CN106093421A - 一种唾液降钙素原荧光免疫检测方法 - Google Patents

一种唾液降钙素原荧光免疫检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫检测分析的技术领域，尤其是一种唾液降钙素原荧光免疫检测方法，包含有唾液收集器、唾液、抗降钙素原抗体、荧光试剂和检测器。唾液收集器包括收集管、收集棒、收集刮片的一种或组合；抗降钙素原抗体为抗降钙素原单克隆抗体和抗降钙素原多克隆抗体的一种或组合；荧光试剂为含有所述荧光物质的液相和/或固相材料，荧光物质为有机荧光染料或稀土元素荧光染料的一种或组合；检测器为荧光检测器。以人体唾液为检测样本，可有效监测唾液中降钙素原，特异性强，重复性好，灵敏度高，操作简单，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广，适合于现场检测。

Description

一种唾液降钙素原荧光免疫检测方法
技术领域
本发明涉及免疫检测分析的技术领域，尤其是一种唾液降钙素原荧光免疫检测方法。
背景技术
降钙素原(PCT)是一种含116个氨基酸的无激素活性糖蛋白，分子量为13KD。其半衰期为25-30h。在生理情况下由甲状腺-C细胞产生，含量极少，在健康人群的血清或脑脊液中几乎不能被检出。据文献介绍,在细菌、真菌、寄生虫等感染性疾病并有全身和中枢神经系统性炎症反应时，病菌的内毒素可促使甲状腺-C细胞、肝脏巨噬细胞和单核细胞、肺和肠道组织的淋巴细胞以及神经内分泌细胞等甲状腺以外的组织大量产生PCT，而导致其血清和脑脊液中的含量升高或持续性升高，且与感染的程度、进展或消退呈正相关。在病毒感染、慢性非生物性炎症、癌性发热、药热、自身免疫性疾病以及手术创伤患者的PCT水平却不增高或仅有轻度短暂性增高。其敏感度和特异性远高于传统的C-反应蛋白和外周血白细胞计数的检测，因而具有重要的临床诊断和鉴别诊断价值。
目前检测PCT常用的实验室方法有放射免疫学分析法(RIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、胶体金比色法(GICA)和酶联免疫法(ELISA)，众多血液样本PCT检测技术与产品已广泛应用于临床，这些产品取得了比较满意的准确率。但采用唾液进行PCT快速检测的产品还鲜有面市。
其实，唾液与广泛应用于临床检测的血液(包括全血、血清与血浆)均是人体体液的一部分，都属于细胞外液，其大多数成分类似，尤其是临床检测中具有重大意义目标物质的出现时机具有一致性，只是含量存在一定差异。因而唾液被认为是人体健康状态的一面镜子，能反映出机体的各种内环境状态，例如癌症、感染、系统性疾病等。Challacombe的研究结果证实唾液中IgG可及时反映体内IgG的存在；Parry通过RIA及ELISA对唾液的特异性抗体水平进行研究表明：唾液中抗体含量虽远低于血清，IgA、IgG与IgM分别大约为血清含量的1/10、1/800、1/400，但已足够用于某些免疫学诊断。另外在临床中，于唾液中寻找诊断标志物是最理想的方法，因为收集唾液存在简单、方便、无创、经济、不会引起患者不安、操作者易于掌握等优点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术中之不足，提供一种适用范围、灵敏度高、准确性强、操作简便、能够快速诊断唾液降钙素原的唾液降钙素原荧光免疫检测方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种唾液降钙素原荧光免疫检测方法，包含有唾液收集器、唾液、抗降钙素原抗体、荧光试剂和检测器。所述唾液收集器包括收集管、收集棒、收集刮片的一种或组合；所述抗降钙素原抗体为抗降钙素原单克隆抗体和抗降钙素原多克隆抗体的一种或组合；所述荧光试剂为含有所述荧光物质的液相和/或固相材料，所述荧光物质为有机荧光染料或稀土元素荧光染料的一种或组合；所述检测器为荧光检测器。
进一步的，所述的检测方法包括如下步骤：
1)用化学交联或生物分子间特异性作用将荧光染料偶联到降钙素原特异性抗体1表面，得到荧光染料修饰的降钙素原特异性抗体载体，荧光染料的发射波长范围为300～1300nm；
2)制备荧光免疫层析试纸条，所述荧光免疫层析试纸条包括标记垫、层析膜、吸水垫和底板；
3)配置清洗缓冲液，所述清洗缓冲液包含牛血清白蛋白、蔗糖和表面活性剂，pH值为7.0-8.0，其中，牛血清白蛋白的浓度为0.05～2％，蔗糖的浓度为1～15％，表面活性剂的浓度为0.05～2％。
4)将步骤1)得到的所述荧光染料修饰的降钙素原特异性抗体2固定到所述标记垫上；
5)在所述层析膜上分别设置一条检测线和一条质控线，其中，质控线上固定有能与所述荧光染料修饰的降钙素原特异性抗体载体相结合的生物分子，检测线上固定有降钙素原特异性抗体；
6)将所述标记垫、层析膜、吸水垫和底板组合，构建成降钙素原荧光免疫层析试纸条；
7)将收集的所述唾液加载到所述标记垫上，所述唾液中所含有的所述降钙素原与所述荧光染料修饰的降钙素原特异性抗体结合，形成“荧光染料-降钙素原特异性抗体1-降钙素原”复合物，即复合物1；
8)含有所述复合物1的液相流经层析膜，形成“荧光染料-降钙素原特异性抗体1-降钙素原-降钙素原特异性抗体2”复合物，即复合物2，并被捕获固定在所述固相膜上；
9)用所述荧光检测器检测被间接固定到所述固相膜上的荧光染料产生的荧光值，以检测所述唾液降钙素原的含量。
进一步的，所述的标记垫上的荧光染料发射波长为550-800nm，优选665nm。
进一步的，所述层析膜和所述底板在大于550nm时荧光很弱或不含有荧光剂，优选底板为白色，表面附有不干胶，且两者均不含荧光剂。
本发明的有益效果是：本发明以人体唾液为检测样本，可有效监测唾液中降钙素原，特异性强，重复性好，灵敏度高，操作简单，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广，适合于现场检测。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明中荧光免疫层析试纸条的结构示意图。
图中1.底板，2.样品垫，3.吸水垫，4.层析膜，5.标记垫，6.检测线，7.质控线。
具体实施方式
现在结合附图和优选实施例对本发明作进一步的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。
如图1所示的一种唾液降钙素原荧光免疫检测方法，包含有唾液收集器、唾液、抗降钙素原抗体、荧光试剂和检测器，具有如下特征：
1)所述唾液收集器包括收集管、收集棒、收集刮片的一种或组合；
2)所述抗降钙素原抗体为抗降钙素原单克隆抗体和抗降钙素原多克隆抗体的一种或组合；
3)所述荧光试剂为含有所述荧光物质的液相和/或固相材料，所述荧光物质为有机荧光染料或稀土元素荧光染料的一种或组合；
4)所述检测器为荧光检测器。
一种唾液降钙素原荧光免疫检测方法，包括如下步骤：
1)用化学交联或生物分子间特异性作用将荧光染料偶联到降钙素原特异性抗体1表面，得到荧光染料修饰的降钙素原特异性抗体，荧光染料的发射波长范围为300～1300nm；
2)制备荧光免疫层析试纸条，所述荧光免疫层析试纸条包括标记垫5、层析膜4、吸水垫3和底板1；
3)配置清洗缓冲液，所述清洗缓冲液包含牛血清白蛋白、蔗糖和表面活性剂，pH值为7.0-8.0，其中，牛血清白蛋白的浓度为0.05～2％，蔗糖的浓度为1～15％，表面活性剂的浓度为0.05～2％。
4)将步骤1)得到的所述荧光染料修饰的降钙素原特异性抗体1固定到所述标记垫上；
5)在所述层析膜4上分别设置一条检测线6和一条质控线7，其中，质控线7上固定有能与所述荧光染料修饰的降钙素原特异性抗体载体相结合的生物分子，检测线6上固定有降钙素原特异性抗体2；
6)将所述标记垫5、层析膜4、吸水垫3和底板1组合，构建成降钙素原荧光免疫层析试纸条；
7)将收集的所述唾液加载到所述标记5垫上，所述唾液中所含有的所述降钙素原与所述荧光染料修饰的降钙素原特异性抗体结合，形成“荧光染料-降钙素原特异性抗体1-降钙素原”复合物，即复合物1；
8)含有所述复合物1的液相流经层析膜，形成“荧光染料-降钙素原特异性抗体1-降钙素原-降钙素原特异性抗体2”复合物，即复合物2，并被捕获固定在所述固相膜上；
9)用所述荧光检测器检测被间接固定到所述固相膜上的荧光染料产生的荧光值，以检测所述唾液降钙素原的含量。
标记垫5上的荧光染料发射波长为550-800nm，优选665nm，层析膜4和所述底板1在大于550nm时荧光很弱或不含有荧光剂，优选底板为白色，表面附有不干胶，且两者均不含荧光剂。
具体的采用化学交联或生物分子间特异性作用将荧光染料偶联到降钙素原单克隆抗体的表面，得到荧光染料修饰的降钙素原单克隆抗体。在本发明中，当荧光染料表面存在活性基团时，可将其直接与特异性抗体反应，不需用化学交联剂；反之，则需通过化学交联剂偶联。其中，化学交联剂包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及戊二醛等。
在本发明的一个优选实施例中，采用有活性基团的荧光染料修饰降钙素原单克隆抗体，步骤为：将纯化后的荧光染料溶解，然后加入一定量的降钙素原单克隆抗体，以缓冲液作为反应介质，反应2～4小时，加入盐酸羟胺终止反应，用色谱、层析柱或超滤离心等方式纯化，得到荧光染料修饰的降钙素原单克隆抗体。
为了提高信号与背景的区分度，本发明中荧光染料的波长范围为300～1300nm，优选为550-800nm。此外，层析膜4、底板1和扣卡一般在近红外区域(600～800nm)荧光强度极弱，因此，优选波长范围为550-800nm的荧光染料以进一步提高灵敏度，更优选荧光染料发射波长为665nm。
荧光染料包括有机荧光染料和稀土元素荧光染料，荧光染料可以偶联到胶乳微球上，变成了荧光微球的形式，荧光染料可以是单一化合物的荧光染料或者由几种化合物组成的复合荧光染料，但优选单一化合物荧光染料、且优选具有较强的光稳定性的荧光染料。荧光染料例如Alexa Fluro系列的荧光素。
为了降低对荧光染料荧光信号的影响，采用弱荧光的层析膜4、底板1以及扣卡，其荧光噪声在大于550nm是会很弱，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。优选底板1为白色，表面附有不干胶，且扣卡、层析膜4、底板1及不干胶均不含有荧光剂。
荧光免疫层析试剂盒对唾液样品中的降钙素原进行定量检测。检测时，将唾液样品通过加样孔加入到样品垫2中，样品沿层析膜4向吸水垫3方向层析运动。样品层析时间通常为8～25分钟，优选15分钟。层析过后，用清洗缓冲液清洗层析膜4，时间为3-8分钟，优选5分钟，以降低本底，提高检测灵敏度。清洗缓冲液中包含牛血清白蛋白、蔗糖和表面活性剂，pH值为7.0-8.0，其中，牛血清白蛋白的浓度为0.05～2％，蔗糖的浓度为1～15％，表面活性剂的浓度为0.05～2％。表面活性剂优选吐温20、曲拉通X-100，缓冲液优选Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液，层析结束后，用荧光定量仪判断检测窗中的检测线6和质控线7，以得出结果。
实施例1：一种唾液降钙素原荧光免疫检测方法，具体在步骤如下：
(一)、唾液降钙素原荧光免疫检测试剂盒的制备
1)荧光染料与抗体的偶联
将发射波长为665nm的荧光染料罗丹明与l mg/ml的降钙素原单克隆抗体混合，室温反应3h，加入1mol/L盐酸羟胺终止反应，并用色谱柱或层析柱分离纯化，得到荧光染料修饰的降钙素原单克隆抗体，荧光染料发射波长为665nm。
2)试剂盒的构建，包括如下步骤：
a.取荧光染料标记物，加入牛血清白蛋白(含量为1％)、蔗糖(含量为10％)以及表面活性剂曲拉通X-100(含量为0.8％)，随后均匀喷涂在标记垫上，40℃干燥后密封，室温下保存。
b.组装唾液降钙素原荧光免疫检测试剂条，由样品垫2、标记垫5、层析膜4、吸水垫3组成，底板1的两端部分别有样品垫2和吸水垫3，样品垫2与层析膜4之间搭接有标记垫5，吸水垫3搭接在层析膜4上，层析膜4上固定有一条检测线6和一条质控线7。其中，样品垫2为孔状隔膜，选择玻璃纤维，为待测样品收集区；标记垫5中含有荧光染料修饰降钙素原单克隆抗体；层析膜4上固定有定量检测线6和质控线7，检测线6和质控线7的间隔为5mm，且检测线6固定有区别于标记垫中羊抗人降钙素原多克隆抗体，质控线7固定有羊抗鼠IgG。组装好后，按照要求切割为所需宽度，并置于扣卡内，加入干燥剂封装，与清洗缓冲液共同构建为唾液降钙素原荧光免疫检测试剂盒。
(二)、唾液降钙素原荧光免疫检测试剂盒的检测方式，包括以下步骤：
a)取出待检测的唾液样本；
b)滴加80ul于加样孔中，正向层析反应15min；
c)配清洗缓冲液，pH值为7.5，缓冲系统为20mM的磷酸盐，加入牛血清白蛋白(浓度为1％)、蔗糖(浓度为10％)以及表面活性剂曲拉通X-100(浓度为0.8％)，在样品孔加入50μL，静置5min；
d)置于荧光定量仪中获取荧光信号强度，得出所检唾液样品的浓度。
(三)、唾液降钙素原荧光免疫检测试剂盒的性能评估试验
1)标准工作曲线的绘制：
取降钙素原抗原用正常人唾液稀释成浓度为10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL的唾液标本，再分别测定其降钙素原，以配成值为X，荧光实测值为Y绘制标准工作曲线，经统计拟合标准工作曲线的表达式列出回归方程为：Y＝0.05872X+0.12315，拟合系数的平方为R2＝0.98。结果见附图1，图1为线性检测标准工作曲线，降钙素原测定范围为0.5～10ng/ml。
2)准确性试验
取同一患者唾液标本，用同一批次的试纸条重复检测3次，计算出相对偏差B值为10.9％。符合产品设计要求
3)重复性试验
取同一患者唾液标本，用同一批次的试纸条同时检测20次，计算出变异系数CV值为3.15％。符合产品设计要求。
图1标准曲线
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种唾液降钙素原荧光免疫检测方法，包含有唾液收集器、唾液、抗降钙素原抗体、荧光试剂和检测器，具有如下特征：
1)所述唾液收集器包括收集管、收集棒、收集刮片的一种或组合；
2)所述抗降钙素原抗体为抗降钙素原单克隆抗体和抗降钙素原多克隆抗体的一种或组合；
3)所述荧光试剂为含有所述荧光物质的液相和/或固相材料，所述荧光物质为有机荧光染料或稀土元素荧光染料的一种或组合；
4)所述检测器为荧光检测器。
2.根据权利要求1所述的一种唾液降钙素原荧光免疫检测方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)用化学交联或生物分子间特异性作用将荧光染料偶联到降钙素原特异性抗体1表面，得到荧光染料修饰的降钙素原特异性抗体，荧光染料的发射波长范围为300～1300nm；
2)制备荧光免疫层析试纸条，所述荧光免疫层析试纸条包括标记垫、层析膜、吸水垫和底板；
3)配置清洗缓冲液，所述清洗缓冲液包含牛血清白蛋白、蔗糖和表面活性剂，pH值为7.0-8.0，其中，牛血清白蛋白的浓度为0.05～2％，蔗糖的浓度为1～15％，表面活性剂的浓度为0.05～2％。
4)将步骤1)得到的所述荧光染料修饰的降钙素原特异性抗体1固定到所述标记垫上；
5)在所述层析膜上分别设置一条检测线和一条质控线，其中，质控线上固定有能与所述荧光染料修饰的降钙素原特异性抗体载体相结合的生物分子，检测线上固定有降钙素原特异性抗体2；
6)将所述标记垫、层析膜、吸水垫和底板组合，构建成降钙素原荧光免疫层析试纸条；
7)将收集的所述唾液加载到所述标记垫上，所述唾液中所含有的所述降钙素原与所述荧光染料修饰的降钙素原特异性抗体结合，形成“荧光染料-降钙素原特异性抗体1-降钙素原”复合物，即复合物1；
8)含有所述复合物1的液相流经层析膜，形成“荧光染料-降钙素原特异性抗体1-降钙素原-降钙素原特异性抗体2”复合物，即复合物2，并被捕获固定在所述固相膜上；
9)用所述荧光检测器检测被间接固定到所述固相膜上的荧光染料产生的荧光值，以检测所述唾液降钙素原的含量。
3.根据权利要求2所述的一种唾液降钙素原荧光免疫检测方法，其特征在于：所述的标记垫上的荧光染料发射波长为550-800nm，优选665nm。
4.根据权利要求2所述的一种唾液降钙素原荧光免疫检测方法，其特征在于：所述层析膜和所述底板在大于550nm时荧光很弱或不含有荧光剂，优选底板为白色，表面附有不干胶，且两者均不含荧光剂。
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