CN109337974B - 一种检测银屑病的诊断标志物的试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测银屑病的诊断标志物的试剂在制备诊断、评估银屑病的产品中的应用，优选的，所述的检测银屑病的诊断标志物的试剂为抗体芯片。本发明所述的用于银屑病诊断标志物检测的抗体芯片灵敏度高、准确性强；同时能够一次性检测135种银屑病血液相关诊断标志物，实现了高通量的免疫检测，为科学研究、银屑病诊断和治疗的标志物研究提供有效的工具。

Description

一种检测银屑病的诊断标志物的试剂及其应用
技术领域
本发明涉及医学分子生物学技术领域，具体涉及一种银屑病的诊断标志物及其检测银屑病的诊断标志物的试剂在制备诊断、评估银屑病的产品中的应用。
背景技术
银屑病是一类常见的通常伴有角化细胞异常增殖等特征的鳞屑丘疹性皮肤病，是一种慢性易复发的自身免疫性疾病，银屑病在世界范围内的发病率为2％～4％，不同国家与地区的差别很大，是人类十大顽症之一。银屑病临床表现以大面积的红斑和鳞屑为主，全身均可发病，以头皮，四肢较为常见。银屑病是长期性疾病，同时可能诱发心血管疾病、脑血管疾病、糖尿病和恶性肿瘤等严重的并发症。由于发病机制尚不明了，目前尚无有效治愈银屑病的药物和方法，缓解症状、改善生活质量、减少复发、控制发展、预防并发症是国际治疗策略。
银屑病的病因及发病机制尚不明了，目前很多研究者通过检测银屑病的易感基因来预测银屑病是否可能发生，例如：专利CN101353704A公开了一种检测银屑病易感基因LCE，并通过检测LCE基因的多态性位点检测试验者的易感性概率。专利CN101525618A公开了一种与银屑病密切相关联的易感基因区域，该区域含有LCE3A、LCE3B、LCE3C、LCE3D、LCE3E、LCE2C、LCE2D基因，用于检测银屑病易感人群。专利CN103361402A公开了一种检测银屑病相关风险基因的试剂盒，该试剂盒包括同时检测IL12B基因、IL23R基因的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体罹患银屑病的风险性。
目前，关于银屑病的诊断主要采用ELISA、IHC、RP-HPLC等方法检测血液或皮肤中的银屑病相关的靶点蛋白，例如：专利CN106324259A公开了Prokineticin 2作为银屑病生物标志物，通过检测健康人与银屑病患者体内Prokineticin 2蛋白的含量，证明Prokineticin2蛋白与银屑病的发生具有相关性，即通过检测Prokineticin 2蛋白的含量诊断是否患有银屑病。专利CN106620694A公开了Cornulin作为靶点在制备防治银屑病的药物中的应用，所述的药物是在基因水平和/或蛋白水平以Cornulin作为药物靶点。Cornulin与银屑病的发展呈正相关，采用适当浓度的Cornulin抗体治疗咪喹莫特小鼠银屑病模型，能够改善鳞屑和皮损厚度并且通过抑制AKT信号来促成银屑病的进展以及抑制皮损恢复正常。专利CN107699616A公开了Fibulin-3作为靶点在制备防治银屑病药物中的应用，所述的药物是在基因水平和/或蛋白水平以Fibulin-3作为药物靶点。但是这些方案虽然能够对免疫反应进行定性和定量检测，但其重复性不好，干扰因素较多且容易出现假阳性。最重要的是诊断标志物单一，依然缺少特异性高、比较系统、全面的用于临床的银屑病血液蛋白检测工具。抗体芯片技术作为蛋白芯片的一种，是将抗体作为亲合体固定在固相载体的表面，通过特异性的免疫反应捕获待测样品中的抗原，从而实现高通量的免疫检测，可以在一张芯片上同时检测成千上万种蛋白质的表达丰度，在弥补传统ELISA缺陷的同时，具有高特异性、高灵敏度的特点。但是迄今为止还未有全面检测银屑病血液相关蛋白表达水平的技术和工具。
因此，本发明提供了更多、更全面的银屑病诊断标志物，并将其应用到银屑病的诊断、治疗中，制作了检测银屑病的抗体芯片。
发明内容
本发明人通过创造性劳动确定135种与银屑病相关的诊断标志物，并将其应用于制备诊断、评估银屑病的产品中，优选为可以全面检测银屑病在不同时期、阶段和药物处理条件下病人血液中诊断标志物水平变化的抗体芯片。本发明所述的抗体芯片解决了传统银屑病检测法ELISA检测指标单一、信息量少，检测多个指标需经过多次繁琐的ELISA或者Western blot印迹法的缺陷，并具有高灵敏度、准确性和高通量检测银屑病诊断标志物，最多可一次性检测135种与银屑病相关的诊断标志物的基因突变、基因水平或蛋白表达水平，实验快速、简便和准确，节省时间、成本及临床样本。通过与统计学和生物信息学结合，可全面系统解析银屑病病人发病条件下的诊断标志物表达水平的系统性变化，并揭示出诊断标志物与临床生理生化指标的相互关系，进而为临床科研、诊断和治疗提供指导。
优选的，在这135种诊断标志物中有12种诊断标志物对药物处理条件下血液中蛋白质水平的变化极其敏感，作为评估药效的诊断标志物。
本发明的第一方面，涉及一种检测银屑病的诊断标志物的试剂在制备诊断、评估银屑病的产品中的应用，所述的诊断标志物为IGHE、RETN、SELL、IL4、ICAM1、FAS、TNFSF8、IL12B、FCAR、CD8A、IL19、TNF、GAS6、CD163、PI3、CD40LG、KRT16、KLK6、HMGB1、IL2RA、APLN、CRP、EGFR、TNFRSF1A、CRH、IL23A、IL15RA、CD40、CAMP、LCN2、DEFB4B、EGF、ADA、SERPINE1、MIF、KITLG、EDN1、CFD、FLT1、CCL5、CELA1、PTX3、S100A8、CCL2、KLK1、IL1A、MMP3、CCL28、PEPD、IL6、AHR、MKI67、KLK10、IL7、PRL、IL22、S100A9、CXCL8、LBP、TNFRSF11B、GHRL、IL13、MMP1、B2M、HAMP、IL10、ADIPOQ、BDNF、COMP、TNFRSF8、ENG、MMP9、MPO、TGFB1、IL20、TIMP1、SELP、CHI3L1、DPP4、IFNG、KLK5、ANG、AHSG、CXCR3、C4B、CXCL10、TNFSF13B、IL18、IL21、CCL4、IL25、IL2、ITLN1、CD200、CORT、CX3CL1、CCHCR1、CXCL1、FN1、APOA1、IL36G、CLU、KLK8、CCL27、RENBP、VEGFA、KLK13、CD4、MGP、IL17A、S100B、CXCL9、ADAM28、CCL22、HBD、PPBP、RNASE3、RBP4、APOC3、AOC3、PFN1、CCL20、APOB、LEP、PTH、CCL17、ICAM3、IL1B、SELE、GKV1-9、IGLV9-49、C8B、AZGP1、IGLV7-43、FCN2蛋白中的两种以上或所述各蛋白的编码基因中的两种以上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的诊断标志物为PI3、TNFRSF8、KRT16、TNFSF8、KLK1、APOC3、CXCR3、CCL4蛋白中的两种以上或所述各蛋白的编码基因中的两种以上。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的诊断标志物用于评估银屑病药物治疗效果，具体为IL13、SELE、IGKV1-9、IGLV9-49、CLU、MKI67、MMP1、C8B、AZGP1、IGLV7-43、MIF、FCN2蛋白中的两种以上或所述各蛋白的编码基因中的两种以上。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的诊断标志物用于评估银屑病药物治疗效果，具体为MMP1和/或MIF蛋白。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的诊断标志物为PI3、TNFRSF8、KRT16、TNFSF8、KLK1、APOC3、CXCR3和CCL4蛋白的组合。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的诊断标志物用于评估银屑病药物治疗效果，具体为IL13、SELE、IGKV1-9、IGLV9-49、CLU、MKI67、MMP1、C8B、AZGP1、IGLV7-43、MIF和FCN2蛋白的组合。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的诊断标志物用于评估银屑病药物治疗效果，具体为MMP1和MIF蛋白。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的诊断标志物为PFN1蛋白。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的诊断标志物为IGHE、RETN、SELL、IL4、ICAM1、FAS、TNFSF8、IL12B、FCAR、CD8A、IL19、TNF、GAS6、CD163、PI3、CD40LG、KRT16、KLK6、HMGB1、IL2RA、APLN、CRP、EGFR、TNFRSF1A、CRH、IL23A、IL15RA、CD40、CAMP、LCN2、DEFB4B、EGF、ADA、SERPINE1、MIF、KITLG、EDN1、CFD、FLT1、CCL5、CELA1、PTX3、S100A8、CCL2、KLK1、IL1A、MMP3、CCL28、PEPD、IL6、AHR、MKI67、KLK10、IL7、PRL、IL22、S100A9、CXCL8、LBP、TNFRSF11B、GHRL、IL13、MMP1、B2M、HAMP、IL10、ADIPOQ、BDNF、COMP、TNFRSF8、ENG、MMP9、MPO、TGFB1、IL20、TIMP1、SELP、CHI3L1、DPP4、IFNG、KLK5、ANG、AHSG、CXCR3、C4B、CXCL10、TNFSF13B、IL18、IL21、CCL4、IL25、IL2、ITLN1、CD200、CORT、CX3CL1、CCHCR1、CXCL1、FN1、APOA1、IL36G、CLU、KLK8、CCL27、RENBP、VEGFA、KLK13、CD4、MGP、IL17A、S100B、CXCL9、ADAM28、CCL22、HBD、PPBP、RNASE3、RBP4、APOC3、AOC3、PFN1、CCL20、APOB、LEP、PTH、CCL17、ICAM3、IL1B、SELE、GKV1-9、IGLV9-49、C8B、AZGP1、IGLV7-43、FCN2蛋白的组合。
本发明所述的检测银屑病的诊断标志物的试剂检测诊断标志物基因的突变或水平，或者，所述的检测银屑病的诊断标志物的试剂检测诊断标志物蛋白的水平。
优选的，本发明所述的诊断标志物在制备诊断、治疗或预防银屑病的产品中的应用。
进一步优选的，所述的检测银屑病的诊断标志物作为药物靶标和/或治疗靶标在制备检测银屑病的试剂或治疗银屑病药物方面的用途。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的治疗产品为药物。优选的，所述的药物是针对所述检测银屑病的诊断标志物的抗体，或者，所述的药物是阻碍所述的检测银屑病的诊断标志物表达或转录的DNA或RNA，或者，所述的药物是阻碍/抑制所述的检测银屑病的诊断标志物活化AKT信号的药物。
优选的，一种本发明所述的诊断标志物在评估银屑病治疗程度、药物治疗效果或药物筛选的产品中的应用。
本发明的第二方面，涉及一种银屑病的诊断标志物，所述的诊断标志物为IGHE、RETN、SELL、IL4、ICAM1、FAS、TNFSF8、IL12B、FCAR、CD8A、IL19、TNF、GAS6、CD163、PI3、CD40LG、KRT16、KLK6、HMGB1、IL2RA、APLN、CRP、EGFR、TNFRSF1A、CRH、IL23A、IL15RA、CD40、CAMP、LCN2、DEFB4B、EGF、ADA、SERPINE1、MIF、KITLG、EDN1、CFD、FLT1、CCL5、CELA1、PTX3、S100A8、CCL2、KLK1、IL1A、MMP3、CCL28、PEPD、IL6、AHR、MKI67、KLK10、IL7、PRL、IL22、S100A9、CXCL8、LBP、TNFRSF11B、GHRL、IL13、MMP1、B2M、HAMP、IL10、ADIPOQ、BDNF、COMP、TNFRSF8、ENG、MMP9、MPO、TGFB1、IL20、TIMP1、SELP、CHI3L1、DPP4、IFNG、KLK5、ANG、AHSG、CXCR3、C4B、CXCL10、TNFSF13B、IL18、IL21、CCL4、IL25、IL2、ITLN1、CD200、CORT、CX3CL1、CCHCR1、CXCL1、FN1、APOA1、IL36G、CLU、KLK8、CCL27、RENBP、VEGFA、KLK13、CD4、MGP、IL17A、S100B、CXCL9、ADAM28、CCL22、HBD、PPBP、RNASE3、RBP4、APOC3、AOC3、PFN1、CCL20、APOB、LEP、PTH、CCL17、ICAM3、IL1B、SELE、GKV1-9、IGLV9-49、C8B、AZGP1、IGLV7-43、FCN2蛋白中的两种以上或所述各蛋白的编码基因中的两种以上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的诊断标志物为PI3、TNFRSF8、KRT16、TNFSF8、KLK1、APOC3、CXCR3、CCL4蛋白中的两种以上或所述各蛋白的编码基因中的两种以上。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的诊断标志物用于评估银屑病治疗效果，具体为IL13、SELE、IGKV1-9、IGLV9-49、CLU、MKI67、MMP1、C8B、AZGP1、IGLV7-43、MIF、FCN2蛋白中的两种以上或所述各蛋白的编码基因中的两种以上。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的诊断标志物用于评估银屑病治疗效果，具体为MMP1和/或MIF蛋白。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的诊断标志物为PI3、TNFRSF8、KRT16、TNFSF8、KLK1、APOC3、CXCR3和CCL4蛋白的组合。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的诊断标志物用于评估银屑病治疗效果，具体为IL13、SELE、IGKV1-9、IGLV9-49、CLU、MKI67、MMP1、C8B、AZGP1、IGLV7-43、MIF和FCN2蛋白的组合。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的诊断标志物用于评估银屑病治疗效果，具体为MMP1和MIF蛋白。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的诊断标志物为PFN1蛋白。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的诊断标志物为IGHE、RETN、SELL、IL4、ICAM1、FAS、TNFSF8、IL12B、FCAR、CD8A、IL19、TNF、GAS6、CD163、PI3、CD40LG、KRT16、KLK6、HMGB1、IL2RA、APLN、CRP、EGFR、TNFRSF1A、CRH、IL23A、IL15RA、CD40、CAMP、LCN2、DEFB4B、EGF、ADA、SERPINE1、MIF、KITLG、EDN1、CFD、FLT1、CCL5、CELA1、PTX3、S100A8、CCL2、KLK1、IL1A、MMP3、CCL28、PEPD、IL6、AHR、MKI67、KLK10、IL7、PRL、IL22、S100A9、CXCL8、LBP、TNFRSF11B、GHRL、IL13、MMP1、B2M、HAMP、IL10、ADIPOQ、BDNF、COMP、TNFRSF8、ENG、MMP9、MPO、TGFB1、IL20、TIMP1、SELP、CHI3L1、DPP4、IFNG、KLK5、ANG、AHSG、CXCR3、C4B、CXCL10、TNFSF13B、IL18、IL21、CCL4、IL25、IL2、ITLN1、CD200、CORT、CX3CL1、CCHCR1、CXCL1、FN1、APOA1、IL36G、CLU、KLK8、CCL27、RENBP、VEGFA、KLK13、CD4、MGP、IL17A、S100B、CXCL9、ADAM28、CCL22、HBD、PPBP、RNASE3、RBP4、APOC3、AOC3、PFN1、CCL20、APOB、LEP、PTH、CCL17、ICAM3、IL1B、SELE、GKV1-9、IGLV9-49、C8B、AZGP1、IGLV7-43、FCN2蛋白的组合。
本发明的第三方面，涉及一种检测银屑病的诊断标志物的试剂，所述的检测银屑病的诊断标志物的试剂检测的诊断标志物选自IGHE、RETN、SELL、IL4、ICAM1、FAS、TNFSF8、IL12B、FCAR、CD8A、IL19、TNF、GAS6、CD163、PI3、CD40LG、KRT16、KLK6、HMGB1、IL2RA、APLN、CRP、EGFR、TNFRSF1A、CRH、IL23A、IL15RA、CD40、CAMP、LCN2、DEFB4B、EGF、ADA、SERPINE1、MIF、KITLG、EDN1、CFD、FLT1、CCL5、CELA1、PTX3、S100A8、CCL2、KLK1、IL1A、MMP3、CCL28、PEPD、IL6、AHR、MKI67、KLK10、IL7、PRL、IL22、S100A9、CXCL8、LBP、TNFRSF11B、GHRL、IL13、MMP1、B2M、HAMP、IL10、ADIPOQ、BDNF、COMP、TNFRSF8、ENG、MMP9、MPO、TGFB1、IL20、TIMP1、SELP、CHI3L1、DPP4、IFNG、KLK5、ANG、AHSG、CXCR3、C4B、CXCL10、TNFSF13B、IL18、IL21、CCL4、IL25、IL2、ITLN1、CD200、CORT、CX3CL1、CCHCR1、CXCL1、FN1、APOA1、IL36G、CLU、KLK8、CCL27、RENBP、VEGFA、KLK13、CD4、MGP、IL17A、S100B、CXCL9、ADAM28、CCL22、HBD、PPBP、RNASE3、RBP4、APOC3、AOC3、PFN1、CCL20、APOB、LEP、PTH、CCL17、ICAM3、IL1B、SELE、GKV1-9、IGLV9-49、C8B、AZGP1、IGLV7-43、FCN2蛋白中的两种以上或所述各蛋白的编码基因中的两种以上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的检测银屑病的诊断标志物的试剂检测的诊断标志物选自PI3、TNFRSF8、KRT16、TNFSF8、KLK1、APOC3、CXCR3、CCL4蛋白中的两种以上或所述各蛋白的编码基因中的两种以上。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的检测银屑病的诊断标志物的试剂检测的诊断标志物选自IL13、SELE、IGKV1-9、IGLV9-49、CLU、MKI67、MMP1、C8B、AZGP1、IGLV7-43、MIF、FCN2蛋白中的两种以上或所述各蛋白的编码基因中的两种以上。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的检测银屑病的诊断标志物的试剂检测的诊断标志物为MMP1和/或MIF蛋白。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的检测银屑病的诊断标志物的试剂检测的诊断标志物为PI3、TNFRSF8、KRT16、TNFSF8、KLK1、APOC3、CXCR3和CCL4蛋白的组合。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的检测银屑病的诊断标志物的试剂检测的诊断标志物为IL13、SELE、IGKV1-9、IGLV9-49、CLU、MKI67、MMP1、C8B、AZGP1、IGLV7-43、MIF、FCN2蛋白的组合。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的检测银屑病的诊断标志物的试剂检测的诊断标志物为MMP1和MIF蛋白。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的检测银屑病的诊断标志物的试剂检测的诊断标志物为IGHE、RETN、SELL、IL4、ICAM1、FAS、TNFSF8、IL12B、FCAR、CD8A、IL19、TNF、GAS6、CD163、PI3、CD40LG、KRT16、KLK6、HMGB1、IL2RA、APLN、CRP、EGFR、TNFRSF1A、CRH、IL23A、IL15RA、CD40、CAMP、LCN2、DEFB4B、EGF、ADA、SERPINE1、MIF、KITLG、EDN1、CFD、FLT1、CCL5、CELA1、PTX3、S100A8、CCL2、KLK1、IL1A、MMP3、CCL28、PEPD、IL6、AHR、MKI67、KLK10、IL7、PRL、IL22、S100A9、CXCL8、LBP、TNFRSF11B、GHRL、IL13、MMP1、B2M、HAMP、IL10、ADIPOQ、BDNF、COMP、TNFRSF8、ENG、MMP9、MPO、TGFB1、IL20、TIMP1、SELP、CHI3L1、DPP4、IFNG、KLK5、ANG、AHSG、CXCR3、C4B、CXCL10、TNFSF13B、IL18、IL21、CCL4、IL25、IL2、ITLN1、CD200、CORT、CX3CL1、CCHCR1、CXCL1、FN1、APOA1、IL36G、CLU、KLK8、CCL27、RENBP、VEGFA、KLK13、CD4、MGP、IL17A、S100B、CXCL9、ADAM28、CCL22、HBD、PPBP、RNASE3、RBP4、APOC3、AOC3、PFN1、CCL20、APOB、LEP、PTH、CCL17、ICAM3、IL1B、SELE、GKV1-9、IGLV9-49、C8B、AZGP1、IGLV7-43、FCN2蛋白的组合。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的检测银屑病的诊断标志物的试剂检测的诊断标志物为PFN1。
本发明所述的检测银屑病的诊断标志物的试剂，所述的试剂选自下列任意一种：
a)检测与银屑病相关的诊断标志物基因的探针组；
b)扩增与银屑病相关的诊断标志物基因的引物组；
c)检测与银屑病相关的诊断标志物基因的核酸适配体；
d)检测与银屑病相关的诊断标志物基因的肽核酸；
e)检测与银屑病相关的诊断标志物蛋白的抗体；
f)包含a)所述探针组、b)所述引物组、c)所述核酸适配体和/或d)所述肽核酸的基因芯片；
g)包含e)所述抗体的抗体芯片；
h)包含a)所述探针组、b)所述引物组、c)所述核酸适配体、d)所述肽核酸和/或f)所述基因芯片的试剂盒；
i)包含e)所述抗体和/或g)所述抗体芯片的试剂盒。
本发明所述的检测与银屑病相关的诊断标志物基因的探针组为根据上述与银屑病相关的诊断标志物基因通过公知、通用的方法设计并合成探针序列，对目的片段进行特异性捕获、扩增、测序，以达到检测样本的目的。
本发明所述的扩增与银屑病相关的诊断标志物基因的引物组为根据上述基因通过公知、通用的方法设计并合成引物序列，对目的片段进行特异性捕获、扩增、测序，以达到检测样本的目的。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的检测与银屑病相关的诊断标志物基因的探针组或扩增与银屑病相关的基因的引物组通过Beacon Designer软件设计并经固相亚磷酰胺三酯法合成。
本发明所述的核酸适配体或肽核酸为根据上述与银屑病相关的诊断标志物基因通过公知、通用的方法设计并合成。
本发明所述的核酸适配体(Aptamer)选自一段DNA(脱氧核糖核酸)，RNA(核糖核酸)序列，XNA(核酸类似物)或肽。可以与银屑病相关的诊断标志物基因或蛋白结合，并具有很高的灵敏性及特异性。
本发明所述的肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，与银屑病相关的诊断标志物基因具有优良的特异性。
本发明所述的包含所述探针组、所述引物组、所述核酸适配体和/或肽核酸的基因芯片，还包括基因芯片的固相载体。
优选的，所述的基因芯片的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片或聚丙烯膜中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述探针固定在基因芯片的固相载体上的方法选自原位合成法、点样法或其他固定方法。
其中，将基因芯片中的探针固定在所述的基因芯片的固相载体上。优选的，将探针序列密集有序地排列固定在基因芯片的固相载体预先设置的区域内，形成微型检测器件。
本发明所述的包含所述探针组、所述引物组、所述核酸适配体、肽核酸和/或所述基因芯片的试剂盒，还包括杂交液和/或缓冲液和/或洗涤液。优选的，所述试剂盒还包括富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、漂洗液、NaOH溶液、Tris-HCl缓冲液、PCR反应液、TE缓冲液。
本发明所述的检测与银屑病相关的诊断标志物蛋白的抗体为根据上述与银屑病相关的诊断标志物蛋白通过公知、通用的方法设计并合成。优选的，所述的与银屑病相关的诊断标志物蛋白的抗体为外包Abcam、NOVUS Biologicals或RD Systems公司生产。
本发明所述的包含所述抗体的抗体芯片，还包含基片，所述的基片选自采用氨基、醛基等化学基团修饰的玻片、硅片、三维基质或者特定的微球表面。所述的三维基质如硝酸纤维素膜、限位过滤膜、聚偏氟乙烯膜或尼龙膜。
优选的，所述的抗体芯片还包含阴性对照、阳性对照。
本发明所述的包含所述抗体和/或所述抗体芯片的试剂盒，还包括稀释液、清洗液、封闭液、BSA或标记试剂中的一种或两种以上的组合。
本发明所述的检测与银屑病相关的诊断标志物基因或蛋白为检测与银屑病相关的诊断标志物基因的突变，或者，检测与银屑病相关的诊断标志物蛋白的水平。
优选的，所述的突变选自剪切位点突变、无义突变或移码突变。
本发明的第四方面，涉及一种评估银屑病治疗效果的试剂，所述的评估银屑病治疗效果的试剂检测IL13、SELE、IGKV1-9、IGLV9-49、CLU、MKI67、MMP1、C8B、AZGP1、IGLV7-43、MIF或FCN2蛋白中的两种以上的蛋白水平。
优选的，所述的评估银屑病治疗效果的试剂检测MMP1和/或MIF蛋白的水平。
优选的，所述的评估银屑病治疗效果的试剂至少包括检测MMP1蛋白的水平。
优选的，所述的评估银屑病治疗效果的试剂至少包括检测MIF蛋白的水平。
本发明所述的评估银屑病治疗效果的试剂选自下述任意一种：
(1)抗体或抗体组：IL13、SELE、IGKV1-9、IGLV9-49、CLU、MKI67、MMP1、C8B、AZGP1、IGLV7-43、MIF或FCN2抗体中的两种以上的组合；
(2)抗体芯片：包含(1)所述的抗体或抗体组的抗体芯片；
(3)试剂盒：包含(1)所述的抗体或抗体组，和/或(2)所述的抗体芯片的试剂盒。
本发明所述的抗体或抗体组为根据上述IL13、SELE、IGKV1-9、IGLV9-49、CLU、MKI67、MMP1、C8B、AZGP1、IGLV7-43、MIF或FCN2蛋白通过公知、通用的方法设计并合成。优选的，所述的抗体为外包Abcam、NOVUS Biologicals或RD Systems公司生产。
本发明所述的包含所述抗体或抗体组的抗体芯片，还包含基片，所述的基片选自采用氨基、醛基等化学基团修饰的玻片、硅片、三维基质或者特定的微球表面。所述的三维基质如硝酸纤维素膜、限位过滤膜、聚偏氟乙烯膜或尼龙膜。优选的，所述的抗体芯片还包含阴性对照、阳性对照。
本发明所述的包含所述抗体或抗体组，和/或所述抗体芯片的试剂盒，还包括稀释液、清洗液、封闭液、BSA或标记试剂中的一种或两种以上的组合。
本发明的第五方面，涉及一种诊断银屑病的芯片，所述的芯片检测的基因或蛋白包含IGHE、RETN、SELL、IL4、ICAM1、FAS、TNFSF8、IL12B、FCAR、CD8A、IL19、TNF、GAS6、CD163、PI3、CD40LG、KRT16、KLK6、HMGB1、IL2RA、APLN、CRP、EGFR、TNFRSF1A、CRH、IL23A、IL15RA、CD40、CAMP、LCN2、DEFB4B、EGF、ADA、SERPINE1、MIF、KITLG、EDN1、CFD、FLT1、CCL5、CELA1、PTX3、S100A8、CCL2、KLK1、IL1A、MMP3、CCL28、PEPD、IL6、AHR、MKI67、KLK10、IL7、PRL、IL22、S100A9、CXCL8、LBP、TNFRSF11B、GHRL、IL13、MMP1、B2M、HAMP、IL10、ADIPOQ、BDNF、COMP、TNFRSF8、ENG、MMP9、MPO、TGFB1、IL20、TIMP1、SELP、CHI3L1、DPP4、IFNG、KLK5、ANG、AHSG、CXCR3、C4B、CXCL10、TNFSF13B、IL18、IL21、CCL4、IL25、IL2、ITLN1、CD200、CORT、CX3CL1、CCHCR1、CXCL1、FN1、APOA1、IL36G、CLU、KLK8、CCL27、RENBP、VEGFA、KLK13、CD4、MGP、IL17A、S100B、CXCL9、ADAM28、CCL22、HBD、PPBP、RNASE3、RBP4、APOC3、AOC3、PFN1、CCL20、APOB、LEP、PTH、CCL17、ICAM3、IL1B、SELE、GKV1-9、IGLV9-49、C8B、AZGP1、IGLV7-43或FCN2中的两种以上组合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的芯片包含PI3、TNFRSF8、KRT16、TNFSF8、KLK1、APOC3、CXCR3或CCL4的抗体中的两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的芯片包含PFN1抗体。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的芯片包含IL13、SELE、IGKV1-9、IGLV9-49、CLU、MKI67、MMP1、C8B、AZGP1、IGLV7-43、MIF或FCN2的抗体中的两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的芯片包含IL13、SELE、IGKV1-9、IGLV9-49、CLU、MKI67、MMP1、C8B、AZGP1、IGLV7-43、MIF或FCN2的抗体的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的芯片包含PI3、TNFRSF8、KRT16、TNFSF8、KLK1、APOC3、CXCR3和CCL4的抗体的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的芯片包含IGHE、RETN、SELL、IL4、ICAM1、FAS、TNFSF8、IL12B、FCAR、CD8A、IL19、TNF、GAS6、CD163、PI3、CD40LG、KRT16、KLK6、HMGB1、IL2RA、APLN、CRP、EGFR、TNFRSF1A、CRH、IL23A、IL15RA、CD40、CAMP、LCN2、DEFB4B、EGF、ADA、SERPINE1、MIF、KITLG、EDN1、CFD、FLT1、CCL5、CELA1、PTX3、S100A8、CCL2、KLK1、IL1A、MMP3、CCL28、PEPD、IL6、AHR、MKI67、KLK10、IL7、PRL、IL22、S100A9、CXCL8、LBP、TNFRSF11B、GHRL、IL13、MMP1、B2M、HAMP、IL10、ADIPOQ、BDNF、COMP、TNFRSF8、ENG、MMP9、MPO、TGFB1、IL20、TIMP1、SELP、CHI3L1、DPP4、IFNG、KLK5、ANG、AHSG、CXCR3、C4B、CXCL10、TNFSF13B、IL18、IL21、CCL4、IL25、IL2、ITLN1、CD200、CORT、CX3CL1、CCHCR1、CXCL1、FN1、APOA1、IL36G、CLU、KLK8、CCL27、RENBP、VEGFA、KLK13、CD4、MGP、IL17A、S100B、CXCL9、ADAM28、CCL22、HBD、PPBP、RNASE3、RBP4、APOC3、AOC3、PFN1、CCL20、APOB、LEP、PTH、CCL17、ICAM3、IL1B、SELE、GKV1-9、IGLV9-49、C8B、AZGP1、IGLV7-43或FCN2的抗体的组合。
优选的，所述的芯片包含上述检测的基因的核酸适配体或肽核酸，或者，包含上述检测的蛋白的抗体。
优选的，所述芯片为抗体芯片，所述抗体芯片还包含基片。进一步优选的，所述基片选自采用氨基、醛基等化学基团修饰的玻片、硅片、三维基质或者特定的微球表面。所述的三维基质如硝酸纤维素膜、限位过滤膜、聚偏氟乙烯膜或尼龙膜。
优选的，所述的抗体芯片还包含阴性对照、阳性对照。
优选的，所述的抗体芯片检测人血清或血浆中的蛋白质。
本发明的第六方面，涉及一种检测本发明所述的银屑病的诊断标志物的方法，所述的方法为将待检血清/血浆样品与本发明所述的检测银屑病的诊断标志物的试剂混合。
优选的，应用本发明所述的芯片检测本发明所述的诊断标志物的基因突变、基因水平或蛋白水平。
进一步优选的，应用本发明所述的抗体芯片检测本发明所述的诊断标志物的蛋白水平。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的检测诊断标志物的方法为双抗体夹心法。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的检测诊断标志物的方法采用直接对血清或血浆样品进行生物素或荧光素标记，具体包括如下步骤：
1)用生物素标记血清/血浆；
2)将步骤1)标记的血清/血浆与本发明所述的抗体芯片孵育反应；
3)向步骤2)的反应物中加入荧光素标记的链霉亲和素/亲和素，使其与标记的血清接触并反应；
4)对反应结束的抗体芯片进行信号读取。
优选的，所述的信号读取采用荧光法、显色法、化学发光法、电化学或者力学检测方法。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的信号读取采用生物芯片扫描仪。
本发明所述的检测诊断标志物方法可以为非诊断目的或诊断目的。
本发明所述的非诊断目的为检测诊断标志物基因的突变或检测诊断标志物蛋白的水平，或者，评估治疗银屑病药物的效果及筛选治疗银屑病的药物。
本发明所述的诊断目的为通过检测诊断标志物基因的突变或检测诊断标志物蛋白的水平确认个体是否患有银屑病，或者，将诊断标志物作为治疗银屑病的药物的靶标，或者，调高/低诊断标志物的水平治疗银屑病。
本发明还提供了siRNA敲除本发明所述的检测银屑病的诊断标志物在制备防治银屑病的药物中的应用
本发明所述的银屑病包括但不限于寻常型银屑病、脓包型银屑病、红皮病性银屑病或关节病型银屑病。
本发明所述的产品至少包含本发明所述的试剂。优选的，所述的产品还包括辅助本发明所述试剂进行检测诊断标志物的辅助物质和/或检测本发明所述诊断标志物之外的银屑病其他疾病相关的血液基因/蛋白的试剂。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：为银屑病病人血清的代表性重复芯片检测结果。
图2为银屑病抗体芯片检测血清的流程。
图3：通过与实验内(Array-to-Array)和实验间(Slide-to-Slide)两个相同阵列对同一血清进行检测，进行两个阵列信号的相关性分析，确定其重复性。
图4：统计学鉴定几种与银屑病相关的作为诊断标志物的血液蛋白，其中，N为健康对照，P为银屑病患者。
图5：为抗体芯片检测的几种银屑病诊断标志物的蛋白表达水平，其中，N为健康对照，P为银屑病患者。
图6：银屑病抗体芯片联合质谱检测银屑病诊断标志物可区分健康组和银屑病组，其中，N为健康对照，P为银屑病患者。
图7：统计学鉴定的银屑病标志物分子对健康组和银屑病组的区分情况，其中，N为健康对照，P为银屑病患者。
图8：统计学鉴定的银屑病标志物分子对健康组和银屑病组的区分情况。
图9：通过抗体芯片和质谱的交叉性验证的诊断标志物PFN1的蛋白表达水平，其中，Normal为健康对照，Psoriasis为银屑病患者。
图10：测定11例中药银屑灵治疗银屑病的病人对药物的响应情况，其中横坐标为11个病人的编号。
图11：12种诊断标志物用于区分药物有效组和药物无效组，其中横坐标为11个病人的编号。
图12：药物治疗前后银屑病诊断标志物FCN2、MIF、MMP1的蛋白表达水平变化情况，其中，左侧线表示响应，右侧线表示不响应。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1银屑病诊断标志物、抗体芯片的组成及其制备
一、得到的135个银屑病血液蛋白作为银屑病的诊断标志物(见表1)。
表1 135个银屑病诊断标志物
Figure GDA0003351939390000161
二、抗体芯片的组成
抗体及生产厂家见表2。
阴性对照为Buffer(1×PBS)和BSA溶液(100μg/mL BSA的1×PBS)。
阳性对照为10μg/mL的Alexa Fluor 555修饰的抗人IgG(10μg/mL，BSA溶液稀释)和100μg/mL的生物素化抗人IgG(100μg/mL，BSA溶液稀释)。
每个抗体重复4个点，阳性对照和阴性对照重复8个点，一个阵列548个点，每张芯片4个阵列，可测4个样本。
表2抗体及生产厂家
Figure GDA0003351939390000162
Figure GDA0003351939390000171
Figure GDA0003351939390000181
三、上述银屑病诊断标志物检测的抗体芯片的制备方法
利用英国Arrayjet的Ultra MarathonⅡ点样仪，采用喷点的方式，将各种抗体、阴性对照和阳性对照点置在晶芯高分子三维基片D(博奥生物集团有限公司，北京)上，点制好的芯片置于湿度为60％，温度为25℃的封闭环境中放置2个小时后放在-20℃冰箱储存，备用。
实施例2：银屑病抗体芯片对银屑病病人血清蛋白的测定
1、所用试剂：
(1)实施例1所述的银屑病诊断标志物检测的抗体芯片；
(2)样本稀释液1×PBS(137mMNaCl，2.7mMKCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4)；
(3)清洗液0.05％PBST(0.05％Tween，1×PBS)，Tween购自美国Amresco公司；
(4)5％牛奶封闭液(5％牛奶，1×PBST)，脱脂奶粉购自美国BD公司；
(5)生物素标记试剂(NHS-PEG4-Biotin)、荧光染料(Streptavidin,R-PhycoerythrinConjugate(SAPE))购自美国Thermo Fisher Scientific公司；
(6)BSA(Albumin from bovine serum)购于美国Sigma-Aldrich公司。
2、所用的仪器设备：
(1)美国Molecular Devices仪器公司生产的生物芯片扫描仪(
Figure GDA0003351939390000182
4300A)；
(2)德国PEPperPRINT公司生产的孵育盘(
Figure GDA0003351939390000183
3/5)；
(3)德国Eppendorf股份公司生产的温度控制混匀器(MixMate)和台式离心机(Centrifuge 5810R)；
(4)美国Bio-Rad公司生产的微型分离柱Bio-Spin6；
(5)美国Axygen公司生产的PCR-384M2-C微孔板。
3、具体操作步骤：
使用前将血清用生物素进行标记，同时用5％牛奶封闭液封闭芯片一个小时。清洗封闭后的芯片3次，每次5分钟，然后将生物素标记的血清按照1:50稀释后加入到芯片的表面4℃下孵育过夜。第二天取出清洗芯片3次，然后加入链霉亲和素(Streptavidin，R-Phycoerythrin Conjugate(SAPE))(2μg/mL)继续室温下孵育1个小时。最后再清洗3次、吹干进行荧光芯片的扫描。采用生物芯片扫描仪读取芯片上每个抗体点上的荧光信号(具体步骤见图2，银屑病病人血清的代表性重复芯片检测结果见图1)。
4、试验结果
通过与实验内和实验间两个相同阵列对同一血清进行检测，相关性分析显示两个阵列信号就有高度的重复性(r＝0.99)，表明银屑病芯片检测血清的可重复性(图3)。另外，我们检测了16例健康人和23例银屑病病人的血清(临床样本信息见表3)。统计学t检验(p≤0.05)结果检测出大量与银屑病密切相关的蛋白(见图4)，其中图5示出了PI3、TNFRSF8、KRT16、TNFSF8、KLK1、APOC3、CXCR3及CCL4蛋白的表达水平。
表3 16例健康人和23例银屑病病人的临床样本信息
Figure GDA0003351939390000191
Figure GDA0003351939390000201
通过进一步与质谱检测结合，结果见图6，证明了质谱和抗体芯片检测到的诊断标志物可以自动聚类，把健康对照(N)和大部分银屑病(P)病人区分开，其中，图6中右侧纵坐标的蛋白名称从上到下按照1-399的顺序，依次见表4。
自动聚类分析为层次聚类(Hierarchical Clustering)，在蛋白及样本两个层面上进行无监督分析以确定不同条目间的相似性。
距离概念：欧氏距离(Euclidean)；
聚类规则：Ward最小方差法(Ward.D)。
层次聚类过程中，将样本中的个体间关系远近使用距离来进行代替，将距离相近的样本置于同一类别。
层次聚类的基本过程如下：
+Step-1：将每一个样本点视为一个簇；
+Step-2：计算各个簇之间的距离，最近的两个簇聚合成一个新簇；
+Step-3：重复Step-2直至最后只有一簇。
表4图6中右侧纵坐标对应的蛋白顺序
Figure GDA0003351939390000202
Figure GDA0003351939390000211
Figure GDA0003351939390000221
Figure GDA0003351939390000231
Figure GDA0003351939390000241
在用统计学t检验(p≤0.01)挑选出银屑病标志物后，进一步自动聚类分析显示可以区分全部健康对照(N)和银屑病(P)病人(图7和图8)。其中图9为PFN1用质谱(DIA-MS)证实的结果图。
实施例3：银屑病诊断标志物在评估药物处理效果中的应用
1、所用试剂：
(1)实施例1所述的银屑病诊断标志物检测的抗体芯片；
(2)样本稀释液1×PBS(137mMNaCl，2.7mMKCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4)；
(3)清洗液0.05％PBST(0.05％Tween，1×PBS)，Tween购自美国Amresco公司；
(4)5％牛奶封闭液(5％牛奶，1×PBST)，脱脂奶粉购自美国BD公司；
(5)生物素标记试剂(NHS-PEG4-Biotin)、荧光染料(Streptavidin,R-PhycoerythrinConjugate(SAPE))购自美国Thermo Fisher Scientific公司；
(6)BSA(Albumin from bovine serum)购于美国Sigma-Aldrich公司。
2、所用的仪器设备：
(1)美国Molecular Devices仪器公司生产的生物芯片扫描仪(
Figure GDA0003351939390000252
4300A)；
(2)德国PEPperPRINT公司生产的孵育盘(
Figure GDA0003351939390000253
3/5)；
(3)德国Eppendorf股份公司生产的温度控制混匀器(MixMate)和台式离心机(Centrifuge 5810R)；
(4)美国Bio-Rad公司生产的微型分离柱Bio-Spin6；
(5)美国Axygen公司生产的PCR-384M2-C微孔板。
3、具体操作步骤同实施例2。
4、试验结果
测定11例中药银屑灵治疗银屑病的病人(临床样本信息见表5)。
表5检测的11例中药银屑灵治疗银屑病的病人的临床样本信息
Figure GDA0003351939390000251
Figure GDA0003351939390000261
检测的11例样本中有6例治疗后病情有所改善，5例在治疗后无响应或恶化(图10)。通过采用抗体芯片结合质谱表明，有12个诊断标志物可以很好的区分药物有效组和药物无效组(图11)，其中与无效组相比，抗体芯片鉴定的有效组MIF和MMP1在治疗后12周均比无效组的表达水平高(图12)，提示这两个蛋白诊断标志物分子具有用于预测银屑病药物治疗能力的潜力。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (4)

1.一种检测银屑病的诊断标志物的试剂在制备诊断银屑病的产品中的应用，其特征在于，所述的诊断标志物包含ADA、ADIPOQ、AOC3、APOB、APOC3、CCL22、CCL27、CD40LG、CXCL8、CXCR3、EGFR、FAS、HMGB1、ICAM3、IL7、KITLG、KLK1、KRT16、LBP、MIF、MMP9、PFN1、PI3、PPBP、PTX3、SELP、TIMP1、TNFRSF8、TNFSF13B、TNFSF8、VEGFA、AMBP、APOF、APOH、ATRN、C1S、CFP、COLEC11、F11、HPX、IGHG4、IGHV3-30、IGHV3-9、IGHV4-39、IGKV1-16、IGLV1-47、IGLV3-27、MTRF1、PF4、PF4V1、PFN1、PLCH1、PLG、SERPINA3、SERPINA5、SERPINA7、SERPING1和TTR，所述的应用包含检测诊断标志物中各蛋白的水平。
2.一种检测银屑病的诊断标志物的试剂在制备评估银屑病药物治疗效果的产品中的应用，其特征在于，所述的银屑病药物为银屑灵，所述的诊断标志物包含MIF和MMP1，所述的应用包含检测诊断标志物中各蛋白的水平。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的试剂选自下列任一种：
a)检测与银屑病相关的诊断标志物蛋白的抗体；
b)包含a)所述抗体的抗体芯片；
c)包含a)所述抗体和/或b)所述抗体芯片的试剂盒。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的试剂为抗体芯片，所述抗体芯片还包含基片。
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