를 기록한 것이다.
< 실험예 5> 암 줄기세포에서 다양한 독성물질에 의한 SERPINB2 유전자의 발현 여부 확인
다음으로, 본 발명자들은 상기 인간 제대혈 유래 줄기세포에서 발굴한 표적 유전자인 SERPINB2 유전자가 암의 전이 및 재발에 중요한 역할을 하는 유방암, 대장암 및 간암 유래의 암 줄기세포에서도 다양한 독성 및 발암 물질들에 반응하는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
유방암 줄기세포(breast cancer cell), 대장암 줄기세포(colorectal cancer cell) 및 간암 줄기세포(liver cancer cell)에서 각각 배양액을 제거한 후 10㎖ D-PBS를 첨가하고 손으로 흔들어 세포를 세척하였다. 1㎖ Trypsin-EDTA를 첨가한 후 가볍게 흔들어 주고 이산화탄소 배양기에서 5분간 배양한 후, 세포액을 모아서 다시 2000rpm에서 3분간 원심분리하여 60mm 플레이트(plate)에 1.2 X 105으로 분주하여 배양하였다. 16시간 후, 1% FBS가 첨가된 배양액에 이미 잘 알려져 있는 9가지의 독성 및 발암물질인 10μM Aristolochic acid I, 10μM Benzidine, 2μM Benzo[a]pyrene, 6.5μM Carbon tetrachloride, 0.5mM Semustine, 5nM 12-0 tetradecanoylphorbol-13 acatate(TPA), 100mM 1,2-Dichlopropane, 10mM 1,3-Butadiene 및 5μM 4,4-Methylenebis을 넣어 각각 세포에 처리하였다. 72시간이 지난 후, 세포에서 RNA를 추출하여 상기 <실험예 1-1>과 같은 방법으로 RT-qPCR을 수행하여 SERPINB2 유전자의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 유방암 줄기세포(breast cancer cell)에서는 semustine 1개 물질만을 제외하고 나머지 8 종류의 발암 및 독성 물질에 대해 SERPINB2 유전자가 반응하는 것을 확인하였다(도 6의 A ~ D 및 도 7의 A ~ E).
또한, 도 8 및 9에 나타낸 바와 같이, 대장암 줄기세포(colorectal cancer cell)에서는 Benzidine와 semustine 2개 물질만을 제외하고 나머지 7 종류의 발암 및 독성 물질에 대해 SERPINB2 유전자가 반응하는 것을 확인하였다(도 8의 A ~ D 및 도 9의 A ~ E).
아울러, 도 10 및 11에 나타낸 바와 같이, 간암 줄기세포(liver cancer cell)에서는 1,3-Butadiene 1개 물질만을 제외하고 나머지 8 종류의 발암 및 독성 물질에 대해 SERPINB2 유전자가 반응하는 것을 확인하였다(도 10의 A ~ D 및 도 11의 A ~ E)
< 실험예 6> 줄기세포에서 독성 및 발암물질에 반응하는 SERPINB2 유전자 리포터 시스템( reporter system)의 제작
다음으로 본 발명자들은 상기 SERPINB2 유전자 발현의 결과들을 토대로 하여, 줄기세포가 독성 및 발암성 물질에 노출되었을 경우, SERPINB2 유전자의 발현 여부와 발현 정도에 따라 명확한 독성 및 발암성의 여부를 쉽게 검출하고 평가할 수 있는지 여부를 알아보기 위해 줄기세포 탑재형 SERPINB2 유전자 리포터 시스템(reporter system)을 다음과 같이 제작하였다.
우선, 도 12에 나타낸 바와 같이, SERPINB2 유전자 리포터 벡터(serpinb2-reporter vector)가 삽입된 인간 제대혈 유래 줄기세포(도 12의 A)와 대조군 실험으로써 컨트롤 벡터(Control-vector)가 삽입된 인간 제대혈 유래 줄기세포를 각각 6 웰(well) 플레이트에 배양하였다. 다음날 각각의 줄기세포에 10 nM 다이옥신을 포함한 배양액을 최종 부피 1ml가 되도록 처리하여 72시간이 지난 후, 배양액만을 걷어서 e-튜브(tube)에 옮겼다. 다음으로 Luminescence 어세이(assay)용 버퍼(buffer) 10X를 증류수에 희석하여 1X로 만든 후, 버퍼(Buffer) 1ml당 10μl 기질(substrate)을 섞고 상온에서 25분 동안 반응시킨다. 그리고 버퍼(buffer) 100μl에 따로 분리한 10μl 배양액을 넣어 Luminometer를 사용하여 반응의 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 공인된 독성 및 발암성 시험평가 기준 물질인 다이옥신(dioxin)을 처리하여 SERPINB2 유전자가 발현하였을 때 루시퍼라아제(luciferase)가 활성화되며 형광을 발현시킴을 확인하였다(도 12의 B). 이는 SERPINB2 유전자의 발현 여부 및 정도를 수치화하여 독성 및 발암성을 예측할 수 있는 줄기세포 기반의 시스템을 구축할 수 있음을 보여준다.

Claims (11)

1) 줄기세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 줄기세포로부터 SERPINB2 유전자의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 SERPINB2 유전자의 발현이 무처리 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 줄기세포는 유방, 골수, 제대혈, 지방, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반 및 자궁으로 구성된 군에서 선택된 인간 조직 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법.
제 2항에 있어서, 상기 인간 조직 유래 줄기세포는 인간 제대혈 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 줄기세포는 유방암, 뇌암, 위장관암, 폐암, 간암, 자궁암, 대장암 및 혈액암으로 구성된 군에서 선택된 종양 유래 암 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법.
제 4항에 있어서, 상기 종양 유래 암 줄기세포는 유방암 줄기세포, 대장암 줄기세포 또는 간암 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 피검물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 활성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 피검물질의 처리는 72시간 동안인 것을 특징으로 하는 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 발현은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합 효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩, 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linkedimmunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(FluorescenceActivated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법.
제 1항의 SERPINB2 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 기반의 독성 물질 검출용 키트.
제 9항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 제대혈 유래 줄기세포 또는 암 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 기반의 독성 물질 검출용 키트.
제 9항에 있어서, 상기 키트는 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 또는 rNTPs(사전혼합형 또는 분리공급형), 표식시약, 및 세척 완충용액으로 구성된 반응시약 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 기반의 독성 물질 검출용 키트.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020012905A1 (en) 2000-06-14 2002-01-31 Snodgrass H. Ralph Toxicity typing using liver stem cells
JP2009533056A (ja) 2006-04-10 2009-09-17 ウィスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファウンデーション ヒト胚性幹細胞を使用して薬学的化合物および他の化学物質の毒性を評価するための試薬および方法
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150103431A (ko) * 2014-03-03 2015-09-11 한국과학기술원 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020012905A1 (en) 2000-06-14 2002-01-31 Snodgrass H. Ralph Toxicity typing using liver stem cells
JP2009533056A (ja) 2006-04-10 2009-09-17 ウィスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファウンデーション ヒト胚性幹細胞を使用して薬学的化合物および他の化学物質の毒性を評価するための試薬および方法
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