JP2006061002A - 新規なａｓｃ様タンパク質およびそれをコードする新規遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【課題】 本発明は、新規なＡＳＣ様タンパク質、その遺伝子、その製造方法、およびその用途を提供することを目的とする。
【解決手段】 ヒトHCC cell lineより新規なＡＳＣ様タンパク質をコードする遺伝子を単離した。この新規遺伝子は、癌サンプルにおいて異常なメチル化を生じ、この遺伝子がコードするタンパク質は、アポトーシスの活性化を介した細胞増殖抑制機能を有すると考えられる。新規遺伝子および新規タンパク質は、癌の治療法や診断法研究の標的として有用である。
【選択図】 なし
【解決手段】 ヒトHCC cell lineより新規なＡＳＣ様タンパク質をコードする遺伝子を単離した。この新規遺伝子は、癌サンプルにおいて異常なメチル化を生じ、この遺伝子がコードするタンパク質は、アポトーシスの活性化を介した細胞増殖抑制機能を有すると考えられる。新規遺伝子および新規タンパク質は、癌の治療法や診断法研究の標的として有用である。
【選択図】 なし
Description
本発明は、新規なApoptosis-associated Speck-like protein （ＡＳＣ）様タンパク質およびその遺伝子等に関する。
ＰＡＡＤ、ＤＡＰＩＮとしても知られるｐｙｒｉｎドメインは、death domain (ＤＤ)、death-effector domain （ＤＥＤ）およびcaspase recruitment domain （ＣＡＲＤ）を含むdeath domain-foldスーパーファミリーのメンバーであると考えられており、これらのドメインを有するタンパク質は、アポトーシスや炎症の起こるメカニズムに関与するとの報告がなされている（非特許文献１）。
ｐｙｒｉｎドメインを有するタンパク質の一つであるＡＳＣは、抗癌剤処理によって癌細胞にアポトーシスを誘導したときに、細胞内で凝集塊（speck）を形成するＣＡＲＤタンパク質として発見された（非特許文献２）。ＡＳＣはｐｙｒｉｎドメインに加えて、Ｃ末端にＣＡＲＤドメインを有し、ＣＡＲＤ−ＣＡＲＤ相互作用によってprocaspaseＩを活性化し（非特許文献３）、炎症のシグナル伝達において機能する。
ＡＳＣは、target of methylation-induced silencing （ＴＭＳ１）とも呼ばれるように、ＤＮＡのメチル化によりその発現が抑制されることが乳癌で報告されている（非特許文献４）。
一般に、プロモータ領域のＣｐＧアイランドでメチル化が起こると、ヒストンのアセチル化が低下し、転写が抑制される傾向がある。近年、複数種の癌において、がん抑制遺伝子などの遺伝子がメチル化され、これらの遺伝子の機能が抑制されている現象が見出されている。
さらに、ＡＳＣは、そのｐｙｒｉｎドメインによってＢａｘに結合し、これをミトコンドリアにリクルートすることによって、シトクロムｃの放出と各種カスパーゼの活性化に寄与している（非特許文献５）。
これらの情報は、ＡＳＣが、免疫反応のみならず、癌の発生に深く関わっていることを示唆しており、基礎研究および癌の予防・治療法の研究の分野において注目されている。
Fairbrother WJ, et al. Protein Sci 2001;10:1911-8 Masumoto J, et al. J Biol Chem 1999;274:33835-8 Srinivasula SM, et al. J Biol Chem 2002;277:21119-22 Conway KE, et al. Cancer Res 2000;60:6236-42 Ohtsuka T, et al. Nat Cell Biol 2004;6:121-8
ｐｙｒｉｎドメインを有するタンパク質の一つであるＡＳＣは、抗癌剤処理によって癌細胞にアポトーシスを誘導したときに、細胞内で凝集塊（speck）を形成するＣＡＲＤタンパク質として発見された（非特許文献２）。ＡＳＣはｐｙｒｉｎドメインに加えて、Ｃ末端にＣＡＲＤドメインを有し、ＣＡＲＤ−ＣＡＲＤ相互作用によってprocaspaseＩを活性化し（非特許文献３）、炎症のシグナル伝達において機能する。
ＡＳＣは、target of methylation-induced silencing （ＴＭＳ１）とも呼ばれるように、ＤＮＡのメチル化によりその発現が抑制されることが乳癌で報告されている（非特許文献４）。
一般に、プロモータ領域のＣｐＧアイランドでメチル化が起こると、ヒストンのアセチル化が低下し、転写が抑制される傾向がある。近年、複数種の癌において、がん抑制遺伝子などの遺伝子がメチル化され、これらの遺伝子の機能が抑制されている現象が見出されている。
さらに、ＡＳＣは、そのｐｙｒｉｎドメインによってＢａｘに結合し、これをミトコンドリアにリクルートすることによって、シトクロムｃの放出と各種カスパーゼの活性化に寄与している（非特許文献５）。
これらの情報は、ＡＳＣが、免疫反応のみならず、癌の発生に深く関わっていることを示唆しており、基礎研究および癌の予防・治療法の研究の分野において注目されている。
Fairbrother WJ, et al. Protein Sci 2001;10:1911-8 Masumoto J, et al. J Biol Chem 1999;274:33835-8 Srinivasula SM, et al. J Biol Chem 2002;277:21119-22 Conway KE, et al. Cancer Res 2000;60:6236-42 Ohtsuka T, et al. Nat Cell Biol 2004;6:121-8
特定のタンパク質の発現やＤＮＡの変異と癌との関連を示すことができれば、そのタンパク質やＤＮＡを研究することによって、癌発生のメカニズム解明の研究にも貢献し、癌の治療法、予防法の開発にもつながると考えられる。また、そのタンパク質やＤＮＡの変異を検出または定量することにより、癌の早期発見にも用いることが可能である。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、新規なＡＳＣ様タンパク質、その遺伝子、その製造方法、および用途を提供することを目的とする。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、新規なＡＳＣ様タンパク質、その遺伝子、その製造方法、および用途を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、肝臓、脳、脾臓を含む様々な組織で発現している新規なＡＳＣ様タンパク質をコードする遺伝子を単離し、このタンパク質をＡＳＣ−ｌｉｋｅ（以下、「ＡＳＣＬ」という。）と名付けた。
そして、ＡＳＣＬ遺伝子は、肝細胞癌（以下、「ＨＣＣ」という。）のcell lineにおいては高密度かつ高頻度（８０％）にメチル化されていること、正常な肝サンプルではこのような顕著なメチル化が生じていないこと、さらに、この異常なメチル化が、ＲＮＡの発現抑制に高い関連性を有していることを見出した。ＡＳＣＬの発現が抑制されている細胞を脱メチル化剤で処理したところ、ＡＳＣＬ発現が再び活性化されたことから、ＡＳＣＬの発現抑制がＤＮＡのメチル化に関連することが、より明らかとなった。
一方、ＡＳＣＬのメチル化はその頻度は低いものの、原発性ＨＣＣにおいても見られ、原発性ＨＣＣサンプルの５３％で、ＡＳＣＬまたはＡＳＣのいずれかのメチル化が起こっていることが確認された。
さらに、メチル化による発現抑制が起こった細胞で、発現を再活性化させると、その細胞の増殖が抑制されることを確認し、本発明を完成するに至った。
そして、ＡＳＣＬ遺伝子は、肝細胞癌（以下、「ＨＣＣ」という。）のcell lineにおいては高密度かつ高頻度（８０％）にメチル化されていること、正常な肝サンプルではこのような顕著なメチル化が生じていないこと、さらに、この異常なメチル化が、ＲＮＡの発現抑制に高い関連性を有していることを見出した。ＡＳＣＬの発現が抑制されている細胞を脱メチル化剤で処理したところ、ＡＳＣＬ発現が再び活性化されたことから、ＡＳＣＬの発現抑制がＤＮＡのメチル化に関連することが、より明らかとなった。
一方、ＡＳＣＬのメチル化はその頻度は低いものの、原発性ＨＣＣにおいても見られ、原発性ＨＣＣサンプルの５３％で、ＡＳＣＬまたはＡＳＣのいずれかのメチル化が起こっていることが確認された。
さらに、メチル化による発現抑制が起こった細胞で、発現を再活性化させると、その細胞の増殖が抑制されることを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ：（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするＤＮＡ；〔２〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ；〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質またはペプチド；〔４〕上記〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡを含有するベクター；〔５〕上記〔４〕に記載のベクターを含む形質転換体；〔６〕上記〔５〕に記載の形質転換体を培養し、発現したタンパク質またはペプチドを回収する工程を含む、上記〔３〕に記載のタンパク質またはペプチドの製造方法；〔７〕上記〔３〕に記載のタンパク質または部分ペプチドに結合する抗体；〔８〕被検者から採取した試料からＤＮＡを抽出する工程と、該ＤＮＡ上の下記(i)〜（v）のいずれかに記載の領域におけるメチル化の頻度を測定する工程と、を含む癌の診断方法：（i）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含む領域、（ii）配列番号：１に記載の塩基配列を含む領域、（iii）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするＤＮＡを含む領域、（iv）配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするＤＮＡを含む領域、（v）配列番号３に記載の塩基配列からなる領域；〔９〕さらに、前記被検者から採取した試料から抽出されたＤＮＡ上の、ＡＳＣタンパク質のコード領域におけるメチル化の頻度も測定する、上記〔８〕に記載の方法。；〔１０〕前記メチル化の頻度を測定する工程が、Methylation Specific ＰＣＲ法である、上記〔８〕または〔９〕に記載の方法；〔１１〕前記メチル化の頻度を測定する工程が、Bisulfite Sequencing法である、上記〔８〕または〔９〕に記載の方法〔１２〕被検者から採取した試料中に含まれる請求項１に記載のＤＮＡの発現を検出および／または定量する工程と、
これを健常者における場合と比較して、該ＤＮＡの発現が低下している場合に被検者が癌であると判定する工程と、を含む癌の診断方法；〔１３〕下記（ａ）または（ｂ）を含む癌の診断用キット：（ａ）上記〔３〕に記載のタンパク質またはペプチドに結合する抗体、（ｂ）請求項１または２に記載のＤＮＡ若しくはその相補鎖の全部または一部に相補的なポリヌクレオチド；〔１４〕上記〔１〕に記載のＤＮＡの発現を亢進または抑制する化合物のスクリーニング方法であって、細胞に被検化合物を添加する工程と、前記被検化合物の添加の前後における、前記細胞内での上記〔１〕に記載のＤＮＡの発現の変化を検出および／または定量する工程と、を含む方法、を提供する。
〔１〕下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ：（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするＤＮＡ；〔２〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ；〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質またはペプチド；〔４〕上記〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡを含有するベクター；〔５〕上記〔４〕に記載のベクターを含む形質転換体；〔６〕上記〔５〕に記載の形質転換体を培養し、発現したタンパク質またはペプチドを回収する工程を含む、上記〔３〕に記載のタンパク質またはペプチドの製造方法；〔７〕上記〔３〕に記載のタンパク質または部分ペプチドに結合する抗体；〔８〕被検者から採取した試料からＤＮＡを抽出する工程と、該ＤＮＡ上の下記(i)〜（v）のいずれかに記載の領域におけるメチル化の頻度を測定する工程と、を含む癌の診断方法：（i）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含む領域、（ii）配列番号：１に記載の塩基配列を含む領域、（iii）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするＤＮＡを含む領域、（iv）配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするＤＮＡを含む領域、（v）配列番号３に記載の塩基配列からなる領域；〔９〕さらに、前記被検者から採取した試料から抽出されたＤＮＡ上の、ＡＳＣタンパク質のコード領域におけるメチル化の頻度も測定する、上記〔８〕に記載の方法。；〔１０〕前記メチル化の頻度を測定する工程が、Methylation Specific ＰＣＲ法である、上記〔８〕または〔９〕に記載の方法；〔１１〕前記メチル化の頻度を測定する工程が、Bisulfite Sequencing法である、上記〔８〕または〔９〕に記載の方法〔１２〕被検者から採取した試料中に含まれる請求項１に記載のＤＮＡの発現を検出および／または定量する工程と、
これを健常者における場合と比較して、該ＤＮＡの発現が低下している場合に被検者が癌であると判定する工程と、を含む癌の診断方法；〔１３〕下記（ａ）または（ｂ）を含む癌の診断用キット：（ａ）上記〔３〕に記載のタンパク質またはペプチドに結合する抗体、（ｂ）請求項１または２に記載のＤＮＡ若しくはその相補鎖の全部または一部に相補的なポリヌクレオチド；〔１４〕上記〔１〕に記載のＤＮＡの発現を亢進または抑制する化合物のスクリーニング方法であって、細胞に被検化合物を添加する工程と、前記被検化合物の添加の前後における、前記細胞内での上記〔１〕に記載のＤＮＡの発現の変化を検出および／または定量する工程と、を含む方法、を提供する。
ＡＳＣＬ遺伝子はそのメチル化により発現が抑制され、ＡＳＣＬタンパク質の発現の有無は細胞のアポトーシスに深く関与する。従って、ＡＳＣＬおよびＡＳＣＬ遺伝子の発現に関する研究は、癌その他の細胞増殖に関連する疾患の予防または治療方法の開発につながる大きな可能性を有している。ＡＳＣＬおよびＡＳＣＬ遺伝子の発現を調整する物質は、各種癌疾患の予防または治療薬として作用する可能性がある。さらに、ＡＳＣＬ遺伝子のメチル化の頻度や、ＡＳＣＬタンパク質を検出または定量し、その結果を各種疾患の診断に用いることも可能である。
以下に、本明細書で用いる用語等の意味を明示して、本発明を詳細に説明する。
本発明は、本発明に係るタンパク質として、新規なＡＳＣ様タンパク質を提供する。当該ＡＳＣ様タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に、このタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に示す。ＡＳＣＬは、新規なｐｙｒｉｎドメインタンパク質であり、その遺伝子は、肝臓、脳、脾臓を含む正常組織で発現していた。一方で、ＡＳＣＬ遺伝子には、肝細胞癌のcell lineにおいて異常なメチル化が高い割合で生じており、このメチル化は、ＡＳＣＬのＲＮＡの発現抑制と高い相関性を有していた。ＲＮＡの発現が抑制された細胞を脱メチル化剤である5-aza-2'-deoxycytidineで処理することにより、ＡＳＣＬ遺伝子の発現を再活性化したことから、この発現抑制にはＡＳＣＬ遺伝子のメチル化が関与していることがより明らかとなった。
また、脱メチル化によりＡＳＣＬの機能を回復させた細胞のコロニーでは、細胞の増殖抑制が観察されたこと、さらに、ＡＳＣＬ遺伝子を含むベクターで形質転換した細胞において、annexin-V結合が陽性になり、カスパーゼ３が活性化されたことから、ＡＳＣＬタンパク質は細胞のアポトーシスに関与している可能性が高いことも示唆された。
これらの事実から、ＡＳＣＬタンパク質は、ＨＣＣの発生において何らかの重要な役割を果たしていることが推察され、ＡＳＣＬに関連する研究は、ＨＣＣの予防方法や治療方法につながるものとして重要であると言える。
また、ＡＳＣＬタンパク質やＡＳＣＬ遺伝子のメチル化を検出または定量し、その結果を癌の診断、癌になりやすい傾向、癌の進行度の指標としても用いることができる可能性が高い。
また、脱メチル化によりＡＳＣＬの機能を回復させた細胞のコロニーでは、細胞の増殖抑制が観察されたこと、さらに、ＡＳＣＬ遺伝子を含むベクターで形質転換した細胞において、annexin-V結合が陽性になり、カスパーゼ３が活性化されたことから、ＡＳＣＬタンパク質は細胞のアポトーシスに関与している可能性が高いことも示唆された。
これらの事実から、ＡＳＣＬタンパク質は、ＨＣＣの発生において何らかの重要な役割を果たしていることが推察され、ＡＳＣＬに関連する研究は、ＨＣＣの予防方法や治療方法につながるものとして重要であると言える。
また、ＡＳＣＬタンパク質やＡＳＣＬ遺伝子のメチル化を検出または定量し、その結果を癌の診断、癌になりやすい傾向、癌の進行度の指標としても用いることができる可能性が高い。
また、本発明に係るタンパク質は、ＡＳＣＬと機能的に同質なタンパク質も含む。このようなタンパク質には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるＡＳＣＬタンパク質の変異体、ホモログ、バリアントなどが含まれる。ここで「配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同質」とは、例えば、そのタンパク質の発現を増加させることによって、そのタンパク質を含む細胞の増殖が抑制される機能を有することを意味する。このような機能は、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換した細胞を用いて確認することができる。
本発明に係る、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有する。このようなタンパク質は、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入し、このＤＮＡを含むベクターを用いて宿主を形質転換し、発現したタンパク質を回収することによって得ることができる。また、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質には、細胞内で自然に誘発された変異を有するタンパク質も含まれる。アミノ酸の変異数や変異部位は、タンパク質の機能が保持される限り制限されない。
「変異を導入する方法」としては、部位特異的突然変異誘発法を用いることができ、この方法によれば、まず、変異させたい遺伝子をＭ１３ファージ等のベクターの一部に組み込んで一本鎖環状のファージＤＮＡを得て、これに変異を導入するよう一部の塩基を変更して設計されたオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせたのち、ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡリガーゼで修復して一部ミスマッチの状態になった二本鎖環状ＤＮＡとする。これを大腸菌等に感染させて培養すると二本鎖の組換え体Ｍ１３の複製の際、変異株と非変異株が分離してそれぞれ一本鎖となって個々のファージ粒子に入る。そこで変異が導入された方の鎖のみ選ぶことで、特定の部位に所望の変異を有する配列を得ることができる。この他、適当な制限酵素を用いて付着末端を生じさせ、そのままＤＮＡリガーゼで連結して数塩基の欠失を起こさせる方法や、エラーが起こりやすい条件下でＰＣＲにより増幅することで、一定の領域のランダムな変異を入れる方法、Kunkel法やEckstein法など公知の方法を使用することができる。
本発明に係る、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有する。このようなタンパク質は、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入し、このＤＮＡを含むベクターを用いて宿主を形質転換し、発現したタンパク質を回収することによって得ることができる。また、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質には、細胞内で自然に誘発された変異を有するタンパク質も含まれる。アミノ酸の変異数や変異部位は、タンパク質の機能が保持される限り制限されない。
「変異を導入する方法」としては、部位特異的突然変異誘発法を用いることができ、この方法によれば、まず、変異させたい遺伝子をＭ１３ファージ等のベクターの一部に組み込んで一本鎖環状のファージＤＮＡを得て、これに変異を導入するよう一部の塩基を変更して設計されたオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせたのち、ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡリガーゼで修復して一部ミスマッチの状態になった二本鎖環状ＤＮＡとする。これを大腸菌等に感染させて培養すると二本鎖の組換え体Ｍ１３の複製の際、変異株と非変異株が分離してそれぞれ一本鎖となって個々のファージ粒子に入る。そこで変異が導入された方の鎖のみ選ぶことで、特定の部位に所望の変異を有する配列を得ることができる。この他、適当な制限酵素を用いて付着末端を生じさせ、そのままＤＮＡリガーゼで連結して数塩基の欠失を起こさせる方法や、エラーが起こりやすい条件下でＰＣＲにより増幅することで、一定の領域のランダムな変異を入れる方法、Kunkel法やEckstein法など公知の方法を使用することができる。
また、本発明に係るタンパク質は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質として、配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質も包含する。「配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」の例としては、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡとの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡなどを挙げることができる。
ここで、ハイブリダイゼーションは、当業者であれば自体公知の方法（例えば、Current Protocols in Molecular Biology; edit. Ausubel et al. (1987)に記載の方法等）またはそれに準ずる方法に従って、適宜行うことができる。ストリンジェントな条件は、例えば、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃とすることができ、ＳＣＣの濃度および温度などで調整することができる。高ストリンジェントな条件を選択すれば、より高い相補性を有するＤＮＡのみがハイブリダイズする。
ここで、ハイブリダイゼーションは、当業者であれば自体公知の方法（例えば、Current Protocols in Molecular Biology; edit. Ausubel et al. (1987)に記載の方法等）またはそれに準ずる方法に従って、適宜行うことができる。ストリンジェントな条件は、例えば、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃とすることができ、ＳＣＣの濃度および温度などで調整することができる。高ストリンジェントな条件を選択すれば、より高い相補性を有するＤＮＡのみがハイブリダイズする。
本発明に係るタンパク質は、生体に由来するものであっても、人工的に合成されるものであってもよく、例えば、ヒトの肝細胞や脾臓細胞のcell lysateから公知のタンパク質精製の方法に従って得ることができる。後述のように、本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターで適当な宿主を形質転換して得ることもできるし、自体公知の無細胞系タンパク質合成方法によって作製してもよい。
本発明は、また、上述した本発明に係るタンパク質の部分ペプチドも提供する。本発明に係る部分ペプチドは、具体的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列、または、ＡＳＣＬと機能的に同質のタンパク質のアミノ酸配列の一部である、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。部分ペプチドは、遺伝子工学的手法で得ることもできるし、公知の固相または液相ペプチド合成法により合成することもでき、また、ＡＳＣＬを適当なペプチダーゼや臭化シアン等で切断することによってもできる。かかる部分ペプチドは、例えば、ＡＳＣＬに結合する抗体の調製に用いることができ、また、ＡＳＣＬと他のタンパク質との結合活性を有する部分ペプチドであれば、医薬品候補化合物のスクリーニングに利用することも可能である。
なお、本発明に係るタンパク質は、Ｃ末端は通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）化されているものも含む。また、本発明に係るタンパク質は、糖が結合した糖タンパク質などの複合タンパク質であってもよく、タンパク質の塩も包含する。
本発明はまた、本発明に係るタンパク質をコードするＤＮＡをも提供する。かかるＤＮＡは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、およびこのタンパク質と機能的に同質なタンパク質をコードするＤＮＡであれば、特に制限はなく、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡなどを含んでもよい。また、ＡＳＣＬまたはこれと機能的に同質のタンパク質をコードする限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡなども含まれる。
また、本発明は、本発明に係るＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。本発明で用いられるベクターは、挿入したＤＮＡを安定に保持するものであれば、特に限定されず、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、酵母由来のプラスミド（例えば、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）等が挙げられる。大腸菌を宿主とする場合は、λファージ系やＭ１３ファージ系などのバクテリオファージがよく用いられる。また、動物細胞を宿主とする場合は、ベクターとして、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルスなどのウイルスＤＮＡを用いることができる。
さらに、宿主内で、本発明に係るタンパク質が効率よく発現されるよう、宿主に適した、プロモータ配列、エンハンサー配列、シャインダルガーノ配列、シグナル配列、ポリＡシグナルなどを適宜選択し、ベクターに挿入することができる。
本発明に係るＤＮＡの上記ベクターへの挿入は、例えば、制限酵素を用いてベクターを切断し、リガーゼ反応によって、ＤＮＡを該切断部位に連結することにより行うことができる。
さらに、宿主内で、本発明に係るタンパク質が効率よく発現されるよう、宿主に適した、プロモータ配列、エンハンサー配列、シャインダルガーノ配列、シグナル配列、ポリＡシグナルなどを適宜選択し、ベクターに挿入することができる。
本発明に係るＤＮＡの上記ベクターへの挿入は、例えば、制限酵素を用いてベクターを切断し、リガーゼ反応によって、ＤＮＡを該切断部位に連結することにより行うことができる。
本発明は、上記本発明に係るベクターで形質転換させた形質転換体も含む。本発明の形質転換体は、本発明に係るＤＮＡが挿入されたベクターに適した宿主を選択し、この宿主に前記ベクターを導入することにより得られる。宿主としては、例えば大腸菌や緑膿菌などのグラム陰性菌、枯草菌などのグラム陽性菌、放線菌、酵母、糸状菌、動植物培養細胞、昆虫培養細胞などが挙げられる。
ベクターの導入方法としては、宿主が大腸菌である場合には塩化カルシウム法、枯草菌を宿主とする場合にはコンピテントセル法や酢酸リチウム法、枯草菌、放線菌、酵母などにはプロトプラスト法、動植物細胞、酵母、細菌などに広く用いられる方法としてリン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ−デキストランやポリブレンなどのポリマーと複合体を形成させる方法などから適宜選択することができる。カチオン性脂質のリポソームと複合体を形成させるリポフェクトアミン（Invitrogen社）を用いることもできる。
ベクターの導入方法としては、宿主が大腸菌である場合には塩化カルシウム法、枯草菌を宿主とする場合にはコンピテントセル法や酢酸リチウム法、枯草菌、放線菌、酵母などにはプロトプラスト法、動植物細胞、酵母、細菌などに広く用いられる方法としてリン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ−デキストランやポリブレンなどのポリマーと複合体を形成させる方法などから適宜選択することができる。カチオン性脂質のリポソームと複合体を形成させるリポフェクトアミン（Invitrogen社）を用いることもできる。
本発明はまた、上記形質転換体を培養して、本発明に係るタンパク質を生成させることを特徴とする、タンパク質の製造方法も含む。形質転換体の培養は、宿主細胞の特性、発現するタンパク質の特性、プロモータの特性などにより選択することができ、例えばＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培地（Gibco社）等の公知の培地を使用することができる。また、例えば抗生物質耐性を有するプラスミドを用いた場合は、当該抗生物質を培地に添加することにより目的タンパク質の発現を調節することができ、又ラクトース依存性プラスミドを使用した場合はＩＰＴＧを培地に添加して発現を誘導することができる。
このようにして得た形質転換体を培養して発現させた本発明に係るタンパク質は、通常のタンパク質の精製方法を用いて精製することができ、使用した発現系により、例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過法、塩析、浸透圧ショック法、超音波処理などを組み合わせて精製することができる。クロマトグラフィー法としては、例えば、水溶液中で行うイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、有機溶媒を用いる逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。本発明はこれらの精製方法を用いて精製されたタンパク質も含む。
また、発現させたタンパク質は、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を用いて修飾を加えたり部分的にペプチドを除去したりすることもでき、これらの修飾されたタンパク質も本発明に含まれる。タンパク質修飾酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、プロテインキナーゼやグルコシダーゼなどが挙げられる。尚、当業者は、発現したタンパク質が遊離した状態であれば塩に、塩として得られた場合に遊離した状態に容易に変えることができる。
このようにして得た形質転換体を培養して発現させた本発明に係るタンパク質は、通常のタンパク質の精製方法を用いて精製することができ、使用した発現系により、例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過法、塩析、浸透圧ショック法、超音波処理などを組み合わせて精製することができる。クロマトグラフィー法としては、例えば、水溶液中で行うイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、有機溶媒を用いる逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。本発明はこれらの精製方法を用いて精製されたタンパク質も含む。
また、発現させたタンパク質は、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を用いて修飾を加えたり部分的にペプチドを除去したりすることもでき、これらの修飾されたタンパク質も本発明に含まれる。タンパク質修飾酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、プロテインキナーゼやグルコシダーゼなどが挙げられる。尚、当業者は、発現したタンパク質が遊離した状態であれば塩に、塩として得られた場合に遊離した状態に容易に変えることができる。
本発明は、また、本発明に係るタンパク質または部分ペプチドに結合する抗体をも提供する。本発明にかかる抗体は、ＡＳＣＬタンパク質、ＡＳＣＬと機能的に同質なタンパク質、またはそれらの部分ペプチドに特異的に結合するものであればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。ヒト以外の哺乳動物を本タンパク質で免疫することによって得た抗体のほか、ヒト抗体や、遺伝子組換えにより得られた抗体も、本発明に係るタンパク質または部分ペプチドに特異的に結合する限り本発明に含まれる。本発明にかかる抗体は、自体公知またはそれに準じた方法により製造することができるが、以下に代表的方法を例示する。
まず、ポリクローナル抗体は、ＡＳＣＬを用いて哺乳動物、好ましくはマウスやラット等のげっ歯目、ウサギ目、サルなどの霊長目の動物を免疫し、血清を得て、この血清をＡＳＣＬまたは部分ペプチドを固定したアフィニティーカラムに通して精製することにより得ることができる。
またモノクローナル抗体は、まず同様に哺乳動物を免疫し、この動物から得た抗体産生細胞と、増殖力の強いミエローマ細胞とを融合させ、個々の融合細胞を分離し、求める抗体の生産能を検定することによって抗原の一つのエピトープに特異的に反応する抗体分子を1種だけ生産する細胞を選択し、この細胞を培養することによって製造することができる。またモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをベクターに挿入し、このベクターを宿主に導入して産生させて遺伝子工学的方法で得ることもできる。ヒト抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物を免疫すれば、ヒト抗体を産生することもでき、マウスのモノクローナル抗体の抗原結合部位をコードするｃＤＮＡとヒトのＩｇＧ遺伝子の定常部をコードする遺伝子を連結してこれをＢリンパ球に導入すればキメラ抗体分子を生産させることも可能であり、これらの抗体も本発明に含まれる。本発明の抗体は、本発明に係るタンパク質または部分ペプチドを特異的に認識して結合する限り、フラグメントや修飾された抗体であってもよい。抗体のフラグメントとしては例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｃフラグメント、またはシングルチェインＦｖなどが挙げられ、修飾された抗体としては例えばポリエチレングリコールなどの化合物と結合された抗体などが挙げられる。本発明の抗体は、ＡＳＣＬの精製や検出、定量に用いることができるし、またＡＳＣＬの生物学的活性を亢進または抑制する作用を有する場合には、アゴニストまたはアンタゴニストとなりうる。
まず、ポリクローナル抗体は、ＡＳＣＬを用いて哺乳動物、好ましくはマウスやラット等のげっ歯目、ウサギ目、サルなどの霊長目の動物を免疫し、血清を得て、この血清をＡＳＣＬまたは部分ペプチドを固定したアフィニティーカラムに通して精製することにより得ることができる。
またモノクローナル抗体は、まず同様に哺乳動物を免疫し、この動物から得た抗体産生細胞と、増殖力の強いミエローマ細胞とを融合させ、個々の融合細胞を分離し、求める抗体の生産能を検定することによって抗原の一つのエピトープに特異的に反応する抗体分子を1種だけ生産する細胞を選択し、この細胞を培養することによって製造することができる。またモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをベクターに挿入し、このベクターを宿主に導入して産生させて遺伝子工学的方法で得ることもできる。ヒト抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物を免疫すれば、ヒト抗体を産生することもでき、マウスのモノクローナル抗体の抗原結合部位をコードするｃＤＮＡとヒトのＩｇＧ遺伝子の定常部をコードする遺伝子を連結してこれをＢリンパ球に導入すればキメラ抗体分子を生産させることも可能であり、これらの抗体も本発明に含まれる。本発明の抗体は、本発明に係るタンパク質または部分ペプチドを特異的に認識して結合する限り、フラグメントや修飾された抗体であってもよい。抗体のフラグメントとしては例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｃフラグメント、またはシングルチェインＦｖなどが挙げられ、修飾された抗体としては例えばポリエチレングリコールなどの化合物と結合された抗体などが挙げられる。本発明の抗体は、ＡＳＣＬの精製や検出、定量に用いることができるし、またＡＳＣＬの生物学的活性を亢進または抑制する作用を有する場合には、アゴニストまたはアンタゴニストとなりうる。
本発明はまた、被検者から採取した試料からＤＮＡを抽出する工程と、該ＤＮＡ上で本発明に係るタンパク質またはその部分配列をコードする領域におけるメチル化の頻度を測定する工程と、を含む癌の診断方法をも提供する。上述のように、ＡＳＣＬ遺伝子では癌細胞においてメチル化の頻度が高いことが知られているので、メチル化の頻度を検出・定量することによって、そのサンプルが癌患者由来のものであるかどうかを判定することができる。例えば、被検者から採取したサンプルにおいて、メチル化の頻度が一定割合以上である場合や、頻度が健常者の平均値よりも高い場合に、その被検者は癌である、または癌の危険があるといった判断をすることができる。
癌の診断のためにメチル化を検出するのに適した領域は以下の（i）〜（v）である。
（i）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含む領域。
（ii）配列番号：１に記載の塩基配列を含む領域。
（iii）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするＤＮＡを含む領域。
（iv）配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む領域。
（v）配列番号：３に記載の塩基配列からなる領域。
ここで、配列番号：３に示す塩基配列からなる領域は、ゲノムＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断した際に得られるＮｏｔＩサイトであり、ＡＳＣＬタンパク質のコード領域を完全に含む領域である。従って、被検者から採取したＤＮＡをＮｏｔＩで処理し、配列番号：３に記載の塩基配列からなる領域におけるメチル化を検出することにより、そのＤＮＡが癌患者に由来するものかどうかを好適に判定することができる。また、メチル化の検出は、領域（i）〜（v）の一部であってもよい。
（i）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含む領域。
（ii）配列番号：１に記載の塩基配列を含む領域。
（iii）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするＤＮＡを含む領域。
（iv）配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む領域。
（v）配列番号：３に記載の塩基配列からなる領域。
ここで、配列番号：３に示す塩基配列からなる領域は、ゲノムＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断した際に得られるＮｏｔＩサイトであり、ＡＳＣＬタンパク質のコード領域を完全に含む領域である。従って、被検者から採取したＤＮＡをＮｏｔＩで処理し、配列番号：３に記載の塩基配列からなる領域におけるメチル化を検出することにより、そのＤＮＡが癌患者に由来するものかどうかを好適に判定することができる。また、メチル化の検出は、領域（i）〜（v）の一部であってもよい。
ＤＮＡにおけるメチル化の頻度の測定は、自体公知の方法またはそれに準ずる方法を用いることができるが、Methylation Specific ＰＣＲ法（以下、「ＭＳＰ法」という。）またはBisulfite Sequencing法が好ましい。これらの方法は、BuisulfiteでＤＮＡを処理するとシトシンがウラシルに変化するが、メチル化を受けたシトシンは構造上安定なため変化しないという事実に基づく方法である。Bisulfite処理によって、メチル化されたＤＮＡは、メチル化されていないＤＮＡと塩基配列において違いを生じる。
ＭＳＰ法では、メチル化された配列に特異的なプライマーを用いてメチル化された領域だけを増幅し、検出する方法である。
一方、Bisulfite Sequencing法は、Bisulfite処理後の塩基配列を解析することによって、メチル化を検出する方法である。配列解析の方法は特に限定されず、マクサム・ギルバート法、ジデオキシ法等公知の方法によることができるが、例えばPyrosequencing法によれば、高精度に定量することができて好適である（Colella S. et al., BioTechniques 35: 146-150(July 2003)）。
ＭＳＰ法では、メチル化された配列に特異的なプライマーを用いてメチル化された領域だけを増幅し、検出する方法である。
一方、Bisulfite Sequencing法は、Bisulfite処理後の塩基配列を解析することによって、メチル化を検出する方法である。配列解析の方法は特に限定されず、マクサム・ギルバート法、ジデオキシ法等公知の方法によることができるが、例えばPyrosequencing法によれば、高精度に定量することができて好適である（Colella S. et al., BioTechniques 35: 146-150(July 2003)）。
なお、被検者から採取する試料は、特に限定されず、内視鏡やバイオプシーにより得られた組織の細胞や、痰、尿、便、血液などの体液等を用いることができる。
また本発明に係る診断方法が用いられる癌は、特に限定されず、例えば、脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌、膵癌、肺癌、乳癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、等が挙げられる。なお、本発明者らはＨＣＣセル・ラインを用いてＡＳＣＬの機能を解明したが、例えば、ＳＯＣＳ−１遺伝子におけるメチル化が、肝癌、リンパ腫、膵癌、胃癌で見られるように、メチル化は各種の癌に共通する現象であることが知られている（例えば、Esteller M, et al., Cancer Research 2001, Apr 15;61(8):3225-9を参照）。
また本発明に係る診断方法が用いられる癌は、特に限定されず、例えば、脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌、膵癌、肺癌、乳癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、等が挙げられる。なお、本発明者らはＨＣＣセル・ラインを用いてＡＳＣＬの機能を解明したが、例えば、ＳＯＣＳ−１遺伝子におけるメチル化が、肝癌、リンパ腫、膵癌、胃癌で見られるように、メチル化は各種の癌に共通する現象であることが知られている（例えば、Esteller M, et al., Cancer Research 2001, Apr 15;61(8):3225-9を参照）。
上記診断方法では、ＡＳＣＬ遺伝子のメチル化と同時に、被検者から採取したＤＮＡのＡＳＣ遺伝子におけるメチル化も併せて検出・定量することが好ましい。本発明者らの知見によれば、ＡＳＣＬ遺伝子のメチル化は、原発性ＨＣＣよりも培養細胞において高い頻度で生じていた。しかしながら、原発性ＨＣＣサンプルであっても、ＡＳＣＬ遺伝子またはＡＳＣ遺伝子のいずれかで異常なメチル化が起きているものは５０％以上にのぼった。このことから、ＡＳＣ遺伝子のメチル化を併せて検出することによって、原発性ＨＣＣの遺伝的素因も判定することが可能となる。
原発性ＡＳＣ遺伝子におけるメチル化も、上述したＡＳＣＬ遺伝子と同様の方法で検出または定量することができる。
原発性ＡＳＣ遺伝子におけるメチル化も、上述したＡＳＣＬ遺伝子と同様の方法で検出または定量することができる。
また、本発明に係る癌の診断方法は、被検者から採取した試料中に含まれるＡＳＣＬタンパク質等をコードするＤＮＡの発現を検出および／または定量する工程と、これを健常者における場合とを比較して、ＤＮＡの発現が低下している場合に被検者が癌であると判定する工程と、を含む。
本発明者らは、上述のように、ＡＳＣＬタンパク質をコードするＤＮＡにおいてメチル化が生じると、ＡＳＣＬの発現が低下することを見出した。したがって、この発現を検出および／または定量することによって、その被検試料が癌患者由来のものであるかを検知することができる。なお、本明細書において「ＡＳＣＬタンパク質をコードするＤＮＡの発現」は、転写および翻訳の双方を含み、ｍＲＮＡの発現を検出・定量してもよいし、ＡＳＣＬタンパク質の発現を検出・定量しても良い。
被験者から採取する試料、および本診断法方が用いられる癌疾患は、上述したＤＮＡのメチル化の検出・定量工程を含む診断方法と同様であり、ここでは説明を省略する。
本発明者らは、上述のように、ＡＳＣＬタンパク質をコードするＤＮＡにおいてメチル化が生じると、ＡＳＣＬの発現が低下することを見出した。したがって、この発現を検出および／または定量することによって、その被検試料が癌患者由来のものであるかを検知することができる。なお、本明細書において「ＡＳＣＬタンパク質をコードするＤＮＡの発現」は、転写および翻訳の双方を含み、ｍＲＮＡの発現を検出・定量してもよいし、ＡＳＣＬタンパク質の発現を検出・定量しても良い。
被験者から採取する試料、および本診断法方が用いられる癌疾患は、上述したＤＮＡのメチル化の検出・定量工程を含む診断方法と同様であり、ここでは説明を省略する。
また、本発明は、ＡＳＣＬタンパク質またはその部分ペプチドに結合する抗体を含む癌の診断用キットも提供する。かかる抗体と、抗体とＡＳＣＬタンパク質またはそのペプチドとが結合したことを検出する手段があれば、被検試料中から当該タンパク質またはペプチドを検出することができる。例えば、本発明に係る診断用キットは、ＡＳＣＬに結合する第一の抗体を固定した固相担体と、標識化されたＡＳＣＬタンパク質に結合する第二の抗体と、を含む。第一の抗体を固定した固相担体と、被検者から採取し検出用に希釈等の処理をした資料とを接触させてインキュベートし、これと同時に、またはインキュベート後に第二の抗体を反応させて標識化合物を活性化することにより、タンパク質を検出・定量することができる。
標識としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質等が挙げられるが、これらに限定されない。
標識としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、ＡＳＣＬタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ若しくはその相補鎖の全部または一部に相補的なポリヌクレオチドを含む癌診断用キットも提供する。かかるポリヌクレオチドと、被検試料とを接触させてインキュベートして、該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドの有無を検出することによって、ＡＳＣＬまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ、またはそのＤＮＡから発現したｍＲＮＡを検出・定量することができ、この結果を癌の診断に用いることが可能である。
具体的には、ＡＳＣＬタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ若しくはその相補鎖の全部または一部に相補的なポリヌクレオチドをプローブとして用いたノーザンハイブリダイゼーションを行ったり、プライマーとしてＰＣＲ反応に用い、増幅されたＤＮＡを検出・定量法に供することができる。
具体的には、ＡＳＣＬタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ若しくはその相補鎖の全部または一部に相補的なポリヌクレオチドをプローブとして用いたノーザンハイブリダイゼーションを行ったり、プライマーとしてＰＣＲ反応に用い、増幅されたＤＮＡを検出・定量法に供することができる。
また、本発明は、ＡＳＣＬをコードするＤＮＡの発現を亢進または抑制する化合物のスクリーニング方法をも提供する。該方法は、被検化合物を被検細胞に添加する工程と、被検化合物を添加する前後における、ＡＳＣＬをコードするＤＮＡの発現量の変化をモニターする工程とを含む。
本発明者らは、ＡＳＣＬによる細胞増殖抑制作用にアポトーシスが関与していることを見出した。従って、ＡＳＣＬの発現を亢進または抑制する作用を有する化合物は、細胞のアポトーシスの制御に用いることのできる可能性があり、ひいては、癌の治療薬や予防薬としての機能を有する可能性もある。被検細胞は、ＡＳＣＬをコードするＤＮＡを有する細胞であればよく、特に種類は限定されない。また、ＤＮＡの発現は、上述した診断方法に用いられる方法と同様の方法を用いることができ、ここでは説明を省略する。
本発明者らは、ＡＳＣＬによる細胞増殖抑制作用にアポトーシスが関与していることを見出した。従って、ＡＳＣＬの発現を亢進または抑制する作用を有する化合物は、細胞のアポトーシスの制御に用いることのできる可能性があり、ひいては、癌の治療薬や予防薬としての機能を有する可能性もある。被検細胞は、ＡＳＣＬをコードするＤＮＡを有する細胞であればよく、特に種類は限定されない。また、ＤＮＡの発現は、上述した診断方法に用いられる方法と同様の方法を用いることができ、ここでは説明を省略する。
以下に示す本発明の参考例、実施例、試験例は例示的なものであり、本発明は以下の具体例に制限されるものではない。
なお、以下の実施例では、ヒトＨＣＣのcell lineとして、東北大学加齢医学研究所よりHep3B、HT17およびLi-7を、永森静志氏よりHLC4を、Japanese Culture Collection よりHuH1、HuH4、およびHuH7を、また、財団法人癌研究会癌研究所病理部よりHuH2、PLC/PRF/%、Kim1を入手した。また、原発性HCCサンプルおよび隣接する正常肝組織は、財団法人癌研究会の癌研究会付属病院において、インフォームドコンセントの下に患者から提供されたものを用いた。
（ＡＳＣＬのクローニング）
ヒトHCCのcell lineを用いたrestriction landmark genomic scanning （RLGS）解析で27％の異常が確認された（Nagai H, et al. Cancer Res 1994;54:1545-50、Yoshikawa H, et al. Genomics 1996;31:28−35、Yoshikawa H, et al. Gene 1997;197:129-35）NotIによるフラグメントをクローニングした。BLAST検索により、cDNAクローンであるZD54H05（Genebank accession number AF086332）がCpGリッチな領域に存在し、NotI領域を含むことがわかった（図１Ａ）。
ヒトHCCのcell lineを用いたrestriction landmark genomic scanning （RLGS）解析で27％の異常が確認された（Nagai H, et al. Cancer Res 1994;54:1545-50、Yoshikawa H, et al. Genomics 1996;31:28−35、Yoshikawa H, et al. Gene 1997;197:129-35）NotIによるフラグメントをクローニングした。BLAST検索により、cDNAクローンであるZD54H05（Genebank accession number AF086332）がCpGリッチな領域に存在し、NotI領域を含むことがわかった（図１Ａ）。
ASCLの完全長cDNAをプローブとして、ヒト脾臓、脳、肝臓、胎盤（BD Biosciences）から得たpoly(A)+RNAを用い、Yoshikawa H, et al Genomics 1998;49:237-46の方法に従って、ノーザンブロッティングを行った。この結果、約0.5kb長のmRNAが得られ、これはcDNAの長さ（556bp）に一致した（図１Ｂ）。このRNAの発現は、肝臓、脾臓、脳で確認されたが胎盤では見られなかった。cDNA配列は、open reading flame (ORF)を含み、該ORFの5'末端には、in flameの終止コドンが存在した。これらの結果から、ZD54H05は89アミノ酸からなるタンパク質をコードする完全長の転写物であることが確認された。
cDNAとゲノムDNAとの比較から、完全長転写物は、二つのエクソンからなり、コード領域は最初のエクソンのみに含まれることがわかった。また、このタンパク質は、ASCのpyrinドメイン高い相同性を示した（図１Ｃ）。ASCLはpyrinドメインのみからなるが、ASCは、CARDドメインも含む（図１Ｄ）。
（ASCL遺伝子のメチル化と、HCC cell lineにおける発現抑制）
ASCLのメチル化をMSP法により検出した。MSP法は、Herman JG, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:9821-6の方法に従ってBisulfite処理を行った後、配列番号：４および５に記載の塩基配列を有するプライマーをメチル化領域特異的プライマーとし、配列番号：６および７に記載の塩基配列を有するプライマーを非メチル化領域特異的プライマーとして、Conway KE, et al. Cancer Res 2000;60:6236-42の方法に従って行った。その結果、10のcell lineのうち、8 cell lineでメチル化が確認された（図１Ｅ）が、対照的に、正常肝サンプルでは確認されなかった。すべてのHep3Bを除くすべてのcell lineで、完全なメチル化が生じていた。
ASCLのメチル化をMSP法により検出した。MSP法は、Herman JG, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:9821-6の方法に従ってBisulfite処理を行った後、配列番号：４および５に記載の塩基配列を有するプライマーをメチル化領域特異的プライマーとし、配列番号：６および７に記載の塩基配列を有するプライマーを非メチル化領域特異的プライマーとして、Conway KE, et al. Cancer Res 2000;60:6236-42の方法に従って行った。その結果、10のcell lineのうち、8 cell lineでメチル化が確認された（図１Ｅ）が、対照的に、正常肝サンプルでは確認されなかった。すべてのHep3Bを除くすべてのcell lineで、完全なメチル化が生じていた。
次に、Bisulfite Sequencing法によりメチル化が生じている部位を詳細に解析した。Bisulfite処理後、配列番号：８に示すASCL遺伝子のCpGリッチ領域を、配列番号：９（forward）および１０(reverse)をプライマーとして増幅した。PCR産物をクローニングし、それぞれのサンプルについて任意の8つのクローンの塩基配列を解析した。この結果、HuH2およびLi-7は39CpG領域においてほとんど完全にメチル化されているが、癌でない肝細胞ではほとんどメチル化が生じていなかった（図１Ｆ）。この結果、HCC cell lineにおいて、ASCL遺伝子は、高頻度かつ高密度にメチル化されていることがわかった。
続いて、RT-PCR法により、HCC cell lineにおけるASCL遺伝子の発現を解析した。RNeasy Mini Kit （Qiagen）を用いて、HCC cell lineから全RNAを抽出し、正常肝全RNA（Ambion）を入手した。cDNAはSuperscript Preamplification System（Invitrogen）を用い、3μgの全RNAの逆転写により調製した。ASCL増幅には、配列番号：１１および１２に記載の塩基配列を持つプライマーを使用した。その結果、メチル化されていないcell line（Huh7およびPLC/PRF/5）および正常肝サンプルではASCLの発現が見られた。しかし、メチル化されたcell lineでは発現が見られず（図１Ｇ）、ASCL発現はASCL遺伝子のメチル化と相関性を有することが確認された。メチル化による発現抑制をさらに確かめるため、1μMの5-aza-2'-deoxycytidin（脱メチル化剤）で4日間処理したところ、実験に用いた3つのHCC cell line全てにおいて、ASCL遺伝子の再活性化が見られた（図１Ｈ）。部分的にメチル化されたHep3Bにおいても再活性化が起きた。これらの結果から、ASCL遺伝子の発現抑制は、CpGアイランドの異常なメチル化が関与していることが示唆された。
原発性HCCサンプルにおいても、MSP解析により23.5％において異常なメチル化が見られた。
（ASCLによる細胞増殖抑制）
ヒト肝臓RNA(BD Biosciences)から完全長ASCLcDNAを単離し、配列番号：１３および１４に記載のプライマーペアを用いてPCRで増幅し、これをpcDNA3.1/HisCベクター（Invitrogen）に挿入した。ASCcDNAは、配列番号：１５および：１６に記載のプライマーペアを用いて、RT-PCRにより増幅し、Xpress-tagをHA-tagに置き換えるよう修飾したpcDNA3.1ベクターに挿入した。これらのベクターを用いて細胞を形質転換し、G418で4週間培養した。
ヒト肝臓RNA(BD Biosciences)から完全長ASCLcDNAを単離し、配列番号：１３および１４に記載のプライマーペアを用いてPCRで増幅し、これをpcDNA3.1/HisCベクター（Invitrogen）に挿入した。ASCcDNAは、配列番号：１５および：１６に記載のプライマーペアを用いて、RT-PCRにより増幅し、Xpress-tagをHA-tagに置き換えるよう修飾したpcDNA3.1ベクターに挿入した。これらのベクターを用いて細胞を形質転換し、G418で4週間培養した。
この結果、ASCLが過剰発現した細胞においては、細胞（HuH2）の増殖が著しく抑制されることが確認された（図２Ａ）。増殖抑制は、Li-7細胞でも抑制された。
また、アポトーシスを検出するため、annexin V-Cy3 apoptosis detection kit（MBL）を用いた。形質転換細胞を、Cy3で標識されたannexin-V溶液とともにインキュベートし、Binding Bufferで洗浄して結合しなかったannexin-Vを除去した。細胞は２％のパラホルムアルデヒドで固定し、0.1％Triton X-100で処理した後、anti-Xpress antibody (Invitrogen)と共にインキュベートして、続いて二次抗体（Jackson Immunorsearch）で標識したFITCとインキュベートした。細胞を、DAPI(Vector Laboratory)を含むマウント液に移し、共焦点顕微鏡で観察した。
この結果ASCL発現細胞は、annexin-Vと膜の結合が観察された（図２Ｂ）。
さらに、Yoshikawa H, et al. Na Genet 2001;28:29-35の方法に従って、ウェスタンブロッティングを行った。抗caspase-3抗体およびβ-actin抗体はSanta Cruz Biotechnology とSigmaからそれぞれ入手した。
この結果、ASCLの過剰発現は、procaspase-3を切断し、caspase-3を活性かすることが確認された（図２Ｃ）。この活性化は、一般的なcasepase阻害剤Z-VAD-FMKにより阻害された。
以上の結果は、ASCLがアポトーシスに関連する方法で、細胞の増殖抑制に関与することを裏付けた。
（HCCにおけるDNAのメチル化とASCの発現抑制）
ASCLとASCは、そのゲノム上の位置づけと、pyrin domainの相同性から密接に関連するものと考えられる。そこで、HCCにおけるASC遺伝子のメチル化と発現を解析した。10のHCC cell lineのうち、7つ（HuH2、HuH4、HuH7、Li-7、PLC/RPF/5、Kim1およびFLC4）がメチル化を受けていた（図３Ａ）。対照的に、残りの3つのcell lineと正常肝サンプルでは、メチル化は検出されなかった。発現解析では、完全にメチル化されているcell line（HuH2、PLC/PRF/5およびFLC4）では、まったく発現せず（図３Ｂ）、これらのcell lineでは、DNAのメチル化に関連してASC遺伝子が不活化されていることが示唆された。部分的にメチル化を受けたcell lineでは、ASC遺伝子の発現が見られ、メチル化を受けていない対立遺伝子が活性を有するものと考えられた。
ASCLとASCは、そのゲノム上の位置づけと、pyrin domainの相同性から密接に関連するものと考えられる。そこで、HCCにおけるASC遺伝子のメチル化と発現を解析した。10のHCC cell lineのうち、7つ（HuH2、HuH4、HuH7、Li-7、PLC/RPF/5、Kim1およびFLC4）がメチル化を受けていた（図３Ａ）。対照的に、残りの3つのcell lineと正常肝サンプルでは、メチル化は検出されなかった。発現解析では、完全にメチル化されているcell line（HuH2、PLC/PRF/5およびFLC4）では、まったく発現せず（図３Ｂ）、これらのcell lineでは、DNAのメチル化に関連してASC遺伝子が不活化されていることが示唆された。部分的にメチル化を受けたcell lineでは、ASC遺伝子の発現が見られ、メチル化を受けていない対立遺伝子が活性を有するものと考えられた。
原発性HCCでは、17サンプルのうち6つでASC遺伝子のメチル化が見られ、非癌肝サンプルでは、メチル化は見られなかった（図３Ｃ）。
（ASCLの免疫学的特性）
ASCL遺伝子またはASC遺伝子を含むベクターで形質転換した細胞を3%パラホルムアルデヒドで固定し、0.1%Triton X-100で処理した。マウス抗Xpress (Invitrogen)抗体および、ウサギ抗HA (Santa Cruz Biotechnology, Inc)抗体を使用して、Xpress標識されたASCLおよび、HA標識されたASCを検出した。
ASCL遺伝子またはASC遺伝子を含むベクターで形質転換した細胞を3%パラホルムアルデヒドで固定し、0.1%Triton X-100で処理した。マウス抗Xpress (Invitrogen)抗体および、ウサギ抗HA (Santa Cruz Biotechnology, Inc)抗体を使用して、Xpress標識されたASCLおよび、HA標識されたASCを検出した。
細胞はCy3またはFITCで標識した二次抗体（Jackson Immunoresearch）とインキュベートし、DAPI染色して共焦点顕微鏡で観察した。Speck陽性細胞または多核細胞の解析のため、ASCLおよび／またはASCを発現する200の細胞を観察した。
この結果、ASCLは、HuH2細胞を形質転換した発現細胞において、その30%で小さなspeck様の染色を示した（図４Ａ）。これらのspeckは、核とサイトゾルで観察された。
ASCは、HL60およびHela細胞における場合と同様に（Masumoto J, et al. J Biol Chem 1999;274:33835-8、McConnell BB, et al. Cancer Res 2000;60:6243-7、Richards N, et al. J Biol Chem 2001;276:39320-9）、HuH2細胞においてもspeckを形成した（図４Ｂ）。
ASCLとASCとを共発現させると、ASC特異的speckがサイトゾルに出現し、ASCLはASC特異的speckにおいてASCと共在することが判明した（図４Ｃ）。ASC特異的speckが現れた細胞の頻度は、ASC単独で発現させた場合（18%）と、ASCとASCLを共発現させた場合（17%）においてほぼ同等であった。
また、ASCLまたはASC遺伝子で形質転換した細胞においては、多核細胞が増加していることが確認された（図４Ｄ、Ｅ）。多核細胞の頻度は、ASCLで12％、ASCで5%、コントロールで1%であった。
一方、ASCのspeckは一細胞あたり一つなのに対して、ASCLのspeckは、ASCのspeckより小さなサイズのものが一細胞に複数出現した。また、ASCLのspeckはある細胞では核とサイトゾルの両方（図４Ｆ−ａ）に、ある細胞では核のみに（図４Ｆ−ｂ）、またある細胞ではサイトゾルのみに（図４Ｆ−ｃ）出現したが、ASCのspeckにはこのような動きは見られず、常に核とサイトゾルの両方に見られた（図４Ｇ）。
Claims (14)
- 下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするＤＮＡ。 - 配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ。
- 請求項１または２に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質またはペプチド。
- 請求項１または２に記載のＤＮＡを含有するベクター。
- 請求項４に記載のベクターを含む形質転換体。
- 請求項５に記載の形質転換体を培養し、発現したタンパク質またはペプチドを回収する工程を含む、請求項３に記載のタンパク質またはペプチドの製造方法。
- 請求項３に記載のタンパク質または部分ペプチドに結合する抗体。
- 被検者から採取した試料からＤＮＡを抽出する工程と、
該ＤＮＡ上の下記（ｉ）〜（v）のいずれかに記載の領域におけるメチル化の頻度を測定する工程と、を含む癌の診断方法。
（i）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含む領域。
（ii）配列番号：１に記載の塩基配列を含む領域。
（iii）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするＤＮＡを含む領域。
（iv）配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同質のタンパク質をコードするＤＮＡを含む領域。
（v）配列番号３に記載の塩基配列からなる領域。 - さらに、前記被検者から採取した試料から抽出されたＤＮＡ上の、ＡＳＣタンパク質のコード領域におけるメチル化の頻度も測定する、請求項８に記載の方法。
- 前記メチル化の頻度を測定する工程が、Methylation Specific ＰＣＲ法である、請求項８または９に記載の方法。
- 前記メチル化の頻度を測定する工程が、Bisulfite Sequencing法である、請求項８または９に記載の方法。
- 被検者から採取した試料中における請求項１に記載のＤＮＡの発現を検出および／または定量する工程と、
これを健常者における場合と比較して、該ＤＮＡの発現が低下している場合に被検者が癌であると判定する工程と、を含む癌の診断方法。 - 下記（ａ）または（ｂ）を含む癌の診断用キット。
（ａ）請求項３に記載のタンパク質またはペプチドに結合する抗体。
（ｂ）請求項１または２に記載のＤＮＡ若しくはその相補鎖の全部または一部に相補的なポリヌクレオチド。 - 請求項１に記載のＤＮＡの発現を亢進または抑制する化合物のスクリーニング方法であって、
細胞に被検化合物を添加する工程と、
前記被検化合物の添加の前後における、前記細胞内での請求項１に記載のＤＮＡの発現の変化を検出および／または定量する工程と、を含む方法。
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|---|---|---|---|---|
| JP2011521240A (ja) * | 2008-07-03 | 2011-07-21 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 肺癌用マーカーとしてのａｓｃ |
| KR101619122B1 (ko) | 2013-08-14 | 2016-05-10 | 연세대학교 산학협력단 | 탈메틸화 의존적 ａｓｃ 발현을 촉진시켜서 대장암 종양세포의 사멸감수성을 증진시키는 항암제 병용 투여용 후보물질의 스크리닝 방법 |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| US20030077699A1 (en) * | 2000-09-26 | 2003-04-24 | Reed John C. | PAAD domain-containing polypeptides, encoding nucleic acids, and methods of use |
| US20040002593A1 (en) * | 2002-04-04 | 2004-01-01 | Reed John C. | PAAD domain-containing polypeptides, encoding nucleic acids, and methods of use |
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2004
- 2004-07-28 JP JP2004219993A patent/JP2006061002A/ja active Pending
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