CN104820093A

CN104820093A - 一种利用聚多巴胺生物检测表面进行抗原检测的方法及应用

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Publication number: CN104820093A
Application number: CN201410851466.2A
Authority: CN
Inventors: 王丰; 杨艳; 余波; 赵晓梅; 王琳; 王威正; 王佩兰
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2015-08-05

Abstract

本发明涉及利用聚多巴胺生物检测表面进行抗原检测的方法。该方法首先通过多巴胺(DA)的自聚合在基底表面修饰上一层聚多巴胺(PDA)，之后利用聚多巴胺的化学反应性进一步与抗体发生反应，将抗体修饰在PDA表面，进而通过双抗夹心法检测样品中抗原的含量，为医学、食品、环境检测等提供依据。该方法较为新颖，且重现性较好，准确率较高，在生物医药、疾病诊断、食品检测、环境监测等方面具有良好的应用前景。

Description

一种利用聚多巴胺生物检测表面进行抗原检测的方法及应用

技术领域

本发明属于生物医学检测领域，具体地说是一种利用聚多巴胺生物检测表面进行抗原检测的方法及应用。

背景技术

聚多巴胺(PDA)是一种具有粘附性、亲水性及生物相容性的仿生高分子。可以通过将DA溶解在碱性的水溶液(如10mM tris-HCl缓冲液，pH＝8.5)中，在有氧的条件下静置或者搅拌均可以生成具有粘附性的聚多巴胺(PDA)。

聚多巴胺具有活性的酚羟基、含氮官能团和双键，对几乎所有基底均具有粘附性，可实现对玻璃、纤维、石英等的表面修饰。这种经PDA修饰的表面可以继续利用聚多巴胺的反应性进一步反应，从而在在材料表面生成新的功能层。例如，利用与含巯基、氨基等化合物反应形成单分子层、

通过化学镀形成金属层以及通过大分子接枝形成生物活性层等。这些新的功能层可以进一步用于电化学传感器、细胞成像、药物包埋释放等医学领域。

目前聚多巴胺在电化学传感器和药物包埋释放等方面已得到广泛应用，但是聚多巴胺在疾病诊断、食品检测和环境监测中的应用有待进一步研究，如果将聚多巴胺应用于生物检测界面的制备，并进一步应用于医学、食品和环境检测，将具有广阔的开发前景。

本发明公布了一种利用聚多巴胺生物检测表面进行抗原检测的方法。本发明首先通过多巴胺(DA)的自聚合在基底表面修饰上一层聚多巴胺(PDA)，之后利用聚多巴胺的化学反应性进一步与抗体发生反应，将抗体修饰在PDA表面，进而通过双抗夹心法检测样品中抗原的含量，并研究其在生物医学、食品、环境等检测领域的相关应用。

该方法制备的新型聚多巴胺生物检测表面具有很高的应用价值。综合以上技术和相关背景，我们所阐述的方法较为新颖，且重现性较好，准确率较高。同时由于聚多巴胺具有良好的粘附性，几乎可以修饰所有基底表面，拓展了生物检测的应用范围，在生物医药、疾病诊断、食品安全、环境检测方面具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是拓展聚多巴胺在疾病检测、食品安全、环境监测中的应用，通过制备新型聚多巴胺生物检测表面，并将该表面应用于医学、食品与环境检测，拓展聚多巴胺的应用范围，同时为疾病诊断、食品与环境检测提供新的思路。

本发明的工艺包括以下步骤：

(1)制备检测界面：通过多巴胺(DA)的自聚合在基底表面修饰上一层聚多巴胺(PDA)胶层，将能与待测抗原特异性结合的抗体(一抗)接枝到聚多巴胺(PDA)胶层表面；

(2)接入抗原：将待测样品中能与上述抗体特异性结合的抗原与抗体结合；

(3)形成“夹心”：加入与待测抗原呈特异反应的酶联抗体(二抗)；

(4)加入上述酶的发光底物，通过光学方法测定底物浓度，从而得到样品中抗原的含量。

所述基底包括孔板、玻璃、纤维、石英和塑料。

步骤(1)中聚多巴胺直接与抗体溶液反应过夜制备抗体检测界面，或，使用戊二醛作为交联剂，聚多巴胺先与多官能团化合物反应，再与抗体溶液反应过夜制备抗体检测界面。

所述多官能团化合物包括多聚甲醛、乙二醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛、环氧氯丙烷、环己烷甲醛和环戊烷羧酸。

所述光学方法包括化学发光法、分光光度法如紫外光谱法和荧光光谱法。

上述方法用于生物医学检测时所述抗原包括血液、尿液、唾液、汗液、体液标本中降钙素原(PCT)、甲胎蛋白(AFP)、甲状腺球蛋白TG、人绒毛膜促性腺激素hCG、胰岛素、甲状旁腺激素(PTH)、骨钙素、癌胚抗原、铁蛋白、糖类抗原、前列腺特异抗原PSA、鳞状细胞癌抗原SCCA、组织多态性抗原TPA、促黄体生成激素、雌二醇、睾酮、垂体泌乳素、肌钙蛋白T、衣原体、弓形虫、ABO血型抗原、ABH抗原、人游离前列腺特异性抗原(fPSA)、人总前列腺特异抗原(tPSA)、过氧化物酶金葡菌A蛋白、狂犬病毒抗原RV-Ag、人淋巴细胞抗原、人组织多肽抗原(TPA)、人痢疾内阿米巴抗原、单纯疱疹病毒抗原、人糖连抗原724和人新型隐球菌抗原。

上述方法用于食品检测时所述抗原包括黄曲霉、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、沙门氏菌、军团菌、大肠杆菌、李斯特菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌、伏马毒素、赭曲毒素、河豚毒素、CP4EPS蛋白、免疫球蛋白、氨苄西林钠、脱氧雪腐镰刀菌烯酮和展青霉素黄曲霉毒素。

上述方法用于环境监测时所述抗原包括垃圾焚烧飞灰中的二噁英，土壤中的苏云金芽孢杆菌的Bt杀虫蛋白，土壤中的除草剂毒莠定、莠去津、西玛津、扑草净甘草磷和丁草胺，水环境中的甲氰菊酯，环境中的甲胺磷、氟虫腈、除虫脲、甲基对硫磷和毒死蜱。

本发明中，多巴胺通过自聚合形成聚多巴胺沉积在基底表面，通过聚多巴胺的化学反应性与抗体反应形成PDA-抗体检测界面，通过抗体与抗原的特异性反应接入待测抗原；加入与待测抗原呈特异反应的酶联抗体(二抗)，形成“双抗夹心”；之后加入酶的发光底物，发光底物在酶的作用下发生化学反应并释放大量的能量，产生激发态的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用光学方法测定底物浓度，从而得到样品中抗原的含量。

本发明的创新性和优势如下：

1、将聚多巴胺应用于检测界面的制备，并应用于生物医学、食品安全、环境监控等领域具有创新性，同时拓展了聚多巴胺的应用范围。

2、新型聚多巴胺生物检测表面的制备方法较为新颖，且重现性较好，准确率较高，具有很高的应用价值。

3、由于聚多巴胺具有良好的粘附性，几乎可以修饰所有基底表面，拓展了生物医学检测的应用范围。

附图说明

图1是PDA-抗体界面检测标本中抗原含量示意图。

图2是PDA膜的制备与表征，其中图2a为不同反应时间对PDA膜接枝率的影响；图2b为不同DA浓度对PDA膜接枝率的影响，图2c和2d分别为PDA膜的SEM图和拉曼光谱图。

图3是“一步法”(a)和“两步法”(b)测得的不同浓度PCT抗体的接枝率以及两者接枝率的比较(c)。

图4是“一步法”(a)和“两步法”(b)测得的不同浓度甲胎蛋白抗体的接枝率以及两者接枝率的比较(c)。

图5“一步法”制备的PDA-抗体检测界面测得的PCT抗原(a)和AFP抗原(b)发光值随浓度的变化曲线。

图6是“两步法”制备的PDA-抗体检测界面测得的PCT抗原(a)和AFP抗原(b)发光值随浓度的变化曲线

图7a是使用“一步法”制备的PDA-抗体检测界面检测肉制品中沙门氏菌含量。

图7b是使用“两步法”制备的PDA-抗体检测界面检测土壤中莠去津含量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明，但仅是对本发明的示例性说明，而非对本发明范围的限制。

实施例1：PDA膜的制备与表征

选取5mg/mL DA溶液，测定不同反应时间对聚多巴胺接入量的影响，结果如图2(a)所示。由图可知，随着反应时间的增加，基底的吸光度增加， PDA接入量增大；当DA含量为5mg/mL时，反应4h和6h后吸光度变化不大，故可选取4小时作为最佳PDA反应时间。配制不同浓度的DA溶液(0，0.2，0.5，1，2，3，4，5mg/mL)，测定反应4小时后的吸光度。由图2(b)可知，随浓度增大，基底的吸光度增大，PDA接入量增大。鉴于DA浓度过高，导致基底偏黑，透明度较差，故选取2mg/mL多巴胺溶液反应4小时进行以下实验。

将多巴胺溶于25mL tris-Hcl缓冲液中(10mM,pH 8.5)，配制成2mg/mL的DA溶液。将盖玻片置于DA溶液中，反应4小时后，用蒸馏水清洗并干燥后使用拉曼光谱仪、场发射扫描电子显微镜对制备的基底表面进行表征。PDA膜的SEM图见图2(c)，从图上可见DA经过自聚合形成PDA膜后表面均匀平滑。拉曼光谱中在1564cm^-1和1417cm^-1处存在两个宽峰，分别是PDA中苯环的伸缩振动和变形振动，证实了PDA膜的形成(图2d)。

实施例2：一步法”和“两步法”测PCT抗体的接枝率

根据实施例1，选取2mg/mL DA溶液反应4小时并清洗干燥后，一组不加戊二醛直接加入PCT抗体溶液(0.1，5，10，20，30，40，50μg/mL)反应过夜(一步法)；另一组加入200μL 1％戊二醛反应4小时后再加入PCT抗体溶液反应过夜(两步法)。取出反应上清液并清洗孔板，使用Bradford法分别测量孔板的吸光度，代入标准曲线计算PCT抗体的接枝率，结果见图3。从图可以看出，使用“一步法”得到PCT抗体的接枝率约在30～45％之间，使用“两步法”得到PCT抗体的接枝率约在35～50％；结合图3c可知使用“两步法”获得的PCT抗体的接枝率略微高于“一步法”，但两者相差不大。本实验证明PCT抗体可以直接或间接与PDA反应，生成PDA/ 抗体生物检测界面，从而进一步应用于抗原的检测，在生物医学检测中具有良好的应用前景。

实施例3：“一步法”和“两步法”测AFP抗体的接枝率

方法如实施例2，选取2mg/mL DA溶液反应4小时并清洗干燥后，一组不加戊二醛直接加入AFP抗体溶液2ml(0.1，5，10，20，30，40，50μg/mL)反应过夜；另一组加入200μL 1％戊二醛反应4小时后再加入AFP抗体溶液反应过夜。实施例2相同方法计算PCT抗体的接枝率，结果见图4。从图可以看出，使用“一步法”得到AFP抗体的接枝率约在30～40％之间，使用“两步法”得到AFP抗体的接枝率约在37～45％；

实施例4：“一步法”制备的PDA-抗体检测界面检测待测样品中PCT抗原和AFP抗原含量。

于不透光8磁条中使用“一步法”制备PDA-抗体检测界面，向孔板中加入Tris溶液100μL反应15分钟，封闭醛基；加入100μL POB封闭液(1×PBS，0.5％BSA，0.1％吐温)于37℃下摇床封闭5min，封闭5次，之后用HRP系清洗液清洗3次，分别加入不同浓度的PCT抗原标准溶液(AFP标准溶液)25μL(0，0.1，0.5，4，20，50，100ng/mL)和25μL配制样品(2，10，75ng/mL)，5μL PCT-HRP液(AFP-HRP液)，反应30min，用HRP系清洗液清洗3次，加鲁米诺A/B液25μL，2分钟后于化学发光仪中测定发光值。

不同浓度的PCT和AFP抗原标准溶液的发光值和浓度的关系如图5。从图可以看出，随着浓度的增大，发光值也变大。发光值和浓度之间存在着良好的线性关系。使用“一步法”测得PCT的线性方程为y＝198.33x+6077.4，相关系数R²＝0.9923；测得AFP的线性方程为y＝262.48x+9817.4，相关系数R²＝0.9746。将PCT，AFP配制样品的测定值与计算值比较，发现相差值均不大(表1)，具有良好的重现性和较高的准确率，表明将PDA应用于抗原的检测具有一定的可行性。

表1

实施例5：“两步法”制备的PDA-抗体检测界面检测待测样品中PCT抗原和AFP发光值随浓度的变化曲线

方法同实施例2。于不透光8磁条中使用“两步法”制备PDA-抗体检测界面，向孔板中加入Tris溶液100μL反应15分钟，封闭醛基；加入100μL POB封闭液(1×PBS，0.5％BSA，0.1％吐温)于37℃下摇床封闭5min，封闭5次，之后用HRP系清洗液清洗3次，分别加入不同浓度的PCT抗原标准溶液(AFP标准溶液)25μL(0，0.1，0.5，4，20，50，100ng/mL)和25μL配制样品(2，10，75ng/mL)，5μL PCT-HRP液(AFP-HRP液)，反应30min，用HRP系清洗液清洗3次，加鲁米诺A/B液25μL，2分钟后于化学发光仪中测定发光值。

不同浓度的PCT抗原标准溶液的发光值和浓度的关系如图6。从图可以看出，发光值和浓度之间存在着良好的线性关系。使用“两步法”测得PCT的线性方程为y＝290.22x+5147.8，相关系数R²＝0.9564。测得AFP的线性方程为y＝336.84x+8742.6，相关系数R²＝0.9825。将PCT，AFP配制样品的测定值与计算值比较，发现相差值均不大(表2)，具有良好的重现性和较高的准确率。

表2

以PCT为例，当接入PCT抗体浓度为50μg/mL时，由计算得“一步法”和“两步法’的检测限均为2ng/mL，检测范围0.1-100ng/mL。与传统的双抗夹心法相比，检测限较低，灵敏度较高(表3)，可作为新型生物医用检测界面。

表3

实施例6：“一步法”制备的PDA-抗体检测界面检测肉制品中沙门氏菌含量

在板条孔板中使用“一步法”制备的PDA-抗体检测界面，向孔板中加入BSA液200μL，于37℃下摇床封闭1h，之后用HRP系清洗液清洗3 次。设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品25μL(0，0.1，0.5，4，20，50，100ng/mL)，待测样本孔加经增菌和包被处理的待测样本(人工污染沙门氏菌的香肠)25μL以及使用标准品稀释配制的样品(1ng/ml，10ng/ml)。轻微震荡后加入5μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。弃去液体，吸水纸上吸干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸吸干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A/B液25μL，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液(2M硫酸)20μL，15min内使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值。以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准曲线(如图7a)，按曲线方程计算各样本浓度值。从图7中可知，Y＝0.0133X+0.0697，R²＝0.9827。测得配制样品的实际OD值和带入标准曲线的计算值见表4，可知两者差异性不大，重现性较好，准确率较高。测得香肠待测样品的OD值为0.0937，带入标准曲线得到香肠中沙门氏菌的含量为1.8045。检测限为0.5ng/ml、检测范围0.1-50ng/ml。

实施例7：“两步法”制备的PDA-抗体检测界面检测稻田土壤中除草剂毒莠定的残留量

在板条孔板中使用“两步法”制备PDA-抗体检测界面，清洗后向每孔中加入300μL封闭液(含1％牛血清蛋白的PBS溶液，pH＝7.4)，37℃下封闭30min。设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品25μL(0，0.1，0.5，5，10，50，100，500ng/mL)，待测样本孔加处理后的待测样本(喷洒过毒莠定的试验稻田土壤液)以及使用标准品稀释配制的样品(1ng/ml，20ng/ml)各25μL。每种样品滴加3孔，37℃下反应30min。

倒掉反应液并洗板，每孔加入100μL HRP-羊抗兔抗体(稀释体积比为1：500)，避光室温下反应倒掉反应液并洗板，每孔加入100μL底物溶液(OPD-H₂O₂)，避光酶促反应20min后，加入50μL终止液(2M硫酸)，终止反应。用酶标仪检测490nm下的吸光度。以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准曲线(如图7b)，按曲线方程计算各待测样本浓度值。从图中可知，Y＝0.0051X+0.0445，R₂＝0.9951。测得配制样品的实际OD值和带入标准曲线的计算值见表4，可知两者差异性不大，重现性较好，准确率较高。测得香肠待测样品的OD值为0.0627，带入标准曲线得到稻田土壤中毒莠定的残留量为3.5687。检测限为0.5ng/ml、检测范围0.1-100ng/ml。

表4

Claims

1.一种利用聚多巴胺生物检测表面进行抗原检测的方法，其特征在于：过程如下：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基底包括孔板、玻璃、纤维、石英和塑料。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中聚多巴胺直接与抗体溶液反应过夜制备抗体检测界面，或，使用戊二醛作为交联剂，聚多巴胺先与多官能团化合物反应，再与抗体溶液反应过夜制备抗体检测界面。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述多官能团化合物包括多聚甲醛、乙二醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛、环氧氯丙烷、环己烷甲醛和环戊烷羧酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述光学方法包括化学发光法、分光光度法如紫外光谱法和荧光光谱法。

6.权利要求1-5所述的方法用于生物医学检测，其特征在于：所述抗原包括血液、尿液、唾液、汗液、体液标本中降钙素原(PCT)、甲胎蛋白(AFP)、甲状腺球蛋白TG、人绒毛膜促性腺激素hCG、胰岛素、甲状旁腺激素(PTH)、骨钙素、癌胚抗原、铁蛋白、糖类抗原、前列腺特异抗原PSA、鳞状细胞癌抗原SCCA、组织多态性抗原TPA、促黄体生成激素、雌二醇、睾酮、垂体泌乳素、肌钙蛋白T、衣原体、弓形虫、ABO血型抗原、ABH抗原、人游离前列腺特异性抗原(fPSA)、人总前列腺特异抗原(tPSA)、过氧化物酶金葡菌A蛋白、狂犬病毒抗原RV-Ag、人淋巴细胞抗原、人组织多肽抗原(TPA)、人痢疾内阿米巴抗原、单纯疱疹病毒抗原、人糖连抗原724和人新型隐球菌抗原。

7.权利要求1-5所述的方法用于食品检测，其特征在于：所述抗原包括黄曲霉、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、沙门氏菌、军团菌、大肠杆菌、李斯特菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌、伏马毒素、赭曲毒素、河豚毒素、CP4EPS蛋白、免疫球蛋白、氨苄西林钠、脱氧雪腐镰刀菌烯酮和展青霉素黄曲霉毒素。

8.权利要求1-5所述的方法用于环境监测，其特征在于：所述抗原包括垃圾焚烧飞灰中的二噁英，土壤中的苏云金芽孢杆菌的Bt杀虫蛋白，土壤中的除草剂毒莠定、莠去津、西玛津、扑草净甘草磷和丁草胺，水环境中的甲氰菊酯，环境中的甲胺磷、氟虫腈、除虫脲、甲基对硫磷和毒死蜱。