CN117169515A - 预测发热伴血小板减少综合征预后风险的标志物和系统 - Google Patents
预测发热伴血小板减少综合征预后风险的标志物和系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一组预测发热伴血小板减少综合征预后风险的血浆生物标志物、产品和系统;血浆生物标志物为CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP‑3、IL‑18R1、CD40、HGF、IL‑15RA、IL‑17C、STX8、GALNT10、PD‑L1、IL‑24、CALR、MMP‑10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP‑1、CX3CL1和OPG中的至少一种。所述血浆生物标志物,对SFTS患者死亡结局预测具有更高的特异性和灵敏度;基于这些标志物开发相应试剂盒和预测系统,供医护人员尽早识别高风险患者,进而减少高风险患者死亡率。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一组预测发热伴血小板减少综合征预后风险的标志物和系统。
背景技术
发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)是由一种新型布尼亚病毒SFTSV(2020年更名为大别班达病毒DBV)引起的急性传染病,起病急,病情凶险,病死率高达33%。由于对发病机制认识严重不足,且无批准上市的疫苗和抗病毒药物,SFTS于2017、2018连续两年被列入世卫组织《需要优先研究和干预的传染病短清单》。
DBV感染可以引起患者系统性免疫功能失调,包括细胞因子风暴产生、固有免疫应答和适应性免疫应答紊乱。DBV的非结构蛋白NSs过度激活NF-κB通路,可诱发细胞因子风暴。DBV没有明显的器官靶向性,可破坏全身多种组织和细胞,引起多器官受损,发展至严重阶段可导致弥漫性血管内凝血(DIC)和多器官功能障碍(MODS)甚至死亡。
SFTS临床表现为急性发热、血小板减少和白细胞减少,常伴有出血症状。多数患者预后良好,但部分患者病情进展十分迅速,短期内快速进展为重症,严重影响临床预后。因而若能早期识别重症病例并及时给予相应的监护和治疗是降低病死率的关键。因此亟需探索有效简便的方法,帮助临床医生及早识别死亡高风险患者,从而进行密集监测或合理分配资源,减少对低风险患者不必要的额外检测或医疗干预,而这些医疗资源更多地侧向给高风险患者。
已有的研究对SFTS患者的实验室检查指标、临床症状和患者重症化以及死亡之间的关系进行了探讨,已报道的重症和死亡预警指标包括如下几种主要类型:
①临床实验室检查指标参数:血常规、肝、肾功能等生化指标检查、凝血相关指标检查、DBV病毒载量等。例如:粒细胞/淋巴细胞比值(NLR)、嗜酸性粒细胞百分比(EOS%)、嗜碱性粒细胞百分比(BAS%)、天冬氨酸转氨酶(AST)/谷丙转氨酶(ALT)比值、ALT和血尿素氮(BUN)、C反应蛋白/白蛋白比值、AST、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、空腹血糖、降钙素原。
②CT等影像学检查:CT检查肺部出现间质间隔增厚和毛玻璃影(GGO)。
③非常规实验室检测指标:糜蛋白酶(Chymase)、25羟维生素D、胱抑素C、铁蛋白、细胞游离DNA(cf-DNA)。
④临床症状:腹痛、牙龈出血、神经系统症状。
⑤基于多种参数的综合评估系统:神经系统症状联合年龄、病毒载量以及胃肠道出血症状;年龄>65岁联合凝血酶原时间、凝血酶时间以及碳酸氢盐;钙离子水平联合胆固醇、饮酒史、头痛、野外接触、钾以及呼吸困难;年龄联合神经系统症状、LDH、AST、BUN、中性粒细胞百分比;氧分压联合休克与否、是否需要机械通气和血管加压素支持、年龄、乳酸和肌酐水平等。
上述判断指标虽然给评估SFTS患者预后提供了一定参考依据,但对患者死亡结局预测的灵敏度和特异度仍有待提高(多数指标受试者特征性曲线下面积AUC远低于0.9),而基于CT等影像学检查的指标会增加患者暴露放射线的风险,且CT成本较高,普及性差。基于非常规实验室检测指标的预警指标,需要特殊的检测试剂,检测时效性也不够强,此外受检测技术灵敏度限制,既往只能检测部分高水平炎症因子,无法利用少量标本进行高通量蛋白质筛选,因而丢失大量低丰度蛋白质类敏感指标。基于临床症状评估的指标,往往在患者病情已经进展至较严重程度时才呈现阳性,不能在早期帮助医务人员对患者预后进行早期判断。基于多种参数的综合评估除了上述原因以外,还存在操作复杂、检测较慢、临床应用效率低的问题。鉴于前述原因,仍有待开发准确预测SFTS预后风险的新技术。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足,本发明提供一组预测发热伴血小板减少综合征预后风险的标志物,对SFTS患者死亡结局预测具有更高的特异性和灵敏度,且检测方法简单,时效性好,可用于优化SFTS死亡预警策略;本发明基于这些标志物开发了相应的检测试剂盒等产品和预测系统,可大幅提高临床应用效率,以便临床医生及早识别死亡高风险患者,从而合理分配医疗资源,减少高风险患者死亡率。
(二)技术方案
第一方面,本发明涉及血浆生物标志物在预测发热伴血小板减少综合征预后风险中的应用,所述血浆生物标志物为CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中的至少一种。
第二方面,本发明涉及检测血浆中CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白水平的试剂或试剂组合物在制备预测发热伴血小板减少综合征预后风险的产品或系统中的应用。
优选地,所述产品为试剂盒、抗体芯片、抗体探针或检测仪。
优选地,所述试剂盒是以CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白或其特异性抗体作为靶分子,检测CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白在血浆中的表达水平。
优选地,所述试剂盒是酶联免疫检测试剂盒或免疫组化试剂盒。
所述试剂盒包括:可特异性识别和捕获CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白的捕获抗体、多肽染料和生物素标记的检测抗体。
优选地,所述试剂盒包含:分别包被有靶向CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白的捕获抗体的编码微球,生物素分别标记的CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白的检测抗体,以及链霉亲和素标记的藻红蛋白。
利用所述试剂盒在检测血浆中CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白水平时,首先利用所述编码微球捕获待测血浆样品中CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1或OPG蛋白,然后利用生物素分别标记的CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1或OPG检测抗体,以及链霉亲和素标记的藻红蛋白对捕获得到的CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1或OPG蛋白水平分别进行定量。
在本发明中,所述编码微球是指使用不同荧光比例的微球进行数据编码,利用荧光编码的微球共价交联特异性单克隆抗体,通过激光扫描荧光编码来识别单个微球。检测时,将具有不同编码信息的微球混合,每类编码微球上偶联有不同的探针分子,对应不同的检测靶标分子,在特异性识别并捕获相应靶标分子后,可通过流式细胞仪、荧光显微镜等解码系统进行分析。
优选地,所述编码微球为羧基微球。
优选地,在检测血浆中CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白水平时,也可采用Olink超高灵敏度血浆蛋白检测平台以定量检测。
第三方面,本发明涉及一种预测发热伴血小板减少综合征预后风险的试剂盒,其包括:可特异性识别和捕获CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白的捕获抗体、多肽染料和生物素标记的检测抗体。
优选地,所述试剂盒包括:分别包被有靶向CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白的捕获抗体的编码微球,生物素分别标记的CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白的检测抗体,以及链霉亲和素标记的藻红蛋白。
第四方面,本发明还涉及预测发热伴血小板减少综合征预后风险的的系统,其包括检测模块和判断模块;其中,所述检测模块用于定量检测血浆样品中CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白水平;所述判断模块包括存储有判断规则的可读载体;
所述判断规则为:当检测模块获得的血浆样品中CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG满足以下条件之一时,判断为高死亡风险;
CLEC1A的基线表达水平NPX≥3.326;
PLIN1的基线表达水平NPX≥2.588;
CD5的基线表达水平NPX≥5.053;
CCL20的基线表达水平≥62.75pg/mL或NPX≥9.949;
ENAH的基线表达水平NPX≥1.499;
CA12的基线表达水平NPX≥2.575;
MCP-3的基线表达水平NPX≥3.799;
IL-18R1的基线表达水平NPX≥10.066;
CD40的基线表达水平NPX≥11.550;
HGF的基线表达水平NPX≥9.560;
IL-15RA的基线表达水平NPX≥1.419;
IL-17C的基线表达水平NPX≥3.197;
STX8的基线表达水平NPX≥1.984;
GALNT10的基线表达水平NPX≥1.846;
PD-L1的基线表达水平NPX≥7.630;
IL-24的基线表达水平NPX≥1.017;
CALR的基线表达水平NPX≥0.438;
MMP-10的基线表达水平NPX≥8.406;
ST3GAL1的基线表达水平NPX≥5.759;
VEGFA的基线表达水平NPX≥11.846;
TGFB的基线表达水平NPX≥5.610;
CCL28的基线表达水平NPX≥1.895;
MCP-1的基线表达水平NPX≥12.053;
CX3CL1的基线表达水平NPX≥5.524;
OPG的基线表达水平NPX≥11.503NPX;
反之,当上述条件均不满足时,判断为低死亡风险。优选地,所述检测模块为Olink蛋白平台检测系统或流式细胞仪。Olink蛋白平台检测系统包括检测仪器和与之配套的软件系统。
优选地,所述检测模块在定量检测血浆样品中CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白水平时需使用检测试剂,所述检测试剂包括特异性识别CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白的抗体。
(三)有益效果
本发明提供了一组用于预测发热伴血小板减少综合征预后风险的血浆生物标志物,为CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中的至少一种。经实验发现,患者血浆中CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1、OPG的表达水平与SFTS患者死亡结局呈正向关系,单独使用患者血浆的基线表达水平(NPX)(阈值分别依次对应为:3.326,2.588,5.053,9.949,1.499,2.575,3.799,10.066,11.550,9.560,1.419,3.197,1.984,1.846,7.630,1.017,0.438,8.406,5.759,,11.846,5.610,1.895,12.053,5.524,11.503)能预测发热伴血小板减少综合征死亡结局。因此,基于以CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1及OPG其中任一个蛋白或它们的任意组合为血浆生物标志物预测发热伴血小板减少综合征死亡结局具有准确率高、实施较为方便、成本较低的优点,具有广阔的应用前景。
本发明提出的CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1及OPG生物标志物对发热伴血小板减少综合征死亡结局预测的AUC均大于0.95,采用其中之一或两种以上标志物对患者的死亡结局预测准确率更高。本发明基于这些标志物开发了相应的检测试剂盒等产品和预测系统,对SFTS患者死亡结局预测具有更高的特异性和灵敏度,且检测方法简单,方便,成本低且临床应用效率高。
附图说明
图1为Olink实验在孵育过程中对96孔板加样的板布局图。
图2为SFTS存活患者和死亡患者血浆CCL20蛋白表达量。
图3为以血浆CCL20为生物标志物预测SFTS患者死亡风险的ROC曲线分析结果。
图4为患者入院一周内的血浆CCL20基线水平低于和高于阈值(62.75pg/mL)的两组患者的临床结局统计结果。
图5为健康者、临床结局为存活的患者、临床结局为死亡的患者血浆CCL20基线水平与阈值(9.949NPX)的相对关系。
具体实施方式
为了更好的解释本发明,以便于理解,下面结合附图,通过具体实施方式,对本发明作详细描述。
为了筛选对SFTS患者预后结局具有高特异性和灵敏度的生物标志物,实验采用Olink公司基于邻位延伸分析技术(Proximity Extension Assay,PEA)的蛋白质组学分析,对健康志愿者(n=10),存活SFTS患者(n=30),死亡SFTS患者(n=8)血浆样本中与免疫、炎症和器官损伤相关的184种蛋白质进行检测和分析。Olink PEA技术是一种高通量、高特异性、高灵敏度、高动态范围的靶向蛋白质组定量技术,与传统质谱技术相比,能避免样本中高峰度蛋白对低丰度蛋白检测灵敏度的影响,在血浆蛋白质组分析中优势明显。
以下分别对Olink的基本实验方法和相关概念、Olink具体实验步骤和实验结果进行说明。
(一)Olink的基本实验方法和相关概念:
检测使用的96孔板可以最多容纳88个样本(另外8个孔为质控样本),使不同组的样本在板间随机排布。将待测血浆样本、阴性对照、板间对照、混合样本对照根据不同目标panel(炎症panel和器官损伤panel)蛋白浓度进行稀释,再与连有寡核苷酸序列的抗体对共同孵育过夜(16-22h),连接到蛋白质上的两条寡核苷酸序列进行碱基互补配对后,在DNA聚合酶的作用下,配对寡核苷酸序列于反应体系中进行延伸,预扩增后进行PCR检测。使用Olink Signature Q100 system完成高通量real-time qPCR检测,对蛋白进行定量,在qPCR中,反应曲线与阈值线相交点的x轴值被称为Ct,或“循环阈值”。表明信号超过荧光信号阈值线所需的周期数,根据对应的Ct值计算得到各蛋白的相对含量。
蛋白相对丰度的单位:为归一化蛋白质表达量(NPX),两个不同的蛋白质具有相同的NPX值,它们的绝对浓度也可能不同,故在差异比较时,只能比较相同蛋白的含量变化。
对qPCR检测得到的Ct值,根据对照样本进行质控,并通过归一化处理得到蛋白最终相对含量值。Olink的对照样本分为内部对照和外部对照。为了监测、控制和规范实验流程中的关键步骤,Olink PEA检测使用三种内部和三种外部对照,用于质量控制和数据标准化。
内部对照(包括孵化对照、延伸对照、检测对照)
孵化对照:孵化对照1和2采用PEA测量的两种不同非人类抗原。这些对照可监测反应的全三个步骤中的潜在技术变化。如果对照的变化太大,整个板就被判定为不可靠。
延伸对照:延伸对照含有与一对独特的DNA标记相耦合的单个抗体。这些DNA标记总是相当接近,因而此对照预计会给出一个独立于免疫反应的恒定信号。该对照可监测延伸和扩增/检测步骤中的变化,并可用于调整每个样本在延伸和扩增方面的信号。
检测对照:检测对照是一个完整的双链DNA扩增子,且不需要任何近似结合或延伸步骤来产生信号。该对照可监测扩增/检测步骤。
在每个板中,对每个样本的对照水平进行监测,并与所有样本的中位数进行比较。如果任何一个对照组的差异超过接受标准±0.3NPX,则该样本不合格。
外部对照(包括样本对照、阴性对照、板间对照和延伸对照)
样本对照:当运行超过90个样本时,建议运行一式两份的混合样本。用来评估运行和板之间的潜在变化,例如计算批间和批内的CV(建议批间%CV:<25%,批内%CV:<15%)。
阴性对照:每个板上为一式三份,由正常样本的缓冲液组成。用来监测当DNA标记接近时产生的背景噪音,而事先并没有与相应的蛋白质结合。阴性对照为每种蛋白质测定设定了背景水平,并用于计算检测极限(LOD)。若某个蛋白在大部分样本中含量低于该LOD值将过滤掉,不用于后续分析。
板间对照(IPC):在每个板上为一式三份,且都是作为正常样本运行,由92种抗体组成,每一种抗体都有一对独特的DNA标记,可以看作是一个合成样本,正常会在所有的测定中都会产生高信号。三个IPC的中值用做归一化,补偿运行和板之间的变化。
延伸对照:
Ct分析物–Ct延伸对照=dCt分析物
板间对照:
dCt分析物–dCt板间对照=ddCt分析物
对照校正系数进行调整:
校正系数–ddCt分析物=NPX分析物
校正系数由Olink在验证板块的过程中进行计算。该值是预先确定的,使用阴性控制,并用于反转刻度,从而使更高的值对应于更高的信号。其也被用来确保背景水平大约为零。
(二)实验步骤:
1、孵育
(1)配制孵育混合液
根据下表(表1)配制孵育混合液。
表1:
(2)涡旋振荡并离心孵育混合液。取一个PCR 8联管,在8联管的每孔中转移47μL的孵育混合液。
(3)使用反向移液从8联管中将3μL孵育混合液转移到一个新的96孔板的每孔中,并将该96孔板命名为孵育板。
(4)使用多通道排枪,在孵育板的1到11列正向移液转移1μL样本。在第12列中,根据图1的板布局,在三孔(第3-5行)中添加1μL阴性对照,在三孔(第6-8行)中添加1μL板间对照。同时,还在两个孔中加入健康人混合血浆样本作为样品对照(第1-2行)。
(5)使用热塑封密封孵育板,400–1000×g室温离心1分钟,4℃过夜孵育16-22h。
2、延伸
(1)根据下表(表2)配制延伸混合液。
表2:
(2)将孵育板从冰箱中取出恢复至室温,400-1000×g室温离心1分钟。预热PCR仪。
(3)涡旋振荡延伸混合液并倒入加样槽中。
(4)设定计时器5min,使用反向移液,不更换枪头,将96μL的延伸混合物沿96孔板孔壁上侧转移至孵育板中。
(5)使用热塑封密封孵育板,使用以2000转/分的速度充分涡旋振荡30s,确保所有孔都被充分混合,并以400-1000×g的速度离心1min。检查孵育板中每个样品体积是否相同。
(6)将孵育板置于PCR仪中,启动PCR程序:50℃20min,95℃5min(95℃30s,54℃1min,60℃1min)×17,10℃hold。
3、检测
(1)准备并预处理OlinkTM 96.96IFC芯片。简单来说,将阀门注射液注入芯片,然后将芯片置于Olink Signature Q100机器中进行预处理。
(2)解冻引物板,涡旋振荡并短暂离心。
(3)按下表(表3)配制检测混合液。
表3:
(4)涡旋振荡配制好的检测混合液并离心。取一个新的PCR 8联管,在每一个孔中加入95μL的检测混合液。
(5)取一个新的96孔板,在每一个孔中使用反向移液加入7.2μL的检测混合液,并标记为样品板。
(6)将孵育板从PCR仪中取出,涡旋振荡并离心孵育板,使用正向移液移取2.8μL延伸后的样品到样品板中。在吸液时,应从液体上表面移取,不可以将枪头插入板孔底部。
(7)用热塑封密封好样品板,涡旋振荡,室温离心1min,速度400-1000×g。
(8)使用反向移液从引物板的每一个孔中,移取5μL引物到预处理好的芯片左边的试剂格。同样使用反向移液从样品板的每一个孔中,移取延伸后的5μL样品到芯片右边的试剂格。芯片上不能有空的试剂格。
(9)移除气泡,并按照机器屏幕上的提示,将芯片加载到Olink Signature Q100机器中。
(10)在Olink Signature Q100运行,并确保使用正确的芯片适配器。
(三)实验结果:
对Olink鉴定到的炎症、器官损伤相关蛋白进行分析,健康志愿者、存活组、死亡组(入组人群人口学信息和基线数据详见表4-6)。
表4:入组人群人口学信息
表5:存活和死亡SFTS患者基线数据和临床症状统计
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表6:存活和死亡SFTS患者实验室检测指标
表7:死亡和存活SFTS患者差异表达蛋白ROC分析
结合表7所示,对死亡组与存活组SFTS患者血浆差异表达蛋白进行受试者特征曲线(ROC)分析,展示了曲线下面积(AUC)>0.95的蛋白,它们是CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG,因此采用它们中的任意一个或它们的任意组合,都可作为新的血浆生物标志物,用于准确地预测SFTS患者死亡结局。
由表7的ROC分析可知,CCL20、CD40、HGF、OPG生物标志物对发热伴血小板减少综合征死亡结局预测的AUC均大于0.95,因此采用患者血浆的CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG的基线表达水平(NPX)(阈值分别依次对应为:3.326,2.588,5.053,9.949,1.499,2.575,3.799,10.066,11.55,9.56,1.419,3.197,1.984,1.846,7.63,1.017,0.438,8.406,5.759,,11.846,5.61,1.895,12.053,5.524,11.503)其中之一或两种以上标志物能准确地预测发热伴血小板减少综合征死亡结局。
应用例
以CCL20为例来说明上述生物标志物在预测SFTS患者死亡结局中的作用:酶联免疫检测试剂盒进一步验证生物标志物CCL20对发热伴血小板减少综合征死亡结局预测,采用独立SFTS患者验证队列(存活患者n=73,死亡患者n=8)样本进行验证,结果表明死亡患者的血浆CCL20基线水平显著高于存活患者(图2)。ROC分析结果表明,AUC为0.9469(图3)。如图4所示,血浆CCL20绝对阈值为62.75pg/mL,患者入院入院一周内的血浆CCL20基线水平低于该阈值的患者中临床结局为100%存活,而患者入院入院一周内的血浆CCL20基线水平高于该阈值的患者中最终43.38%(95%置信区间:25.64%-63.19%)为死亡。如图5所示,血浆CCL20的阈值为9.949(NPX),健康者和临床结局为存活的患者血浆CCL20基线水平都低于9.949(NPX),而临床结局为死亡的患者血浆CCL20基线水平均明显高于9.949(NPX)。以上结果说明,本发明所筛选出的评估SFTS患者预后风险的生物标志物具有很高的预测准性。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.血浆生物标志物在预测发热伴血小板减少综合征预后风险中的应用,所述血浆生物标志物为CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中的至少一种。
2.检测血浆中CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白水平的试剂或试剂组合物在制备预测发热伴血小板减少综合征预后风险的产品或系统中的应用。
3.根据权利要求2所述应用,其特征在于,所述产品为试剂盒、抗体芯片、抗体探针或检测仪。
4.根据权利要求3所述应用,其特征在于,所述试剂盒是以CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白或其特异性抗体作为靶分子,检测CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白在血浆中的表达水平。
5.根据权利要求3所述应用,其特征在于,所述试剂盒是酶联免疫检测试剂盒或免疫组化试剂盒。
6.根据权利要求5所述应用,其特征在于,所述试剂盒包括:可特异性识别和捕获CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白的捕获抗体、多肽染料和生物素标记的检测抗体。
7.根据权利要求3所述应用,其特征在于,所述试剂盒包含:分别包被有靶向CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白的捕获抗体的编码微球,生物素分别标记的CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白的检测抗体,以及链霉亲和素标记的藻红蛋白。
8.一种预测发热伴血小板减少综合征预后风险的的系统,其特征在于,包括检测模块和判断模块;其中,所述检测模块用于定量检测血浆样品中CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG中至少一种蛋白水平;所述判断模块包括存储有判断规则的可读载体;
所述判断规则为:当检测模块获得的血浆样品中CLEC1A、PLIN1、CD5、CCL20、ENAH、CA12、MCP-3、IL-18R1、CD40、HGF、IL-15RA、IL-17C、STX8、GALNT10、PD-L1、IL-24、CALR、MMP-10、ST3GAL1、VEGFA、TGFB、CCL28、MCP-1、CX3CL1和OPG满足以下条件之一时,判断为高死亡风险;
CLEC1A的基线表达水平NPX≥3.326;
PLIN1的基线表达水平NPX≥2.588;
CD5的基线表达水平NPX≥5.053;
CCL20的基线表达水平≥62.75pg/mL或NPX≥9.949;
ENAH的基线表达水平NPX≥1.499;
CA12的基线表达水平NPX≥2.575;
MCP-3的基线表达水平NPX≥3.799;
IL-18R1的基线表达水平NPX≥10.066;
CD40的基线表达水平NPX≥11.550;
HGF的基线表达水平NPX≥9.560;
IL-15RA的基线表达水平NPX≥1.419;
IL-17C的基线表达水平NPX≥3.197;
STX8的基线表达水平NPX≥1.984;
GALNT10的基线表达水平NPX≥1.846;
PD-L1的基线表达水平NPX≥7.630;
IL-24的基线表达水平NPX≥1.017;
CALR的基线表达水平NPX≥0.438;
MMP-10的基线表达水平NPX≥8.406;
ST3GAL1的基线表达水平NPX≥5.759;
VEGFA的基线表达水平NPX≥11.846;
TGFB的基线表达水平NPX≥5.610;
CCL28的基线表达水平NPX≥1.895;
MCP-1的基线表达水平NPX≥12.053;
CX3CL1的基线表达水平NPX≥5.524;
OPG的基线表达水平NPX≥11.503NPX;
反之,当上述条件均不满足时,判断为低死亡风险。
9.根据权利要求8所述的系统,其特征在于,所述检测模块为Olink蛋白平台检测系统或流式细胞仪。
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