KR101619122B1 - 탈메틸화 의존적 ａｓｃ 발현을 촉진시켜서 대장암 종양세포의 사멸감수성을 증진시키는 항암제 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

탈메틸화 의존적 ａｓｃ 발현을 촉진시켜서 대장암 종양세포의 사멸감수성을 증진시키는 항암제 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 탈메틸화 의존적 ASC 발현을 촉진시키는 대장암 종양세포의 사멸감수성 증진 기술을 사용하면 기존에 비해 대장암 치료용 항암제와 병용 투여할 수 있는 후보 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있고, 대장암을 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

탈메틸화 의존적 ＡＳＣ 발현을 촉진시켜서 대장암 종양세포의 사멸감수성을 증진시키는 항암제 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법 {Screening method for enhancing the sensitization of colorectal cancer cell death by demethylation-induced ASC expression}
본 발명은 탈메틸화 의존적 ASC( A poptosis-associated s peck-like protein containing a c aspase recruitment domain) 발현을 촉진시켜서 대장암 종양세포의 사멸감수성을 증진시키는 항암제 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
의학이 발전한 오늘날에도, 암 환자의 대부분은 진행된 단계에서 발견되며, 대부분의 암 환자는 사망한다. 하지만, 임상에서 암의 초기 진단은 암 세포수가 일정수 이상이 되어야만 판별할 수 있으며, 이러한 단계에서 현재 사용하는 항암제의 효과는 미비한 실정이다.
최근에는, DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있다. 특정 유전자의 프로모터 CpG섬이 과메틸화되어 있을 때, 그 유전자의 발현은 차단(gene silencing)되게 된다. 이는 생체 내에서 유전자의 단백질 지정 코딩서열(coding sequence)에 돌연변이(mutation)가 없이도 그 유전자의 기능이 소실되는 주요 기전이며, 인체 암에서 다수의 종양억제 유전자(tumor suppressor genes)의 기능이 소실되는 원인으로 해석되고 있다. 따라서 종양억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화를 검색하는 것은 암의 연구에 큰 도움이 되며, 이를 메틸화 특이 PCR(이하 MSP라고 함)이나 자동염기분석 등의 방법으로 검사하여 암의 진단과 스크리닝 등에 이용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다.
ASC 발현량에 따른 대장암의 초기 진단에 관한 기술은 이미 개시되어 있다. 하지만, 본 발명자들은 대장암에서 메틸화에 의한 ASC 발현 감소 및 탈메틸화제에 의한 ASC 발현의 회복 및 이에 의한 항암제의 세포사멸 감수성증가를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 항암제에 대한 내성을 가진 암에 대한 항암 치료 효과를 증진시키기 위해 암 치료용 항암제와 병용 투여할 수 있는 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서는 (a) 암 세포주의 ASC(Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain) 발현을 측정하는 단계; (b) 정상 세포의 ASC 발현을 측정하는 단계;　　(c) (a) 단계의 ASC 발현이 (b) 단계의 ASC 발현보다 감소한 경우, 상기 암 세포주에 항암제 병용 투여용 후보물질을 접촉시키는 단계;　　(d) (c) 단계의 암 세포의 ASC 발현이 증가한 경우, 상기 후보물질을 암 치료용 항암제의 병용 투여용으로 판단하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, ASC는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열인 암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법이다. 상기 구체예에서, 상기 후보물질은 탈메틸화제를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법이다. 상기 구체예에서, 상기 ASC 발현의 증가는 암 치료용 항암제에 대한 사멸감수성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법이다. 상기 구체예에서, 상기 ASC 발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법이다. 상기 구체예에서, 상기 mRNA 수준의 측정은 서열번호 2로 표시되는 ASC 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로 PCR 반응을 통해 측정하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법이다. 상기 구체예에서, 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법이다. 상기 구체예에서, 상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법이다. 상기 구체예에서, 상기 정상 세포는 대장 세포인 것을 특징으로 하는 암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법이다. 본 발명의 일 구체예에서, ASC 발현이 억제된 암세포주에 항암제 병용 투여용 후보물질을 접촉시키고, 상기 암 세포주의 ASC 발현이 증가한 경우, 상기 후보물질을 암 치료용 항암제의 병용 투여용으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.
본 발명에서 "PCR"은 DNA 주형을 증폭하는 반응으로, 변성(denaturation) 단계, 어닐링 (annealing) 단계 및 신장 (polymerization) 단계를 거치며, 이 과정을 수 십 회 반복한다. 변성 단계는 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 분리하는 단계이고, 어닐링 단계는 프라이머가 주형 DNA에 특이적으로 결합하는 단계이며, 신장 단계는 DNA 중합 효소에 의하여 상기 주형 DNA에 상보적인 DNA가 상기 프라이머로부터 신장되는 단계이다.
본 발명에서 "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914).
본 발명에서 "암"이란 "제어되지 않은 세포성장"으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양 (tumor)이라고 불리는 세포덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 한다.
본 발명에서 "대장암(colon cancer)"이란 대장의 가장 안쪽 표면인 점막에서 발생한 암으로, 직장암, 결장암 및 항문암을 통칭한 것을 의미한다.
본 발명에서 "바이오마커"는 질병의 진행 또는 치료의 효과를 측정하기 위해 이용될 수 있는 특이적 생물 특성, 생화학적 특징 또는 양상의 분자 지표이다. 단백질 및 핵산은 예시적인 바이오마커이다. 특히, 핵산은 혈액, 소변 및 뇌척수액을 비롯한 대부분의 체액에서 확인되었으며, 질병을 위한 진단 바이오마커로 사용하기 위해 성공적으로 적용되었다.
본 발명에서 "대장암의 진단 마커"는 대장암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비해 대장암을 가진 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예-mRNA), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류, 다당류 등)과 같은 유기 생체 분자를 포함한다.
유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRCpress), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001))을 이용하여 실시할 수 있다.
RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 단일가닥 cDNA를 제조한다. 이어, 단일가닥 cDNA를 주형으로 이용하고, 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 유전자-특이적 프라이머 세트는 하기 표 2에서 열거 되어 있다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 유전자의 발현량 변화를 측정한다.
단백질의 양의 변화는 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzymelinked immunosorbentassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods inMolecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 EdHarlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 표지된 단백질-특이 항체가 이용될 수 있다. 본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 시료가 처리된 세포로부터 추출물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계 (ⅱ) 일차항체로서의 Ire1 혹은 단백질-특이항체와 상기 세포 추출물을 반응시키는 단계 (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시 퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 및 o-페닐렌디아민(OPD)과 같은 기질이 이용될 수 있다. 상기 ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
대장암은 일반적으로 소득수준이 높은 집단에서 발생률이 높아 일반적으로 '선진국형 암'으로 인식되고 있으며 서양의 경우 암 사망에 있어서 제2위를 차지하는 암으로 전체 암의 약 15% 정도를 차지하고 있다. 미국의 경우 연간 약 56,000명이 대장암으로 사망하고 130,000명의 새로운 대장암 환자가 발생한다고 보고되고 있다. 현재, 우리나라에서 대장암 발생율은 매우 현저하게 증가하고 있으며, 사망률에 있어서 대장암이 전체 암에서 차지하는 비율이 위암, 간암, 폐암에 이어 제4위를 차지하는 암으로써 최근 20년간 대장암에 의한 사망률은 2배 이상 증가하고 있는 실정이다. 대장암 환자의 생존률을 높이기 위한 많은 노력이 진행되고 있으나 기존 치료법을 통하여 생존률을 향상시키기 어려운 상태이다. 따라서, 대장암을 정확하게 조기진단할 수 있는 진단시스템의 개발이 필수적이며, 이는 대장암 관련 마커 유전자의 발굴과 관련되어 있다. 또한, 대장암 마커를 활용하여 대장암의 예후를 예측하고 적절한 치료방법을 정할 수 있다.
한편, 암의 진단에 대한 유전자 검사를 활용이 점차 증가하고 있다. 모든 암에서 발현이 변화하는 유전자 또는 특정 암에서 발현이 변화하는 유전자를 탐색하여 진단에 활용하고 있으며, 혈액 내에서 간단하게 탐색할 수 있는 다양한 마커들을 찾아내었다. 실제 혈청에서 돌연변이형의 KRas 암유전자나 p53 종양억제 유전자, p16 유전자의 프로모터 메틸화, 그리고 마이크로세틀라이트 (microsatellite)의 표지와 불안정성(instability) 등을 검사하여 폐암과 두경부암, 유방암, 대장암, 간암 등을 진단하는 것이 활발하게 시도되고 있다 (Chen, X.Q. et al., Clin. Cancer Res., 5:2297, 1999; Esteller, M.et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedes, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Sozzi, G. et al., Clin. Cancer Res., 5:2689, 1999).
본 발명에서는 다양한 암 세포주에서의 ASC 유전자의 발현을 단백질 수준에서 탐색하였고(도 1), ASC 발현이 감소된 암 세포주에서 탈메틸화제인 5-AD를 처리하여 ASC 발현 수준이 회복되는 것을 확인하였다(도 2). 또한, 상기 ASC 발현이 감소된 암 세포주에서 ASC 발현 수준의 회복에 따른 항암제에 대한 사멸 감수성의 증가를 검증하였으며(도 3), ASC 발현이 감소되어 있는 세포주에 대하여 ASC 발현 벡터를 형질전환시켜서 안정적으로 ASC 발현하는 세포주를 제조하여, 항암제에 대한 사멸감수성이 향상됨을 확인하였다(도 4). 한편, ASC 발현이 증가된 암 세포주에서는 siRNA를 사용하여 ASC 발현을 억제함으로써 항암제에 대한 사멸감수성의 증가를 확인하였다(도 5).
본 발명의 탈메틸화 의존적 ASC 발현을 이용한 대장암 종양세포의 사멸감수성 증진 기술을 사용하여 대장암 치료용 항암제와 병용 투여할 수 있는 후보 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있고, ASC 발현이 억제된 대장암에 대하여 탈메틸화제를 포함하는 대장암 치료제의 병용 투여용 약학 조성물을 제조하여 대장암의 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
도 1은 다양한 암세포에서 ASC의 다양한 발현을 보여주는 결과이다.
도 2는 5-AD 처리한 대장암 세포주 DLD-1에서 ASC 발현이 회복됨을 보여주는 결과이다.
도 3은 5-AD 처리에 의해 ASC 발현이 회복된 대장암 세포주 DLD-1에서 항암제에 대한 세포사멸 감수성이 증가한 결과이다.
도 4는 ASC 유전자를 안정적으로 형질전환시킨 대장암 세포주 DLD-1의 항암제에 대한 세포사멸 감수성의 증가를 보여주는 결과이다.
도 5는 ASC 발현을 억제시킨 대장암 세포주 HT-29에서 항암제에 대한 세포사멸 감수성의 감소를 보여주는 결과이다.
대장암 세포주의 ASC 발현 측정
1.1 세포 배양
DLD-1 대장암 세포주는 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)에서 구입하였고, 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 항생제로써 100U/ml 페니실린/스트렙토마이신을 보충한 DMEM 배지에서 배양하였다. A549, NCI-1650, HCC827, PC-3, LNCaP, DMA-MB231, SK-BR3, MCF-7, HCT116, HT-29 및 THP-1 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)으로부터 구입하여 배양하였다. pPMSCV-퓨로마이신(puromycin) 벡터와 pcDNA3-T7-ASC 벡터는 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000, invitrogen)을 이용하여 DLD-1 세포주에 형질전환시켜서 ASC를 안정적으로 발현하는 DLD-1 세포주를 제조하였고, 형질전환 마커인 퓨로마이신 저항성 세포주를 선별하여 ASC 발현을 확인하였다.
1.2 ASC 발현의 확인
다양한 암세포주에서 세포 용해물을 추출하고, ASC에 특이적으로 결합하는 항체를 사용한 면역블롯 시험법을 통해 ASC 발현량을 측정하였다. ASC 프로모터 영역의 메틸화가 발생한 대장암 세포주인 HCT 116 및 DLD-1에서는 ASC 발현이 억제되어 있고, ASC 프로모터 영역의 메틸화가 없는 대장암 세포주인 HT-29에서는 ASC 발현이 증가한 것으로 관찰되었다(도1).
1.3 탈메틸화에 의한 ASC 발현의 회복
DLD-1 세포는 후생유전학적 메틸화(epigenetic methylation)에 의해 ASC 발현이 억제되어 있다. 따라서, 탈메틸화에 의해 ASC 발현이 회복되는 것을 확인하기 위해, DNA 메틸전이효소의 저해제인 5-AD를 DLD-1 세포주에 처리하고 ASC 발현의 회복을 확인하였다(도2).
ASC 발현과 항암제 감수성과의 상관 관계
2.1 ASC 발현이 억제된 대장암
대장암 세포주 DLD-1에서 메틸화에 의해 발현이 억제된 ASC의 암-억제 효과를 검증하기 위하여, 탈메틸화 제제인 5-AD를 전-처리한(primed) DLD-1 세포주에 화학적 항암제인 에포토시드(etoposide) 및 독소루비신(doxorubicin)을 처리하였다. 세포사멸은 CytoTox®96 비-방사선활성 세포독성 시험키트(Promega)를 사용하여 락테이트 탈수소효소(LDH, lactate dehydrogenase)의 세포외 분비의 측정을 통해 검사하였다. 5-AD에 의해 ASC 발현이 회복ㆍ증가된 DLD-1 대장암 세포주는 항암제에 대한 세포사멸감수성이 증가하였다(도3). 또한, ASC 유전자를 형질전환시켜서 ASC 발현이 증가된 DLD-1 대장암 세포주에서도 항암제에 대한 세포사멸 감수성이 증가하였다(도4).
2.2 ASC 발현이 증가된 대장암
ASC 발현과 대장암 세포주의 항암제 감수성의 관계를 증명하기 위해, ASC 프로모터의 탈메틸화에 의해 ASC 발현이 증가된 HT-29 대장암 세포주에서 siRNA를 사용하여 ASC의 발현을 감소시켰다. ASC 발현이 감소된 HT-29 대장암 세포주에 항암제를 처리하여, ASC 발현 감소에 의해 대장암 세포주의 항암제 감수성이 감소했음을 확인하였다(도5).
지금까지 예시적인 실시예을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시예로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> YONSEI UNIVERSITY <120> Screening method for enhancing the sensitization of colorectal cancer cell death by demethylation-induced ASC expression <130> IPDB50474 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 195 <212> PRT <213> HUMAN <400> 1 Met Gly Arg Ala Arg Asp Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu Asn Leu Thr 1 5 10 15 Ala Glu Glu Leu Lys Lys Phe Lys Leu Lys Leu Leu Ser Val Pro Leu 20 25 30 Arg Glu Gly Tyr Gly Arg Ile Pro Arg Gly Ala Leu Leu Ser Met Asp 35 40 45 Ala Leu Asp Leu Thr Asp Lys Leu Val Ser Phe Tyr Leu Glu Thr Tyr 50 55 60 Gly Ala Glu Leu Thr Ala Asn Val Leu Arg Asp Met Gly Leu Gln Glu 65 70 75 80 Met Ala Gly Gln Leu Gln Ala Ala Thr His Gln Gly Ser Gly Ala Ala 85 90 95 Pro Ala Gly Ile Gln Ala Pro Pro Gln Ser Ala Ala Lys Pro Gly Leu 100 105 110 His Phe Ile Asp Gln His Arg Ala Ala Leu Ile Ala Arg Val Thr Asn 115 120 125 Val Glu Trp Leu Leu Asp Ala Leu Tyr Gly Lys Val Leu Thr Asp Glu 130 135 140 Gln Tyr Gln Ala Val Arg Ala Glu Pro Thr Asn Pro Ser Lys Met Arg 145 150 155 160 Lys Leu Phe Ser Phe Thr Pro Ala Trp Asn Trp Thr Cys Lys Asp Leu 165 170 175 Leu Leu Gln Ala Leu Arg Glu Ser Gln Ser Tyr Leu Val Glu Asp Leu 180 185 190 Glu Arg Ser 195 <210> 2 <211> 588 <212> DNA <213> HUMAN <400> 2 atggggcgcg cgcgcgacgc catcctggat gcgctggaga acctgaccgc cgaggagctc 60 aagaagttca agctgaagct gctgtcggtg ccgctgcgcg agggctacgg gcgcatcccg 120 cggggcgcgc tgctgtccat ggacgccttg gacctcaccg acaagctggt cagcttctac 180 ctggagacct acggcgccga gctcaccgct aacgtgctgc gcgacatggg cctgcaggag 240 atggccgggc agctgcaggc ggccacgcac cagggctctg gagccgcgcc agctgggatc 300 caggcccctc ctcagtcggc agccaagcca ggcctgcact ttatagacca gcaccgggct 360 gcgcttatcg cgagggtcac aaacgttgag tggctgctgg atgctctgta cgggaaggtc 420 ctgacggatg agcagtacca ggcagtgcgg gccgagccca ccaacccaag caagatgcgg 480 aagctcttca gtttcacacc agcctggaac tggacctgca aggacttgct cctccaggcc 540 ctaagggagt cccagtccta cctggtggag gacctggagc ggagctga 588 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> HUMAN <400> 3 tgggcctgca ggagatg 17 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> HUMAN <400> 4 atttggtggg attgccag 18

Claims (10)

  1. (a) 대장암 세포주의 ASC(Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain) 발현을 측정하는 단계;
    (b) 정상 대장 세포의 ASC 발현을 측정하는 단계;
    (c) (a) 단계의 ASC 발현이 (b) 단계의 ASC 발현보다 감소되어 있는 경우, 상기 대장암 세포주에 항암제 병용 투여용 후보물질을 접촉시키는 단계;
    (d) 항암제 병용 투여용 후보물질과의 접촉으로 인하여 (c) 단계의 대장암 세포주의 ASC 발현이 증가한 경우, 상기 후보물질을 에토포시드(Etoposide) 또는 독소루비신(Doxorubicin)의 병용 투여용으로 판단하며,
    상기 ASC 발현의 증가는 에토포시드 또는 독소루비신에 대한 사멸감수성을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 대장암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    ASC는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열인, 대장암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 후보물질은 탈메틸화제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 ASC 발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 것을 특징으로 하는, 대장암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 mRNA 수준의 측정은 서열번호 2로 표시되는 ASC 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로 PCR 반응을 통해 측정하는 것을 특징으로 하는, 대장암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. ASC 발현이 억제된 대장암 세포주에 항암제 병용 투여용 후보물질을 접촉시키고, 상기 대장암 세포주의 ASC 발현이 증가한 경우, 상기 후보물질을 에토포시드(Etoposide) 또는 독소루비신(Doxorubicin)의 병용 투여용으로 판단하며,
    상기 ASC 발현의 증가는 에토포시드 또는 독소루비신에 대한 사멸감수성을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 대장암 치료용 항암제의 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법.
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Cancer Biology & Therapy, 제6권,11호,1710-16면(2007.11.)*

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