KR20100091212A

KR20100091212A - 암 마커로서의 세프라아제

Info

Publication number: KR20100091212A
Application number: KR1020107012678A
Authority: KR
Inventors: 볼프강 롤링거; 요한 칼; 자레마 피터 코찬; 마르쿠스 뢰쓸러; 미하엘 타케
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2007-12-10
Filing date: 2008-12-08
Publication date: 2010-08-18
Also published as: ES2372442T3; EP2223115A1; AU2008335855B2; WO2009074275A1; CN101896818A; DK2223115T3; BRPI0820793A2; CN101896818B; JP2011506941A; PL2223115T3; CA2706115A1; MX2010004671A; AU2008335855A1; US8980573B2; JP5563988B2; ATE524740T1; US20100240081A1; EP2223115B1; HK1150884A1; KR101202220B1

Abstract

본 발명은 암 평가 보조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 상이한 암 유형의 보편적인 마커로서의 인간 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP/세프라아제) 의 용도를 기재하고 있다. 세프라아제는 폐 또는 폐암 (LC) 또는 결장암, 예를 들어 비소세포 폐 암종 (NSCLC) 또는 결장직장암 (CRC), 그러나 또한 기타 특이적 유형의 암일 수 있는 암의 평가를 보조한다. 이러한 특이적 암 유형은 예를 들어, 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 방광암, 자궁내막암 또는 전립선암이다. 게다가, 본 발명은 특히 개인으로부터 유래되는 액체 샘플에서 세프라아제를 측정함으로써 액체 샘플로부터 암을 평가하는 방법에 관한 것이다. 세프라아제의 측정은 예를 들어, 암의 초기 검출 또는 수술을 받은 환자의 감시에 사용될 수 있다.

Description

암 마커로서의 세프라아제 {SEPRASE AS A MARKER FOR CANCER}

암은 검출 및 치료법의 발전에도 불구하고 주요한 공중 보건 과제로 남아있다. 암 세포는 암-관련 마커 단백질의 생성을 특징으로 한다. 암-관련 단백질은 암 세포를 가지고 있는 개인의 조직 및 체액 모두에서 발견된다. 이들의 수치는 발암 진행 초기 병기에서는 통상적으로 낮고 질환 전개 동안 증가하며, 오직 드문 경우에만 질환 전개 과정 중 단백질이 감소된 수치를 보이는 것으로 관찰된다. 이러한 단백질을 민감하게 검출하는 것이 유리하며, 암 진단, 특히 초기 병기의 암 진단에 유망한 접근법이다. 가장 일반적인 암 유형은 유방암 (BC), 폐암 (LC) 및 결장직장암 (CRC) 이다.

고형 종양에 대한 가장 중요한 치료적 접근법은 다음과 같다:

a) 종양의 수술적 절제,

b) 화학요법,

c) 항-종양 항체 또는 항-혈관신생 항체와 같은 생물학적 제제로의 치료 및

d) 상기 방법의 조합.

종양의 수술적 절제는 초기 병기의 고형 종양에 대한 일차 항암 치료로서 널리 용인된다. 그러나 대부분의 암은, 오직 증상이 보이는 경우, 즉 환자가 이미 질환 진행이 다소 후기 병기로 접어든 경우에만 검출된다.

암의 병기화는 범위, 진행도 및 심각도 측면에서의 질환의 분류이다. 이는 치료법의 예후 및 선택에 있어서 일반화를 적용할 수 있도록 암 환자를 그룹화한다.

CRC 의 상이한 병기는 듀크 병기 (Dukes' stages) A 내지 D 에 따라 분류되어 사용되었다. 오늘날, TNM 시스템이 가장 널리 사용되는 암의 해부학적 범위 분류이다. 이것은 국제적으로 허용되는 단일 병기화 시스템을 나타낸다. T (일차 종양의 범위), N (국부 림프절의 상태) 및 M (원발 전이의 존재 또는 부재) 의 3 가지의 기본적인 변수가 있다. TNM 범주는 UICC (International Union Against Cancer), Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (eds): TNM Classification of Malignant Tumours, sixth edition, 2002) 에 의해 공개되었다. 일단 TNM 상태가 측정되면, 환자는 I 내지 IV (IV 가 가장 진행된 질환 병기임) 범위의 로마 숫자로 표시된 질환 병기로 그룹화된다. TNM 병기화 및 UICC 질환 병기는 앞서 [Sobin L.H. 및 Wittekind (eds.)] 에서 채택된 하기 표에 제시되는 바와 같이 서로에게 해당한다.

특히 중요한 것은, 예를 들어 CRC 의 초기 진단 암이 훨씬 양호한 예후로 해석된다는 것이다. CRC 에서 결장직장의 악성 종양은 양성 종양, 즉, 선종으로부터 발생된다. 그러므로, 선종 병기로 진단을 받은 환자들이 최상의 예후를 나타낸다. 병기 T_is, N0, M0 또는 T1-3; N0; M0 정도로 초기인 것으로 진단된 환자는 적합하게 치료를 받는 경우, 이미 원발 전이가 존재하는 것으로 진단된 환자의 경우 5 년 생존률이 오직 10% 인 것과 비교하면, 진단 후 5 년 생존 기회가 90% 를 넘는다.

x 선 또는 핵 공명 영상과 같은 영상법을 비롯한 현행의 검출법은 이론상 일반적인 스크리닝 도구로서 사용하기에는 적어도 부분적으로는 적합할 수 있을 것이다. 그러나, 이들은 매우 비싸고 일반적으로 건강 보험 시스템이 감당할 수 없고, 다수의 대상, 특히 임의의 종양 증상이 없는 대상의 대량 스크리닝에서 널리 사용된다.

그러므로, 본 발명의 목적은 간단하고 비용-효율적인 종양 평가 절차를 제공하는 것, 예를 들어, 암을 가진 것으로 의심되는 개인을 확인하는 것이다. 이러한 목적을 위해, 체액, 예를 들어 혈액 또는 혈청 또는 혈장 또는 이러한 마커 패널에서 검출가능한 일반적인 종양 마커가 바람직할 것이다.

다수의 혈청 종양 마커가 이미 임상적으로 사용되고 있다. 예를 들어, 사이토세라틴 19 (CYFRA 21-1) 의 가용성 3O kDa 조각, 암배아발생 항원 (CEA), 뉴런-특이적 에놀라아제 (NSE), 및 평편 세포 암종 항원 (SCC) 이 가장 두드러진 LC 마커이다. 그러나, 이 중 어느 것도 스크리닝 도구에 필요한 민감도 및 특이도에 대한 기준을 충족시키지 못한다 (Thomas, L., Labor und Diagnose (2000) TH Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt/Main, Germany).

임상적 유용성을 위해, 단일 마커로서의 새로운 진단 마커는 당업계에 공지된 기타 마커와 필적할만 하거나, 더욱 양호해야만 한다. 또는, 새로운 마커는 단독으로 또는 하나 이상의 기타 마커와 조합으로 사용되는 경우 각각, 진단 민감도 및/또는 특이도에서 진척을 보여야만 한다. 시험의 진단 민감도 및/또는 특이도는 수용자-반응 특성에 의해 최상으로 평가되며, 이것은 하기에 상세히 기재될 것이다.

전 혈액, 혈청 또는 혈장은 임상 관례에서 가장 널리 사용되는 샘플 공급원이다. 신뢰성 있는 암 검출을 보조하거나 초기 예후 정보를 제공할 수 있을 것인 초기 종양 마커의 확인은 상기 질환의 진단 및 관리를 크게 도울 수 있는 방법을 도출할 것이다. 그러므로, 암, 특히 LC 의 시험관 내 평가를 개선하기 위한 시급한 임상적 필요성이 존재한다. 환자에게는 초기에 진단을 받는 것이 진행된 질환 병기로 진단된 환자보다 생존 기회가 훨씬 높아지므로 암, 예를 들어, LC 의 초기 진단을 개선하는 것이 특히 중요하다.

폐암에 있어서의 생화학적 마커의 임상적 유용성은 최근에 검토되었다 (Duffy, M.J., Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225-262).

CYFRA 21-1 은 폐암에 대한 현재 알려진 종양 마커 중 최상의 것으로 현재 간주되고 있다. 비록 기관에 특이적인 것은 아니지만, 이것은 폐 조직에서 두드러지게 발견된다. 폐암에 대한 CYFRA 21-1 의 민감도는, 기타 양성 폐 질환에 대해 95% 의 특이도에서, 46 내지 61% 인 것으로 기재된다. CYFRA 21-1 의 증가된 혈청 수치는 또한 확연한 양성 간 질환, 신부전 및 침습성 방광암과 관련이 있다. CYFRA 21-1 시험은 수술후 치료법 감시에 추천된다.

CEA 는, 통상적으로 배발생 동안 생성되는 암배아 (carcinofetal) 항원 그룹에 속한다. CEA 는 기관에 특이적인 것이 아니며, 결장직장암의 모니터링에 주로 사용된다. 악성 외에도, 또한 간경화, 기관지염, 췌장염 및 자가면역 질환과 같은 여러 양성 질환이, 증가된 CEA 혈청 수치와 관련이 있다. 양성 폐 질환에 대해 95% 특이도에서, 폐암에 대한 이의 민감도는 29 내지 44% 인 것으로 보고되어 있다. CEA 의 바람직한 용도는 폐암의 치료법 감시이다.

NSE 는 SCLC 에 대한 종양 마커이다. 일반적으로, 증가된 NSE 혈청 수치는 신경외배엽 및 신경내분비 종양과 관련되어 발견된다. 증가된 혈청 수치는 또한 양성 폐 질환 및 뇌 질환, 예컨대 수막염 또는 뇌의 기타 염증성 질환 환자, 및 둔부에 외상 손상을 입은 환자에서 발견된다. 95% 특이도에서 SCLC 에 대한 민감도가 60 내지 87% 인 것으로 보고된 반면, NSCLC 에 대한 NSE 시험 성능은 열악하다 (7 내지 25% 의 민감도). NSE 는 SCLC 의 치료법 감시에 추천된다.

마커 프로파일 및 폐암 진단 개선을 목표로 하는 것과 관련하여, 일반적인 염증 마커인 CYFRA 21-1, NSE 및 C-반응성 단백질 (CRP) 의 혈청 수치를 조합하기 위해 퍼지 논리에 근거하는 분류 알고리즘을 사용하는 방법이 공개되었다 (Schneider, J., et al., Int. J. Clin. Oncol. 7 (2002) 145-151). 저자는 95% 의 특이도에서 92% 의 민감도를 보고하였다. 그러나 이 연구에서, 예를 들어, 단일 종양 마커로서 CYFRA 21-1 의 민감도는 95% 의 특이도에서 72% 인 것으로 보고되었고, 이것은 많은 다른 보고된 연구에서보다 유의하게 높은 것이다. [Duffy, M.J., in Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225-262] 에는 46% 내지 61% 의 민감도가 보고되어 있다. Schneider 등에 의해 달성된 이러한 드문 높은 성능은 일부 의혹을 불러일으켰고, 여러 사실로 인한 것일 수 있다. 첫째로, 대조군 환자 집단이 환자 집단보다 젊은 것 같고, 즉, 그룹의 나이가 잘 부합하지 않았고, 환자 집단은 많은 후기 병기를 포함하였다. 둘째로, 그리고 심지어 더욱 중요한 알고리즘 성능을 퍼지 논리 자격자의 결정에 사용되었던 트레이닝 세트의 샘플에서 확인하였다. 그러므로, 상기 자격자는 엄격하게 말하면 상기 세트를 위해 "맞춰진" 것이고, 독립적인 평가 세트에 적용되는 것이 아니다. 정상 환경 하에서, 좀더 크고, 독립적이고, 잘 균형잡혀진 평가 세트에 적용되는 동일한 알고리즘은 유의하게 감소된 전체 성능을 야기할 것이라고 예상되어야 한다.

생화학적 마커가 암 질환 평가에 사용될 수 있는 가를 확인할 수 있는 지의 여부를 연구하는 것이 본 발명의 과제였다. 특히, 본 발명의 발명자들은 생화학적 마커가 체액 내에서 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암 및 신장암과 같은 상이한 암 유형의 평가를 위해 확인될 수 있는 지의 여부를 연구하였다. 본 발명의 매우 바람직한 양상에서는, 폐암 (LC) 또는 결장직장암 (CRC) 의 평가를 위한 생화학적 마커의 식별을 연구하였다.

놀랍게도, 마커 세프라아제를 사용함으로써, 당업계에 현재 공지된 마커의 문제 중 일부를 적어도 부분적으로 극복할 수 있다는 것이 발견되었다.

본 발명은, 샘플 중에서 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각의 농도 및/또는 활성을 측정하고, 측정 결과, 특히 측정된 농도 및/또는 활성을 암 평가에 사용하는 것을 포함하는 시험관 내 암 평가 방법에 관한 것이다.

놀랍게도, 시험 샘플 중의 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각의 감소된 농도 및/또는 활성이 암의 위험 및/또는 발생과 관련된다는 것이 발견되었다. 세프라아제가 단일 유형의 암에 대해 특이적인 마커인 것이 아니라, 상이한 유형의 암에 대한 마커, 즉, 일반적인 종양 마커라는 것이 추가로 발견되었다. 세프라아제가 발암 과정에 대해 다소 특이적인 것으로 나타났기 때문에, 새로운 종양 마커 세프라아제는 다양한 계열의 종양 유형에 임상적 유용성이 있는 큰 잠재력을 갖는다.

본 발명의 방법은 많은 상이한 유형의 암 평가에 적합하다. 정상 대조군과 비교하여 샘플 중의 세프라아제 또는 이의 조각의 감소된 농도 및/또는 활성은 예를 들어 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 방광암, 자궁내막암 및 전립선암과 같은 특이적 암 유형 각각에서 발견되었다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암 또는 유방암과 같은 특이적 암 유형을 시험관 내에서 평가하기 위해, 세프라아제의 농도 및/또는 활성을 샘플 중에서 측정한다.

본 발명의 또다른 바람직한 구현예에 따르면, 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암 또는 신장암과 같은 암을 시험관 내에서 평가하기 위해, 세프라아제의 농도 및/또는 활성을 샘플 중에서 측정한다.

본 발명의 또다른 바람직한 구현예에 따르면, 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암 또는 담관암과 같은 암을 시험관 내에서 평가하기 위해, 세프라아제의 농도 및/또는 활성을 샘플 중에서 측정한다.

본 발명의 또다른 바람직한 구현예에 따르면, 폐암 (LC) 또는 결장직장암 (CRC) 과 같은 암을 시험관 내에서 평가하기 위해, 세프라아제의 농도 및/또는 활성을 샘플 중에서 측정한다.

본 발명의 또다른 바람직한 구현예에 따르면, 폐암 (LC) 과 같은 암을 시험관 내에서 평가하기 위해, 세프라아제의 농도 및/또는 활성을 샘플 중에서 측정한다.

본 발명의 하나의 구현예는, 아마도 암이 없을 것인 개인과 "의심" 군으로 분류될 수 있는 개인을 구별하기 위한 집단의 대량 스크리닝에 관한 것이다. 그 후 의심 군 개인에는 예를 들어, 영상법 또는 기타 적합한 수단에 의해 추가의 진단 절차를 적용할 수 있다.

본 발명의 추가의 구현예는 일반적 암의 진단에 적합한 종양 마커 패널 또는 특이적 종양 유형, 예를 들어, 폐암 또는 결장암의 진단에 적합한 종양 마커 패널의 개선에 관한 것이다.

본 발명은 또한 샘플 중에서 세프라아제 및 암에 특이적인 하나 이상의 기타 마커의 농도 및/또는 활성을 측정하고, 측정 결과, 특히 측정된 농도를 암 평가에 사용하는 것을 포함하는, 생화학적 마커에 의한 시험관 내 암 평가 방법에 관한 것이다. 세프라아제와 조합으로 사용하기 위한 바람직한 마커는, 한편으로는 일반적 종양 마커 (즉, 단일 종양 유형에 특이적이지 않은 마커) 또는, 다른 한편으로는, 특이적 종양 마커 (단일 종양 유형에 특이적인 마커) 인 마커이다. 예를 들어 폐암 또는 결장암과 같은 암 평가에 바람직한 마커는 Cyfra 21-1, CEA, NSE, CA19-9, CA125, PSA, ASC, S100A12 및 NNMT 이다. 이러한 마커는 각각 개별적으로 또는 세프라아제와 함께 임의의 조합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 방법에 따라 암이 평가되는 경우, 각각의 암에 대한 하나 이상의 기타 마커는 바람직하게는 Cyfra 21-1, CEA, NSE, CA19-9, CA125, PSA, ASC, S100A12 및 NNMT 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

그러므로, 본 발명은 바람직한 구현예에서, 또한 예를 들어 폐암 및/또는 결장암과 같은 암의 평가에서의, 마커 세프라아제 및, 예를 들어, Cyfra 21-1, CEA, NSE, CA19-9, CA125, PSA, ASC, S100A12 및 NNMT 와 같은 하나 이상의 기타 종양 마커를 포함하는 마커 패널의 용도에 관한 것이다.

바람직하게는 본 발명은, 샘플 중에서 세프라아제 및/또는 이의 조각 및 암에 대한 하나 이상의 기타 마커, 예를 들어, 폐암 또는 결장암의 하나 이상의 기타 마커의 농도 및/또는 활성을 측정하고, 측정 결과, 특히 측정된 농도를 암 평가에 사용하는 것을 포함하는, 생화학적 마커에 의한 시험관 내에서의 폐암 또는 결장암과 같은 암 평가 방법에 관한 것이다. 하나 이상의 기타 마커가 Cyfra 21-1, CEA, NSE, CA19-9, CA125, PSA, ASC, S100A12 및 NNMT 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 바람직한 구현예에서, 암, 특히 LC 또는 결장암, 더욱 특히 NSCLC 또는 결장직장암의 평가에서의 적어도 세프라아제 및 CYFRA 21-1 을 포함하는 마커 패널의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 암, 특히 LC 또는 결장암, 더욱 특히 NSCLC 또는 결장직장암의 평가에서의 적어도 세프라아제 및 CEA 를 포함하는 마커 패널의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 암, 특히 LC 또는 결장암, 더욱 특히 NSCLC 또는 결장직장암의 평가에서의 적어도 세프라아제 및 SCC 를 포함하는 마커 패널의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세프라아제 및/또는 이의 조각의 감소된 농도 및/또는 활성이 암에 대한 지표인, 암 평가에서의 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 여러 특이적 유형의 암, 특히 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 방광암, 자궁내막암 또는 전립선암의 평가에서의 세프라아제의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세프라아제 및/또는 이의 조각의 감소된 농도 및/또는 활성이 암에 대한 지표인, 암 평가에서의 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각에 대한 항체의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세프라아제 및/또는 이의 조각의 감소된 농도 및/또는 활성이 암에 대한 지표인, 암 평가에서의 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각의 효소 활성 측정 시약의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각 및 암에 대한 하나 이상의 기타 마커를 특이적으로 측정하는데 필요한 시약을 적어도 포함하는, 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 기타 마커가 각각 개별적으로 또는 이의 임의의 조합으로 사용될 수 있는, 세프라아제 및, 하나 이상의 암 마커, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 방광암, 자궁내막암 또는 전립선암의 마커를 특이적으로 측정하는데 필요한 시약을 적어도 포함하는, 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 적어도 세프라아제 및 CYFRA 21-1 각각을 특이적으로 측정하는데 필요한 시약, 및 임의로 측정을 수행하기 위한 보조 시약을 포함하는, 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 적어도 세프라아제 및 CEA 각각을 특이적으로 측정하는데 필요한 시약, 및 임의로 측정을 수행하기 위한 보조 시약을 포함하는, 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 적어도 세프라아제 및 SCC 각각을 특이적으로 측정하는데 필요한 시약, 및 임의로 측정을 수행하기 위한 보조 시약을 포함하는, 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다.

바람직한 구현예에서 본 발명은 샘플 중에서 (a) 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각, (b) 임의로 암에 대한 하나 이상의 기타 마커의 농도 및/또는 활성을 측정하고, (c) 상기 단계 (a) 및 임의로 단계 (b) 의 측정 결과를 암 평가에 사용하는 것을 포함하며, 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각의 감소된 농도 및/또는 활성이 암에 대한 지표인, 시험관 내 암 평가 방법에 관한 것이다.

"측정" 이라는 용어는 바람직하게는 샘플 중에서 세프라아제 폴리펩티드의 정성적, 반-정량적 또는 정량적 측정을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 측정은 반-정량적 측정이며, 즉, 이것은 세프라아제의 농도 및/또는 활성이 절사값 (cut-off value) 초과 또는 미만인지의 여부를 결정하는 것이다. 당업자가 인지하듯이 예스- (존재) 또는 노- (부재) 어세이에서, 어세이 민감도는 통상적으로 절사값에 부합하도록 설정된다. 절사값은 예를 들어 건강한 개인 그룹의 시험으로부터 측정될 수 있다. 바람직하게는 절사값은 90% 의 특이도를 산출하도록 설정되고, 또한 바람직한 절사값은 95% 의 특이도를 산출하도록 설정되고, 또는 또한 바람직한 절사값은 98% 의 특이도를 산출하도록 설정된다. 절사값 미만의 값은 예를 들어, 암의 존재에 대한 지표가 될 수 있다. 특히 절사값 미만의 값은 예를 들어, 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 방광암, 자궁내막암 또는 전립선암의 존재에 대한 지표가 될 수 있다. 추가의 바람직한 구현예에서, 세프라아제의 측정은 정량적 측정이다. 추가의 구현예에서, 세프라아제의 농도 및/또는 활성은 예를 들어, 질환 병기, 질환 진행 또는 치료법에 대한 반응과 같은 기본적인 진단 질문과 상관관계가 있다.

인간 세프라아제 (섬유모세포 활성화 단백질 (FAP) 로 불림) 는 젤라티나아제 및 디펩티딜 펩티다아제 활성을 갖는 170 kDa 의 막-결합 당단백질이다. 이것은 SEQ ID NO:1 에 제시된 서열 (도 3) 을 특징으로 하는 2 개의 동일한 단량체 단위로 이루어진다 (Uni Prot KB 데이터베이스 접근 번호 P 27487). 세프라아제 단량체는 766 개의 아미노산을 포함하고 겉보기 분자량이 97 kDa 이다 (SDS-PAGE) (Pineiro-Sanchez et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 7595-7601; Park et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 36505-36512). 세프라아제의 가용성 형태는 안티플라스민-분할 효소 APCE 이다 (Lee et al., Blood 103 (2004) 3783-3788; Lee et al., Blood 107 (2006) 1397-1404). APCE 의 N-말단 아미노산 서열은 섬유모세포 세포질 내의 첫번째 6 N-말단 잔기를 갖는 것으로 예상되는 세프라아제의 잔기 24-38 에 해당하고, 이후 20-잔기 막통과 도메인, 그 다음 734 잔기 세포외부 C-말단 촉매 도메인이 있다 (Goldstein et al., Biochim. Biophys. Acta. 1361 (1997) 11-19; Scanlan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5657-5661).

Pineiro-Sanchez 등 (supra) 은 증가된 세프라아제 발현이 인간 흑색종 및 암종 세포의 침습성 표현형과 관련이 있다는 것을 발견하였다. [Henry et al., Clin. Cancer Res. 13 (2007) 1736-1741] 에는 스트로마 세프라아제의 수치가 높은 인간 결장 종양 환자가 공격적인 질환 진행 및 전이 또는 재발의 잠재적인 발달을 더욱 보일 것으로 기재하고 있다.

그러므로, 당업계의 상기 문헌 중 어느 것도 체액 내에서의 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각의 감소된 농도 및/또는 활성이 암의 지표일 것이라는 제안은 하지 않았다.

놀랍게도, 본 발명에서는 체액 내에서의 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각, 특히 APCE 의 농도 및/또는 활성, 예를 들어 효소 활성의 측정이 암, 예를 들어, 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 방광암, 자궁내막암 또는 전립선암의 평가를 가능하게 한다는 것이 발견되었다. 더욱 더 놀랍게도, 정상 대조군과 비교하여 샘플 내에서의 세프라아제 또는 이의 조각의 감소된 농도 및/또는 활성이 암의 위험 또는 발생에 대한 지표라는 것이 발견되었다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 하기 용어 각각은 본 섹션과 관련되는 의미를 갖는다.

단수형은 물품의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과 (즉, 하나 이상) 를 말하는 것으로 본원에서 사용된다. 예를 들어, "마커" 는 하나의 마커 또는 하나 초과의 마커를 의미한다. "적어도" 라는 용어는 임의로 하나 이상의 추가의 대상이 존재할 수 있다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, 적어도 (마커) 세프라아제 및 CYFRA 21-1 을 포함하는 마커 패널은 임의로 하나 이상의 다른 마커를 포함할 수 있다.

"하나 이상" 이라는 표현은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 20 또한 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 또는 15 를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "마커" 또는 "생화학적 마커" 라는 용어는 환자의 시험 샘플을 분석하기 위한 표적으로서 사용되는 분자를 말한다. 이러한 분자 표적의 예는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 본 발명에서 마커로서 사용되는 단백질 또는 폴리펩티드는 상기 단백질의 자연 발생적 변이체 뿐만 아니라 상기 단백질 또는 상기 변이체의 조각, 특히, 면역학적으로 검출가능한 조각을 포함하는 것으로 간주된다. 면역학적으로 검출가능한 조각은 바람직하게는 상기 마커 폴리펩티드의 적어도 6, 7, 8, 10, 12, 15 또는 20 개의 연속 아미노산을 포함한다. 당업자는 세포에 의해 분비되는 단백질 또는 세포외부 매트릭스에 존재하는 단백질이, 예를 들어 염증 동안 손상될 수 있고, 이러한 조각으로 분해 또는 분할될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 특정 마커는 비활성 형태로 합성되고, 그 후에 이것은 단백질분해에 의해 활성화될 수 있다. 당업자가 인지하듯이, 단백질 또는 이의 조각은 또한 복합체의 부분으로서 존재할 수 있다. 이러한 복합체는 또한 본 발명의 견지에서 마커로서 사용될 수 있다. 마커 폴리펩티드의 변이체는 동일한 유전자에 의해 코딩되나, 예를 들어, 대안적인 mRNA 또는 예비-mRNA 프로세싱의 결과로서, 등전위점 (=PI) 또는 분자량 (=MW), 또는 상기 모두가 상이할 수 있다. 변이체의 아미노산 서열은 상응하는 마커 서열과 95% 이상 일치한다. 게다가, 또는 대안적으로 마커 폴리펩티드 또는 이의 변이체는 번역후 개질이 이뤄질 수 있다. 번역후 개질에 대한 비-제한적인 예는 글리코실화, 아실화, 및/또는 인산화이다.

세프라아제 :

본 발명에 따르면, "세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각" 이라는 용어는 단량체성 또는 다량체성, 특히 이량체성 폴리펩티드를 말한다. 또한, "세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각" 이라는 용어는 특히, 세프라아제 및/또는 이의 조각의 가용성 형태, 특히 안티플라스민-분할 효소 (APCE) 뿐 아니라 또다른 폴리펩티드와 복합체의 형태로 존재하는 세프라아제 및/또는 세프라아제 조각을 말한다.

세프라아제 폴리펩티드, 특히 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각의 가용성 형태는, 바람직하게는 적합한 샘플, 특히 체액에서 검출된다. 바람직한 샘플은 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 가래, 소변, 대변 등이다. 바람직하게는, 샘플은 인간 대상, 예를 들어 종양 환자 또는 종양의 위험이 있는 사람 또는 종양을 가진 것으로 의심되는 사람으로부터 유래된다.

본 발명에 따르면, 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각의 농도 및/또는 활성이 측정된다. 하나의 구현예에서, 마커 세프라아제는 특이적 결합제를 사용하여 샘플로부터 특이적으로 측정된다.

특이적 결합제는, 예를 들어 세프라아제에 대한 수용체, 세프라아제에 결합하는 렉틴 또는 세프라아제에 대한 항체이다. 특이적 결합제는 상응하는 표적 분자에 대해 10⁷ ℓ/몰 이상의 친화성을 갖는다. 특이적 결합제는 그의 표적 분자에 대해 바람직하게는 10⁸ ℓ/몰의 친화성 또는 또한 바람직하게는 10⁹ ℓ/몰의 친화성을 갖는다. 당업자가 인지하듯이 "특이적" 이라는 용어는 샘플 중에 존재하는 다른 생분자가 세프라아제에 특이적인 결합제에 유의하게 결합하지 않는 것을 나타내기 위해 사용된다. 바람직하게는, 표적 분자 이외의 생분자에 결합하는 수치는 표적 분자에 대한 친화성의, 각각 최대 오직 10% 이하, 오직 5% 이하, 오직 2% 이하 또는 오직 1% 이하인 결합 친화성을 야기한다. 바람직한 특이적 결합제는 친화성 뿐 아니라 특이도에 대한 상기 최소 기준 모두를 충족시킬 것이다.

특이적 결합제는 바람직하게는 세프라아제와 반응성인 항체이다. "항체" 라는 용어는 폴리클론 항체, 모노클론 항체, 이러한 항체의 항원 결합 조각, 단일 사슬 항체 뿐 아니라, 항체의 결합 도메인을 포함하는 유전적 구축물을 말한다.

특이적 결합제의 상기 기준을 보유하는 임의의 항체 조각이 사용될 수 있다. 항체는 예를 들어, [Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays, 11, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 책 전체, 특히 페이지 43-78] 에 기재되는 바와 같이 당업계의 절차에 의해 생성된다. 또한, 당업자는 항체의 특이적 단리에 사용될 수 있는 면역흡착제에 근거한 방법을 잘 인지하고 있다. 상기 수단에 의해, 폴리클론 항체의 품질, 및 그러므로 면역어세이에서의 이들의 성능이 향상될 수 있다 (Tijssen, P., supra, 페이지 108-115).

본 발명에 기재된 바와 같은 달성을 위해, 토끼에서 생성된 폴리클론 항체가 사용될 수 있다. 그러나, 명백하게는 또한 상이한 종, 예를 들어 래트 또는 기니아 피그로부터의 폴리클론 항체 뿐 아니라, 모노클론 항체가 또한 사용될 수 있다. 모노클론 항체는 일정한 특성을 가지고 필요한 임의의 양으로 생성될 수 있으므로, 이들은 임상 관례에 대한 어세이의 개발에서의 이상적인 도구를 나타낸다. 본 발명에 따른 방법에서 세프라아제에 대한 모노클론 항체의 생성 및 용도는 각각, 또 다른 바람직한 구현예를 나타낸다. 세프라아제의 검출에 적합한 항체의 바람직한 예는 [Pineiro-Sanchez et al., supra] 에 기재되어 있다 (예를 들어, 항체 D8, D28 및 D43).

당업자가 인지하듯이, 이제 세프라아제가 암, 바람직하게는 폐암 또는 결장암의 평가에 유용한 마커로서 확인되었다. 다양한 면역진단 절차는 본 발명의 성취와 필적할만한 결과에 도달하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체를 생성하기 위해 대안적인 전략이 사용될 수 있다. 그 중에서도 이러한 전략은 면역화를 위해 세프라아제의 에피토프를 나타내는 합성 펩티드를 사용하는 것을 포함한다. 대안적으로는, DNA 백신화로서 알려진 DNA 면역화가 또한 사용될 수 있다.

측정을 위해, 개인으로부터 수득된 샘플을 결합제 세프라아제 복합체 형성에 적합한 조건하에서 세프라아제에 대한 특이적인 결합제와 인큐베이션한다. 이러한 조건은 임의의 진보성 없이 당업자가 이러한 적합한 인큐베이션 조건을 쉽게 확인할 수 있으므로, 상술할 필요는 없다. 결합제 세프라아제 복합체의 양은 측정되고, 암, 바람직하게는 폐암의 평가에 사용된다. 당업자가 인식하듯이 관련 교과서 (참조, 예를 들어, Tijssen, P., supra, or Diamandis, E.P., and Christopoulos, T.K. (eds.), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996)) 에 모두 상세히 기재되어 있는 특이적 결합제 세프라아제 복합체의 양을 측정하기 위한 수많은 방법이 있다.

바람직하게는, 세프라아제는 샌드위치-유형 어세이 포맷으로 검출된다. 이러한 어세이에서, 제 1 특이적 결합제는 한쪽 면 상에서의 세프라아제를 포획하는데 사용되고, 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능하게 표지된 제 2 특이적 결합제는 다른 면 상에 사용된다. 샌드위치-유형 어세이 포맷에 사용되는 특이적 결합제는 세프라아제에 대해 특이적인 항체일 수 있다. 한편으로는, 검출은 상이한 포획 및 표지된 항체, 즉, 세프라아제 폴리펩티드 상의 상이한 에피토프를 인지하는 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 다른 한편으로는, 샌드위치-유형 어세이는 또한 세프라아제의 동일한 에피토프에 대한 포획 및 표지 항체로 수행될 수 있다. 본 구현예에서, 세프라아제의 오직 이량체- 및 다량체 형태만이 검출될 수 있다.

본 발명의 추가의 구현예에 따르면, 마커 세프라아제는 세프라아제의 효소 활성 검출에 적합한 시험 섭생을 사용함으로써 샘플로부터 특이적으로 측정된다. 효소 활성은 예를 들어 젤라티나아제 활성 또는 펩티다아제 활성일 수 있다. 젤라티나아제 활성은 예를 들어, 젤라틴 효소도를 사용하는 자이모그래피에 의해 측정될 수 있다. 펩티다아제 활성은 예를 들어, 펩티드 기질을 사용하는 형광 어세이에 의해 측정될 수 있다. 세프라아제 활성의 측정을 위한 어세이는 예를 들어, [Lee et al. (2006), supra] 에 기재되어 있다.

본 발명의 문맥에서의 "암의 마커" 및 특히 "폐암의 마커" 및 "결장암의 마커" 는 마커 세프라아제와 조합되는 경우 암의 평가, 예를 들어, 일반적인 암의 평가 또는 특정 암 유형의 평가, 예를 들어 LC 또는 CRC 의 평가에 관련 정보를 부가하는 임의의 마커이다. 이러한 정보는 관련이 있는 것으로 고려되거나 제공된 특이도에서의 민감도의 경우, 또는 제공된 민감도에서의 특이도의 경우, 각각, 암의 평가를 위한 부가적인 값은 이미 마커 세프라아제를 포함하는 마커 조합에 상기 마커를 포함시킴으로써 향상될 수 있다. 암 평가의 바람직한 구현예에서, 민감도 또는 특이도, 각각에 있어서의 개선은, p = .05, .02, .01 또는 그 이하의 유의성 수준에서 통계적으로 유의하다. 바람직하게는, 하나 이상의 기타 종양 마커는 CYFRA 21-1, CEA, NSE, CA 19-9, CA 125, PSA, ASC, S100A12 및 NNMT 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "샘플" 이라는 용어는 시험관 내 평가를 목적으로 수득되는 생물학적 샘플을 말한다. 본 발명의 방법에서, 샘플 또는 환자 샘플은 바람직하게는 임의의 체액을 포함할 수 있다. 바람직한 샘플은 전 혈액, 혈청, 혈장, 기관지 세척액 또는 가래이고, 혈장 또는 혈청이 가장 바람직하다.

"암 평가" 및 특히 "폐암 평가" 또는 "결장암 평가" 라는 용어는 본 발명에 따른 방법이 (단독 또는 다른 마커 또는 변수, 예를 들어, UICC (상기 참조) 에 의해 언급된 기준과 함께) 예를 들어, 의사가 암, 특히 LC 또는 CRC 의 부재 또는 존재를 확고히 하거나 확인하도록 보조하거나 또는 의사가 예후, 재발 검출 (수술 후 환자의 팔로우-업 (follow-up)) 및/또는 치료, 특히 화학요법의 모니터링을 보조할 것을 나타내는데 사용된다.

당업자가 인지하듯이, 임의의 이러한 평가는 시험관 내에서 이루어진다. 이후 환자 샘플은 폐기된다. 환자 샘플은 본 발명의 시험관 내 진단 방법에서 단독으로 사용되고, 환자 샘플 물질은 환자의 체내로 다시 옮겨지지 않는다. 전형적으로, 샘플은 액체 샘플, 예를 들어, 전 혈액, 혈청 또는 혈장이다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 샘플 중에서 세프라아제의 농도를 측정하고, 측정된 농도 및/또는 활성을 암, 예를 들어, LC 또는 CRC 의 평가에 사용하는 것을 포함하는, 생화학적 마커에 의한 시험관 내 암, 예를 들어, LC 또는 CRC 의 평가 방법에 관한 것이다.

본 발명의 발명자들은 놀랍게도 암, 특히 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 방광암, 자궁내막암 또는 전립선암 환자로부터 유래되는 샘플의 유의한 % 에서 마커 세프라아제의 감소된 농도 및/또는 활성을 검출할 수 있었다. 심지어 더욱 놀라운 것은 이들은 개인으로부터 수득된 이러한 샘플에서의 세프라아제의 감소된 농도 및/또는 활성이 암, 특히 상기 언급된 암 질환의 평가에 사용될 수 있다는 것을 증명할 수 있었다.

진단을 위한 이상적인 시나리오는 단일 사건 또는 과정이 예를 들어, 감염성 질환에서와 같이 각각의 질환을 일으킬 상황일 것이다. 모든 다른 경우에서, 올바른 진단은, 특히 질환의 병인이 많은 암 유형, 예를 들어 LC 에 대한 경우에서와 같이 완전히 이해되지 않은 경우 매우 어려울 수 있다. 당업자가 인지하듯이, 제시된 다인적 질환의 경우, 예를 들어 LC 의 경우 100% 특이도 및 동시에 100% 민감도를 갖는 진단용의 생화학적 마커는 없다. 오히려, 생화학적 마커, 예를 들어, CYFRA 21-1, CEA, NSE, 또는 본원에서 제시되는 바와 같은 세프라아제는 특정한 가망성 또는 예상 값, 예를 들어, 질환의 존재, 부재 또는 심각성을 평가하는데 사용될 수 있다. 그러므로 관례적 임상 진단에서, 일반적으로 다양한 임상적 징후 및 생물학적 마커는 기본적인 질환의 진단, 치료 및 관리에 함께 고려된다.

생화학적 마커는 개별적으로 측정될 수 있거나, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 이들은 칩 또는 비이드 기반 어레이 기술을 사용하여 동시에 측정될 수 있다. 그 다음 생마커의 농도는 예를 들어, 각각의 마커에 대한 개별 절사를 사용하여 독립적으로 해석되거나, 해석을 위해 조합된다.

추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 암의 평가는 샘플 중에서 a) 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각, 및 b) 암에 대한 하나 이상의 기타 마커의 농도 및/또는 활성을 측정하고, c) 측정 결과, 예를 들어 상기 단계 (a) 및 상기 단계 (b) 에서 측정된 농도 각각을 암 평가에 사용하는 것을 포함하는 방법으로 수행된다.

암 평가에서 마커 세프라아제는 다음과 같은 양상: 스크리닝; 진단 보조; 예후; 화학요법, 방사선요법, 및 면역요법과 같은 치료법의 모니터링 중 하나 이상에서 유리할 것이다.

스크리닝:

스크리닝은 질환의 지표, 예를 들어 암의 존재에 대한 개인, 예를 들어 위험이 있는 개인을 확인하기 위한 시험의 체계적 적용으로서 정의된다. 바람직하게는 스크리닝 집단은 암의 평균 위험보다 큰 것으로 알려진 개인들로 구성된다. 예를 들어, 폐암에 대한 스크리닝 집단은 흡연자, 과거흡연자 및 우라늄-, 석영- 또는 석면-노출 작업자와 같은 폐암에 대한 위험이 평균보다 높은 것으로 알려진 개인들로 구성된다.

바람직한 구현예에서, 혈청 또는 가래와 같은 체액은, 암, 예를 들어, 폐암 또는 결장직장암에 대한 스크리닝에서 샘플로서 사용된다.

많은 질병의 경우, 순환 내 단일 생화학적 마커로는 스크리닝 목적을 위해 필요한 민감도 및 특이도 기준을 거의 충족시킬 수 없을 것이다. 이것은 또한 암, 특히 폐암의 경우에는 사실인 것으로 나타난다. 다수의 마커를 포함하는 마커 패널이 암 스크리닝에 사용되어야 할 것으로 예상된다. 본 발명에서 성립된 데이터는, 마커 세프라아제가 스크리닝 목적에 적합한 마커 패널의 필수적인 부분을 형성할 것으로 나타난다. 그러므로 본 발명은 암 마커 패널, 즉 암 스크리닝을 목적으로 세프라아제 및 하나 이상의 부가적인 마커를 포함하는 마커 패널 중 하나의 마커로서의 세프라아제의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 일반적인 암 마커 패널 중 하나의 마커로서의 세프라아제의 용도에 관한 것이다. 이러한 마커 패널은 마커 세프라아제 및 하나 이상의 부가적인 마커, 예를 들어, 일반적인 암 마커 및/또는 상기 언급된 암 유형에 대한 마커를 포함한다.

세프라아제는 또한 특정한 특이적 유형의 암, 예를 들어 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 방광암, 자궁내막암 또는 전립선암에 대한 마커 패널에 기여할 것 같다.

세프라아제를 포함하는 마커 패널로 평가되는 다른 바람직한 유형의 암은 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암 또는 신장암이다.

세프라아제를 포함하는 마커 패널로 평가되는 다른 바람직한 유형의 암은 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암 또는 담관암이다.

세프라아제를 포함하는 마커 패널로 평가되는 다른 바람직한 유형의 암은 폐암 또는 결장암이다.

세프라아제를 포함하는 마커 패널로 평가되는 바람직한 유형의 암은 폐암 (LC) 이다.

본 데이터는 추가로, 마커의 특정한 조합이 암의 스크리닝에 유리할 것임을 나타낸다. 예를 들어, LC 또는 CRC 스크리닝의 바람직한 구현예와 관련하여, 본 발명은 또한 세프라아제 및 CYFRA 21-1 을 포함하는 마커 패널, 또는 세프라아제 및 CEA 를 포함하는 마커 패널, 또는 세프라아제 및 NSE 를 포함하는 마커 패널, 또는 세프라아제 및 CA 19-9 를 포함하는 마커 패널, 또는 세프라아제 및 CA 125 를 포함하는 마커 패널, 또는 세프라아제 및 PSA 를 포함하는 마커 패널, 또는 세프라아제 및 ASC 를 포함하는 마커 패널, 또는 세프라아제 및 S100A12 를 포함하는 마커 패널, 또는 세프라아제 및 NNMT 를 포함하는 마커 패널, 또는 세프라아제 및, CYFRA 21-1, CEA, NSE, CA 19-9, CA 125, PSA, ASC, S100A12 및 NNMT 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2 개 이상의 마커를 포함하는 마커 패널의 용도에 관한 것이다.

진단 보조:

마커는 특정 기관에서의 양성 대 악성 질환의 차별되는 진단을 보조할 수 있거나, 상이한 조직학적 유형의 종양 사이를 구별하는 것, 또는 수술 전에 기준 마커 값을 성립하는 것을 도울 수 있다.

오늘날, 암 검출에 사용되는 중요한 방법은 방사선학 및/또는 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캔이다. 작은 소절, 즉, 의심 조직의 작은 영역을 상기 방법에 의해 가시화할 수 있다. 그러나, 많은 이러한 소절 (CT 로 보았을 경우 90% 초과) 이 양성 조직 변화를 나타내고, 오직 일부의 소절만이 암성 조직을 나타낸다. 마커 세프라아제를 사용하여 양성 대 악성 질환의 구별을 보조할 수 있다.

단독 마커로서의 세프라아제가 기타 마커에 비해, 예를 들어 LC 의 경우 CEA 또는 NSE 와 같은 다른 마커에 비해 우수할 수 있으므로, 세프라아제가 특히 수술 전에 기준 값을 성립함으로써 진단 보조로서 사용될 것이라고 예상되었다. 그러므로 본 발명은 또한 암의 수술 전에 기준 값을 성립하기 위한 세프라아제의 용도에 관한 것이다.

예후:

예후 지표는 특정의 가망 질환 발병을 예측하는 암 환자 및 그들의 종양의 임상적, 병적, 또는 생화학적 특징으로서 정의될 수 있다. 이들의 주요한 용도는 환자 관리를 합리적으로 계획하도록, 즉 공격적인 질환의 치료부족 (undertreatment) 및 더딘 질환의 과잉치료 (overtreatment) 를 각각 피하도록 돕는 것이다. [Molina, R., et al., Tumor Biol. 24 (2003) 209-218] 에서는 NSCLC 에서의 CEA, CA 125, CYFRA 21-1, SSC 및 NSE 의 예후 값을 평가하였다. 이들의 연구에서, 마커 NSE, CEA, 및 LDH (락테이트 디히드로게나아제) 의 비정상적인 혈청 수치는 보다 짧은 생존을 나타내는 것으로 보였다.

세프라아제는 단독으로 건강한 대조군과 암 환자, 예를 들어 LC 또는 CRC 환자를 구별하는데 유의하게 기여하므로, 이것은 암, 바람직하게는 LC 또는 CRC 을 앓는 환자의 예후 평가를 도울 것으로 기대되어 왔다. 수술전 세프라아제의 수치는 아마도 암에 대한 하나 이상의 기타 마커 및/또는 TNM 병기화 시스템과 조합될 것이다. 바람직한 구현예에서, 세프라아제는 LC 또는 CRC 환자의 예후에서 사용된다.

화학요법 모니터링 :

[Merle, P., et al., Int. J. of Biological Markers 19 (2004) 310-315] 에서는 유도 화학요법으로 치료받은 국부적 진행 NSCLC 환자에서 CYFRA 21-1 혈청 수치 변화를 평가하였다. 이들은 CYFRA 21-1 혈청 수치의 초기 모니터링이 병기 III NSCLC 환자에서의 생존 및 종양 반응에 대한 유용한 예후 도구일 수 있다고 결론을 내렸다. 또한, LC 환자의 치료 모니터링에 있어서의 CEA 의 용도를 언급한 보고가 있었다 (Fukasawa, T., et al., Cancer & Chemotherapy 13 (1986) 1862-1867). 대부분의 이러한 연구는 소급적용되고, 비-무작위되고 소수의 환자가 포함되어 있었다. CYFRA 21-1 로의 연구 경우에서와 같이, CEA 연구는 다음과 같이 제안하였다: a) 화학요법을 받는 동안 CEA 수치가 감소된 환자는 일반적으로 CEA 수치가 떨어지지 않는 환자보다 더 나은 결과를 보인다, 및 (b) 대부분의 모든 환자의 경우, CEA 수치의 증가는 질환 진행과 관련이 있다.

세프라아제가 화학요법의 모니터링을 위한 마커로서 적어도 CYFRA 21-1 또는 CEA 각각 만큼은 양호할 것으로 예상된다. 그러므로 본 발명은 또한 화학요법 하의 암 환자, 바람직하게는 폐암 (LC) 또는 결장암 (CRC) 환자의 모니터링에서의 세프라아제의 용도에 관한 것이다. 치료법의 모니터링시, 하나의 바람직한 구현예에서, 세프라아제 및 CYFRA 21-1, CEA 및/또는 NSE 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커에 대한 측정은 조합되고 폐암 (LC) 측정에 사용될 것이다.

팔로우 -업 ( Follow - up ):

암성 조직의 완전한 제거를 목표로 외과적 절제술을 받은 LC 환자 중 많은 비율에서 차후에 재발성 또는 전이성 질환이 발생한다 (Wagner, H., Chest 117 (2000) 110-118; Buccheri, G., et al., Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980). 대부분의 이러한 재발은 수술후 첫번째 2 ~ 3 년 이내에 발생한다. 재발성/전이성 질환은 너무 늦게 검출되는 경우 예외없이 치명적이므로, 상당한 연구가 초기의, 그러므로 잠재적으로 치료가능한 병기에서의 암 재발에 초점을 맞추고 있다.

따라서, 많은 암 환자, 예를 들어 LC 환자에게는 CEA 로의 정규적인 모니터링을 흔히 포함하는 수술후 감시 프로그램을 진행한다. 외과적 절제 후 1 년 CEA 로의 순차적 모니터링은 심지어 의심 증상 또는 징후가 없어도 대략 97% 의 특이도에서 대략 29% 의 민감도로 초기 수술후 재발성/전이성 질환을 검출하는 것으로 나타났다 (Buccheri, G., et al., Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980). 그러므로, 수술 후 LC 환자의 팔로우-업은 적합한 생화학적 마커에 대한 용도의 가장 중요한 분야 중 하나이다. 조사된 LC 환자에서의 세프라아제의 높은 민감도로 인해, 세프라아제가 단독으로 또는 하나 이상의 기타 마커와의 조합으로 LC 환자, 특히 수술 후 LC 환자의 팔로우-업을 크게 도울 것 같다. LC 환자의 팔로우-업에서 세프라아제 및 LC 의 하나 이상의 기타 마커를 포함하는 마커 패널의 용도는 본 발명의 추가의 바람직한 구현예를 나타낸다.

본 발명은 바람직한 구현예에서, 암의 진단 분야에 있어서의 세프라아제의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는 세프라아제는 페암 (LC), 결장암 (CRC), 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 방광암, 자궁내막암 또는 전립선암, 각각의 평가에 사용된다.

또다른 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 암에 대한 하나 이상의 추가의 마커 분자와의 조합으로의, 예를 들어 일반적 암 또는 특이적 유형의 암, 예컨대 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 방광암, 자궁내막암 또는 전립선암에 대한 마커 분자로서의 세프라아제의 용도에 관한 것이다. 추가의 마커 분자는 암-유형 비특이적 일반적인 마커 분자 및/또는 암-유형 특이적 마커 분자, 예를 들어, 폐암 또는 결장암에 대한 마커 분자일 수 있다. 세파라아제 및 하나 이상의 추가의 마커는 개인으로부터 수득된 액체 샘플 중에서의 암, 예를 들어 폐암 또는 결장암의 평가에 사용된다. 세프라아제의 측정과 조합될 수 있는 암에 대한 바람직한 선별된 기타 마커는 Cyfra 21-1, CEA, NSE, CA125, CA19-9, PSA, ASC, S100A12 및 NNMT 이다. 특히, 세프라아제의 측정과 조합될 수 있는 바람직한 선별된 기타 LC 마커는 CYFRA 21-1, CEA 및/또는 NSE 이다. 암, 예를 들어 LC 의 평가에 사용되는 또다른 추가의 바람직한 마커 패널은 세프라아제 및, CYFRA 21-1 및 CEA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기타 마커 분자를 포함한다.

당업자가 인지하듯이 조사 하에서 예후 질문을 개선하기 위해 2 개 이상의 마커의 측정을 사용하기 위한 많은 방법이 있다. 꽤 단순하지만, 그럼에도 종종 효과적인 접근법에서, 샘플이 조사된 마커 중 하나 이상에 대해 양성인 경우, 양성 결과로 평가된다. 이것은 예를 들어, AIDS 와 같은 감염성 질환을 진단하는 경우일 수 있다.

그러나 종종, 마커의 조합이 평가된다. 바람직하게는 마커 패널의 마커, 예를 들어, 세프라아제 및 CYFRA 21-1 에 대해 측정된 값을 수학적으로 조합하고, 조합된 값을 기본적인 진단 질문과 연관시킨다. 마커 값은 임의의 적합한 당업계 수학적 방법에 의해 조합될 수 있다. 마커 조합을 질환과 연관시키기 위한 잘 알려진 수학적 방법은 판별식 분석 (DA) (즉, 선형-, 이차-, 정형화-DA), 커널법 (즉, SVM), 비모수적 방법 (즉, k-최근접-이웃 분류기), PLS (Partial Least Squares: 부분 최소 제곱), 나무구조 기반 방법 (즉, 로지스틱 회귀, CART, 랜덤 포레스트 방법, 부스팅/배깅 방법), 일반적인 선형 모델 (즉, 로지스틱 회귀), 주성분 기반 방법 (즉, SIMCA), 일반적인 부가 모델, 퍼지 논리 기반 방법, 신경 네트워크 및 유전 알고리즘 기반 방법과 같은 방법을 사용한다. 당업자는 본 발명의 마커 조합을 평가하기 위한 적합한 방법을 선택하는데 문제가 없을 것이다. 바람직하게는 본 발명의 마커 조합을 예를 들어, LC 의 존재 또는 부재와 연관시키는데 사용되는 방법은 DA (즉, 선형-, 이차-, 정형화 판별식 분석), 커널법 (즉, SVM), 비모수적 방법 (즉, k-최근접-이웃 분류기), PLS (부분 최소 제곱), 나무구조 기반 방법 (즉, 로지스틱 회귀, CART, 랜덤 포레스트 방법, 부스팅 방법), 또는 일반적인 선형 모델 (즉, 로지스틱 회귀) 로부터 선택된다. 상기 통계적 방법과 관련된 상세한 사항은 하기 문헌에서 발견된다: Ruczinski, I., et al, J. of Computational and Graphical Statistics, 12 (2003) 475-511; Friedman, J. H., J. of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175; Hastie, Trevor, Tibshirani, Robert, Friedman, Jerome, The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics (2001); Breiman, L., Friedman, J.H., Olshen, R.A., Stone, C. J. (1984) Classification and regression trees, California: Wadsworth; Breiman, L., Random Forests, Machine Learning, 45 (2001) 5-32; Pepe, M.S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series 28 (2003); 및 Duda, R.O., Hart, P. E., Stork, D. G., Pattern Classification, Wiley Interscience, 2nd Edition (2001).

생물학적 마커의 기본적인 조합에 대한 최적화된 다변량 절사값을 사용하고, A 상태를 B 상태와, 예를 들어, 질환이 있는 사람과 건강한 사람과 구별하기 위해 사용하는 것이 본 발명의 바람직한 구현예이다. 이러한 유형의 분석에서, 마커는 더 이상 독립적이지 않고, 마커 패널을 형성한다.

진단 방법의 정확도는 수용자-반응 특성 (ROC) (특히 Zweig, M.H., and Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577 참조) 에 의해 최적으로 기술된다. ROC 그래프는 관찰되는 데이터의 전 범위에 걸쳐 연속적으로 변하는 결정 역치값으로부터 유래되는 모든 민감도/특이도 쌍의 플롯이다.

실험실 시험의 임상적 성능은 이의 진단 정확도, 또는 대상을 임상적으로 적절한 하위그룹으로 올바르게 분류하는 능력에 따라 다르다. 진단 정확도는 조사되는 대상의 2 가지 상이한 상태를 올바르게 구별하는 시험 능력을 측정한다. 이러한 상태는 예를 들어 건강 및 질환 또는 양성 대 악성 질환이다.

각 경우에서, ROC 플롯은 결정 역치값의 완전한 범위에 대해 민감도 대 1 - 특이도를 플롯팅함으로써 2 가지 분포 사이의 중복을 도식화한다. y-축은 민감도, 또는 진-양성 분획 [(진-양성 시험 결과의 수)/(진-양성의 수 + 가-음성 시험 결과의 수) 로서 정의됨] 이다. 이것은 또한 질환 또는 상태의 존재가 확실함으로서 언급된다. 이것은 영향을 받은 하위그룹으로부터 단독으로 계산된다. x-축은 가-양성 분획, 또는 1 - 특이도 [(가-양성 결과의 수)/(진-음성의 수 + 가-양성 결과의 수) 로서 정의됨] 이다. 이것은 특이도의 지수이고, 영향을 받지 않은 하위그룹으로부터 전체적으로 계산된다. 2 개의 상이한 하위그룹으로부터의 시험 결과를 사용함으로써 진-양성 및 가-양성 분획이 전체적으로 개별적으로 계산되기 때문에, ROC 플롯은 샘플 내의 질환의 감염율과는 독립적이다. ROC 플롯 상의 각각의 지점은 특정 결정 역치값에 상응하는 민감도/1 - 특이도 쌍을 나타낸다. 완벽하게 식별되는 시험 (결과의 2 가지 분포 사이에 중복이 없음) 은, 진-양성 분획은 1.0, 또는 100% (완벽한 민감도) 이고 가-양성 분획은 0 (완벽한 특이도) 인 상부 좌측 구석을 통과하는 ROC 플롯을 갖는다. 식별되지 않는 시험 (2 가지 그룹에 대한 결과의 일치하는 분포) 에 대한 이론적인 플롯은 하부 좌측 구석에서 상부 우측 구석으로 이어지는 45° 대각선이다. 대부분의 플롯은 상기 2 가지 극단 사이에 놓인다 (ROC 플롯이 45° 대각선 아래에 완전히 놓이는 경우, 이것은 "~ 초과" 에서 "~ 미만" 으로 "확실함" 에 대한 기준을 역전시켜 쉽게 해결되거나 또는 역도 마찬가지이다). 정성적으로는, 플롯이 상부 좌측 코너에 가까울수록, 시험의 전체적인 정확도가 높다.

실험실 시험의 진단 정확도를 정량화하기 위한 하나의 바람직한 방법은 단일 숫자에 의해 성능을 표현하는 것이다. 이러한 전체적인 파라미터는 예를 들어, 소위 "총 에러" 또는 대안적으로 "곡선하 면적 = AUC" 이다. 가장 통상적인 포괄적인 측정값은 ROC 플롯하의 면적이다. 통상적으로, 상기 영역은 항상 > 0.5 이다 (이렇지 않은 경우, 결정 법칙을 반대로 하여 이렇게 만들 수 있다). 값은 1.0 (2 개 그룹의 시험 값의 완벽한 분리) 내지 0.5 (시험 값의 2 개 그룹 사이에 명백한 분포 차이가 없음) 사이의 범위이다. 이러한 영역은 대각선에 가장 근접한 지점 또는 90% 특이도에서의 민감도와 같은 플롯의 특정 지점 뿐 아니라, 전체 플롯에 따라 다르다. 이것은 ROC 플롯이 완벽한 플롯에 근접하는 (면적 = 1.0) 방식의 정량적, 기술적 표현이다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 샘플 중에서 적어도 세프라아제 및 CYFRA 21-1, 및 임의로 CEA, 및/또는 NSE 각각의 농도를 측정하고 측정된 농도를 암, 예를 들어 LC 또는 CRC 의 존재 또는 부재와 연관시킴으로써 암, 예를 들어 LC 또는 CRC 대 건강한 대조군에 대한 진단 정확도를 개선하기 위한 방법에 관한 것이고, 개선은, 단독으로 조사된 임의의 단일 마커에 근거한 분류와 비교하여 건강한 대조군 대 암, 예를 들어 LC 또는 CRC 을 앓고 있는 환자로 더 많은 환자가 올바르게 분류되는 결과를 낳는다.

본 발명에 따른 바람직한 방법에서 적어도 생마커 세프라아제 및 CYFRA 21-1 각각의 농도가 측정되고 마커 조합이 암, 예를 들어 LC 또는 CRC 의 평가에 사용된다.

본 발명에 따른 추가의 바람직한 방법에서 적어도 생마커 세프라아제 및 CEA 각각의 농도가 측정되고 마커 조합이 암, 예를 들어 LC 또는 CRC 의 평가에 사용된다.

본 발명에 따른 추가의 바람직한 방법에서 적어도 생마커 세프라아제, CYFRA 21-1, 및 CEA 각각의 농도가 측정되고 마커 조합이 암, 예를 들어 LC 또는 CRC 의 평가에 사용된다.

본 발명에 따른 추가의 바람직한 방법에서적어도 생마커 세프라아제, CYFRA 21-1, 및 CEA 각각의 농도가 측정되고 마커 조합이 암, 예를 들어 LC 또는 CRC 의 평가에 사용된다.

본 발명에 따른 추가의 바람직한 방법에서 적어도 생마커 세프라아제, CYFRA 21-1, 및 NSE 각각의 농도가 측정되고 마커 조합이 암, 예를 들어 LC 또는 CRC 의 평가에 사용된다.

하기 실시예, 참조 문헌, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이의 참 범주는 특허 청구 범위에 언급된다. 본 발명의 취지에서 벗어남 없이 언급되는 과정에 변경이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.

도 1 도 1 은 결장직장암 (CRC) 환자 및 건강한 대조군에서의 혈청 세프라아제 농도 값의 분포를 보여준다.
도 2 도 2 는 폐암 (LC) 환자 및 건강한 대조군에서의 혈청 세프라아제 농도 값의 분포를 보여준다.
도 3 도 3 은 인간 세프라아제 (SEQ ID NO:1) 의 아미노산 서열을 보여준다.

실시예 1

세프라아제-특이적 결합 분자로서 래트 모노클론 항-세프라아제 항체 (클론 D8, D28 및 D43) 를 사용하였다 (Pineiro-Sanchez, M. -L., et al., J. Biol. Chem., 272 (1997) 7595-7601).

모노클론 래트 IgG 의 비오티닐화

모노클론 래트 IgG (클론 D28 또는 D43) 를 10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 3O mM NaCl 중에서 10 mg/ml 로 만들었다. IgG 용액 1 ml 당 50 ㎕ 비오틴-N-히드록시숙신이미드 (DMSO 중 3.6 mg/ml) 를 첨가하였다. 실온에서 30 분 후, 샘플을 Superdex 200 (10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl) 로 크로마토그래피하였다. 비오티닐화 IgG 를 함유하는 분획을 수집하였다.

모노클론 래트 IgG 의 디곡시게닐화

모노클론 래트 IgG (클론 D8 또는 D43) 를 10 mM NaH₂PO₄/NaOH, 30 mM NaCl, pH 7.5 중에서 10 mg/ml 로 만들었다. IgG 용액 1 ml 당 50 ㎕ 디곡시게닌-3-O-메틸카르보닐-ε-아미노카프로산-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, Cat. No. 1 333 054) (DMSO 중 3.8 mg/ml) 를 첨가하였다. 실온에서 30 분 후, 샘플을 Superdex® 200 (10 mM NaH₂PO₄/NaOH, pH 7.5, 30 mM NaCl) 로 크로마토그래피하였다. 디곡시게닐화 IgG 를 함유하는 분획을 수집하였다.

실시예 2

인간 혈청 및 혈장 샘플 중에서의 세프라아제의 측정을 위한 ELISA .

인간 혈청 또는 혈장에서의 세프라아제의 검출을 위해, 샌드위치 ELISA 를 개발하였다. 제 1 어세이 포맷에서, 비오틴으로 공액된 항-세프라아제 모노클론 항체 D28 및 디곡시게닌으로 공액된 D8 (실시예 1 참조) 의 분취물을 항원의 포획 및 검출을 위해 사용하였다 (D28 x D8 포맷). 제 2 어세이 포맷에서, 비오틴 및 디곡시게닌 각각으로 공액된 항-세프라아제 모노클론 항체 D43 (실시예 1 참조) 의 분취물을 항원의 포획 및 검출을 위해 사용하였다 (D43 x D43 포맷).

샘플 (75 ㎕) 을, 인큐베이션 완충액 (40 mM 포스페이트, 200 mM 나트륨 타르트레이트, 10 mM EDTA, 0.05% 페놀, 0.1% 폴리에틸렌 글리콜 40000, 0.1% Tween 20, 0.2% BSA, 0.1% 소 IgG, 및 0.02% 5-브로모-5-니트로-1,3-디옥산 및 pH 7.4 로 조절됨) 중에 D28-비오틴 및 D8-디곡시게닌 항체 또는 대안적으로 D43-비오틴 및 D43-디곡시게닌 항체를 각각 0.375 ㎍ 함유하는 150 ㎕ 의 항체 시약과 혼합하였다.

2 시간 동안의 인큐베이션 후, 2 x 100 ㎕ 의 혼합물을 스트렙타비딘-코팅 마이크로적가 플레이트의 각 웰로 옮겨놓고, 또다시 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세정 완충액 (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) 으로 3 회 세정하였다.

다음 단계에서, 웰을 유니버설 공액 완충액 (Universal Conjugate Buffer) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog # 11684825) 중의 30 mU/ml 항-디곡시게닌-HRP 공액체 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog # 1633716) 와 함께 60 분 동안 인큐베이션하고, 이전과 같이 세정하였다.

그 다음 웰을 100 ㎕ 의 TMB 기질 용액 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog # 12034425) 으로 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 2 N 황산 (50 ㎕) 을 첨가하여 색상 전개를 중단시켰고, 청색 색조가 황색으로 전환되었다.

ELISA 판독기로 450 nm 에서 OD 를 측정하였다.

모든 인큐베이션은 실온에서 수행되었다. 인간 혈청 또는 혈장 샘플을 인큐베이션 완충액 ad 0.15 % 로 예비-희석하였다. 검정을 위해, 샘플 수집액을 표준으로서 사용하였다. 이것을 인큐베이션 완충액 ad 0.09 / 0.18 / 0.27 / 0.36 / 0.45 % 로 희석하여, 0.03 / 0.06 / 0.09 / 0.12 / 0.15 유닛/ml 각각의 임의로 제시된 값을 갖는 칼리브레이터로 만들었다.

검정 곡선의 방정식을 선형 회귀 분석에 의해 계산하였고, 웰의 흡광도 판독값을 상응하는 농도 값으로 전환시키는데 사용되었다. 결과에 예비-희석 인자를 곱하여, 각각의 샘플 그 자체의 농도를 구하였다.

실시예 3

CRC 연구 집단

제 1 연구에서, 49 명의 잘 특징화된 결장직장암 환자 (표 1 에 제시된 UICC 분류) 로부터 유래된 샘플을 사용하였다.

표 1

표 1 의 샘플을 임의의 공지된 악성 질환을 가지고 있지 않은 50 명의 명백하게 건강한 개인 (= 대조군 코호트) 으로부터 수득된 대조군 샘플과 비교하여 평가하였다.

실시예 4

LC 연구 집단

제 2 연구는 비소세포 폐암 (NSCLC) 에 초점을 둔 제 1 연구와는 전적으로 독립적이다. 더욱 구체적으로는, 주요 유형의 NSCL, 샘암종 및 평편 세포 암종 환자를 조사하였다. 표 2a 에는 암 코호트의 유형 및 병기 분포가 기재되어 있다.

표 2a

본 연구에서 대조군 코호트는 특히 표 2b 에서 기재된 바와 같이 흡연자 및 비흡연자로부터의 샘플을 포함하는 것으로 정의되었다. 폐활량 측정 폐기능 시험 (Miller, M.R. et al., Eur. Respir. J. 26 (2005) 319-338) 을 각각의 개인에서 실시하였다. 증여자의 결과가 정상 범위 내에 있는 경우 샘플에는 대조군 코호트 만이 포함되었다.

표 2b

실시예 5

세프라아제는 암 환자와 건강한 대조군을 구별한다

세프라아제의 혈청 농도는 모든 연구에서 밝혀진 바와 같이, 암 환자와 건강한 대조군 사이에서 현저하게 상이하다. 도 1 및 2 에서, D28 및 D8 항체의 조합을 사용하는 어세이 결과를 나타내었다.

암 환자 코호트의 평균 농도는 대조군 코호트의 평균 농도보다 유의하게 낮다: CRC 및 LC 연구 각각에서 환자 22.6 및 20.9 U/ml 대 대조군 33.6 및 35.6 U/ml 로 나타났다. 각각의 대조군 코호트에 95% 특이도를 산출하는 절사값으로, 민감도는 결장직장암의 경우 67% 이다. 폐암의 경우, 이것은 62% 이다.

민감도는 CRC 및 LC 데이터 모두에서 제시될 수 있는 바와 같이 (표 3 및 4) 모든 병기의 암에 대해서 유사하다. 그러므로, 세프라아제는 질환의 초기 지표자로서 사용될 수 있다. 폐암과 관련하여, 평편 세포 암종에 대한 민감도는 샘암종에 대한 민감도 (표 4) 보다 높다.

표 3

표 4

세프라아제의 오직 이량체 또는 다량체 형태만을 검출하는 2 가지 D43 항체를 사용하는 어세이의 결과는 이와 밀접하게 관련성이 있었다 (데이터는 제시하지 않음).

실시예 6

CRC 및 LC 에 대한 기타 마커의 민감도

세프라아제 외에, CRC 및 LC 연구 샘플에서 10 개의 기타 잘 알려진 종양 마커를 측정하였다. 이 경우에서 시판되는 시험 키트를 사용하였다. 이들 사이에서의 공정한 비교를 위해, 조사되는 각각의 마커의 절사값을 각각의 연구의 대조군 코호트에 대해 95 % 특이도를 산출하는 것으로 설정하였다.

표 5 는 모든 암 유형의 검출을 위한 각각의 마커의 민감도를 나타낸다.

표 5

세프라아제는 CRC 및 LC 에 대해 유사한 민감도를 나타낸다. 전반적으로, 이것은 평균 64.5% 이고, 모든 평가되는 마커 중에서 최고값으로 관찰되었다. 오직 Cyfra 21-1 만이 동일한 평균 민감도를 가졌다. 그러나, Cyfra 는 CRC 의 검출시 세프라아제보다 효과가 유의하게 덜하다. 측정된 모든 기타 종양 마커에 의해 제시된 성능은 이들 둘과 비교하여 다소 열악하였다.

실시예 7

마커 조합

각각의 조합의 마커 중 하나 이상이 특정 역치값을 초과하는 경우, 개인이 암을 갖는 것으로 분류하였다. 일반적으로, 이러한 절사값은 단일 마커 경우에 사용되는 것과는 상이하였으나, 각각의 조합으로 유사하게 95 % 특이도를 산출하였다.

2 가지 가장 두드러진 마커인 세프라아제 및 Cyfra 21-1 의 조합으로는, 암 검출이 현저하게 개선되었고, LC 연구에서 80 % 민감도를 제공하였다.

실시예 8

종양 마커로서 세프라아제를 사용하는 연령이 부합된 건강한 대조군으로부터의 상이한 암의 구별

본 연구에서, 상이한 암 질환을 갖는 잘-특징화된 환자로부터의 샘플 (샘플 번호 및 UICC 분류는 표 6 에 제공된다) 을 측정하였다. 표 6 의 샘플을, 임의의 공지된 악성 질환을 가지고 있지 않은 명백하게 건강한 개인이었던, 264 명의 연령이 부합된 대조군 환자와 비교하여 평가하였다. 본 대조군 코호트에서, 절사값은 95% 의 특이도를 수득하는 것으로 결정하였다.

표 6

세프라아제에 대한 높은 민감도를 식도암, 머리/목암, 위암 및 담관암 뿐 아니라, LC 및 CRC (표 5 에서 제시되는 데이터) 에서도 수득하였다. 세프라아제에 대한 양호한 민감도는 또한 췌장암 및 신장암에 대해서도 발견되었다. 자궁경부암, 난소암 및 유방암의 평가에서는 세프라아제에 대해 보다 덜한 민감도가 발견되었다. 스크리닝 세팅 (95% 특이도) 에서 유방암에서의 필적할만하게 낮은 (18%) 민감도에도 불구하고, 세프라아제는 또한 유방암의 재발 모니터링을 위한 흥미로운 마커로서 고려될 수 있다. 상기 의도되는 용도에 정규적으로 사용되는 마커 CA 15-3 및 CEA 는 상기 유방암 집단에서 각각 오직 6% 및 11% 의 민감도만을 보였고, 이것은 마커 세프라아제와 비교하여 더 적었다.

SEQUENCE LISTING <110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG <120> Seprase as a marker for cancer <130> 24551 WO <150> EP 07023897.7 <151> 2007-12-10 <150> EP 08015310.9 <151> 2008-08-29 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 766 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(766) <223> Sequence according to Figure 3, (FAP)/Seprase (Uni Prot KB database Accession No. P27487) <400> 1 Met Lys Thr Pro Trp Lys Val Leu Leu Gly Leu Leu Gly Ala Ala Ala 1 5 10 15 Leu Val Thr Ile Ile Thr Val Pro Val Val Leu Leu Asn Lys Gly Thr 20 25 30 Asp Asp Ala Thr Ala Asp Ser Arg Lys Thr Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr 35 40 45 Leu Lys Asn Thr Tyr Arg Leu Lys Leu Tyr Ser Leu Arg Trp Ile Ser 50 55 60 Asp His Glu Tyr Leu Tyr Lys Gln Glu Asn Asn Ile Leu Val Phe Asn 65 70 75 80 Ala Glu Tyr Gly Asn Ser Ser Val Phe Leu Glu Asn Ser Thr Phe Asp 85 90 95 Glu Phe Gly His Ser Ile Asn Asp Tyr Ser Ile Ser Pro Asp Gly Gln 100 105 110 Phe Ile Leu Leu Glu Tyr Asn Tyr Val Lys Gln Trp Arg His Ser Tyr 115 120 125 Thr Ala Ser Tyr Asp Ile Tyr Asp Leu Asn Lys Arg Gln Leu Ile Thr 130 135 140 Glu Glu Arg Ile Pro Asn Asn Thr Gln Trp Val Thr Trp Ser Pro Val 145 150 155 160 Gly His Lys Leu Ala Tyr Val Trp Asn Asn Asp Ile Tyr Val Lys Ile 165 170 175 Glu Pro Asn Leu Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Trp Thr Gly Lys Glu Asp 180 185 190 Ile Ile Tyr Asn Gly Ile Thr Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Val Phe 195 200 205 Ser Ala Tyr Ser Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Thr Phe Leu Ala 210 215 220 Tyr Ala Gln Phe Asn Asp Thr Glu Val Pro Leu Ile Glu Tyr Ser Phe 225 230 235 240 Tyr Ser Asp Glu Ser Leu Gln Tyr Pro Lys Thr Val Arg Val Pro Tyr 245 250 255 Pro Lys Ala Gly Ala Val Asn Pro Thr Val Lys Phe Phe Val Val Asn 260 265 270 Thr Asp Ser Leu Ser Ser Val Thr Asn Ala Thr Ser Ile Gln Ile Thr 275 280 285 Ala Pro Ala Ser Met Leu Ile Gly Asp His Tyr Leu Cys Asp Val Thr 290 295 300 Trp Ala Thr Gln Glu Arg Ile Ser Leu Gln Trp Leu Arg Arg Ile Gln 305 310 315 320 Asn Tyr Ser Val Met Asp Ile Cys Asp Tyr Asp Glu Ser Ser Gly Arg 325 330 335 Trp Asn Cys Leu Val Ala Arg Gln His Ile Glu Met Ser Thr Thr Gly 340 345 350 Trp Val Gly Arg Phe Arg Pro Ser Glu Pro His Phe Thr Leu Asp Gly 355 360 365 Asn Ser Phe Tyr Lys Ile Ile Ser Asn Glu Glu Gly Tyr Arg His Ile 370 375 380 Cys Tyr Phe Gln Ile Asp Lys Lys Asp Cys Thr Phe Ile Thr Lys Gly 385 390 395 400 Thr Trp Glu Val Ile Gly Ile Glu Ala Leu Thr Ser Asp Tyr Leu Tyr 405 410 415 Tyr Ile Ser Asn Glu Tyr Lys Gly Met Pro Gly Gly Arg Asn Leu Tyr 420 425 430 Lys Ile Gln Leu Ser Asp Tyr Thr Lys Val Thr Cys Leu Ser Cys Glu 435 440 445 Leu Asn Pro Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Ser Val Ser Phe Ser Lys Glu 450 455 460 Ala Lys Tyr Tyr Gln Leu Arg Cys Ser Gly Pro Gly Leu Pro Leu Tyr 465 470 475 480 Thr Leu His Ser Ser Val Asn Asp Lys Gly Leu Arg Val Leu Glu Asp 485 490 495 Asn Ser Ala Leu Asp Lys Met Leu Gln Asn Val Gln Met Pro Ser Lys 500 505 510 Lys Leu Asp Phe Ile Ile Leu Asn Glu Thr Lys Phe Trp Tyr Gln Met 515 520 525 Ile Leu Pro Pro His Phe Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Leu 530 535 540 Asp Val Tyr Ala Gly Pro Cys Ser Gln Lys Ala Asp Thr Val Phe Arg 545 550 555 560 Leu Asn Trp Ala Thr Tyr Leu Ala Ser Thr Glu Asn Ile Ile Val Ala 565 570 575 Ser Phe Asp Gly Arg Gly Ser Gly Tyr Gln Gly Asp Lys Ile Met His 580 585 590 Ala Ile Asn Arg Arg Leu Gly Thr Phe Glu Val Glu Asp Gln Ile Glu 595 600 605 Ala Ala Arg Gln Phe Ser Lys Met Gly Phe Val Asp Asn Lys Arg Ile 610 615 620 Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Thr Ser Met Val Leu 625 630 635 640 Gly Ser Gly Ser Gly Val Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val 645 650 655 Ser Arg Trp Glu Tyr Tyr Asp Ser Val Tyr Thr Glu Arg Tyr Met Gly 660 665 670 Leu Pro Thr Pro Glu Asp Asn Leu Asp His Tyr Arg Asn Ser Thr Val 675 680 685 Met Ser Arg Ala Glu Asn Phe Lys Gln Val Glu Tyr Leu Leu Ile His 690 695 700 Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Gln Ser Ala Gln Ile Ser 705 710 715 720 Lys Ala Leu Val Asp Val Gly Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Thr 725 730 735 Asp Glu Asp His Gly Ile Ala Ser Ser Thr Ala His Gln His Ile Tyr 740 745 750 Thr His Met Ser His Phe Ile Lys Gln Cys Phe Ser Leu Pro 755 760 765

Claims

샘플 중에서,
a) 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각,
b) 임의로 암에 대한 하나 이상의 기타 마커
의 농도 및/또는 활성을 측정하고,
c) 상기 단계 (a) 및 임의로 단계 (b) 의 측정 결과를 암 평가에 사용하는 것을 포함하며, 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각의 감소된 농도 및/또는 활성이 암에 대한 지표인, 시험관 내 암 평가 방법.
제 1 항에 있어서, 특이적 암 유형 측정을 위한 방법.
제 2 항에 있어서, 특이적 암 유형이 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 방광암, 자궁내막암 또는 전립선암인 방법.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 특이적 암 유형이 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암 또는 유방암인 방법.
제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 암 유형이 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담관암, 췌장암 또는 신장암인 방법.
제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 암 유형이 폐암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암 또는 담관암인 방법.
제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 폐암 (LC) 또는 결장직장암 (CRC) 인 방법.
제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 폐암 (LC) 인 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (b) 의 상기 하나 이상의 기타 마커가 암-유형 비특이적 일반 암 마커인 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (b) 의 상기 하나 이상의 기타 마커가 암-유형 특이적 암 마커인 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 (b) 의 상기 하나 이상의 기타 마커가 CYFRA 21-1, CEA, NSE, CA19-9, CA125, PSA, ASC, S100A12 및 NNMT 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 하나 이상의 기타 마커가 CYFRA 21-1 인 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 하나 이상의 기타 마커가 CEA 인 방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 체액 샘플인 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플인 방법.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 인간 샘플인 방법.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각의 농도를 측정하는 방법.
제 17 항에 있어서, 농도를 면역학적 방법에 의해 측정하는 방법.
제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 세프라아제 폴리펩티드의 이량체 또는 다량체 형태를 측정하는 방법.
제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 세프라아제 폴리펩티드의 단량체 형태를 측정하는 방법.
제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각의 효소 활성을 측정하는 방법.
제 21 항에 있어서, 안티플라스민 분할 활성을 측정하는 방법.
세프라아제 및/또는 이의 조각의 감소된 농도 및/또는 활성이 암에 대한 지표인, 암 평가에서의 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각의 용도.
세프라아제 및/또는 이의 조각의 감소된 농도 및/또는 활성이 암에 대한 지표인, 암 평가에서의 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각에 대한 항체의 용도.
세프라아제 및/또는 이의 조각의 감소된 농도 및/또는 활성이 암에 대한 지표인, 암 평가에서의 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각의 효소 활성 측정 시약의 용도.
제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 폐암, 특히 NSCLC 의 평가에서의, 또는 결장암, 특히 결장직장암 (CRC) 의 평가에서의 용도.
세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각의 감소된 농도 및/또는 활성이 암에 대한 지표인, 암 평가에서의 세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각 및 암에 대한 하나 이상의 기타 마커를 포함하는 마커 패널의 용도.
제 27 항에 있어서, 하나 이상의 기타 마커가 암-유형 비특이적 및/또는 암-유형 특이적 마커인 용도.
제 28 항에 있어서, 하나 이상의 기타 마커가 폐암 또는 결장암의 평가에서의 폐암 마커인 용도.
제 27 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 기타 마커가 CYFRA 21-1, CEA, NSE, CA19-9, CA125, PSA, ASC, S100A12 및 NNMT 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용도.
제 27 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 마커 패널이 적어도 세프라아제 및/또는 이의 조각 및 CYFRA 21-1 을 포함하는 용도.
세프라아제 폴리펩티드 및/또는 이의 조각 및 암에 대한 하나 이상의 기타 마커를 특이적으로 측정하는데 필요한 시약을 포함하는, 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 키트.