CN112748247A - 抗体结合剂在制备白癜风病期辅助检测产品中的应用及白癜风病期鉴定用的检测试剂盒 - Google Patents

抗体结合剂在制备白癜风病期辅助检测产品中的应用及白癜风病期鉴定用的检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗体结合剂在制备白癜风病期辅助检测产品中的应用及白癜风病期鉴定用的检测试剂盒，所述白癜风病期辅助检测产品以人的血清样本为待测样本，所述抗体结合剂为CXCL10结合剂或CCL20结合剂，对应检测试剂盒中包括抗体结合剂和标准品等，其中，抗体结合剂为CXCL10结合剂或CCL20结合剂。与现有技术相比，本发明填补了目前临床上白癜风病期精确判定试剂盒的空白，可以有效地区分白癜风病期，灵敏度高、特异性好。

Description

抗体结合剂在制备白癜风病期辅助检测产品中的应用及白癜 风病期鉴定用的检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物医药和试剂检测技术领域，涉及一种抗体结合剂在制备白癜风病期辅助检测产品中的应用及白癜风病期鉴定用的检测试剂盒。
背景技术
白癜风是由皮肤功能性黑素细胞的减少或缺失引起，以进行性色素脱失为特征的自身免疫性疾病，以大小不等、数目不定的色素脱失斑为典型皮损特征。全球范围内白癜风患病率约0.5％-2％，且呈逐年上升趋势。由于白癜风的皮损肉眼可见，常出现在颜面部、头颈、四肢等暴露部位，且治疗周期较长，给患者带来沉重心理的和经济负担，严重影响了患者正常社交生活。然而，由于白癜风表皮黑素细胞损伤的具体机制尚未完全阐明，目前临床上仍缺乏特异性的治疗手段。白癜风病期的判定是影响白癜风疗效的关键所在，也是难点所在。精确判定白癜风病期(进展期/稳定期)，选择个体化的最佳治疗方案，对白癜风预后十分重要：(1)准确判定白癜风患者病情活动，缩短白癜风进展期，快速控制病情稳定，提升患者坚持治疗的信心，为患者争取外科植皮治疗的机会，从而最终达到治愈的效果；(2)准确判定白癜风患者病情稳定，提高白癜风手术植皮的成功率，并降低白癜风复发率，让患者长期处于临床治愈状态，以上是研究白癜风病期精确判定的临床意义所在。然而，目前尚未发现通过联合检测来判定白癜风病期相关报道。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种白癜风病期鉴定用的检测试剂盒，利用本发明试剂盒获得的CCL20和CXCL10的检测结果，实现了精准度较高的趋化因子表达情况检测，可以有效地区分白癜风病期，灵敏度高、特异性好。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一方面，本发明提供了一种白癜风病期鉴定用的检测试剂盒，包括抗体结合剂、标准品，其中，抗体结合剂为CXCL10结合剂或CCL20结合剂。
进一步的，所述的CXCL10结合剂为(生物素标记抗人CXCL10)。
进一步的，所述的CCL20结合剂为(生物素标记抗人CXCL20)。
进一步的，所述的标准品为重组人CXCL10标准品，20μg/管。
进一步的，检测试剂盒还包括标准品稀释液、清洗液、底物工作液和终止液等。
更进一步的，所述的标准品稀释液为(PBS缓冲液)。
更进一步的，所述的清洗液为(PBS缓冲液)。
更进一步的，所述的底物工作液由0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液与0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液按体积比1:1混合而成，也可以采用其他常规试剂。
更进一步的，所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液，也可以采用其他常规试剂。
另外，检测试剂盒中还包括阴性对照样本，具体为正常人的血清样本。对应的阳性对照样本则为白癜风患者的血清样本。
另一方面，本发明还通过了一种抗体结合剂在制备白癜风病期辅助检测产品中的应用，所述白癜风病期辅助检测产品以人的血清样本为待测样本，所述抗体结合剂为CXCL10结合剂或CCL20结合剂。
本发明还提供了一种利用上述检测试剂盒来区分判定白癜风病期的方法，具体包括以下步骤：
(1)样品准备：于-80℃冰箱取出待检测血清样本(活动期患者、稳定期患者、正常人)，将所有样本缓慢均衡至室温，避免在37℃直接溶解。
(2)标准品准备：按照说明书推荐的浓度对标准品进行倍比稀释，因检测因子不同而异，以CXLC10检测为例，其标准品依次倍比稀释至2000pg/mL、1000pg/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.3pg/mL，并设置空白孔，仅加入标准品稀释液(0pg/mL)。
(3)样品稀释：对于血清样本的检测，在所有检测孔中均加入100μL样品稀释液(PBS缓冲液，样品稀释液与待检测血清样本的体积比1:100)，混匀备用。
(4)加样：分别加入200μL标准品稀释液和各稀释后的待检测血清样品，封膜后室温孵育2h，并记录标准品及各样品名称及位置。
(5)洗涤：每孔加入400μL清洗液，反复洗涤4次充分去除残留样品，最后一次洗涤之后倒扣在滤纸上拍干。
(6)抗体结合：每孔加200μL待检测蛋白的结合剂，如人CXCL10结合剂，并封膜。对于血清样本需室温孵育2h。
(7)洗涤：每孔加入400μL洗液反复洗涤4次充分去除抗体结合剂，滤纸上拍干。
(8)底物显色：每孔加入200μL底物工作液，室温避光孵育20min。
(9)终止显色：每孔加入50μL终止液，并轻轻混匀，可观察到此时可见颜色由蓝色变为黄色。
(10)读取OD值：30min内用酶标仪在450nm处读吸光值，样本的OD450值为所测OD450值减去零浓度标准品的OD450值。
(11)数据分析：根据标准品的OD值计算出标准曲线，根据标准曲线公式计算各样品中待检测蛋白浓度。
(12)统计学分析：所有连续变量数据以平均数±标准差表示，所有离散变量以分配百分比表示。数据制图用GraphPad Prism软件(GraphPad Software,San Diego,CA,United States)，比较临床资料和疾病相关数据用卡方检验和确切概率法检验定性属性值，Student t检验和Mann-Whitney检验检验定量属性值，数据分析用SPSS软件(版本19,IBM,New York,NY,USA)，P<0.05表示有统计学差异。
患者血清样本中的CXCL10浓度是正常人的血清样本中的CXCL10浓度5倍，则判定其为稳定期；患者血清样本中的CXCL10浓度是正常人的血清样本中的CXCL10浓度50倍，则判定其为进展期。
本发明是通过检测白癜风患者外周血中CXCL9、CXCL10、CXCL16、CCL20、IFN-γ、sCD25、sCD27,比较发现其中CCL20和CXCL10为特异性和灵敏性高的标志物，并依据CCL20和CXCL10的二联检测结果在白癜风与正常人之间，以及白癜风各种临床分型间存在差异设计的配套产品，填补了目前临床上白癜风病期精确判定试剂盒的空白。利用本发明试剂盒获得的CCL20和CXCL10的检测结果，实现了精准度较高的趋化因子表达情况检测，可以有效地区分白癜风病期，灵敏度高、特异性好。
附图说明
图1为根据特异性和敏感性筛选最佳生物学标志物示意图；
图2为通过ELISA检测三组研究对象中外周血CXCL10浓度的结果示意图；
图3为通过ELISA检测三组研究对象中外周血CCL20浓度的结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实验材料：
待检测血清样本来自于30例健康对照者、100例进展期白癜风患者、100例稳定期白癜风患者的外周血。进展期：参考白癜风疾病活动度评分(VIDA)、临床特征、同形反应、Wood灯检查。
①VIDA积分：根据新皮损或原皮损扩大出现时间，近6周出现+4分，近3个月出现+3分，近6个月出现+2分，近1年出现+1分，至少稳定1年为0分，至少稳定1年且有自发色素再生-1分；总分>1分即为进展期，≥4分为快速进展期；
②临床特征：出现皮损边缘模糊、炎性白癜风(包括瘙痒、红斑等)、三色白癜风、纸屑样白斑或色素减退斑等临床表现，可判定为进展期白癜风；
③同形反应：皮肤损伤部位1年内出现白斑，损伤方式可以是物理性(创伤、切割伤、抓伤、机械摩擦、持久压迫、热灼伤、冷冻伤)、化学性、过敏性(变应性接触性皮炎)或其他炎症性皮肤病、刺激性反应(接种疫苗、文身等)、治疗性(放射治疗、光疗)等；
④Wood灯检查结果：皮损颜色呈灰白色，边界欠清，Wood灯下皮损面积>目测面积，提示为进展期。以上4条符合任何1条即可考虑病情进展。
稳定期判定：
①VIDA积分为0分；
②临床特征：白斑呈瓷白色，边缘清晰或色素沉着；
③无同形反应(≥1年)；
④Wood灯：皮损颜色呈白色，边界清晰，Wood灯下皮损面积≤目测面积。
以上4条符合至少两条即可提示稳定期。
所有样本均来自于复旦大学附属华山医院皮肤康复科，所有参与者均提供书面知情同意书。
CXCL10结合剂(即生物素标记抗人CXCL10)、CCL20结合剂(生物素标记抗人CXCL20)、标准品(重组人CXCL10标准品)、标准品稀释液(PBS缓冲液)、清洗液(PBS缓冲液)、底物工作液(0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液与0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液按体积比1:1混合而成)和终止液(2mol/L的硫酸溶液)等由RD公司直接购得。同时，其余如无特别说明的原料试剂或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料或常规技术。
实施例1：
(1)样品准备：于-80℃冰箱取出待检测血清样本(活动期患者、稳定期患者、正常人)，将所有样本缓慢均衡至室温，避免在37℃直接溶解。
(2)标准品准备：按照说明书推荐的浓度对标准品进行倍比稀释，因检测因子不同而异，本实施例为CXLC10检测，其标准品依次倍比稀释至2000pg/mL、1000pg/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.3pg/mL，并设置空白孔，仅加入标准品稀释液(0pg/mL)。
(3)样品稀释：对于血清样本的检测，在所有检测孔中均加入100μL样品稀释液(PBS缓冲液，样品稀释液与待检测血清样本的体积比1:100)，混匀备用。
(4)加样：分别加入200μL标准品稀释液和各组稀释后的待检测血清样品，封膜后室温孵育2h，并记录标准品及各样品名称及位置。
(5)洗涤：每孔加入400μL清洗液，反复洗涤4次充分去除残留样品，最后一次洗涤之后倒扣在滤纸上拍干。
(6)抗体结合：每孔加200μL CXCL10结合剂，并封膜。对于血清样本需室温孵育2h。
(7)洗涤：每孔加入400μL洗液反复洗涤4次充分去除抗体结合剂，滤纸上拍干。
(8)底物显色：每孔加入200μL底物工作液，室温避光孵育20min。
(9)终止显色：每孔加入50μL终止液，并轻轻混匀，可观察到此时可见颜色由蓝色变为黄色。
(10)读取OD值：30min内用酶标仪在450nm处读吸光值，样本的OD450值为所测OD450值减去零浓度标准品的OD450值。
(11)数据分析：根据标准品的OD值得到标准曲线，根据标准曲线，计算各样品中待检测蛋白浓度。
患者血清样本中的CXCL10浓度是正常人的血清样本中的CXCL10浓度2倍，则判定其为稳定期；患者血清样本中的CXCL10浓度是正常人的血清样本中的CXCL10浓度10倍，则判定其为进展期。
以某一患者为例进行检测，其通过上述常规方法诊断后，出现血清样本中的CXCL10浓度的2倍，判定为稳定期，而同样采用本实施例的方法检测其血清样本中的CXCL10浓度为250pg/ml，为正常人血清样本中的CXCL10浓度100pg/ml的2.5倍，为稳定期，可见，本实施例的检测结果与实际情况基本匹配。
图2为对本实施例中在CXCL10对白癜风活动期和稳定期之间的差异进行分析，结果发现CXCL10血清水平在白癜风患者与健康正常者之间存在显著性差异(P<0.0001)；活动期白癜风患者外周血CXCL10血清水平相比于稳定期白癜风患者，显著升高(P<0.0001)。
实施例2
(1)样品准备：于-80℃冰箱取出待检测血清样本(活动期患者、稳定期患者、正常人)，将所有样本缓慢均衡至室温，避免在37℃直接溶解。
(2)标准品准备：按照说明书推荐的浓度对标准品进行倍比稀释，因检测因子不同而异，本实施例为CCL20检测，其标准品依次倍比稀释至2000pg/mL、1000pg/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.3pg/mL，并设置空白孔，仅加入标准品稀释液(0pg/mL)。
(3)样品稀释：对于血清样本的检测，在所有检测孔中均加入100μL样品稀释液(PBS缓冲液，样品稀释液与待检测血清样本的体积比1:100)，混匀备用。
(4)加样：分别加入200μL标准品稀释液和各组稀释后的待检测血清样品，封膜后室温孵育2h，并记录标准品及各样品名称及位置。
(5)洗涤：每孔加入400μL清洗液，反复洗涤4次充分去除残留样品，最后一次洗涤之后倒扣在滤纸上拍干。
(6)抗体结合：每孔加200μL CCL20结合剂，并封膜。对于血清样本需室温孵育2h。
(7)洗涤：每孔加入400μL洗液反复洗涤4次充分去除抗体结合剂，滤纸上拍干。
(8)底物显色：每孔加入200μL底物工作液，室温避光孵育20min。
(9)终止显色：每孔加入50μL终止液，并轻轻混匀，可观察到此时可见颜色由蓝色变为黄色。
(10)读取OD值：30min内用酶标仪在450nm处读吸光值，样本的OD450值为所测OD450值减去零浓度标准品的OD450值。
(11)数据分析：根据标准品的OD值得到标准曲线，根据标准曲线，计算各样品中待检测蛋白浓度。
患者血清样本中的CXCL10浓度是正常人的血清样本中的CXCL10浓度2倍，则判定其为稳定期；患者血清样本中的CXCL10浓度是正常人的血清样本中的CXCL10浓度10倍，则判定其为进展期。
以某一患者为例进行检测，其通过上述常规方法诊断后，出现血清样本中的CXCL10浓度de 10倍，判定为活动期，而同样采用本实施例的方法检测其血清样本中的CXCL10浓度为1200pg/ml，为正常人血清样本中的CXCL10浓度(100pg/ml)的12倍，为活动期，可见，本实施例的检测结果与实际情况基本匹配。
图3为本实施例中对CCL20对白癜风活动期和稳定期之间的差异进行分析的结果，结果发现CCL20血清水平在白癜风患者与健康正常者之间存在显著性差异(P<0.001)；活动期白癜风患者外周血CCL20血清水平相比于稳定期白癜风患者，显著升高(P<0.0001)。
另外，本发明还通过检测白癜风患者外周血中CXCL9、CXCL10、CXCL16、CCL20、IFN-γ、sCD25、sCD27来筛选最佳生物学标志物，分别采集30例健康对照者、100例进展期白癜风患者、100例稳定期白癜风患者外周血。结果如图1所示，结果提示CXCL10和CCL20的特异性和敏感性最佳。
综上所述，本发明可以依据CCL20和CXCL10的二联检测结果在白癜风与正常人之间，以及白癜风各种临床分型间存在差异设计的配套产品，填补了目前临床上白癜风病期精确判定试剂盒的空白。利用本发明试剂盒获得的CCL20和CXCL10的检测结果，实现了精准度较高的趋化因子表达情况检测，可以有效地区分白癜风病期，灵敏度高、特异性好。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种白癜风病期鉴定用的检测试剂盒，其特征在于，包括抗体结合剂和标准品，其中，抗体结合剂为CXCL10结合剂或CCL20结合剂。
2.根据权利要求1所述的一种白癜风病期鉴定用的检测试剂盒，其特征在于，所述的CXCL10结合剂为生物素标记抗人CXCL10。
3.根据权利要求1所述的一种白癜风病期鉴定用的检测试剂盒，其特征在于，所述的CCL20结合剂为生物素标记抗人CXCL20。
4.根据权利要求1所述的一种白癜风病期鉴定用的检测试剂盒，其特征在于，所述的标准品为重组人CXCL10标准品。
5.根据权利要求1所述的一种白癜风病期鉴定用的检测试剂盒，其特征在于，还包括标准品稀释液、清洗液、底物工作液和终止液。
6.根据权利要求5所述的一种白癜风病期鉴定用的检测试剂盒，其特征在于，所述的标准品稀释液为PBS缓冲液。
7.根据权利要求5所述的一种白癜风病期鉴定用的检测试剂盒，其特征在于，所述的清洗液为PBS缓冲液。
8.根据权利要求5所述的一种白癜风病期鉴定用的检测试剂盒，其特征在于，所述的底物工作液由0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液与0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液按体积比1:1混合而成。
9.根据权利要求5所述的一种白癜风病期鉴定用的检测试剂盒，其特征在于，所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液。
10.一种抗体结合剂在制备白癜风病期辅助检测产品中的应用，其特征在于，所述白癜风病期辅助检测产品以人的血清样本为待测样本，所述抗体结合剂为CXCL10结合剂或CCL20结合剂。
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