CN114689872A - 生物标志物rgc-32在制备诊断系统性红斑狼疮或评估疾病活动度的产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及生物标志物RGC‑32在制备诊断系统性红斑狼疮或评估疾病活动度的产品中的应用。本发明提供了一种首创的、易于临床操作的诊断系统性红斑狼疮的生物标志物RGC‑32，该生物标志物可灵敏地、特异地诊断系统性红斑狼疮；本发明首次发现RGC‑32在高疾病活动度的患者中表达更高，因此该生物标志物还可用于评估疾病活动度。

Description

生物标志物RGC-32在制备诊断系统性红斑狼疮或评估疾病活 动度的产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及生物标志物RGC-32在制备诊断系统性红斑狼疮或评估疾病活动度的产品中的应用。
背景技术
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种常见的儿童自身免疫性疾病，累及皮肤、浆膜、关节、肾脏及中枢神经系统等全身多系统、多器官，病因复杂，病理表现为自身抗体及免疫复合物的沉积。系统性红斑狼疮的患病率因人群而异，全球平均患病率为12/10万～39/10万，我国患病率为13/10万～70.41/10万，其中约20％的患者在儿童阶段发病，多于12～14岁发病，5岁前发病的儿童少见，且儿童期的病死率较成年人高。
在临床工作中，系统性红斑狼疮临床表现多变，血清学及免疫学指标个体差异较大，其诊断对于临床医生仍是一项挑战，目前临床常用的诊断工具有1997年美国风湿病学会分类标准、2012年系统性红斑狼疮国际合作临床组织系统性红斑狼疮分类标准以及2019年欧洲抗风湿病联盟/美国风湿病学会系统性红斑狼疮分类标准，但这些诊断标准所包含的临床及血清学指标众多，临床上操作复杂，不能简便识别出系统性红斑狼疮患者。
临床上常用系统性红斑狼疮疾病活动指数、补体、抗dsDNA抗体、血沉、C反应蛋白、铁蛋白等炎症指标评估系统性红斑狼疮的疾病活动度。系统性红斑狼疮疾病活动指数是评估系统性红斑狼疮疾病活动度最常用的评分工具，但需经仔细的临床病史询问、体格检查，并进行相应的实验室检查，操作复杂，对评估人员要求高。补体水平也是常见的评估系统性红斑狼疮活动情况的临床指标，但补体不仅与补体活化消耗有关，也与补体的合成速率相关，而在炎症反应过程中，补体的消耗与合成都有显著增加，因此补体水平降低与补体活化消耗并不是平行关系。同时由于在系统性红斑狼疮活动期，机体的免疫功能异常活化，导致抗dsDNA抗体增多，抗dsDNA抗体也可用于评估系统性红斑狼疮的疾病活动度，但该项检查敏感性并不高。血沉、C反应蛋白、铁蛋白等炎症指标也常常用于评估系统性红斑狼疮疾病活动度，但其与感染也有密切关联，它们的升高并不能很好区分系统性红斑狼疮的疾病活动还是机体发生了感染。
近年来对系统性红斑狼疮发病机制的研究不断深入，但是仍然尚无能特异性评估系统性红斑狼疮疾病活动度的生物学标志物被广泛认可并接受。目前，亟需一种便于临床操作的生物学标志物用于评估系统性红斑狼疮的疾病活动度。
系统性红斑狼疮患者体内有大量自身抗体，与相应的自身抗原成分形成免疫复合物，高水平的免疫复合物广泛沉积在肾小球、关节及其他器官的小血管壁，强烈激活补体系统，造成这些部位的炎症损伤。因此补体激活消耗是系统性红斑狼疮的发病基础。由于补体的水平不仅与补体活化消耗有关，也与补体的合成速率相关，而在炎症反应过程中，补体的消耗与合成都有显著增加，因此补体活化后的产物被认为是更具特异性的系统性红斑狼疮生物学标志。C1r、C1s、C4a-d、Bb、C3a-d、C5a、C5b-9等补体活化的产物相较于C3和C4对于补体活化更具特异性，而其中C5b-9与疾病严重程度最相关。而补体应答基因-32是一种重要的补体应答基因，现已发现它可能在细胞周期调控、补体介导的炎症反应、肿瘤转移、组织细胞分化、肾小管间质纤维化过程中起着极其重要作用。还未见将补体应答基因-32作为诊断系统性红斑狼疮或评估疾病活动度的生物学标志物的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了生物标志物RGC-32在制备诊断系统性红斑狼疮或评估疾病活动度的产品中的应用。本发明克服现有技术诊断系统性红斑狼疮及评估其疾病活动度的缺陷，提供一种新型诊断系统性红斑狼疮、评估其疾病活动度的生物标志物。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明一方面提供了一种用于检测RGC-32的物质的应用，该应用选自a)和/或b)：
a)在制备诊断或辅助诊断系统性红斑狼疮的产品中的应用；
b)在制备评估或辅助评估系统性红斑狼疮疾病活动度的产品中的应用。
在本发明提供的具体实施例中，用于检测RGC-32的物质包括：与RGC-32蛋白或其蛋白片段特异结合的物质；和/或，与RGC-32基因或其基因片段特异结合的物质。
在本发明提供的具体实施例中，与RGC-32蛋白或其蛋白片段特异结合的物质包括但不限于RGC-32抗体、抗体片段、亲和性蛋白中的一种或几种。
在本发明提供的具体实施例中，与RGC-32基因或其基因片段特异结合的物质包括但不限于引物、探针、反义寡核苷酸、适配体中的一种或几种。
在本发明提供的具体实施例中，用于检测RGC-32的物质为用于检测RGC-32蛋白或基因存在或不存在、或者表达量的物质。
在本发明提供的具体实施例中，用于检测RGC-32蛋白存在或不存在、或者表达量的方法包括但不限于：酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、蛋白质印迹、流式细胞术、荧光辅助的细胞分选、酶底物显色测定和抗原-抗体聚集、质谱法、免疫组化染色、免疫沉淀分析法、流式细胞荧光分选技术和蛋白质芯片中的一种或几种。
在本发明提供的具体实施例中，用于检测RGC-32基因存在或不存在、或者表达量的方法包括但不限于：基于PCR的检测方法、Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交、DNA微阵列、高通量测序平台中的一种或几种。
在本发明提供的具体实施例中，基于PCR的检测方法包括但不限于反转录PCR、实时定量PCR。
在本发明提供的实施例中，产品包括但不限于试剂、试纸条、试剂盒和/或芯片。
在本发明提供的实施例中，产品的检测样本包括但不限于血液、血清、体液和/或组织；优选的，组织包括但不限于皮肤、关节、浆膜、胎盘、骨骼肌、肾脏、主动脉内皮细胞或肝脏中的一种或几种。
在本发明提供的实施例中，试剂盒包括但不限于qPCR试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、ELISA试剂盒和电化学发光检测试剂盒。
在本发明提供的实施例中，诊断或辅助诊断系统性红斑狼疮的方法为：若检测样本中RGC-32蛋白的水平大于180～210pg/mL，则诊断为系统性红斑狼疮。
在本发明提供的实施例中，评估或辅助评估系统性红斑狼疮疾病活动度的方法为：若检测样本中RGC-32蛋白的水平大于180～210pg/mL、小于等于450～530pg/mL，则评估系统性红斑狼疮的活动度为无活动及轻度活动；若检测样本中RGC-32蛋白的水平大于450～530pg/mL，则评估系统性红斑狼疮的活动度为中重度活动。
在本发明提供的另一实施例中，诊断或辅助诊断系统性红斑狼疮的方法为：若检测样本中RGC-32蛋白的水平大于200～210pg/mL，则诊断为系统性红斑狼疮。
在本发明提供的另一实施例中，评估或辅助评估系统性红斑狼疮疾病活动度的方法为：若检测样本中RGC-32蛋白的水平大于200～210pg/mL、小于等于450～500pg/mL，则评估系统性红斑狼疮的活动度为无活动及轻度活动；若检测样本中RGC-32蛋白的水平大于450～500pg/mL，则评估系统性红斑狼疮的活动度为中重度活动。
在本发明提供的一具体实施例中，诊断或辅助诊断系统性红斑狼疮的方法为：若检测样本中RGC-32蛋白的水平大于206.4pg/mL，则诊断为系统性红斑狼疮。
在本发明提供的一具体实施例中，评估或辅助评估系统性红斑狼疮疾病活动度的方法为：若检测样本中RGC-32蛋白的水平大于206.4pg/mL、小于等于459.5pg/mL，则评估系统性红斑狼疮的活动度为无活动及轻度活动；若检测样本中RGC-32蛋白的水平大于459.5pg/mL，则评估系统性红斑狼疮的活动度为中重度活动。
在本发明提供的实施例中，检测样本为血清。
本发明另一方面提供了一种筛选用于预防和/或治疗系统性红斑狼疮的候选药物的方法，包括如下步骤：
(1)将待测物质与含有或表达RGC-32蛋白的体系接触；
(2)检测体系中RGC-32蛋白的表达水平；
(3)选择可降低RGC-32蛋白的表达水平的物质为预防和/或治疗系统性红斑狼疮的候选药物。
本发明另一方面提供了一种生物标志物RGC-32的应用，该应用选自a)和/或b)：
a)在制备诊断或辅助诊断系统性红斑狼疮的产品中的应用；
b)在制备评估或辅助评估系统性红斑狼疮疾病活动度的产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本发明提供了一种首创的、易于临床操作的诊断系统性红斑狼疮的生物标志物补体应答基因-32，该生物标志物可灵敏地、特异地诊断系统性红斑狼疮；
本发明首次发现补体应答基因-32在高疾病活动度的患者中表达更高，因此该生物标志物还可用于评估疾病活动度；
本发明还发现补体应答基因-32可用于筛选预防和/或治疗系统性红斑狼疮的候选药物，从而进一步开发针对该疾病的有效治疗药物。
附图说明
图1为根据系统性红斑狼疮患者和健康人群的补体应答基因-32水平绘制的ROC曲线。
具体实施方式
本发明公开了生物标志物RGC-32在制备诊断系统性红斑狼疮或评估疾病活动度的产品中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
补体应答基因32(Response gene to complement32，RGC-32)：是一种胞内蛋白，其广泛表达于胎盘、骨骼肌、肾脏、主动脉的内皮细胞和肝脏，在脑和心脏低表达，在肺中无表达。文献报道，RGC-32作为细胞周期的调定点，其与p34CDC2结合，使CDC2与细胞周期素B1活化，进入细胞核内从而启动有丝分裂，使细胞由G1期进入S期。除在细胞增殖、分化和迁移中发挥关键作用外，RGC-32还参与免疫相关性疾病的过程。
聚合酶链式反应(PCR)：是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR是利用DNA在体外95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
Southern印迹杂交：是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。
Northern印迹杂交(Northern blot)：是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。
DNA微阵列(DNA microarray)又称DNA阵列或DNA芯片，比较通俗的名字是基因芯片(gene chip)。是一块带有DNA微阵列(micorarray)涂层的特殊玻璃片，在数平方厘米之面积上安装数千或数万个核酸探针，经由一次测验，即可提供大量基因序列相关资讯。它是基因组学和遗传学研究的工具。
抗dsDNA抗体即抗双链(天然)DNA抗体。高浓度的抗ds-DNA抗体几乎仅见于SLE，所以，抗ds-DNA对SLE来说，几乎是特异性的。且抗ds-DNA抗体与疾病活动度、特别是与活动性狼疮性肾炎密切相关，可以用来作为系统性红斑狼疮诊断和疗效观察的一项指标。
C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质(急性蛋白)，激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，清除入侵机体的病原微生物和损伤、坏死、凋亡的组织细胞。在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。
QPCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System,qPCR)，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。
酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。
受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线)，又称为感受性曲线(sensitivity curve)。受试者工作特征曲线就是以假阳性概率(False positive rate)为横轴，真阳性(True positive rate)为纵轴所组成的坐标图，和受试者在特定刺激条件下由于采用不同的判断标准得出的不同结果画出的曲线。
本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1补体应答基因-32在系统性红斑狼疮患者和健康人群的表达水平
本发明首次发现补体应答基因-32在系统性红斑狼疮患者的表达较健康人群显著增高。具体为：
(1)选取2019年9月至2020年12月上海市儿童医院收治的40例系统性红斑狼疮患者，所有患者符合2012年系统性红斑狼疮国际合作临床组织系统性红斑狼疮分类标准，并选择同期来院的健康体检儿童40例。
(2)收集他们的血清标本，用ELISA方法测定补体应答基因-32的水平。具体操作如下：
①将试剂移至室温(18-25℃)平衡至少30分钟。
②将酶标板取出，设一个空白对照孔、不加任何液体；每个标准点依次各设两孔，每孔加入相应标准品50μL；其余每个检测孔直接加待测标本50μL。
③每孔加入酶结合物50μL(空白对照孔除外)，再按同样的顺序加入抗体50μL，充分混匀，贴上不干胶封片，置37℃温育1小时。
④手工洗板，弃去孔内液体。将洗液工作液按200μL/孔注入孔内，静置10秒甩干，重复三次后拍干；洗板机洗板，选择洗涤三次程序，洗板后拍干。
⑤依序每孔加底物溶液90μL，振荡混匀后，37℃避光显色15分钟，每孔加终止液50μL。
⑥用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度，在反应终止后5分钟内进行检测。
(3)实验结果
表1补体应答基因-32表达水平
Figure BDA0003587281130000081
表2 logistic回归分析实验结果
OR 95％CI P值
1.010 1.004～1.016 0.001
表1结果显示，系统性红斑狼疮患儿血清补体应答基因-32表达水平为326.1(212.5～753.4)pg/mL，健康对照儿童补体应答基因-32的表达水平为148.3(110.3～178.5)pg/mL，系统性红斑狼疮患儿补体应答基因-32的表达显著升高(P<0.05)。
logistic回归分析(表2)显示补体应答基因-32的水平能显著影响是否能诊断为系统性红斑狼疮患者(P<0.05)。并对两组人群的补体应答基因-32水平绘制ROC曲线(图1)，计算AUC＝0.803(95％CI:0.699～0.906，P<0.05)，根据ROC曲线坐标点对应的敏感度与(1-特异度)计算Youden指数，补体应答基因-32诊断系统性红斑狼疮的最佳临界值为206.4pg/mL，当补体应答基因-32的表达水平大于206.4pg/mL时，诊断系统性红斑狼疮的敏感度为77.5％，特异度为85％。
本发明首次发现了补体应答基因-32是一种新型的诊断系统性红斑狼疮的生物标志物，补体应答基因-32升高大于206.4pg/mL可用于帮助诊断系统性红斑狼疮，其操作简单，且敏感度为77.5％，特异度为85％，均较高。
实施例2补体应答基因-32用于评估系统性红斑狼疮疾病活动度
本发明首次发现了系统性红斑狼疮中重度疾病活动的患儿补体应答基因-32的表达较无活动及轻度活动患儿显著升高。具体为：
(1)选取2019年9月至2020年12月上海市儿童医院收治的39例系统性红斑狼疮患者的血清标本，检测补体应答基因-32的水平，根据系统性红斑狼疮疾病活动指数将患者分为两组：系统性红斑狼疮中重度活动组(系统性红斑狼疮疾病活动指数≥10，n＝18)和系统性红斑狼疮无活动及轻度活动组(系统性红斑狼疮疾病活动指数＜10，n＝21)。
(2)采用实施例1方法测定补体应答基因-32的水平。同时将系统性红斑狼疮患者补体应答基因-32水平与已知的临床活动指标进行相关性分析。
(3)实验结果
表3补体应答基因-32表达水平
Figure BDA0003587281130000091
表4 SLE患儿血清RGC-32水平与SLE临床活动指标的相关性分析
血白细胞 血红细胞 C3 C反应蛋白 铁蛋白
r -0.40 -0.39 -0.39 0.35 0.40
p <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05
表3结果显示，无活动及轻度活动组血清补体应答基因-32表达水平为275.8(114.9～459.5)pg/mL，中重度活动组血清补体应答基因-32表达水平为528.1(235.5～1010.0)pg/mL，中重度活动组补体应答基因-32表达显著升高(P＜0.05)。
表4结果显示，补体应答基因-32与已知的临床活动指标具有相关性，其中与C反应蛋白(r＝0.35,P＜0.05)、铁蛋白(r＝0.40,P＜0.05)呈正相关，与补体C3(r＝-0.39,P＜0.05)、血白细胞计数(r＝-0.40,P＜0.05)、血红蛋白浓度(r＝-0.39,P＜0.05)呈负相关。
本发明首次发现补体应答基因-32的升高与系统性红斑狼疮疾病活动相关，且补体应答基因-32的检测过程方便，可用于评估系统性红斑狼疮疾病活动度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于检测RGC-32的物质的应用，其特征在于，所述应用选自a)和/或b)：
a)在制备诊断或辅助诊断系统性红斑狼疮的产品中的应用；
b)在制备评估或辅助评估系统性红斑狼疮疾病活动度的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于检测RGC-32的物质包括：与RGC-32蛋白或其蛋白片段特异结合的物质；和/或，与RGC-32基因或其基因片段特异结合的物质。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述与RGC-32蛋白或其蛋白片段特异结合的物质包括RGC-32抗体、抗体片段、亲和性蛋白中的一种或几种。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述与RGC-32基因或其基因片段特异结合的物质包括引物、探针、反义寡核苷酸、适配体中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于检测RGC-32的物质为用于检测RGC-32蛋白或基因存在或不存在、或者表达量的物质。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述用于检测RGC-32蛋白存在或不存在、或者表达量的方法包括：酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、蛋白质印迹、流式细胞术、荧光辅助的细胞分选、酶底物显色测定和抗原-抗体聚集、质谱法、免疫组化染色、免疫沉淀分析法、流式细胞荧光分选技术和蛋白质芯片中的一种或几种；
所述用于检测RGC-32基因存在或不存在、或者表达量的方法包括：基于PCR的检测方法、Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交、DNA微阵列、高通量测序平台中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂、试纸条、试剂盒和/或芯片；
所述产品的检测样本为血液、血清、体液和/或组织；优选的，所述组织包括皮肤、关节、浆膜、胎盘、骨骼肌、肾脏、主动脉内皮细胞或肝脏中的一种或几种。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的应用，其特征在于，所述诊断或辅助诊断系统性红斑狼疮的方法为：若检测样本中RGC-32蛋白的水平大于180～210pg/mL，则诊断为系统性红斑狼疮；
所述评估或辅助评估系统性红斑狼疮疾病活动度的方法为：若检测样本中RGC-32蛋白的水平大于180～210pg/mL、小于等于450～530pg/mL，则评估系统性红斑狼疮的活动度为无活动及轻度活动；若检测样本中RGC-32蛋白的水平大于450～530pg/mL，则评估系统性红斑狼疮的活动度为中重度活动。
9.一种筛选用于预防和/或治疗系统性红斑狼疮的候选药物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将待测物质与含有或表达RGC-32蛋白的体系接触；
(2)检测所述体系中RGC-32蛋白的表达水平；
(3)选择可降低RGC-32蛋白的表达水平的物质为预防和/或治疗系统性红斑狼疮的候选药物。
10.一种生物标志物RGC-32的应用，其特征在于，所述应用选自a)和/或b)：
a)在制备诊断或辅助诊断系统性红斑狼疮的产品中的应用；
b)在制备评估或辅助评估系统性红斑狼疮疾病活动度的产品中的应用。
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