CN108957014A - 结直肠癌血清标志物、表达评估方法、试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于癌症检测技术领域，具体涉及一种结直肠癌血清标志物、表达评估方法、试剂盒及应用，该结直肠癌血清标志物为CCL20趋化因子和IL17A细胞因子，通过对CCL20和IL17A两种炎症因子的联合检测，有利于对早期结直肠癌患者进行无创性诊断，并对预后作出评估。

Description

结直肠癌血清标志物、表达评估方法、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于癌症检测技术领域，具体涉及一种结直肠癌血清标志物、表达评估方法、试剂盒及应用。
背景技术
结直肠癌最常见的恶性肿瘤之一,也在全球恶性肿瘤中死亡率排第二。据统计，早期结直肠癌患者的5年生存率为90％以上，而晚期IV期患者的仅略高于10％。因此，在早期阶段诊断结直肠癌对于降低其死亡率是至关重要的。尽管筛查策略逐渐发展，诸如结肠镜检查，粪便隐血检测和粪便DNA检测，但是CRC的早期诊断仍然存在很多问题。目前，越来越多的研究者关注无创性生物标志物，目前最常用的血清肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)和碳水化合物抗原19-9(CA19-9)对早期CRC诊断的敏感性和特异性非常有限。因此，寻求新的特异性和非侵入性的生物标志物对CRC早期诊断是很有必要的。
炎症在CRC疾病进展中起关键性因素。许多流行病学研究报道炎性肠病患者高发CRC。趋化因子和细胞因子在恶性肿瘤发展中起重要作用。趋化因子属于低分子量细胞因子的超家族，主要来源于肿瘤相关的白细胞或肿瘤细胞，根据4个保守的半胱氨酸残基中的前2个可分为4个主要家族(CC，CXC，CX3C和C)，其中最大的亚家族是CXC和CC家族。两者主要通过调控白细胞的趋化及肿瘤细胞的生物学特性参与调节急性和慢性炎症和肿瘤发生发展。趋化因子CC配体20(CCL20)也称为巨噬细胞炎性蛋白3α(MIP3α)，是已知与G蛋白偶联的7-跨膜受体CCR6相互作用的唯一趋化因子。越来越多的证据表明CCL20对淋巴细胞具有显著的趋化性。有文献报道在一些炎性疾病和癌症中CCL20的表达增加，并且与肿瘤进展有关。然而，CCL20在血清中的诊断和预后价值尚不清楚。
白介素家族与肿瘤微环境中的炎症反应密切相关。IL17A由活化的CD4+T细胞(Th17)的亚型以及一些CD8+T细胞和γδT细胞产生。已经有文章报道它参与多种恶性肿瘤的侵袭。研究表明IL17A在结直肠癌进展中起主要作用。血清IL17A高表达与CRC患者的无进展生存期缩短及小细胞肺癌患者的肿瘤播散显着相关。迄今为止，还没有关于IL17A在特异性诊断结直肠癌患者的报道。
据报道，IL17A促进肿瘤细胞分泌CCL20。CCL20促进Th17细胞向肿瘤组织的募集，肿瘤微环境中各种因素进一步诱导IL17A的分泌。因此，CCL20可能与IL17A密切相关。目前联合这两种指标进行疾病的诊断评估未见报道。
发明内容
本发明主要提供了一种结直肠癌血清标志物、表达评估方法、试剂盒及应用，通过对CCL20和IL17A两种炎症因子的联合检测，可以对结直肠癌患者及早作出判断，并能有效评估预后，从而为后续的及时干预治疗提供方便。其技术方案如下：
一种结直肠癌血清标志物，其为CCL20趋化因子和IL17A细胞因子。
一种人结直肠癌检测试剂盒，其包括CCL20趋化因子和IL17A细胞因子。该试剂盒可用于检测结直肠癌血清标志物表达水平。
一种结直肠癌血清标志物的ELISA表达评估方法，其中CCL20趋化因子和IL17A细胞因子分别采用下述方法评估：
(1)将1×Capture antibody加入到平底酶标孔板中，封口膜密封后包被16-20h；
(2)取出包被板，甩干并加入Wash buffer洗板；
(3)甩干后，加入1×Assay diluent，室温孵育，孵育结束后，甩干并加入Washbuffer洗板；
(4)甩干后，加入待测血清，室温孵育，孵育结束后，甩干并加入Wash buffer洗板；
(5)甩干后，加入1×Detector antibody，室温孵育，孵育结束后，甩干并加入Washbuffer洗板；
(6)甩干后，加入1×Avidin-HRP，室温孵育，孵育结束后，甩干并在加入Washbuffer洗板；
(7)甩干后，加入显色液，室温避光显色反应；
(8)加入终止液终止反应，检测450nm处的OD值。
上述评估方法用于检测血清中炎症因子的变化，这种方法具有无创性，能有效诊断早期结直肠癌患者，并评估患者预后。以CCL20和IL17A联合在血清中的表达水平的拟合值为0.55作为诊断指数时，其诊断的灵敏度为96.04％，特异度为96.55％。
采用上述方案，本发明具有以下优点：
本发明通过对CCL20和IL17A两种趋化因子的联合检测，具有简便、快捷、无创、灵敏度高、特异性好等特点，同时可以减少人为主观因素的干扰，可以对结直肠癌患者及早作出判断，从而为疾病后续的及时干预治疗提供方便。
附图说明
图1为健康人、结肠炎及结肠腺瘤与结直肠癌早期患者血清中CCL20和IL17A表达量的t检验结果图；
图2A为CCL20、IL17A、CCL20和IL17A联合及CEA诊断结直肠癌患者的ROC曲线。图2B为CCL20联合IL17A诊断早期结直肠癌患者的ROC曲线。
图3为血清中CCL20、IL17A及二者联合对结直肠癌患者预后的评估。
具体实施方式
以下实施例中的实验方法如无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料如无特殊规定均为常规生化试剂和材料。
实施例1
以下方法中使用的是biolegend公司的CCL20的ELISA检测试剂盒和IL17A的检测试剂盒。实验标本来源于郑州大学第一附属医院胃肠外科初治患者112例，所有患者均经病理科确诊为结直肠癌(I-III期)，其中59例早期结直肠癌患者(I/Ⅱ期)。健康志愿者59例，结肠炎患者52例，结肠腺瘤40例，共151例对照。对263例血清进行CCL20和IL17A水平分析。
1、ELISA法分别检测70例健康人与113例结直肠癌患者血清中CCL20的水平：
(1)将1×Capture antibody加入到平底96孔板中，100μL/孔，封口膜密封后4℃包被16-20h；
(2)取出包被板，甩干并在厚纸或软布上垂直摔打3-4次后，室温加入300μLWashbuffer洗板4×5min(加样时，枪头不能接触板壁，防止孔间交叉污染，也不要直接吹打板底，避免扰动包被层)；
(3)甩干并在厚纸或软布上垂直摔打3-4次后，加入200μL1×Assay diluent，室温200rpm孵育1h；
(4)根据试剂盒说明，准备标准品和待测样品；
(5)孵育结束后，甩干并在厚纸或软布上垂直摔打3-4次后，室温加入300μLWashbuffer洗板4×5min；
(6)甩干并在厚纸或软布上垂直摔打3-4次后，加入100μL标准品及待测患者血清，室温200rpm孵育2h；
(7)孵育结束后，甩干并在厚纸或软布上垂直摔打3-4次后，室温加入300μLWashbuffer洗板4×5min；
(8)甩干并在厚纸或软布上垂直摔打3-4次后,加入100μL 1×Detectorantibody,室温200rpm孵育1h；
(9)孵育结束后，甩干并在厚纸或软布上垂直摔打3-4次后，室温加入300μLWashbuffer洗板4×5min；
(10)甩干并在厚纸或软布上垂直摔打3-4次后，加入100μL1×Avidin-HRP，室温200rpm孵育0.5h；
(11)孵育结束后，甩干并在厚纸或软布上垂直摔打3-4次后，室温加入300μLWashbuffer洗板5×5min；
(12)甩干并在厚纸或软布上垂直摔打3-4次后，加入100μL新鲜配置的TMBsubstrate solution，室温避光反应(反应终止时间根据颜色变化决定，反应越快则蓝色越深)；
(13)待颜色变化达到需要的水平时,加入100μL Stop solution终止反应(颜色变黄),检测450nm处的OD值。
2、ELISA法分别检测151例对照与112例结直肠癌患者血清中IL17A的水平，具体检测方法同上。
3、结直肠癌患者及健康志愿者、结肠炎、结肠腺瘤对照组血清中CCL20和IL17A表达量的t检验结果如图1所示。图2为CCL20，IL17A，CCL20和IL17A联合，与传统的CEA诊断进行对比。图3为血清中CCL20，IL17A，CCL20和IL17A联合对预后的影响。表1是两者联合的诊断分析结果：
表1：联合诊断结果分析
标准化预测值 敏感度 特异度 AUC(95％CI)
>0.555 96.04 96.55 0.989(0.958-0.999)
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种结直肠癌血清标志物，其为CCL20趋化因子和IL17A细胞因子。
2.一种人结直肠癌检测试剂盒，其包括CCL20趋化因子和IL17A细胞因子。
3.一种结直肠癌血清标志物的ELISA评估方法，其特征在于：CCL20趋化因子和IL17A细胞因子采用下述方法评估：
(1)将1×Capture antibody加入到平底酶标孔板中，封口膜密封后包被16-20h；
(2)取出包被板，甩干并加入Wash buffer洗板；
(3)甩干后，加入1×Assay diluent，室温孵育，孵育结束后，甩干并加入Wash buffer洗板；
(4)甩干后，加入待测血清，室温孵育，孵育结束后，甩干并加入Wash buffer洗板；
(5)甩干后，加入1×Detector antibody，室温孵育，孵育结束后，甩干并加入Washbuffer洗板；
(6)甩干后，加入1×Avidin-HRP，室温孵育，孵育结束后，甩干并在加入Wash buffer洗板；
(7)甩干后，加入显色液，室温避光显色反应；
(8)加入终止液终止反应，检测450nm处的OD值。
4.根据权利要求3所述的结直肠癌血清标志物的ELISA评估方法，其特征在于：该方法用于检测血清中炎症因子的变化，这种方法具有无创性，能有效诊断早期结直肠癌患者，并评估患者预后。
5.根据权利要求3所述的结直肠癌血清标志物的ELISA检测评估方法，其特征在于：以CCL20和IL17A联合在血清中的表达水平的拟合值为0.55作为诊断指数时，其诊断的灵敏度为96.04％，特异度为96.55％。
6.权利要求2所述的试剂盒在判断结直肠癌血清标志物表达水平检测中的应用。
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