CN111122865A - 一种基于CD11b和CD169蛋白分子的用于肝癌预后预测的标志物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CD11b和CD169蛋白分子的用于肝癌预后预测的标志物，所述标志物为MRS，MRS＝0.161×CD11b_T‑0.106×CD169_T+35。本发明提出的MRS利用了髓系细胞的标记物而非淋巴细胞的标记物；对于患者术后复发和生存的预测能力得到了多中心、大样本验证，具有更高的可靠性；还可用于预测术后复发患者后续进行索拉非尼或TACE治疗的疗效；只需要检测肝癌组织中CD11b⁺细胞密度和CD169⁺细胞密度，即可得到预后高特异性、高敏感性和高临床应用价值的预后指标，检测方法简单便捷。

Description

一种基于CD11b和CD169蛋白分子的用于肝癌预后预测的标 志物

技术领域

本发明涉及肝癌预后预测技术领域，更具体地，涉及一种基于CD11b和CD169蛋白分子的用于肝癌预后预测的标志物

背景技术

肝细胞癌(简称肝癌)是世界范围内发病率最高的癌症之一。我国肝癌发病人数长期以来居高不下，早诊率低于30％，5年相对生存率仅为10.1％(国家癌症中心2015)，位居我国男性第二位肿瘤相关死因。目前，临床上对于肝癌的治疗手段仍十分有限，根治性切除术仍为我国肝癌患者的主要治疗方案。在此背景下，建立肝癌术后的预后预测指标，是判断肝癌患者术后复发风险、及早干预疾病进一步恶化和避免患者承受不必要的治疗风险的关键。然而，目前仍缺乏一个精准而简单的肝癌术后预测指标。建立一个在预测效果上能得到多中心、大样本支持，同时在方法学上足够简单从而能广泛推广使用的新型肝癌预测指标，将提高对肝癌术后复发和患者生存的预测水平，有助于针对性开展肝癌辅助治疗和新辅助治疗的临床决策，从而提高肝癌疗效，为肝癌的精准治疗奠定基础。

绝大多数原发性肝癌起源于具有大量免疫细胞浸润的肝炎病毒感染组织。组织免疫应答既是人体清除病毒和肿瘤的“武器”，又是引起肝脏损伤和肝癌发生发展的重要因素。髓系细胞是一类先天性免疫细胞，也是肝癌组织中浸润的主要免疫细胞类型。髓系细胞是一个高度异质的细胞群体，既包含有大量促肿瘤的髓系细胞如肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关粒细胞和髓源抑制细胞等，也包含了抗肿瘤的经典巨噬细胞等。因此，抗肿瘤髓系细胞和促肿瘤髓系细胞在肝癌微环境中相互拮抗、竞争，构成微环境中的髓系反应平衡。尽管近年来对于髓系细胞各个亚群的认识有了一定的进展，但仍未有一个指标能指示肝癌中整体的髓系免疫反应平衡倾向。更重要的是，至今仍未有一个基于髓系免疫反应平衡的生物指标，能够帮助肝癌的临床预后预测和医疗决策。

目前临床常用TMN分期和肝癌巴塞罗分期(BCLC)对患者预后进行预测。其中，TNM分期结合肿瘤大小、淋巴结转移及远端转移情况，对肝癌进行分期评价。而BCLC主要考虑三类预后因素：(1)病人的一般状态；(2)肿瘤的状态；(3)肝功能状态。除此以外，免疫相关标记物在肝癌中并不常见，且通常采用淋巴细胞相关标记物或单个髓系细胞标记物。大部分新提出的免疫相关标记物未经多中心、大样本数据验证，存在过度拟合所使用的临床样本数据的可能，大范围使用时的可靠性存疑，对患者预后判断的效力较低，精确度较差；同时，目前对于多指标指示肝癌中的免疫反应及预测患者预后，多使用淋巴细胞标记(如CD3、CD8、Granzyme B、Foxp3等)，而忽视了髓系细胞对于患者预后和抗肿瘤治疗的重要影响。同时，目前对于精准预测肝癌术后预后的标记物组合和预测模型，一般均需要采用基因表达芯片、基因甲基化芯片、RNA测序等高通量技术，检测成本高，纳入最终模型的指标多，不利于临床上推广使用。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种基于CD11b和CD169蛋白分子的用于肝癌预后预测的标志物。

本发明的第一个目的是提供一种基于CD11b和CD169蛋白分子的用于肝癌预后预测的标志物。

本发明的第二个目的是提供所述的标志物在制备肝癌预后预测试剂盒的应用。

本发明的第三个目的是提供所述的标志物在制备肝癌患者分组试剂盒的应用。

本发明的第四个目的是提供所述的标志物在制备患者复发后进行索拉非尼治疗的疗效试剂盒的应用。

本发明的第五个目的是提供所述的标志物在制备患者复发后介入治疗效果的试剂盒的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明要求保一种用于肝癌预后预测的标志物，所述标志物为基于CD11b和CD169蛋白分子的细胞密度计算得到的髓系反应评分MRS，髓系反应评分MRS＝0.161×CD11b_T-0.106×CD169_T+35；其中，CD11b_T为每平方毫米肝癌癌巢区域中CD11b⁺细胞数量；CD169_T为每平方毫米肝癌癌巢区域中CD169⁺细胞数量；计算得到的MRS值小于0，使之为0；计算得到的MRS值大于100，使之为100。

CD11b⁺细胞为利用anti-CD11b抗体为第一抗体，通过免疫组织化学染色所标记的阳性细胞；

CD169⁺细胞为利用anti-CD169抗体为第一抗体，通过免疫组织化学染色所标记的阳性细胞。

Score＝A×CD11b_T+B×CD169_T+C(其中，A、B、C均为常数；在此公式中，A＝0.161，B＝-0.106，C＝35)，且A与B之比为约等于-1.5(-1至-2范围内)，即使A、B、C值与本公式不同，亦可相应调整后续分组阈值，达到此公式达到类似的对患者预后预测结果。因此，亦可视为与以上公式具有同等的效果。

优选地，所述预后为患者手术后复发或生存，髓系反应评分MRS越高患者手术后复发概率越高、手术后生存概率越低，髓系反应评分MRS越低患者手术后复发概率越低、手术后生存概率越高。

优选地，所述手术为肝癌切除术。

优选地，每平方毫米肝癌癌巢区域中CD11b⁺细胞数量和每平方毫米肝癌癌巢区域中CD169⁺细胞数量通过免疫组织化学染色后统计得到。

不同来源的抗体、抗原修复方式和抗体染色方法，但仍是针对CD11b(亦称为Integrin alpha M，整合素αM)和CD169(亦称为Sialoadhesin-1，唾液酸黏附蛋白-1)的免疫组织化学染色或免疫荧光染色，均可得到肝癌组织中CD11b⁺细胞密度和CD169⁺细胞密度，可视为与本方法等同。

人工计数或自动计数方法，均可得到准确而类似的CD11b⁺细胞密度和CD169⁺细胞密度。

所述的标志物在制备肝癌预后预测试剂盒的应用，也属于本发明的保护范围。

所述的标志物在制备肝癌患者分组试剂盒的应用，也属于本发明的保护范围。

优选地，0≤髓系反应评分MRS≤37.9，低复发风险和/或死亡风险可能；37.9<髓系反应评分MRS≤60.6中等复发风险和/或死亡风险可能；60.6<髓系反应评分MRS≤100，高复发风险和/或死亡风险可能。

所述的标志物在制备患者复发后进行索拉非尼治疗的疗效试剂盒的应用，也属于本发明的保护范围。

优选地，0≤髓系反应评分MRS≤37.9，对索拉非尼治疗响应最好；37.9<髓系反应评分MRS≤60.6，对索拉非尼治疗响应中等；60.6<髓系反应评分MRS≤100，对索拉非尼治疗响应最差。

所述的标志物在制备患者复发后介入治疗效果的试剂盒的应用。

优选地，0≤髓系反应评分MRS≤37.9，患者复发后介入治疗效果最好；37.9<髓系反应评分MRS≤60.6，患者复发后介入治疗效果中等；60.6<髓系反应评分MRS≤100，患者复发后介入治疗效果最差。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

与目前提出的其他预测肝癌患者预后的免疫学指标不同相比，MRS利用了髓系细胞的标记物而非淋巴细胞的标记物；MRS对于患者术后复发和生存的预测能力得到了多中心、大样本验证，具有更高的可靠性；MRS还可用于预测术后复发患者后续进行索拉非尼或TACE治疗的疗效。MRS不需要进行基因表达芯片、基因甲基化芯片、RNA测序等高通量检测，只需要应用目前在临床上已经很成熟和得到推广的免疫组织化学染色技术，并且只需要检测肝癌组织中CD11b⁺细胞密度和CD169⁺细胞密度，即可得到预后高特异性、高敏感性和高临床应用价值的预后指标，检测方法简单便捷。

附图说明

图1为MRS在训练子集中的预后相关性；A：MRS在初始样本集-训练子集中的临床相关性。ROC分析的AUC值表示MRS分别在1、2年RF和2、3年OS下对预后预测的准确性；B：MRS在训练子集中无复发生存(左)和总体生存(右)的Kaplan-Meier生存分析。OS，总体生存期；RF，无复发生存时间。

图2为MRS预测临床预后的多中心、大样本验证，A-C：MRS分别在初始样本集-验证子集(A)，内部验证集(B)和外部验证集(C)中的临床相关性：左图分别为在三个样本集中进行的ROC分析，AUC值表示MRS分别在1、2年RF和2、3年OS下对预后预测的准确性；中、右图分别展示了三个样本集中无复发生存和总体生存的Kaplan-Meier生存分析。OS，总体生存期；RF，无复发生存期。

图3为MRS与复发性肝癌的治疗效果：显示针对每位患者在开始行索拉菲尼治疗(诊断为复发)后的生存时间、各疗效评价时间点和时间段(n＝56)；索拉非尼疗效评价依据实体肿瘤疗效评价标准(RECIST 1.1版)：Complete response，CR，完全缓解；Patialresponse，PR，部分缓解；Progressive disease，PD，疾病进展；图中嵌合小图显示MRS在索拉菲尼治疗患者中的无进展生存期分析。

图4为MRS在TACE治疗患者中的总体生存期分析。

图5为MRS、BCLC和TNM预测患者复发和生存的时间依赖ROC曲线分析；A：对预测2年复发进行ROC曲线分析，比较MRS、BCLC分期和TNM分期的预测能力；B：时间依赖的ROC分析，曲线显示MRS、BCLC分期和TNM分期预测0.5至96月内复发的AUC值；C：对预测3年总体生存进行ROC曲线分析，比较MRS、BCLC分期和TNM分期的预测能力；D：时间依赖的ROC分析，曲线显示MRS、BCLC分期和TNM分期预测0.5至96月内患者总体生存的AUC值；AUC，曲线下面积。

图6为对MRS和临床分期预测肝癌患者预后的决策曲线分析(DCA)；(A)比较MRS、BCLC分期和TNM分期预测2年复发的临床实用性进行DCA分析；(B)比较MRS、BCLC分期和TNM分期预测3年总体生存的临床实用性进行DCA分析。

图7为预测肝癌患者术后复发和生存情况的列线图；A：基于MRS构建用于预测肝癌患者的术后复发的列线图；B：基于MRS构建用于预测肝癌患者术后总体生存情况的列线图。

图8为基于MRS的列线图对患者复发和生存的预测；3个样本集分别根据TTR列线图和OS列线图将患者分成3组，并分别进行KM生存分析。

图9为对基于MRS的列线图的性能的评估；在3个样本集中分别对预测TTR(上)和OS(下)的列线图进行时间ROC曲线分析(A)、校准曲线分析(B)，决策曲线分析(DCA)的临床有效性(C)。AUC,曲线下面积。

图10为对比列线图、MRS和临床分期预测不同时间点(从术后6个月至术后96个月)患者术后复发(TTR，图10A)及总体生存(OS，图10B)的预测能力进行时间依赖的ROC曲线分析(特异性、灵敏性)。图中所示为不同时间点的预测能力的ROC曲线下面积(AUC)。

图11为对列线图、MRS和临床分期的ROC曲线分析和临床实用性分析；A-B：对预测2年复发的基于MRS的列线图进行时间ROC曲线(A)和临床实用性分析(B)分析，并MRS、BCLC分期和TNM分期进行对比；(C-D)对预测3年总体生存的基于MRS的列线图进行时间ROC曲线(C)和临床实用性分析(D)分析，并MRS、BCLC分期和TNM分期进行对比。AUC，曲线下面积。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

1.肿瘤大小：测量肿瘤最大直径，分为三组：小于等于4cm、4－10cm、大于10cm；

2.血管侵犯：将手术切除的肿瘤组织制作成石蜡切片，常规H&E染色可判断是否存在肿瘤侵犯血管的情况；

3.肝硬化：超声检测肝脏是否回声增粗和外形改变，结合患者有无脾大、食管胃底静脉曲张、腹水，以及外周血总胆红素含量、白蛋白含量、凝血酶原时间，由主治医师判定是否存在肝硬化情况；

4.肿瘤数量：术中可判断肿瘤是单发还是多发肿瘤；

5.Child-Pugh分级：Child-Pugh分级标准是一种临床上常用的用以对肝硬化患者的肝脏储备功能进行量化评估的分级标准。该标准将患者5个指标(包括肝性脑病的有无及其程度、腹水、血清胆红素、血清白蛋白浓度及凝血酶原时间)的不同状态分为三个层次，分别记以1分，2分和3分，并将5个指标计分进行相加，总和最低分为5分，最高分为15分，从而根据该总和的多少将肝脏储备功能分为A、B、C三级，预示着三种不同严重程度的肝脏损害(分数越高，肝脏储备功能越差)。其具体分级标准如下表1：

表1：Child-Pugh分级标准

根据上表得到的评分，进行分级。其中，A级：5－6分；B级：7－9分；C级：≥10分

实施例1 髓系反应评分(Myeloid Response Score，以下简称MRS)的计算

本发明选用两个髓系免疫细胞的蛋白分子标记(CD11b和CD169)。其中，CD11b用于标记CD11b⁺的髓系细胞(主要为CD11b⁺粒细胞、单核细胞、髓源抑制性细胞等)；CD169用于标记CD169⁺的髓系细胞(主要为CD169⁺单核/巨噬系细胞)。

1、免疫组织化学染色

具体染色流程如下：

(1)选取肝癌组织蜡块，确保有足够可供统计的癌巢面积且无大片组织坏死；

(2)获取4μm的石蜡切片，在60℃烤片2小时，取出，略冷；

(3)室温下用二甲苯脱蜡2次，每次10分钟；

(4)在100％乙醇中洗去二甲苯，再依次经过95％酒精、80％酒精、70％酒精，每次5分钟；

(5)双蒸水中洗5分钟；

(6)用0.3％H₂O₂封闭内源性过氧化物酶活性，室温10分钟；

(7)双蒸水中洗4次，每次5分钟；

(8)抗原修复：具体的第一抗体来源和免疫组化染色条件如下表2所示。

表2第一抗体的来源和具体实验条件：

标记物	抗体来源	修复方法	显色时间
				CD11b	Abcam，货号：ab52478	高压10min，10mM CB(pH＝6.0)	0.5min
CD169	R&D，货号：AF5197	高压10min，10mM CB(pH＝6.0)	5min

CB：柠檬酸缓冲液

(9)室温自然冷却30分钟；

(10)PBS缓冲液中洗4次，每次3分钟；

(11)将第一抗体(详见表1)分别滴加在组织切片上，4℃孵育12小时；

(12)PBS缓冲液冼4次，每次5分钟；

(13)滴加辣根过氧化物酶标记的第二抗体，37℃孵育30分钟；所述2种第二抗体，分别是山羊抗鼠/兔IgG的多克隆抗体(与anti-CD11b第一抗体配合使用；购自Dako公司，货号为K5007)和驴抗绵羊IgG的多克隆抗体(与anti-CD169第一抗体配合使用；购自R&D公司，货号为NL010)；

(14)PBS洗4次，每次5分钟；

(15)滴加DAB显色剂(购自Dako公司，货号为K5007)，室温，具体时间如表3所示；

(16)双蒸水洗4次，每次5分钟；

(17)苏木素复染，室温2分钟；

(18)双蒸水洗4次，每次5分钟；

(19)PBS缓冲液中洗3分钟；

(20)自来水冲洗3分钟；

(21)烘干，封片。

2、CD11b⁺细胞和CD169⁺细胞的统计

(1)在低倍视野(20倍)下获取癌巢区域的图片3张，分辨率为1392px×1040px；

(2)用Inform软件进行组织类型训练，准确划分图像中需要分析的组织区域，或手动画出需要分析的区域；

(3)采用分析软件识别DAB染色的阳性细胞信号(棕色)和苏木素染色的细胞核(蓝色)；

(4)采用人工计数或软件自动识别技术，分析细胞膜阳性信号的个数，得到每单位面积图中阳性信号的数量；

(5)最终统计结果为3张照片的平均值。

3、髓系反应评分(Myeloid Response Score，以下简称MRS)的计算

将上述所得CD11b+细胞密度和CD169+细胞密度代入以下公式：

公式1：MRS＝0.161×CD11b_T-0.106×CD169_T+35(0≤MRS≤100)

其中，CD11b_T为每平方毫米肝癌癌巢区域中CD11b⁺细胞数量(cells/mm²)；CD169_T为每平方毫米肝癌癌巢区域中CD169⁺细胞数量(cells/mm²)。若计算得到的MRS值小于0，则记为0；若计算得到的MRS值大于100，则记为100。

实施例2 髓系反应评分MRS可作为肝癌患者分组的依据

一、MRS作为初始样本集-训练子集患者分组的依据

1、初始样本集-训练子集样本的选择

初始样本集(primary cohort)的488例石蜡存档标本来自2006年1月至2008年12月间在中山大学附属肿瘤医院首次接受肿瘤切除术的肝癌患者，包括肝癌肿瘤组织及匹配的远端癌旁正常组织(距肿瘤区域2cm以上)。将该批次患者随机均分为两组，分别为244例的训练集(primary-training cohort)和244例的验证集(primary-test cohort)，进行后续的模型构建。以上所有入选患者没有同时感染梅毒、HIV病毒或患有自身免疫疾病。样本采集前均未接受任何抗肿瘤治疗，且术后肿瘤标本经病理诊断确认为肝细胞肝癌。患者术后定期随访，进行血清AFP、腹腔超声和胸透等检查以确认是否复发。患者术后复发确诊以CT、MR或血管造影等影像学诊断为标准，且复发前不进行辅助性治疗。患者无瘤生存时间(time to recurrence，TTR)为手术日期至复发确诊日期之间的时间；总体生存时间(overall survival，OS)为手术日期至患者死亡日期之间的时间。术后随访至少8年，若随访终止时仍未复发或死亡则以删失处理。

2、样本情况统计

所有患者病理信息见表3。

表3：各样本集中肝癌患者的病理信息

AFP：甲胎蛋白(alpha-fetoprotein)；ALT：谷氨酸氨基转移酶或称丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase)；FUZH：复旦大学中山医院(Fudan UniversityZhongshan Hospital)；HBsAg：B型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen)；HCVAb：丙型肝炎病毒抗体(Hepatitis C virus antibody)；NA：无资料(not available)；THZP：浙江省台州市医院(Taizhou Hospital of Zhejiang Province)。

3、MRS作为初始样本集-训练子集患者分组的依据

采用X-tile软件根据训练子集内患者复发情况选择最优Cutoff值，将患者根据MRS分(使用实施例1中的公式1计算)为临床预后具有显著差异的3组，其中，低MRS(MRS-low)：0≤MRS≤37.9；

中MRS(MRS-int)：37.9<MRS≤60.6；

高MRS(MRS-high)：60.6<MRS≤100。

在初始样本集的训练子集中，Kaplan-Meier曲线显示训练子集内不同MRS分组患者之间不论是无复发生存期(time to recurrence，TTR)还是总体生存期(overallsurvival，OS)都具有显著差异(图1B)。

其中低MRS组1、2年复发率分别为13.7％、32.6％，2、3年生存率分别为97.9％、94.7％。与之形成鲜明对比的是，高MRS组1、2年复发率分别为80.7％、87.7％，2、3年OS复发率分别为43.6％、28.1％。

此外，Cox单因素回归分析显示相对于MRS-low组，MRS-high组患者的复发风险(HR，5.35；95％CI,3.38-8.45)和死亡风险(HR，7.96；95％CI,4.68-13.53)都显著更高(P<0.001)。

二、MRS在其他样本集作为患者分组的依据

1、验证集样本的选择与样本统计情况

如前所述，初始样本集的244例的验证子集(primary-test cohort)来自于对初始样本集的随机分组。此外，内部验证集(internal validation cohort)样本来自341例2002年1月至2005年12月间在中山大学附属肿瘤医院行肿瘤切除术的肝癌患者的肿瘤组织；外部验证集(external validation cohort)原发性肝癌组织的348例样本由两批样本组成：94例来自中国科技大学，254例来自复旦大学中山医院。所有患者病理信息见表3。

2、MRS在其他样本集作为患者分组的依据

在其他的多个样本集中，同样根据MRS对患者进行分组(同上文)，并进行Kaplan-Meier曲线分析和Cox单因素回归分析。

结果显示，样本集中不同MRS分组的患者的TTR和OS均有显著差异(P<0.0001，图2)。表明MRS作为分层标准，在不同样本中同样具有准确区分肝癌患者术后复发和生存风险的能力。此外，对各验证样本集进行的Cox单因素回归分析均显示随着MRS的升高，患者术后复发和生存的风险逐渐升高：相对于MRS-low组，MRS-high组患者的复发风险(HR：验证子集，4.13；内部验证集，3.36；外部验证集，3.74)和死亡风险(HR：验证子集，6.49；内部验证集，4.98；外部验证集，3.88)都显著更高(P<0.001)。

实施例3 MRS预测患者复发后进行索拉非尼治疗的疗效

一、实验方法

在56例既往行肝癌根治性切除术，且在复发诊断后每日给予索拉非尼800mg的患者队列中，肿瘤切除后0.8～121.4个月复发(四分位距，4.9～30.1个月)，索拉非尼治疗时间1.7～60.8个月(四分位距,6.3～21.4个月)。

采用相同的标准将患者按MRS值分组后(低MRS：0≤MRS≤37.9；中MRS：37.9<MRS≤60.6；高MRS：60.6<MRS≤100)，根据患者接受治疗后的总体生存将患者进行排序，并标记各时间点的疗效评价。

二、实验结果

相对于另外两组，MRS-low组肝癌患者倾向于获得更长的治疗后生存期，且对索拉非尼治疗响应最好。其中对治疗部分响应和完全响应的患者几乎均分布于MRS-low组。而反之，MRS-high组的肝癌患者对索拉非尼的客观反应几乎均受到限制，大部分在治疗后迅速出现疾病进展。

实施例4 MRS预测复发后介入治疗效果

一、实验方法

在113例既往行肝癌根治性切除术，且在复发诊断后行至少一次肝动脉化疗栓塞术(TACE)介入治疗的患者队列中，肿瘤切除后1～96个月复发(四分位距,4.77～33.2个月)。采用相同的标准将患者按MRS值分组(低MRS：0≤MRS≤37.9；中MRS：37.9<MRS≤60.6；高MRS：60.6<MRS≤100)。进行Kaplan-Meier和log-rank分析。

二、实验结果

结果显示，采用Kaplan-Meier和log-rank分析显示，低、中、高MRS分组患者的总体生存期分别为首次治疗后的39.80个月、24.20个月和9.60个月(图4)。Cox单因素回归分析显示MRS-high组与MRS-low分组无进展生存情况的危险比为4.37(95％CI，2.40-8.46；P<0.0001)。这些结果提示MRS也是复发后介入治疗结果的一个潜在预测标志，为之后临床对肝癌患者的抗肿瘤治疗也具有一定的提示意义。

实施例5 MRS分期、TMN分期和肝癌巴塞罗分期(BCLC)方法的比较

一、实验方法

采用实施例2的MRS分期和目前临床通用的TMN分期和肝癌巴塞罗分期(BCLC)方法对肝癌患者(所有患者病理信息见表3)进行分期。

TMN分期具体分期方法如表4到表5所示。

表4肝癌TNM分期的常用分期符号：

表5肝癌的TNM分期系统：

肝癌巴塞罗分期(BCLC)主要考虑三类预后因素：(1)病人的一般状态；(2)肿瘤的状态；(3)肝功能状态，具体分期方法如表6所示。

表6巴塞罗那肝癌临床分期系统(BCLC)：

进行时间依赖的ROC曲线分析和决策曲线分析

二、实验结果

与目前临床通用的TMN分期和肝癌巴塞罗分期(BCLC)相比，MRS具有更佳的预测患者术后复发(TTR)和生存(OS)的准确性和特异性。时间依赖的ROC曲线分析显示，MRS对患者术后0.5月～96月内的复发，以及12月～96月的患者生存的预测效果，其AUC值均在BCLC分期和TNM分期之上，表明MRS分组对肝癌患者术后预后的准确性和精确度均更高(图5)。决策曲线分析法(Decision Curve Analysis，DCA)显示，MRS与目前流行的临床分期相比，对于具有广泛风险系数的临床决策都具有更强的指导意义，说明其临床实用性(图6)。以上数据表明MRS在临床肝癌预后中具有区别于现有传统分期的临床预后价值。

实施例6 利用MRS预测肝癌患者根治性切除术后复发(TTR)的列线图

以MRS作为连续变量纳入如图7A所示的预测复发(TTR)的列线图，具体计分方法为：(1)MRS作为连续变量纳入，MRS评分即为列线表中MRS所属项评分；(2)肿瘤直径小于等于4cm计0分；4－10cm计21.8分，大于10cm计40.4分；(3)无血管侵袭计0分，存在血管侵袭计49.7分；(4)无肝硬化计0分，肝硬化计33.3分。

以上各项得分相加，即得到TTR列线图总分。总分所对应的的1年复发率、2年复发率和中位复发时间如图7A所示。

实施例7 用MRS预测肝癌患者根治性切除术后总体生存(OS)的列线图

以MRS作为连续变量纳入如图7B所示的预测总体生存(OS)的列线图，具体计分方法为：1)MRS作为连续变量纳入，MRS评分即为列线表中MRS所属项评分；(2)肿瘤直径小于等于4cm计0分；4－10cm计16.0分，大于10cm计27.9分；(3)无血管侵袭计0分，存在血管侵袭计56.3分；(4)无肝硬化计0分，肝硬化计27.6分；(4)单发肿瘤计0分，多发肿瘤计21.1分；(5)Child-Pugh分级为A级计0分，分级为B级或C级计32.1分。

以上各项得分相加，即得到OS列线图总分。总分所对应的2年生存率、3年生存率和中位生存时间如图7B所示。

实施例7 利用MRS的预后的列线图对临床样本进行预测

一、实验方法

利用实施例6的列线图对初始样本集和实施例7的列线图对内、外部验证集患者的复发(TTR)和总体生存(OS)进行预测。

二、实验结果

根据实施例6的列线图对初始样本集和实施例7的列线图对内、外部验证集患者的复发(TTR)和总体生存(OS)进行预测，将总得分将患者分为三组：低分组(Nomo-low，<75分)，中分组(Nomo-int，75～150分)，高分组(Nomo-high，>150分)。

Kaplan-Meier分析显示三组患者之间的复发和生存情况具有显著差异(p<0.001，图8)。Log-rank分析显示相对于低分组，高分组患者的复发风险(HR：初始样本集，7.5；内部验证集，4.64；外部验证集，6.21)和死亡风险(HR：初始样本集，15.10；内部验证集，9.64；外部验证集，10.78)都显著更高(p<0.001)。

结果表明不论是在初始样本集，还是内、外部验证集中，基于MRS的列线图模型均能显著区分患者复发和生存情况。

(1)区分度：接受者操作特性曲线(Receiver Operating Characteristic curve，简称ROC曲线)曲线分析显示(图9A)，预测2年复发的列线图曲线下面积(AreaUnder theCurve，简称AUC)在初始样本集为0.79(95％CI，0.73-0.84)，内部验证集为0.75(95％CI，0.68-0.80)，外部验证集为0.75(95％CI，0.69-0.80)；预测3年总体生存的列线图AUC在初始样本集为0.87(95％CI，0.83-0.90)、内部验证集为0.84(95％CI，0.79-0.88)和外部验证集为0.79(95％CI,0.74-0.84)。以上结果表明基于MRS的列线图模型具有良好的区分高、低风险患者的能力。

(2)准确性：在各样本集的2年复发率和3年生存率的校准曲线(图9B)显示基于MRS的列线图模型对患者复发或生存的预测有较高的准确性。

(3)临床实用性：此外，采用决策曲线评估模型(Decision Curve Analysis，DCA，图9C)辅助临床决策是否可改善患者结局，结果显示基于MRS的列线图模型在所有三个独立样本集中都具有显著的临床应用价值。

MRS具有更佳的预测患者术后复发(TTR)和生存(OS)的准确性和特异性。时间依赖的ROC曲线分析显示，MRS对患者术后6月～96月内的复发，以及12月～96月的患者生存的预测效果，其AUC值均在MRS、BCLC分期和TNM分期之上，表明MRS分组对肝癌患者术后预后的准确性和精确度均更高(图10)。

对比了基于MRS的列线图模型与与目前临床通用的TMN分期和肝癌巴塞罗分期(BCLC)：ROC曲线显示列线图模型预测2年复发的AUC为0.76(95％CI，0.72-0.79)，预测3年生存的AUC为0.83(95％CI，0.80-0.85)，两者均高于TMN分期和肝癌巴塞罗分期(BCLC)(图11A和图11C)。时间依赖的ROC曲线分析显示，列线图对患者术后12月～96月内的复发和总体生存的预测效果，其AUC值均在MRS、BCLC分期和TNM分期之上，表明列线图对肝癌患者术后预后的准确性和精确度均更高(图10)。而在指导临床治疗方面，决策曲线分析法(Decision Curve Analysis，DCA)显示，列线图与MRS及目前流行的临床分期相比，对于具有广泛风险系数的临床决策都具有更强的指导意义，列线图也可使患者从临床决策中获得更大收益，说明其临床实用性(图11B和图11D)。以上结果表明，基于MRS的列线图模型通过联合MRS和临床病理指标，能够更准确/便捷地预测HCC患者预后，并且提示了MRS在临床应用上具有较大的潜力。

相比起目前已提出的精准预测肝癌术后预后的标记物组合和预测模型，本列线图不需要进行基因表达芯片、基因甲基化芯片、RNA测序等高通量检测，只需要应用目前在临床上已经很成熟和得到推广的免疫组织化学染色技术，并且只需要检测2个标记，结合临床上常用的临床/病理指标，即可得到预后高特异性、高敏感性和高临床应用价值的预后指标。

Claims (10)

1.一种基于CD11b和CD169蛋白分子的用于肝癌预后预测的标志物，其特征在于，所述标志物为基于CD11b和CD169蛋白分子的细胞密度计算得到的髓系反应评分MRS，髓系反应评分MRS＝0.161×CD11b_T-0.106×CD169_T+35；其中，CD11b_T为每平方毫米肝癌癌巢区域中CD11b⁺细胞数量；CD169_T为每平方毫米肝癌癌巢区域中CD169⁺细胞数量；计算得到的MRS值小于0，使之为0；计算得到的MRS值大于100，使之为100。

2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述预后为患者手术后复发或生存，髓系反应评分MRS越高患者手术后复发概率越高，手术后生存概率越低；髓系反应评分MRS越低患者手术后复发概率越低，手术后生存概率越高。

3.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，每平方毫米肝癌癌巢区域中CD11b⁺细胞数量和每平方毫米肝癌癌巢区域中CD169⁺细胞数量通过免疫组织化学染色后统计得到。

4.权利要求1所述的标志物在制备肝癌预后预测试剂盒的应用。

5.权利要求1所述的标志物在制备肝癌患者分组试剂盒的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，0≤髓系反应评分MRS≤37.9，低复发风险和/或死亡风险可能；37.9<髓系反应评分MRS≤60.6中等复发风险和/或死亡风险可能；60.6<髓系反应评分MRS≤100，高复发风险和/或死亡风险可能。

7.权利要求1所述的标志物在制备患者复发后进行索拉非尼治疗的疗效试剂盒的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，0≤髓系反应评分MRS≤37.9，对索拉非尼治疗响应最好；37.9<髓系反应评分MRS≤60.6，对索拉非尼治疗响应中等；60.6<髓系反应评分MRS≤100，对索拉非尼治疗响应最差。

9.权利要求1所述的标志物在制备患者复发后介入治疗效果的试剂盒的应用。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，0≤髓系反应评分MRS≤37.9，患者复发后介入治疗效果最好；37.9<髓系反应评分MRS≤60.6，患者复发后介入治疗效果中等；60.6<髓系反应评分MRS≤100，患者复发后介入治疗效果最差。

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