CN102435748B - 一种双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及其制备方法。本发明所述检测试剂盒由包被有NSE和CK19单克隆抗体的多孔板，辣根过氧化物酶标的NSE和碱性磷酸酶标记的CK19，显色底物TMB、PNPP、磷酸氢二钠和底物终止液组成。本发明所述检测试剂盒具有简便、灵敏、稳定、重复性好等优点，具有实用价值。

Description

一种双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及试剂盒领域，具体涉及一种双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及其制备方法。 
背景技术
    肺癌是世界范围内最常见致死人数最多的恶性肿瘤之一，其发病率增长速度亦高居各恶性肿瘤之首，由于肺癌起病隐匿。目前仍缺乏有效地筛查和早期诊断方法，患者出现症状是多为晚期，预后较差，总得五年生存不超过15%，有症状者小于10%，但是在早期诊断的肺癌患者中，手术治疗的预后叫中晚期肺癌有明显改善，其生存率可达70%。临床上传统的诊断方法如胸片、支气管镜、痰细胞学检查等方法。但是缺乏足够的特异性和灵敏性。因此，临床上急需一种能够针对肺癌早期诊断的方法。目前，对于肺癌早期诊断比较简便快捷的方法是借助酶联免疫试剂盒，而国内外对于肺癌诊断的试剂盒都是针对肺癌某一种标志物进行检测，但是肺癌到目前没有一种特异性的肺癌标记物，都是一些相关的标记物，同时由于肺癌分类复杂，不同病理时期标志物的表达量有所不同，只是针对某一种标志物进行诊断，会带来极大地误诊情况。 
目前所采用的酶联免疫试剂盒联合检测是把几种标志物的酶标板同时操作，已达到联合检测的目的，此种操作会带来很大的人为误差。 
发明内容
本发明的目的在于根据现有的检测试剂盒中存在的不足，提供一种可以同时在一块酶标板上对两种或三种标志物同时进行定量检测，消除人为误差，同时操作简便，降低了成本的检测试剂盒。 
本发明另一目的在于提供上述检测试剂盒的制备方法。 
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现： 
一种联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒，由包被有NSE和CK19单克隆抗体的多孔板，碱性磷酸酶标记的NSE和辣根过氧化物酶标记的CK19，NSE和CK19的标准抗原，显色底物TMB、PNPP、磷酸氢二钠和底物终止液组成；所述多孔板每孔包被NSE单克隆抗体1~4ug/mL；每孔包被CK19单克隆抗体1~2ug/mL。
作为一种优选方案，所述多孔板中，每孔的包被液为100uL。 
作为一种优选方案，所述酶结合物的工作浓度稀释倍数均为1:500~1:2500。 
更进一步地，所述酶结合物保护液由含0.1 %的牛血清白蛋白，0.1 %的硫柳汞的0.01 mol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲液稀释得到。 
本发明联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒的制备方法包括如下步骤：制备包被有NSE和CK19单克隆抗体的多孔板；用pH 8~10碳酸盐缓冲液将NSE、CK19单克隆抗体稀释，然后将上述NSE、CK19单克隆抗体稀释液加入到孔中；37℃包被1h，将5%牛血清白蛋白溶液加入到酶标板各孔，37℃封闭1 h；封闭后用磷酸盐缓冲液洗版拍干，将其保存于4℃。 
本发明所述联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒用于肿瘤相关标志物的检测中。 
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 
（1）同时检测两种肿瘤相关抗原；
（2）检测的特异性高；
（3）检测灵敏度高；
（4）降低了成本。
附图说明
图1为两种抗原检测的标准曲线； 
图2为试剂盒稳定性分析结果。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1  双抗夹心法酶联免疫试剂盒检测NSE、CK19 两种抗原
（1）反应孔中分别加入各浓度标准品每孔加0 ng/mL、7.5 ng/mL、31.15 ng/mL、125 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL和待检血清，待检血清稀释5倍，每孔加入100uL，置于37℃，1h。
（2）拍干板内液体，加入洗涤液洗板，每孔200uL，每次30s，洗涤5次。 
（3）各孔加入稀释后的酶标抗体，每孔100uL，37℃，温育1h。 
（4）拍干板内液体，加入洗涤液洗板，每孔200uL，每次30s，洗涤5次。 
（5）各孔加入显色液PNPP,每孔100uL，37℃反应10 min，加入终止液，405nm读数。 
（6）拍干板内液体，加入洗涤液洗板，每孔200uL，每次30s，洗涤3次。 
（7）各孔加入显色液TMB，每孔100uL，37℃反应10 min，加入终止液，450nm读数。 
实施例2  双抗夹心ELISA法重复性分析
选取阳性血清样品，用实施例1所得的试剂盒进行检测，每份样品分别平行测3孔，进行试剂盒批内重复性检测。
表1碱性磷酸酶（AP）标记NSE 
选取阳性血清样品，用3份不同批次的实施例1制得的双抗夹心法诊断试剂盒进行检测，进行试剂盒批间重复性检测。
实施例3  试剂盒稳定性分析
将试剂盒存放于37℃环境中保存，定期检测，直至其质量指标的最大值下降一半为止，通常认为在37℃存放一天相当于4-10℃存放1.5个月。如表分析试剂盒37℃放置6天，NSE在第6天时检测OD值下降一半，相当于可在4℃保存9个月以上。CK19在第4天时检测OD值将要下降一半。因CK19相当于可在4℃保存6个月以上。所以试剂盒在4℃可以保存至少保存6个月。

Claims (6)

1.一种联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于由包被有NSE和CK19单克隆抗体的多孔板，碱性磷酸酶标记的NSE抗体和辣根过氧化物酶标记的CK19抗体，NSE和CK19的标准抗原，显色底物TMB、PNPP和底物终止液组成；所述多孔板每孔包被NSE单克隆抗体1～4ug/mL；每孔包被CK19单克隆抗体1～2ug/mL。
2.根据权利要求1所述的联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述多孔板中，每孔的包被液为100uL。
3.根据权利要求1所述的联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒，其特征还在于所述碱性磷酸酶标记的NSE抗体和辣根过氧化物酶标记的CK19抗体的工作浓度稀释倍数均为1:500～1:2500。
4.根据权利要求1所述的联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒，其特征还在于酶结合物保护液由含0.1%的牛血清白蛋白，0.1%的硫柳汞的0.01mol/L的pH7.4磷酸盐缓冲液稀释得到。
5.权利要求1～4中任意一条权利要求所述联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：制备包被有NSE和CK19单克隆抗体的多孔板；用pH8～10碳酸盐缓冲液将NSE、CK19单克隆抗体稀释，然后将上述NSE、CK19单克隆抗体稀释液加入到孔中；37℃包被1h，将5%牛血清白蛋白溶液加入到酶标板各孔，37℃封闭1h；封闭后用磷酸盐缓冲液洗板拍干，将其保存于4℃。
6.权利要求1～4中任意一条权利要求所述联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒在肿瘤相关标志物NSE和CK19的检测中的应用。
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