JP2002523088A - 結腸癌において示差的に発現されるヒト遺伝子 - Google Patents

結腸癌において示差的に発現されるヒト遺伝子

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エディー ザ サード キャロル，
セオドア ジェイ． カティーノ，
プアーニマ ドウィベディ，
ドナ エム． フォード，
マーシャ イー． ルイス，
ゲイリー エイ． モリノ，
ジョン イー． モナハン，
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なヒト遺伝子に関し、この遺伝子に発現されるタンパク質に関し、そしてこのタンパク質の改変体に関する。本発明はまた、この遺伝子およびタンパク質に関連する診断アッセイおよび治療薬剤にも関連し、これらには、プローブ、アンチセンス構築物、および抗体が含まれる。本発明の核酸は、腫瘍細胞、特に結腸癌組織において、示差的に調節されることが見出されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、その全体が本明細書中で参考として援用されている、１９９９年１
月２７日に出願された仮特許出願番号第６０／１１７，３９３号および１９９８
年８月３１日に出願された仮特許出願番号第６０／０９８，６３９号に基づく。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は、核酸配列、およびそれによってコードされるタンパク質、ならびに
その核酸配列に由来するプローブ、コードされたタンパク質に対する抗体、およ
び癌性細胞（特に、結腸癌細胞）を検出するための診断方法を提供する。
【０００３】 （発明の背景） 結腸直腸癌腫（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、悪性の新生
物形成性疾患である。西洋（特に、米国において）には結腸直腸癌腫の高い発病
率が存在する。この型の腫瘍は、しばしば、リンパ性のチャンネルおよび血管の
チャンネルを介して転移する。結腸直腸癌腫を有する多くの患者は、最終的には
この疾患によって死亡する。実際、米国だけでも６２，０００人が、毎年結腸直
腸癌腫で死亡していると推定される。
【０００４】 しかし、早期に診断されれば、結腸癌は、癌性組織の外科手術による除去によ
って効果的に処置され得る。結腸直腸癌は、結腸直腸の上皮に起源し、そして代
表的には、発症の初期段階の間は、広範囲には血管化しない（従って、侵襲性で
はない）。結腸直腸癌は、結腸または直腸の上皮の管壁中での単一の変異細胞の
クローン性拡大から生じると考えられている。高度に血管化された、侵襲性の、
そして最終的に転移性の癌（これは、体全体に拡大する）に移行するには、一般
に、１０年またはそれ以上を要する。癌が侵襲性になる前に検出された場合は、
癌性組織の外科手術による除去が、有効な治療である。しかし、結腸直腸癌はし
ばしば、臨床的な症状（例えば、痛みおよび黒いタール状の便）の発現の際にの
み、検出される。一般的には、このような症状は、疾患が十分に確立された場合
にのみ存在し、しばしば、転移が起こった後に存在し、そして癌性組織の外科手
術による切除の後でさえ、患者についての予後は、乏しい。従って、その検出が
その罹患率を有意に低下させ得るという点で、直腸結腸癌の初期の検出が、重要
である。
【０００５】 侵襲性の診断方法（例えば、内視鏡による検査）は、ポリープのような潜在的
な癌性増殖の直接的な可視的な同定、除去、および生検を可能にする。内視鏡は
、高価であり、そして不快であり、そして本質的にリスクが高く、従って、結腸
直腸癌を有するものを同定するための集団のスクリーニングのためには実用的な
道具ではない。結腸直腸の癌または前癌の存在を示す特徴についての便のサンプ
ルの非侵襲的な分析は、初期の診断のための好ましい代替法であるが、この目的
を確かに達成する利用可能な診断方法は、知られていない。初期段階で結腸癌を
診断するための、確かな、侵襲的ではない、そして正確な技術は、多くの生命を
守る手助けとなる。
【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、核酸配列、およびそれによってコードされるタンパク質、ならびに
その核酸配列に由来するプローブ、コードされたタンパク質に対する抗体、およ
び癌性細胞（特に、結腸癌細胞）を検出するための診断方法を提供する。本明細
書中に開示された配列は、結腸癌細胞株および／または結腸癌組織から得られら
サンプルにおいて示差的に発現されることが見出された。得られた５４４の配列
を、公に利用可能なデータベースに対してこれら配列を「ブラスティング（ｂｌ
ａｓｔｉｎｇ）」することにより分析した；Ｂｌａｓｔサーチ結果に基づいて、
配列番号１−３５は、新規な配列を含み、配列番号３６−１６８は、ＥＳＴ配列
を含み、そして配列番号１６９−５４４は、公知の配列を含むことが見出された
。
【０００７】 １つの局面においては、本発明は、配列番号１−５４４の配列またはそれに相
補的である配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌク
レオチド配列を含む、単離された核酸を提供する。関連する実施態様においては
、この核酸は、配列番号１−５４４のうちの１つまたはそれに相補的である配列
の、少なくとも約１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または少
なくとも約４０個の連続するヌクレオチドから全長まで、あるいはその配列がフ
ラグメントである遺伝子の全長まで、に対応する配列に対して、少なくとも約８
０％、または約１００％同一である。特定の実施態様においては、本発明の核酸
は、表２に新規であるとして示される領域に由来する、少なくとも約５個、少な
くとも約１０個、または少なくとも約２０個の核酸を含む。特定の他の実施態様
においては、本発明の核酸は、その登録番号が表２に列挙される対応するクロー
ンには含まれない、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、または少なくとも
約２０個のヌクレオチドを含む。
【０００８】 別の局面においては、本発明は、配列番号１−１６８、好ましくは、配列番号
１−３５の配列、またはそれに相補的である配列に対して、ストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸を提供す
る。関連する実施態様においては、この核酸は、配列番号１−１６８、好ましく
は配列番号１−３５のうちの１つ、またはそれに相補的である配列の、少なくと
も約１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４
０個の連続するヌクレオチドから全長まで、あるいはその配列がフラグメントで
ある遺伝子の全長まで、に対応する配列に対して、少なくとも約８０％、または
約１００％同一である。特定の実施態様においては、本発明の核酸は、表２に新
規であるとして示される領域に由来する、少なくとも約５個、少なくとも約１０
個、または少なくとも約２０個の核酸を含む。特定の他の実施態様においては、
本発明の核酸は、その登録番号が表２に列挙される対応するクローンには含まれ
ない、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、または少なくとも約２０個のヌ
クレオチドを含む。
【０００９】 １つの実施態様においては、本発明は、配列番号１−１６８、好ましくは配列
番号１−３５の配列、またはそれに対して相補的である配列に対してストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、およびこの
ヌクレオチド配列を発現ベクターとしての使用に適切にするようにこのヌクレオ
チド配列に作動可能に連結された転写調節配列を提供する。別の実施態様におい
ては、この核酸は、原核生物細胞または真核生物細胞中での複製が可能な発現ベ
クター中に含まれ得る。関連する実施態様においては、本発明は、この発現ベク
ターを用いてトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００１０】 別の実施態様においては、本発明は、その細胞中に取り込まれた、配列番号１
−１６８、好ましくは配列番号１−３５の配列またはそれに相補的である配列に
対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む
核酸のトランスジーンを有する、トランスジェニック動物を提供する。このトラ
ンスジーンは、この核酸の発現のレベル、この核酸のｍＲＮＡ転写の安定性、ま
たはこの核酸のコードされる産物の活性を改変する。
【００１１】 なお別の実施態様においては、本発明は、配列番号１−１６８、好ましくは配
列番号１−３５のうちの１つまたはそれらに相補的である配列の、少なくとも約
１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個
の連続するヌクレオチドから全長まで、あるいはその配列がフラグメントである
遺伝子の全長まで、に対応する核酸プローブに対して、ストリンジェントな条件
下でハイブリダイズする実質的に純粋な核酸を提供する。本発明はまた、配列番
号１−５４４のうちの１つの、少なくとも１２個、少なくとも２５個、もしくは
少なくとも５０個の連続するヌクレオチドから、配列番号１−５４４のうちの１
つもしくはそれに相補的な配列の全長まで、またはその配列がフラグメントであ
る遺伝子の全長まで、に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
そして、ヌクレアーゼ（好ましくは、内因性のエンドヌクレアーゼまたはエキソ
ヌクレアーゼ）による切断に対して耐性である、アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドアナログを提供する。
【００１２】 別の実施態様においては、本発明は、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド
を含むプローブ／プライマーを提供する。上記のオリゴヌクレオチドは、配列番
号１−１６８から選択されるセンス配列またはアンチセンス配列の、少なくとも
約１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、もしくは少なくとも約４
０個の連続するヌクレオチドから配列番号１−１６８のうちの１つもしくはそれ
に相補的である配列の全長まで、またはその配列がフラグメントである遺伝子の
全長まで、に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチ
ド配列の領域を含む。好ましい実施態様においては、このプローブは、標的核酸
と選択的にハイブリダイズする。別の実施態様においては、このプローブは、こ
のプローブに付着され、そして検出され得る標識基を含み得る。この標識基は、
放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、および酵素補因子から選択され得る。本発
明はさらに、固体支持体に付着された、上記に記載されるような少なくとも約１
０個、少なくとも約２５個、少なくとも約５０個、または少なくとも約１００個
の異なるプローブの、アレイを提供する。
【００１３】 なお別の実施態様においては、本発明は、細胞の表現型を決定する方法に関す
る。この方法は、正常な細胞と比較して、配列番号１−５４４の１つに対してス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１つの核酸の示差的な
発現を検出する工程であって、ここで、この核酸は、少なくとも２倍、少なくと
も５倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍示差的に発現される、工程
を包含する。
【００１４】 別の局面においては、本発明は、本発明の核酸によってコードされるポリペプ
チドを提供する。１つの実施態様においては、本発明は、配列番号１−１６８の
配列、もしくはそれに対して相補的な配列に対してストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされるアミノ酸
配列を含むポリペプチド、またはその少なくとも約２５個、もしくは少なくとも
約４０個のアミノ酸を含むフラグメントに関する。これらのポリペプチドに対し
て免疫反応性である抗体が、さらに提供される。
【００１５】 なお別の局面においては、本発明は、診断方法を提供する。１つの実施態様に
おいては、本発明は、以下によって患者由来の細胞の表現型を決定するための方
法に関する：配列番号１−５４４の配列中に示される、少なくとも１２個、少な
くとも約１５個、少なくとも約２５個、もしくは少なくとも約４０個の連続する
ヌクレオチドから、配列番号１−５４４の１つまたはそれに相補的な配列の全長
まで、あるいはその配列がフラグメントである遺伝子の全長まで、を有するヌク
レオチド配列を含む核酸プローブを提供すること、患者から細胞のサンプルを得
ること、その実質的に全てが非癌性である第２の細胞のサンプルを提供すること
、上記の第１の細胞のサンプルおよび第２の細胞のサンプルのそれぞれのｍＲＮ
Ａと、ストリンジェントな条件下でこの核酸プローブを接触させること、ならび
に（ａ）第１の細胞のサンプルのｍＲＮＡとのプローブのハイブリダイゼーショ
ンの量と、（ｂ）第２の細胞のサンプルのｍＲＮＡとのプローブのハイブリダイ
ゼーションの量とを比較することであって、ここで、第２の細胞のサンプルのｍ
ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比較した場合の、第１の細胞のサンプ
ルのｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量における、少なくとも２倍、少な
くとも５倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍の差異は、この第１の
細胞のサンプル中の細胞の表現型の指標であること。表現型を決定することは、
この用語が本明細書中で使用される場合は、その遺伝子型を決定することを含む
。
【００１６】 別の実施態様においては、本発明は、形質転換された細胞を同定するための試
験キットを提供する。このキットは、患者から単離された細胞のサンプル中の、
配列番号１−５４４の核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
する核酸のレベルを測定するための、上記のようなプローブ／プライマーを含む
。特定の実施態様においては、このキットは、このキットを使用するための説明
書、細胞を懸濁または固定するための溶液、検出可能なタグまたは標識、ハイブ
リダイゼーションに対して核酸を敏感にするための溶液、細胞を溶解するための
溶液、あるいは核酸の精製のための溶液をさらに含み得る。
【００１７】 別の実施態様においては、本発明は、細胞の表現型を決定する方法を提供する
。この方法は、配列番号１−５４４のうちの１つに対してストリンジェントな条
件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる少なくとも１つのタンパク
質の、正常な細胞と比較して示差的な発現を検出する工程を包含する。ここで、
このタンパク質は、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも２０倍、また
は少なくとも５０倍、示差的に発現される。１つの実施態様においては、タンパ
ク質のレベルは、イムノアッセイにおいて検出される。本発明はまた、細胞中の
配列番号１−１６８の１つに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
する核酸の存在または非存在を決定するための方法に関する。この方法は、上記
のようなプローブと、細胞とを接触させる工程を包含する。本発明はさらに、細
胞中の、配列番号１−１６８のうちの１つに対してストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズする核酸によってコードされる本発明のポリペプチドの存在また
は非存在を決定するための方法を提供する。この方法は、上記のような抗体と、
細胞とを接触させる工程を包含する。なお別の実施態様においては、本発明は、
配列番号１−１６８の配列またはそれに対して相補的である配列にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズする遺伝子中での異常な変異（例えば、核酸の欠
失、挿入、もしくは置換）または異常なメチル化の存在を決定するための方法を
提供する。この方法は、患者から細胞のサンプルを回収する工程、このサンプル
の細胞から核酸を単離する工程、この核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅
が生じるような条件下で、配列番号１−５４４の核酸配列に特異的にハイブリダ
イズする１つ以上のプライマーとこの核酸サンプルとを接触させる工程、ならび
に増幅産物の存在、非存在、または大きさを正常な細胞の増幅産物に対して比較
する工程を包含する。
【００１８】 １つの実施態様においては、本発明は、形質転換された細胞を同定するための
試験キットを提供する。このキットは、配列番号１−５４４のいずれか１つにス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパ
ク質に特異的な抗体を含む。特定の実施態様においては、このキットは、このキ
ットを使用するための説明書をさらに含む。特定の実施態様においては、このキ
ットは、このキットを使用するための説明書、細胞を懸濁または固定するための
溶液、検出可能なタグまたは標識、抗体の結合に対してポリぺプチドを敏感にす
るための溶液、細胞を溶解するための溶液、あるいはポリペプチドの精製のため
の溶液をさらに含み得る。
【００１９】 なお別の局面においては、本発明は、本発明の核酸を含む薬学的組成物を提供
する。１つの実施態様においては、配列番号１−５４４のうちの１つまたはそれ
に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の
細胞中での発現のレベルを変化させる薬剤が以下によって同定される：細胞を提
供すること、試験薬剤でこの細胞を処理すること、配列番号１−５４４のうちの
１つまたはそれに相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズする核酸の細胞中での発現のレベルを決定すること、および処理していない
細胞中でのこの核酸の発現のレベルと処理した細胞中でのこの核酸の発現のレベ
ルとを比較することであって、ここで、処理していない細胞中の核酸の発現のレ
ベルと比較した、処理した細胞中での核酸の発現のレベルにおける変化は、細胞
中の核酸の発現のレベルを変化させる薬剤の指標であること。本発明はさらに、
この方法によって同定される薬剤を含有する、薬学的組成物を提供する。別の実
施態様においては、本発明は、配列番号１−５４４の１つまたはそれに相補的な
配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
を有する核酸によってコードされるポリペプチドを含有する、薬学的組成物を提
供する。１つの実施態様においては、本発明は、配列番号１−５４４の１つまた
はそれに相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
配列を含む核酸を含有する薬学的組成物に関する。
【００２０】 （発明の詳細な説明） 本発明は、開示されるヌクレオチド配列（配列番号１−５４４）を有する核酸
、ならびにこれらの配列に対応する全長ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、および遺伝子、な
らびにこれらの核酸および遺伝子およびその一部によってコードされるポリペプ
チドおよびタンパク質に関する。
【００２１】 配列番号１−５４４の核酸によってコードされるポリペプチドおよびタンパク
質をコードする核酸もまた、含まれる。これらのポリペプチドおよびタンパク質
をコードし得る種々の核酸は、ほとんどのアミノ酸が１つより多くの三重コドン
によってコードされるという遺伝コードの縮重に起因して異なる。このようなコ
ドンの同一性は当該分野においては周知であり、そしてこの情報は、本発明の範
囲内で核酸の構築のために使用され得る。
【００２２】 核酸および関連するｃＤＮＡおよび遺伝子によってコードされるポリペプチド
およびタンパク質の改変体である、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする
核酸もまた、本発明の範囲内である。改変体は、野生型タンパク質の生物学的活
性を増強する、付加する、または低下させるのいずれかである、１つ以上のアミ
ノ酸置換を有するという点で、野生型タンパク質とは異なる。一旦、アミノ酸変
化が選択されると、その改変体をコードする核酸が本発明に従って構築される。
【００２３】 以下の詳細な説明は、核酸に対応する全長ｃＤＮＡおよびヒト遺伝子を得るか
または作成するための方法、これらの核酸および遺伝子を発現するための方法、
遺伝子の構造的なモチーフを同定するための方法、核酸に対応する遺伝子によっ
てコードされるタンパク質の機能を同定するための方法、マッピングおよび組織
プロファイリングにおけるプローブとして核酸を使用する方法、抗体を惹起する
ために対応するポリペプチドおよびタンパク質を使用する方法、ならびに、治療
目的および診断目的のために核酸、ポリペプチド、およびタンパク質を使用する
方法を開示する。
【００２４】 本明細書中で研究される配列は、結腸癌組織から得られるサンプル中で示差的
に発現されることが見出されている。しかし、これらの配列は、他の型の癌に関
する有用性をもまた有し得ると考えられている。関連出願のＰＣＴ／ＩＢ９９／
０１０６２（１９９９年６月９日出願）では、本発明者らは、正常組織（例えば
、正常結腸組織および／または正常非結腸組織）における発現レベルに比較した
結腸癌由来細胞株（例えばＳＷ４８０）において示差的に発現された核酸配列を
開示した。本出願では、表３に、癌細胞株ＳＷ４８０ならびに種々の患者から得
られた結腸癌組織の両方において過剰発現される核酸配列を列挙する。
【００２５】 従って、本発明の特定の局面は、腫瘍組織（特に、結腸癌細胞株）中で示差的
に発現される核酸、このような核酸によってコードされるポリペプチド、および
これらのポリペプチドと免疫反応性である抗体、およびこのような組成物の調製
物に関する。さらに、本発明は、例えば、本核酸の異常な発現に関連する障害を
検出および処置するための、診断および治療アッセイおよび試薬を提供する。
【００２６】 （Ｉ．概要） 本発明は、ヒトの腫瘍（特に、固形腫瘍（例えば、乳癌または結腸癌のような
癌腫および肉腫）中に存在する癌性の細胞を同定および／または分類するための
新規の方法に、一部、関連する。この方法は、正常な結腸細胞のような、関連す
る正常な細胞と比較して、癌細胞株および／または癌組織中で示差的に発現され
る遺伝子を使用し、それによって特定の遺伝子の発現のアップレギュレーション
および／またはダウンレギュレーション、腫瘍形成に関連する事象により、腫瘍
細胞を同定または分類する。
【００２７】 特定の遺伝子（例えば、オンコジーン）のアップレギュレーションまたは増大
した発現は、悪性腫瘍の増殖を促進するように作用する。腫瘍サプレッサー遺伝
子のような遺伝子のダウンレギュレーションまたは低下した発現もまた、悪性腫
瘍の増殖を促進する。従って、遺伝子のいずれかの型の発現における変更は、被
験体が癌（例えば、結腸癌）を発症する危険性があるか、または癌を有している
かどうかを決定するための可能性のある診断の指標である。
【００２８】 従って、１つの局面においては、本発明はまた、ヒトの腫瘍細胞について（例
えば、結腸癌細胞について）の核酸マーカーのような生体マーカーを提供する。
本発明はまた、これらの核酸マーカーによってコードされるタンパク質を提供す
る。
【００２９】 本発明はまた、このような癌細胞の処置のため、および癌性の状態（例えば、
結腸癌）の処置のために有用な薬物を同定するための方法を特徴とする。以前の
方法とは異なり、本発明は、発症の初期段階で癌細胞を同定するための手段を提
供し、その結果、前悪性腫瘍細胞は、ヒトの体全体にそれらが蔓延する前に同定
され得る。このことによって、可能性のある癌性の状態の初期の検出、および体
全体の癌性の細胞の蔓延の前または回復不可能な癌性の状態の発症の前のこのよ
うな癌性の状態の処置を可能にする。
【００３０】 （ＩＩ．定義） 便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用される特
定の用語および句の意味を、以下に提供する。
【００３１】 用語「異常な発現」は、本発明の核酸に対して適用される場合は、健常な組織
中のその核酸の発現のレベルとは異なるか、または健常な被験体中に存在するポ
リペプチドの活性とは異なる、核酸の発現のレベルをいう。ポリペプチドの活性
は、それがそのネイティブ対応物の活性より強いという理由で、異常であり得る
。あるいは、活性は、それがそのネイティブ対応物の活性と比較して弱いかまた
は欠失しているという理由で、異常であり得る。異常な活性はまた、活性におけ
る変化であり得る；例えば、異常なポリペプチドは、異なる標的ペプチドと相互
作用し得る。細胞は、遺伝子の過剰発現または過小発現に起因する、その遺伝子
の異常な発現レベルを有し得る。
【００３２】 用語「アゴニスト」は、本明細書中で使用される場合は、タンパク質の生物活
性を模倣するかまたはアップレギュレートする（例えば、強化するかまたは補充
する）因子をいうように意味される。アゴニストは、野生型タンパク質であり得
るか、または野生型タンパク質の少なくとも１つの生物活性を有するその誘導体
であり得る。アゴニストはまた、遺伝子の発現をアップレギュレートするか、ま
たはタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増大させる化合物であり得る。ア
ゴニストはまた、別の分子（例えば、標的ペプチドまたは核酸）とポリペプチド
との相互作用を増大させる化合物であり得る。
【００３３】 用語「対立遺伝子」（これは、本明細書中で「対立遺伝子変異体」と互換的に
使用される）は、遺伝子またはその一部の別の形態をいう。対立遺伝子は、相同
染色体上の同じ遺伝子座または位置を占める。被験体が遺伝子の２つの同一の対
立遺伝子を有する場合は、その被験体は、その遺伝子または対立遺伝子に関して
ホモ接合性であると言われる。被験体が遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有す
る場合は、その被験体は、その遺伝子に関してヘテロ接合性であると言われる。
特定の遺伝子の対立遺伝子は、単一のヌクレオチド、またはいくつかのヌクレオ
チドで互いに異なり得、そしてヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入
を含み得る。遺伝子の対立遺伝子はまた、変異を含有する遺伝子の形態であり得
る。
【００３４】 用語「遺伝子の多型性領域の対立遺伝子変異体」は、他の個体中の遺伝子のそ
の領域において見出されるいくつかのヌクレオチド配列の１つを有する遺伝子の
領域をいう。
【００３５】 「アンタゴニスト」は、本明細書中で使用される場合は、タンパク質の少なく
とも１つの生物活性をダウンレギュレートする（例えば、抑制するかまたは阻害
する）因子をいうように意味される。アンタゴニストは、タンパク質と別の分子
（例えば、標的ペプチドまたは酵素基質）との間の相互作用を阻害するかまたは
低下させる化合物であり得る。アンタゴニストはまた、遺伝子の発現をダウンレ
ギュレートするか、または存在する発現されるタンパク質の量を減少させる化合
物でもあり得る。
【００３６】 用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合は、例えば、任意のイソ型（Ｉ
ｇＧ，ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）の全抗体を含むことが意図され、そしてま
た、脊椎動物（例えば、哺乳動物）タンパク質と特異的に反応性であるそのフラ
グメントを含む。抗体は、従来技術を使用して断片化され得、そしてフラグメン
トは、全抗体について上記と同じ様式で有用性についてスクリーニングされ得る
。従って、この用語は、特定のタンパク質と選択的に反応し得る抗体分子の、タ
ンパク質分解的に切断された、または組換え的に調製された部分のセグメントを
含む。このようなタンパク質分解的および／または組換え的なフラグメントの限
定的ではない例として、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ならびにペ
プチドリンカーによって連結されたＶ［Ｌ］および／またはＶ［Ｈ］ドメインを
含有する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ｓｃＦｖは、２つ以上の結合部位
を有する抗体を形成するように、共有結合的に連結され得るかまたは非共有的に
連結され得る。本発明は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または抗
体の他の精製された調製物、および組換え抗体を含む。
【００３７】 「アポトーシス」の現象は周知であり、そしてプログラムされた細胞死として
記載され得る。公知のように、アポトーシスは、毒性の物質または他の外部の効
果によって殺傷させられた結果として細胞が死ぬ場合の現象である「壊死」と対
比される。アポトーシスは、染色体凝集（ｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｎｄｅｎｓ
ａｔｉｏｎ）、膜の小水疱形成（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）、およびＤＮＡの断片化を
伴い、これらの全てが一般には、顕微鏡試験の際に可視である。
【００３８】 核酸の異常な発現「に関連する」かまたはそれらに「よって特徴付けられる」
疾患、障害、または状態は、核酸の発現の異常なレベルによって生じるか、それ
に寄与されるか、またはそれが原因である、被験体中の疾患、障害、または状態
をいう。
【００３９】 本明細書中で使用される場合は、用語「ポリペプチドの生物活性フラグメント
」は、全長ポリペプチドのフラグメントをいう。ここで、このフラグメントは、
野生型のポリペプチドの活性を特異的にアゴナイズ（模倣）するかまたはアンタ
ゴナイズ（阻害）する。生物活性フラグメントは、好ましくは、全長タンパク質
が結合し得る少なくとも１つの他の分子（例えば、タンパク質、低分子、または
ＤＮＡ）と相互作用し得るフラグメントである。
【００４０】 「生物学的活性」または「生物活性」または「活性」または「生物学的機能」
（これらは互換的に使用される）は、本明細書中では、ポリペプチド（そのネイ
ティブのコンフォメーションまたは変性されたコンフォメーションにはかかわら
ず）によってか、あるいはその任意の部分配列によって、直接的または間接的に
行われるエフェクターまたは抗原性の機能を意味する。生物学的活性は、ポリペ
プチドに対する結合、他のタンパク質または分子に対する結合、ＤＮＡ結合タン
パク質として、転写調節因子としての活性、損傷したＤＮＡを結合する能力など
を含む。生物活性は、対象のポリペプチドに直接影響を及ぼすことによって調節
され得る。あるいは、生物活性は、ポリペプチドのレベルを調節することによっ
て（例えば、対応する遺伝子の発現を調節することによって）変更され得る。
【００４１】 用語「生体マーカー」は、その存在または濃度が検出され得、そして既知の状
態（例えば、疾患状態）と相関付けされ得る、生物学的な分子（例えば、核酸、
ペプチド、ホルモンなど）をいう。
【００４２】 「細胞」、「宿主細胞」、または「組換え宿主細胞」は、本明細書中で互換的
に使用される用語である。このような用語が、特定の対象の細胞だけではなく、
そのような細胞の子孫または可能性のある子孫をも意味することが理解される。
特定の改変が、変異または環境的な影響のいずれかに起因して、続く世代におい
て生じ得るので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれ
ないが、本明細書中で使用される場合この用語の範囲になお含まれる。
【００４３】 「キメラポリペプチド」または「融合ポリペプチド」は、対象のポリペプチド
の１つをコードする第１のアミノ酸配列と、対象のポリペプチドの任意のドメイ
ンに対して外来であり、そして実質的に相同ではないドメイン（例えば、ポリペ
プチド部分）を規定する第２のアミノ酸配列との融合体である。キメラポリペプ
チドは、生物（これもまた第１のポリペプチドを発現する）中に（異なるポリペ
プチド中であるにもかかわらず）見出される外来ドメインを提示し得るか、ある
いはこれは、生物の異なる種によって発現されるポリペプチド構造の「種間」、
「遺伝子間（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ）」などの融合体であり得る。一般には、融
合ポリペプチドは、一般式（Ｘ）n−（Ｙ）m−（Ｚ）nによって表され得る。こ
こで、Ｙは、対象のポリペプチドの一部を表し、そしてＸおよびＺは、それぞれ
独立して、存在しないか、あるいは生物中で見出されるネイティブの配列と非関
連であるかまたは対象の配列と連続するポリペプチド鎖としては見出されない、
アミノ酸配列を表す。ここで、ｍは、１以上の整数であり、そしてｎのそれぞれ
の事象は、独立して、０または１以上の整数である（ｎおよびｍは、５または１
０よりは大きくないことが好ましい）。
【００４４】 「送達複合体」は、標的化手段（例えば、標的細胞表面に対する核酸、タンパ
ク質、ポリペプチド、もしくはペプチドのより高い親和性結合、および／または
標的細胞による増大した細胞取り込みもしくは核取り込みを生じる分子）を意味
する。標的化手段の例として以下が挙げられる：ステロール（例えば、コレステ
ロール）、脂質（例えば、カチオン性脂質、ウイロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）
、もしくはリポソーム）、ウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイ
ルス、およびレトロウイルス）、または標的細胞特異的結合因子（例えば、標的
細胞特異的レセプターによって認識されるリガンド）。好ましい複合体は、標的
細胞によってインターナライズされる前の有意なアンカップリング（ｕｎｃｏｕ
ｐｌｉｎｇ）を妨げるために、十分にインビボで安定である。しかし、この複合
体は、核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドが機能的な形態で放出
されるように、細胞中での適切な条件下で切断可能である。
【００４５】 周知であるように、遺伝子または特定のポリペプチドは、個体のゲノム中の単
一または複数のコピーで存在し得る。このような複製遺伝子は同一であり得るか
または特定の改変（ヌクレオチドの置換、付加、または欠失を含む）を有し得る
。これらの全ては、なお、実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードする
。従って、用語「ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列」は、特定の個体中の１
つ以上の遺伝子に言及し得る。さらに、ヌクレオチド配列における特定の差異が
、個々の生物間で存在し得、これは、対立遺伝子と呼ばれる。このような対立遺
伝子の差異は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列における差異を生じて
もよいし、または生じなくてもよいが、同じ生物学的活性を有するポリペプチド
をなおコードする。
【００４６】 用語「等価物」は、機能的な等価なポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を含むと理解される。等価なヌクレオチド配列は、１つ以上のヌクレオチドの
置換、付加、または欠失によって異なる配列（例えば、対立遺伝子変異体）を含
む；従って、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１〜５４４に示される核酸
のヌクレオチド配列とは異なる配列を含む。
【００４７】 本明細書中で使用される場合は、用語「遺伝子」、「組換え遺伝子」、および
「遺伝子構築物」は、エキソン配列および（必要に応じて）イントロン配列の両
方を含む、オープンリーディングフレームを伴う本発明の核酸をいう。
【００４８】 「組換え遺伝子」は、ポリペプチドをコードし、そしてエキソン配列を含む核
酸をいうが、これは、必要に応じて、例えば、関連するかまたは関連しない染色
体遺伝子に由来するイントロン配列を含み得る。用語「イントロン」は、タンパ
ク質には翻訳されない所定の遺伝子中に存在するＤＮＡ配列をいい、そして一般
には、エキソン間に見出される。
【００４９】 用語、細胞の「増殖」または「増殖状態」は、細胞の増殖性の状態、ならびに
その分化の状態をいう。従って、この用語は、細胞がある細胞周期の期（例えば
、Ｇ０，Ｇ１、Ｇ２、前期、中期、または終期）、ならびにその分化の状態（例
えば、分化していない、部分的に分化している、または完全に分化している）を
いう。制限されることは望まないが、細胞の分化は、通常は、細胞の増殖速度に
おける低下によって達成される。
【００５０】 「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間、または
２つの核酸分子間の配列類似性をいい、そして同一性がより厳密な比較である。
相同性および同一性はそれぞれ、比較の目的のためにアラインメントされ得る各
配列中の位置を比較することによって決定され得る。比較される配列中の位置が
同じ塩基またはアミノ酸によって占有されている場合は、分子はその位置で同一
である。核酸配列間の相同性または類似性または同一性の程度は、核酸配列によ
って共有される位置での同一またはマッチするヌクレオチドの数の関数である。
アミノ酸配列の同一性の程度は、アミノ酸配列によって共有される位置での同一
のアミノ酸の数の関数である。アミノ酸配列の相同性または類似性の程度は、ア
ミノ酸（すなわち、アミノ酸配列によって共有される位置での構造的に関連する
アミノ酸）の数の関数である。「非関連」または「非相同」配列は、本発明の配
列の１つと、４０％未満の同一性を共有するが、好ましくは２５％未満の同一性
を共有する。
【００５１】 用語「パーセント同一」は、２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド
配列間の配列同一性をいう。同一性は、それぞれ、比較の目的のためにアライン
メントされ得るそれぞれの配列中の位置を比較することによって決定され得る。
比較される配列中の等価な位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有される場
合は、分子はその位置で同一である；等価な部位が同じまたは類似のアミノ酸残
基（例えば、立体的な性質および／または電気的性質において類似である）によ
って占有される場合は、分子はその位置で相同（類似）であるといわれ得る。相
同性、類似性、または同一性の割合としての表現は、比較される配列によって共
有される位置での、同一または類似のアミノ酸の数の関数をいう。種々のアライ
ンメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが、使用され得る。これらは、
ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＥＮＴＲＥＺを含む。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡ
ＳＴは、ＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏ
ｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）の一部として入手可能であり、そして例え
ば、デフォルトセッティングを用いて使用され得る。ＥＮＴＲＥＺは、Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍ
ａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ，Ｍｄを通じて利用可能である。１つの実施態様においては、２つの配列のパ
ーセント同一性は、１のギャップ重量を用いるＧＣＧプログラムによって決定さ
れ得る。例えば、各アミノ酸ギャップは、それが２つの配列間での単一のアミノ
酸またはヌクレオチドのミスマッチであるように重み付けられる。
【００５２】 アラインメントための他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、第２６６巻：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６）、Ｄｏｏ
ｌｉｔｔｌｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｒｃｏｕｒｔ
Ｂｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．の一部門，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ，ＵＳＡに記載されている。好ましくは、配列中にギャップを可能にするアラ
インメントプログラムが、配列のアラインメントのために利用される。Ｓｍｉｔ
ｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列のアラインメント中のギャップを可能にする１つ
の型のアルゴリズムである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８
７（１９９７）を参照のこと。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈア
ラインメント方法を使用するＧＡＰプログラムが、配列をアラインメントするた
めに利用され得る。別の検索ストラテジーは、ＭＰＳＲＣＨソフトウェアを使用
する。これは、ＭＡＳＰＡＲコンピューター上で実行される。ＭＰＳＲＣＨは、
大規模な並列したコンピューター上で配列をスコア付けするためのＳｍｉｔｈ−
Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する。このアプローチは、距離を空けて関
連するマッチをピックアップする能力を改良し、そして特に、小さなギャップお
よびヌクレオチド配列の誤りに寛容である。核酸によってコードされるアミノ酸
配列は、タンパク質およびＤＮＡデータベースの両方を検索するために使用され
得る。
【００５３】 個々の配列を有するデータベースは、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編、前出に記載されている。データベースは、Ｇｅ
ｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、およびＤＮＡ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｊａｐａｎ（
ＤＤＢＪ）を含む。
【００５４】 好ましい核酸は、配列番号１〜５４４の１つに示される配列の核酸配列に対し
て、少なくとも７０％、そしてより好ましくは８０％同一、そしてより好ましく
は９０％、そしてなおより好ましくは少なくとも９５％同一である配列を有する
。配列番号１〜５４４の１つに示される核酸配列に対して、少なくとも９０％、
より好ましくは９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％同一で
ある核酸もまた、当然のことながら本発明の範囲内である。好ましい実施態様に
おいては、核酸は哺乳動物のものである。
【００５５】 用語「相互作用する」は、本明細書中で使用される場合は、天然における、タ
ンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、核酸−核酸、およびタンパク質−低
分子、または核酸−低分子間での相互作用のような、分子間の検出可能な相互作
用（例えば、生化学的な相互作用）を含むように意図される。
【００５６】 用語「単離された」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸に関して本明細書中
で使用される場合は、高分子の天然の供給源中に存在するそれぞれ他のＤＮＡま
たはＲＮＡから分離された分子をいう。用語単離されたはまた、本明細書中で使
用される場合は、組換えＤＮＡ技術によって産生される場合には、細胞性の物質
、ウイルス性の物質、または培養培地を実質的に含まない、あるいは、化学的に
合成される場合には、化学的な前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、
核酸またはペプチドをいう。さらに、「単離された核酸」は、フラグメントとし
ては天然には存在せず、そして天然の状態においては見出されない核酸のフラグ
メントを含むことを意味する。用語「単離された」はまた、他の細胞性のタンパ
ク質から単離されたポリペプチドをいうように、本明細書中で使用され、そして
精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を含むことを意味する
。
【００５７】 用語「調節される」および「示差的に調節される」は、本明細書中で使用され
る場合は、アップレギュレーション（すなわち、活性化または刺激（例えば、ア
ゴナイズすることまたは強化することによる））およびダウンレギュレーション
（すなわち、阻害または抑制（例えば、アンタゴナイズすること、低下させるこ
と、もしくは阻害することによる））の両方をいう。
【００５８】 用語「変異した遺伝子」は、変異した遺伝子を有さない被験体と比較して、変
異した遺伝子を有する被験体の表現型を変化させ得る、遺伝子の対立遺伝子の形
態をいう。被験体が、変化した表現型を有するために、この変異についてホモ接
合性でなければならない場合は、その変異は劣性であると言われる。変異した遺
伝子の１つのコピーが、被験体の遺伝子型を変更するために十分である場合は、
その変異は優性であるといわれる。被験体が、変異した遺伝子の１つのコピーを
有し、そして（その遺伝子について）ホモ接合性の被験体の表現型とヘテロ接合
性の被験体の表現型との間の中間である表現型を有する場合は、その変異は相互
優性であると言われる。
【００５９】 文字「Ｎ」は、それが添付の配列表（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ）に
現れる場合には、対応するヌクレオチドの同一性が未知であることを示す。従っ
て、「Ｎ」は、任意のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）での置換
を許容するとして必ずしも解釈されないが、そのアイデンティティが最終的には
決定されていないヌクレオチドの位置を保持するとして解釈されるべきである。
【００６０】 本発明の「非ヒト動物」は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒ
ツジ、イヌ、ウシ）、ニワトリ、両生類、ハ虫類などを含む。好ましい非ヒト動
物は、ラットおよびマウスを含むげっ歯類のファミリーから選択される。最も好
ましくは、マウスである。しかし、トランスジェニック両生類（例えば、Ｘｅｎ
ｏｐｕｓ属のメンバー）およびトランスジェニックニワトリもまた、例えば、胚
形成および組織の形成に影響を与え得る因子を理解および同定するための重要な
ツールを提供し得る。用語「キメラ動物」は、本明細書中で使用されて、組換え
遺伝子がその中で見出される動物、または組換え遺伝子がその動物の全てではな
いがいくつかの細胞において発現される動物をいう。用語「組織特異的キメラ動
物」は、組換え遺伝子の１つが、いくらかの組織中に存在および／または発現も
しくは破壊されているが、他の組織ではそうではないことを示す。
【００６１】 本明細書中で使用される場合は、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ
）、そして適切である場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを
いう。この用語はまた、等価物として、ヌクレオチドアナログから作製されたＲ
ＮＡまたはＤＮＡのいずれかのアナログ、そして記載されている実施態様に対し
て適用可能な場合には一本鎖（センスまたはアンチセンス）ポリヌクレオチドお
よび二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。ＥＳＴ、染色体、
ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｒＲＮＡは、核酸と呼ばれ得る分子の代表的な例で
ある。
【００６２】 用語「配列番号ｘのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列」は
、配列番号ｘを有する核酸の鎖の相補鎖のヌクレオチド配列をいう。用語「相補
鎖」は、用語「相補体」と互換的に本明細書中で使用される。核酸の鎖の相補体
は、コード鎖の相補体または非コード鎖の相補体であり得る。
【００６３】 用語「多型」は、遺伝子またはその一部（例えば、対立遺伝子変異体）の１つ
より多い形態の同時の存在をいう。少なくとも２つの異なる形態（すなわち、２
つの異なるヌクレオチド配列）が存在する遺伝子の一部は、「遺伝子の多型性領
域」といわれる。多型性領域は、そのアイデンティティが種々の対立遺伝子にお
いて異なる単一のヌクレオチドであり得る。多型性領域はまた、いくつかのヌク
レオチド長であり得る。
【００６４】 「多型性遺伝子」とは、少なくとも１つの多型性領域を有する遺伝子をいう。
【００６５】 本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、このプロモーターに
対して作動可能に連結された選択されたＤＮＡ配列の発現を調節するＤＮＡ配列
を意味し、そしてこのプロモーターは、細胞中でのその選択されたＤＮＡ配列の
発現をもたらす。この用語は、「組織特異的」プロモーター（すなわち、特定の
細胞（例えば、特定の組織の細胞）中でのみその選択されたＤＮＡ配列の発現を
もたらすプロモーター）を含む。この用語はまた、いわゆる「漏出性（ｌｅａｋ
ｙ）」プロモーターを含む。これは、主に１つの組織中で選択されたＤＮＡの発
現を調節するが、他の組織においても同様に発現を生じる。この用語はまた、組
織特異的ではないプロモーター、および構成的に発現されるかまたは誘導性であ
る（すなわち、発現レベルが制御され得る）プロモーターを含む。
【００６６】 用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、遺伝子産物
をいう場合には、本明細書中で互換的に使用される。
【００６７】 用語「組換えタンパク質」とは、組換えＤＮＡ技術によって産生される本発明
のポリペプチドをいう。ここでは、一般には、ポリペプチドをコードするＤＮＡ
は、適切な発現ベクター中に挿入され、次いで、これは、異種タンパク質を産生
するように宿主細胞を形質転換するために使用される。さらに、句「に由来する
」は、組換え遺伝子に関しては、「組換えタンパク質」の意味の中に、ネイティ
ブなポリペプチドのアミノ酸配列、またはそのポリペプチドの天然に存在する形
態の置換および欠失（短縮（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を含む）を含む変異によっ
て生成されるそれに類似のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むことが意味さ
れる。
【００６８】 「低分子」は、本明細書中で使用される場合は、約５ｋＤ未満の分子量、およ
び最も好ましくは、約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうことが意味され
る。低分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂
質、または他の有機分子（炭素を含有する）もしくは無機分子であり得る。多く
の製薬会社は、化学的および／または生物学的混合物、しばしば、真菌、細菌、
もしくは藻類の抽出物の広範囲のライブラリーを有する。これらは、生物活性を
調節する化合物を同定するために、本発明の任意のアッセイを用いてスクリーニ
ングされ得る。
【００６９】 本明細書中で使用される場合は、用語「特異的にハイブリダイズする」または
「特異的に検出する」は、配列番号１〜５４４もしくはそれに相補的である配列
、またはその天然に存在する変異体のいずれかの１つに示される核酸の少なくと
も一部（例えば、およそ、６、１２、１５、２０、３０、５０、１００、１５０
、２００、３００、３５０、４００、５００、７５０、または１０００の連続す
るヌクレオチド）にハイブリダイズする本発明の核酸分子の能力をいう。その結
果、これは、異なるタンパク質をコードする細胞の核酸（例えば、ｍＲＮＡまた
はゲノムＤＮＡ）に対して、１５％未満、好ましくは１０％未満、そしてより好
ましくは５％未満のバックグラウンドのハイブリダイゼーションを有する。好ま
しい実施態様においては、オリゴヌクレオチドプローブは、特定の核酸のみを検
出する。例えば、これは、類似である核酸または関連する核酸、またはそれらの
相補体に対して実質的にハイブリダイズしない。
【００７０】 「転写調節配列」は、開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーターのよ
うなＤＮＡ配列をいうための、明細書を通じて使用される一般的な用語である。
「転写調節配列」は、それらが作動可能に連結されるタンパク質コード配列の転
写を誘導または制御する。好ましい実施態様においては、遺伝子の１つの転写は
、発現が意図される細胞型中での組換え遺伝子の発現を制御する、プロモーター
配列（または、他の転写調節配列）の制御下にある。組換え遺伝子が、ポリペプ
チドの天然に存在する形態の転写を制御する配列と同じであるかまたはそれとは
異なる、転写調節配列の制御下にあり得ることもまた、理解される。
【００７１】 本明細書中で使用される場合、用語「トランスフェクション」は、核酸によっ
て媒介される遺伝子移入によるレシピエント細胞中への（例えば、発現ベクター
を介する）核酸の導入を意味する。「形質転換」は、本明細書中で使用される場
合、外因性のＤＮＡまたはＲＮＡの細胞取りこみの結果として細胞の遺伝子型が
変更されるプロセスをいう。そして例えば、形質転換された細胞は、ポリペプチ
ドの組換え形態を発現するか、または移入された遺伝子からのアンチセンスの発
現の場合には、標的遺伝子の発現が破壊される。
【００７２】 本明細書中で使用される場合、用語「トランスジーン」は、細胞中に導入され
ている核酸配列（またはそれに対するアンチセンス転写物）を意味する。トラン
スジーンは、それが導入されるトランスジェニック動物または細胞に対して、部
分的にもしくは全体的に異種（すなわち、外来性）であり得るか、またはそれが
導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞の内因性の遺伝子に対して、同
種である。しかし、これは、それが挿入される細胞のゲノムを変更するような様
式で動物のゲノム中に挿入されるように設計されるか、または挿入される（例え
ば、これは、天然の遺伝子のものとは異なる位置に挿入されるか、またはその挿
入はノックアウトを生じる）。トランスジーンはまた、エピソームの形態で細胞
中に存在し得る。トランスジーンは、１つ以上の転写調節配列、および選択され
た核酸の最適な発現のために必要であり得る任意の他の核酸（例えば、イントロ
ン）を含み得る。
【００７３】 「トランスジェニック動物」は、任意の動物（好ましくは、非ヒト哺乳動物、
鳥類、または両生類）をいう。ここで、動物の１つ以上の細胞は、ヒトの介入に
よって、例えば、当該分野で周知のトランスジェニック技術によって導入された
異種核酸を含む。核酸は、細胞の前駆体中への導入によって、意図的な遺伝子操
作によって（例えば、マイクロインジェクションによって、または組換えウイル
スでの感染によって）、直接または間接的に細胞に導入される。用語遺伝子操作
は、古典的な交雑育種またはインビトロでの受精を含まないが、組換えＤＮＡ分
子の導入を指向する。この分子は、染色体中に組み込まれ得るか、またはこれは
、染色体外複製をするＤＮＡであり得る。本明細書中で記載される代表的なトラ
ンスジェニック動物においては、トランスジーンは、細胞に、対象のポリペプチ
ドの１つの組換え形態（例えば、アゴニスト形態またはアンタゴニスト形態のい
ずれか）を発現させる。しかし、組換え遺伝子がサイレントであるトランスジェ
ニック動物もまた、意図される（例えば、以下に記載されるＦＬＰまたはＣＲＥ
組換え酵素依存性構築物）。さらに、「トランスジェニック動物」はまた、１つ
以上の遺伝子の遺伝子破壊が、組換えおよびアンチセンス技術の両方を含むヒト
の介入によって引き起こされた組換え動物を含む。
【００７４】 用語「処置する」は、本明細書中で使用される場合、状態または疾患の少なく
とも１つの症状を治癒させることおよび改良させることを含むように意図される
。
【００７５】 用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子を
いう。好ましいベクターの１つの型は、エピソーム（すなわち、染色体外複製が
可能な核酸）である。好ましいベクターは、自律的複製および／またはそれが連
結されている核酸の発現が可能であるベクターである。それらが作動可能に連結
されている遺伝子の発現を指向し得るベクターは、本明細書中で「発現ベクター
」と呼ばれる。一般には、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、し
ばしば、「プラスミド」の形態である。これは、一般には、環状の二本鎖のＤＮ
Ａループをいい、それらのベクター形態においては、それは、染色体に結合して
いない。本明細書中では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが
ベクターの最も一般に使用される形態である場合には、互換的に使用される。し
かし、本発明は、等価な機能を提供し、そして当該分野で後に公知になる、その
ような他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
【００７６】 用語「野生型対立遺伝子」は、被験体中に２つのコピーで存在する場合に野生
型の表現型を生じる遺伝子の対立遺伝子をいう。特定の遺伝子のいくつかの異な
る野生型対立遺伝子が存在し得る。なぜなら、遺伝子における特定のヌクレオチ
ド変化は、そのヌクレオチド変化を有する遺伝子の２つのコピーを有する被験体
の表現型に影響を与えないかもしれないからである。
【００７７】 （ＩＩＩ．本発明の核酸） 以下に記載するように、本発明の１つの局面は、単離された核酸、変異体、お
よび／またはこのような核酸の等価物に関する。
【００７８】 本発明の核酸（例えば、配列番号１−５４４、好ましくは、配列番号１−１６
８、なおより好ましくは、配列番号１−３５、またはそれらの配列相補物）は、
腫瘍細胞（例えば、結腸ガンに由来する細胞株）中で示差的に発現される（正常
な組織（例えば、正常な結腸組織および／または正常な結腸ではない組織）中で
の発現レベルと比較して）として同定されている。特定の実施態様においては、
本発明の核酸は、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、なおより好まし
くは少なくとも２０倍、さらにより好ましくは少なくとも５０倍示差的に発現さ
れる。好ましい核酸として、結腸のガン細胞組織および結腸のガン細胞株の両方
において示差的に発現されるとして同定される配列が挙げられる。好ましい実施
態様においては、本発明の核酸は、腫瘍細胞（特に、結腸ガン組織および／また
は結腸ガンに由来する細胞株）中でアップレギュレートされる。別の実施態様に
おいては、本発明の核酸は、腫瘍細胞（特に、結腸ガンの組織および／または結
腸ガンに由来する細胞株）中でダウンレギュレートされる。
【００７９】 表１は、正常な組織と比較して、結腸ガンに由来する細胞株中で過剰に発現さ
れるかまたは発現が不足する配列を示す。そしてさらに、また、結腸ガン組織中
で別々に調節される配列を示す。文字Ｏは、対応する配列が過剰発現されたこと
を示し、Ｍは、過剰発現される可能性があることを示し、Ｎは示差的に発現され
ないことを示し、そしてＵは、発現が不足することを示す。
【００８０】 異常に増殖している細胞中の、オンコジーンのようなアップレギュレートされ
る遺伝子、または腫瘍サプレッサーのようなダウンレギュレートされる遺伝子は
、診断技術または治療技術の標的であり得る。例えば、ｃｄｃ２遺伝子のアップ
レギュレーションは、有糸分裂を誘導する。有糸分裂の不活性化因子であるｍｙ
ｔ１遺伝子の過剰発現は、ｃｄｃ２の活性をネガティブに調節する。異常な増殖
は、このように、ｃｄｃ２をアップレギュレートすること、またはｍｙｔ１をダ
ウンレギュレートすることのいずれかによって誘導され得る。同様に、腫瘍サプ
レッサー（例えば、ｐ５３およびＲｂ）のダウンレギュレーションが、腫瘍形成
に関与している。
【００８１】 特に好ましいポリペプチドは、配列番号１−５４４の核酸配列に対して、少な
くとも約７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、または９８％類似
である核酸配列によってコードされるものである。好ましくは、この核酸は、配
列番号１−１６８の核酸、好ましくは配列番号１−３５の核酸、またはそれに相
補的である配列に対応する、ヌクレオチド配列の全てまたは一部（例えば、少な
くとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約２５、または少なくとも約４０
のヌクレオチド）を含む。
【００８２】 本発明のなお他の好ましい核酸は、配列番号１−５４４のうちの１つによって
コードされるポリペプチドの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする。
例えば、プローブ／プライマー、またはアンチセンス分子（すなわち、非コード
核酸分子）としての使用に好ましい核酸分子は、約１２、２０、３０、５０、６
０、７０、８０、９０、または１００塩基対の長さから完全な遺伝子の長さまで
を含み得る。コード核酸分子は、例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、ま
たは１００塩基対から完全な遺伝子の長さまでを含み得る。
【００８３】 本発明の別の局面は、配列番号１−１６８（好ましくは、配列番号１−３５）
またはそれに相補的な配列のうちの１つによって示される核酸配列に対して、低
い、中程度の、または高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする核
酸を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェン
シーの条件（例えば、４５℃での６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム
（ＳＳＣ）、続く５０℃での２．０×ＳＳＣでの洗浄）は、当業者に公知である
か、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）
、６．３．１−１２．３．６に見出され得る。例えば、洗浄工程における塩濃度
は、５０℃での約２．０×ＳＳＣの低いストリンジェンシーから５０℃での約０
．２×ＳＳＣの高いストリンジェンシーまでから選択され得る。さらに、洗浄工
程での温度は、室温（約２２℃）での低いストリンジェンシーの条件から、約６
５℃での高いストリンジェンシーの条件まで上昇され得る。温度および塩の両方
が変更され得るか、または温度もしくは塩濃度が一定に保持され得たままもう一
方の変数が変更される。好ましい実施態様においては、本発明の核酸は、配列番
号１−１６８（好ましくは、配列番号１−３５）またはそれらに相補的な配列の
うちの１つに、中程度にストリンジェントな条件（例えば、約４０℃での約２．
０×ＳＳＣ）下で結合する。特に好ましい実施態様においては、本発明の核酸は
、配列番号１−１６８（好ましくは、配列番号１−３５）またはそれらに相補的
な配列のうちの１つに、高いストリンジェンシーの条件下で結合する。
【００８４】 １つの実施態様においては、本発明は、室温での６×ＳＳＣ、続く室温での２
×ＳＳＣでの洗浄の低いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする核酸
を提供する。
【００８５】 別の実施態様においては、本発明は、６５℃での２×ＳＳＣ，続く６５℃での
０．２×ＳＳＣでの洗浄の、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズ
する核酸を提供する。
【００８６】 遺伝子コードの縮重に起因する、配列番号１−１６８（好ましくは、配列番号
１−３５）またはそれらに相補的な配列の１つに示されるヌクレオチド配列とは
異なる配列を有する核酸もまた、本発明の範囲内である。このような核酸は、機
能的に等価であるペプチド（すなわち、等価または類似の生物学的活性を有する
ペプチド）をコードするが、遺伝子コードの縮重に起因して配列表に示される配
列とは配列が異なる。例えば、多数のアミノ酸は、１つ以上のトリプレットによ
って示される。同じアミノ酸を特定するコドン、または同義語（例えば、ＣＡＵ
およびＣＡＣはそれぞれヒスチジンをコードする）は、ポリペプチドのアミノ酸
配列には影響を与えない「サイレントな」変異を生じ得る。しかし、本発明のポ
リペプチドのアミノ酸配列における変更をもたらすＤＮＡ配列の多型性が、哺乳
動物の間に存在することが予想される。ポリペプチドの活性を有するポリペプチ
ドをコードする核酸の１つ以上のヌクレオチド（例えば、そのヌクレオチドの約
３−５％まで）におけるこれらのバリエーションが、天然の対立遺伝子のバリエ
ーションに起因して、所定の種の個体間に存在し得ることが、当業者に明らかで
ある。
【００８７】 配列番号１−５４４、好ましくは配列番号１−１６８、なおより好ましくは配
列番号１−３５、またはそれらに相補的である配列の核酸によってコードされる
タンパク質のスプライシング変異体あるいはこのようなタンパク質の天然のホモ
ログをコードする核酸もまた、本発明の範囲内である。このようなホモログは、
本明細書中にさらに記載されるように、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲに
よってクローン化され得る。
【００８８】 ポリヌクレオチド配列はまた、対象ポリペプチドについての、リーダー配列（
例えば、天然のリーダー配列または異種リーダー配列）をコードし得る。例えば
、所望されるＤＮＡ配列は、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を補
助するＤＮＡ配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分
泌配列として機能するリーダー配列）に対して同じリーディングフレームで融合
され得る。リーダー配列を有するタンパク質はプレタンパク質であり、そしてそ
のタンパク質の成熟形態を形成するように宿主細胞によって切断されるリーダー
配列を有し得る。
【００８９】 本発明のポリヌクレオチドはまた、本明細書中で「Ｔａｇペプチド」をコード
する「Ｔａｇ配列」とも呼ばれるマーカー配列に対してインフレームで融合され
得る。これは、本発明のポリペプチドの生成および／または精製を可能にする。
好ましい実施態様においては、そのマーカー配列は、ヘキサヒスチジンタグ（例
えば、ＰＱＥ−９ベクターによって提供される）である。多数の他のＴａｇペプ
チドが、商業的に入手可能である。他の頻繁に使用されるＴａｇとして、ｍｙｃ
−エピトープ（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９９１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ
２６６：２１１５０−２１１５７）（これは、ｃ−ｍｙｃに由来する１０残基
の配列を含む）、ｐＦＬＡＧシステム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ｐＥＺＺ−プロテインＡシステム（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ，ＮＪ）、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
赤血球凝集素タンパク質の１６アミノ酸部分が挙げられる。さらに、任意のポリ
ペプチドが、試薬（例えば、Ｔａｇポリペプチドと特異的に相互作用する抗体）
が入手可能であるかまたは調製もしくは同定され得る限りは、Ｔａｇとして使用
され得る。
【００９０】 以下に示される実施例によって示されるように、核酸は、例えば、任意の多数
の真核生物中に存在するｍＲＮＡから得られ得、そして好ましくは、後生動物細
胞から、より好ましくは、脊椎動物細胞から、およびなおより好ましくは哺乳動
物細胞から得られる。成体および胚の両方に由来するゲノムＤＮＡから本発明の
核酸を得ることもまた、可能であるはずである。例えば、遺伝子は、当業者に一
般的に公知であるプロトコールに従って、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムラ
イブラリーのいずれかからクローン化され得る。ｃＤＮＡは、細胞（例えば、脊
椎動物細胞、哺乳動物細胞，またはヒト細胞（胚性細胞を含む））から全ｍＲＮ
Ａを単離することによって、得られ得る。次いで、二本鎖のｃＤＮＡが、全ｍＲ
ＮＡから調製され得、続いて、多数の公知の技術のうちの任意の１つを使用して
適切なプラスミドベクターまたはバクテリオファージベクター中に挿入され得る
。遺伝子はまた、本発明によって提供されるヌクレオチド配列情報に従って、確
立されたポリメラーゼ連鎖反応技術を使用してクローン化され得る。
【００９１】 特定の実施態様においては、本発明の核酸、プローブ、ベクター、または他の
構築物は、表２に新規として示される領域に由来する、少なくとも約５、少なく
とも約１０、または少なくとも約２０の核酸を含む。特定の他の実施態様におい
ては、本発明の核酸は、その登録番号が表２に列挙されるクローンには含まれな
い、少なくとも約５、少なくとも約１０、または少なくとも約２０の核酸を含む
。
【００９２】 本発明は、この生物学的な材料から得られる核酸のヌクレオチド配列を有する
ポリヌクレオチドを、本発明の範囲に含む。ここで、この核酸は、配列番号１−
５４４の少なくとも１つの少なくとも１５連続するヌクレオチドとストリンジェ
ントな条件（６５℃での少なくとも約４×ＳＳＣ、または４２℃での少なくとも
約４×ＳＳＣ；例えば、米国特許第５，７０７，８２９号（本明細書中で参考と
して援用されている）を参照のこと）下でハイブリダイズする。これによって、
配列番号１−５４４の１つの少なくとも１５連続するヌクレオチドがプローブと
して使用される場合は、プローブは、相補的な配列を含む（生物学的な材料の）
遺伝子またはｍＲＮＡと優先的にハイブリダイズし、これによって、選択された
プローブに独特にハイブリダイズする生物学的材料の核酸の同定および検索を可
能にすることが意図される。配列番号１−５４４の１より多くに由来するプロー
ブは、それらが由来するｃＤＮＡが１つのｍＲＮＡに対応する場合に、同じ遺伝
子またはｍＲＮＡとハイブリダイズする。１５より多いヌクレオチドのプローブ
が使用され得るが、特有の同定については１５ヌクレオチドが十分な配列を表す
。
【００９３】 本発明の核酸は部分的なｍＲＮＡ転写物を示すので、本発明の２以上の核酸は
、同じｍＲＮＡ転写物および同じ遺伝子の、異なる領域を提示し得る。従って、
配列番号１−５４４の２つ以上が同じクローンに属するとして同定されるならば
、いずれかの配列が、全長のｍＲＮＡまたは遺伝子を得るために使用され得る。
【００９４】 核酸に関連するポリヌクレオチドはまた、ｃＤＮＡライブラリーからも単離さ
れ得る。これらのライブラリーは、好ましくはヒトの結腸細胞（より好ましくは
ヒト結腸ガン特異的組織（添付の表においてＤＥクローンと命名）から調製され
る。別の実施態様において、核酸は、正常な結腸特異的組織（添付の表において
ＰＡクローンと命名）から調製される。なお別の実施態様において、本発明は、
ヒト結腸腺ガン細胞株のＳＷ４８０から調製されたライブラリー、ならびに正常
な結腸特異的組織または結腸ガン特異的組織のいずれかから調製されたライブラ
リーの両方から単離され得る。これらの配列は、表３に列挙される。上記に記載
されるような、配列番号１−５４４のアラインメントは、関連するタンパク質ま
たはポリペプチドの細胞株供給源または組織供給源もまた、核酸に関連するｃＤ
ＮＡの供給源として使用され得ることを示し得る。
【００９５】 核酸配列のライブラリーを産生およびプローブするための技術は、例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に記載されている。ｃＤＮＡは、
配列番号１−５４４に由来する配列に基づくプライマーを使用して調製され得る
。１つの実施態様においては、ｃＤＮＡライブラリーは、ポリアデニル化された
ｍＲＮＡのみから作製され得る。従って、ポリＴプライマーが、ｍＲＮＡからｃ
ＤＮＡを調製するために使用され得る。配列番号１−５４４のアラインメントは
、関連するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの同定を生じ得る。本明細書中
に開示されるポリヌクレオチドのいくつかは、検索手順の間にマスキングに供せ
られた反復領域を含む。反復領域についての情報は以下で議論される。
【００９６】 配列番号１−５４４の配列を有するポリヌクレオチドの構築物は、合成によっ
て生成され得る。あるいは、多数のオリゴデオキシリボヌクレオチドからの遺伝
子および完全なプラスミドの単一の工程のアセンブリが、Ｓｔｅｍｍｅｒら、Ｇ
ｅｎｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）（１９９５）１６４（１）：４９−５３によって
記載されている。この方法においては、アセンブリＰＣＲ（多数のオリゴデオキ
シリボヌクレオチド（オリゴ）からの長いＤＮＡ配列の合成）が記載されている
。この方法は、ＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ（１９９
４）３７０：３８９−３９１）に由来し、そしてＤＮＡリガーゼにはよらず、そ
のかわりにＤＮＡポリメラーゼに依存して、アセンブリプロセスの間に、漸増的
により長いＤＮＡフラグメントを構築する。例えば、ＴＥＭ−１β−ラクタマー
ゼをコードする遺伝子（ｂｌａ）を含有する１．１ｋｂのフラグメントが、全５
６オリゴから、それぞれ４０ヌクレオチド（ｎｔ）の長さで単一の反応において
アセンブルされ得る。合成遺伝子は、ＰＣＲ増幅され得、そして単一の選択マー
カーとしてテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃ−Ｒ）を含有するベクター中にク
ローン化され得る。アンピシリン（Ａｐ）選択には頼ることなく、Ｔｃ−Ｒコロ
ニーの７６％がＡｐ−Ｒであった。このことは、このアプローチを、任意の遺伝
子の迅速かつコスト的に効率のよい合成のための一般的な方法にしている。
【００９７】 （ＩＶ．当該分野で認識されている方法を使用する、新規の遺伝子の機能的お
よび構造的モチーフの同定） 核酸、ｃＤＮＡ、または全長の遺伝子のヌクレオチド配列の翻訳物は、個々の
既知の配列とともに整列され得る。個々の配列との類似性は、本発明のポリヌク
レオチドによってコードされるポリペプチドの活性を決定するために使用され得
る。例えば、ケモカイン配列と類似性を示す配列は、ケモカイン活性を示し得る
。また、１より多くの個々の配列と類似性を示す配列は、いずれかまたは両方の
個々の配列の特徴である活性を示し得る。
【００９８】 最も密接に関連するもののポリヌクレオチド配列の全長の配列およびフラグメ
ントは、核酸の全長の配列を同定および単離するためのプローブおよびプライマ
ーとして使用され得る。最も密接に関連するものは、核酸の全長の配列について
のライブラリーを構築するために使用される、組織または細胞型を示し得る。
【００９９】 代表的には、核酸は、個々の配列との最良のアラインメントを決定するために
、６つ全てのフレームで翻訳される。配列表において本明細書中に開示される配
列は、５’から３’方向であり、そして３個のフレームでの翻訳が十分であり得
る（実施例に記載されるようないくつかの特定の例外を有する）。一般的には、
これらのアミノ酸配列は問い合わせ配列と呼ばれ、これは、個々の配列と整列さ
れる。
【０１００】 核酸配列は、上記に開示される任意の方法によって、既知の遺伝子と比較され
得る。個々の配列と問い合わせ配列とのアラインメントの結果は、以下の３つの
カテゴリーに分けられ得る：高い類似性、弱い類似性、および類似性なし。高い
類似性から弱い類似性までの範囲である個々のアラインメントは、ポリペプチド
の活性および／または構造を決定するための基準を提供する。
【０１０１】 個々の結果を分類するためのパラメーターとして、以下が挙げられる：最も強
いアラインメントが見出される場合のアラインメント領域の長さの割合、配列同
一性パーセント、およびｐ値。
【０１０２】 アラインメント領域の長さの割合は、最も強いアラインメントの領域において
見出される個々の配列の残基の数を計数することによって計算される。この数が
問い合わせ配列の全残基の長さによって割り算されて、割合が判明する。例を以
下に示す：
【０１０３】
【化１】 アラインメントの領域は、アミノ酸９で始まりそしてアミノ酸１９で終わる。
問い合わせ配列の全長は、２０アミノ酸である。アラインメントの領域の長さの
パーセントは、１１／２０、すなわち５５％である。
【０１０４】 配列同一性パーセントは、問い合わせ配列と個々の配列との間で適合するアミ
ノ酸の数を計数し、そして最も強いアラインメントの領域中に見出される個々の
配列の残基の数で適合の総数を割り算することによって計算される。上記の例に
ついては、同一性パーセントは、（１０の適合）÷（１１アミノ酸）であり、す
なわち、およそ９０．９％である。
【０１０５】 Ｐ値は、アラインメントが偶然に産生される可能性である。単一のアラインメ
ントについては、ｐ値は、Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．８７：２２６４（１９９０）およびＫａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：（１９９３）に従って計算され得る。同じ問い合わ
せ配列を使用する複数のアラインメントのｐ値は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎａｔ
．Ｇｅｎｅｔ．６：１１９（１９９４）に記載される帰納的アプローチを使用し
て計算され得る。ＢＬＡＳＴプログラムのようなアラインメントプログラムが、
ｐ値を計算し得る。
【０１０６】 配列が整列する領域の境界は、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、前出；ＢＬＡＳＴプログラムまたはＦＡＳＴＡプログラ
ムに従って決定され得るか；あるいは、配列同一性が最も高い領域を決定するこ
とによって、決定され得る。
【０１０７】 同一性または類似性を決定するために考慮する別の因子は、類似性または同一
性の位置である。強力な局所的アラインメントは、たとえアラインメントの長さ
が短い場合でも、類似性を示し得る。問い合わせ配列の長さを通じて散在する配
列同一性もまた、問い合わせ配列とプロフィール配列との間での類似性を示し得
る。
【０１０８】 （高い類似性） 高い類似性であると考えられるアラインメント結果については、代表的には、
アラインメント領域の長さのパーセントは、全長の問い合わせ配列の少なくとも
約５５％；より代表的には少なくとも約５８％；なおより代表的には問い合わせ
配列の全残基長の少なくとも約６０％である。通常は、アラインメント領域の長
さのパーセントは、約６２％程度；より通常は約６４％程度；なおより通常は約
６６％程度であり得る。
【０１０９】 さらに、高い類似性に関しては、アラインメントの領域は、代表的には、少な
くとも約７５％の配列同一性；より代表的には少なくとも約７８％；なおより代
表的には少なくとも約８０％の配列同一性を示す。通常は、配列同一性パーセン
トは、約８２％程度；より通常は約８４％程度；なおより通常は約８６％程度で
あり得る。
【０１１０】 ｐ値は、これらの方法と組み合わせて使用される。高い類似性が見出される場
合は、問い合わせ配列は、ｐ値が約１０-2以下；より通常は約１０-3以下；なお
より通常は約１０-4以下である場合に、プロフィール配列と高い類似性を有する
と考えられる。より代表的には、ｐ値は、高い類似性であると考えられる問い合
わせ配列について、約１０-5以下；より代表的には約１０-10以下；なおより代
表的には約１０-15以下である。
【０１１１】 （弱い類似性） 弱い類似性であると考えられるアラインメント結果については、アラインメン
ト領域の最少のパーセントの長さは存在せず、また、アラインメントの最少の長
さも存在しない。弱い類似性をより良好に示すことは、アラインメントの領域が
、代表的には、少なくとも約１５アミノ酸残基長；より代表的には少なくとも約
２０；なおより代表的には少なくとも約２５アミノ酸残基長である場合に、考え
られる。通常は、アラインメントの領域の長さは、約３０アミノ酸残基程度；よ
り通常は約４０アミノ酸残基程度；なおより通常は約６０アミノ酸残基程度であ
り得る。
【０１１２】 さらに、弱い類似性については、アラインメントの領域は、代表的には、少な
くとも約３５％の配列同一性；より代表的には少なくとも約４０％；なおより代
表的には少なくとも約４５％の配列同一性を示す。通常は、配列同一性パーセン
トは、約５０％程度；より通常は約５５％程度；なおより通常は約６０％程度で
あり得る。
【０１１３】 低い類似性が見出される場合は、問い合わせ配列は、通常は、ｐ値が約１０-2 以下；より通常は約１０-3以下；なおより通常は約１０-4以下である場合に、プ
ロフィール配列と弱い類似性を有すると考えられる。より代表的には、ｐ値は、
弱い類似性であると考えられる問い合わせ配列について、約１０-5以下；より通
常は；約１０-10以下；なおより通常は；約１０-15以下である。
【０１１４】 （配列同一性によって決定される類似性） 配列同一性単独が、個々の配列に対する問い合わせ配列の類似性を決定するた
めに使用され得、そして配列の活性を示し得る。このようなアラインメントは、
好ましくは、配列を整列するためのギャップを許容する。代表的には、問い合わ
せ配列は、問い合わせ配列全体にわたるその配列同一性が少なくとも約１５％；
より代表的には少なくとも約２０％；なおより代表的には少なくとも約２５％；
なおより代表的には少なくとも約５０％である場合に、プロフィール配列に関連
する。類似性の尺度としての配列同一性は、単独で、問い合わせ配列が通常は、
少なくとも８０残基長；より通常は９０残基；なおより通常は少なくとも９５ア
ミノ酸残基長である場合に、最も有用である。より代表的には、類似性は、問い
合わせ配列が好ましくは１００残基長；より好ましくは１２０残基長；なおより
好ましくは１５０アミノ酸残基長である場合に、配列同一性のみに基づいて決定
され得る。
【０１１５】 （プロフィールおよび複数の整列された配列とのアラインメントから活性を決
定する） 核酸の翻訳物は、タンパク質ファミリーまたは共通のモチーフのいずれかを規
定するアミノ酸プロフィールと整列され得る。また、核酸の翻訳物は、タンパク
質ファミリーまたはモチーフのメンバーのポリペプチド配列を含む複数の配列の
アラインメント（ＭＳＡ）に対して整列され得る。プロフィール配列またはＭＳ
Ａとの類似性または同一性は、核酸または対応するｃＤＮＡもしくは遺伝子によ
ってコードされるポリペプチドの活性を決定するために使用され得る。例えば、
ケモカインプロフィールまたはＭＳＡと同一性または類似性を示す配列は、ケモ
カイン活性を示し得る。
【０１１６】 プロフィールは、（１）ＭＳＡを作成すること（これは、そのファミリーに属
するメンバーのアミノ酸配列のアラインメントである）および（２）アラインメ
ントの統計的表示を構築することによって手動で設計され得る。このような方法
は、例えば、Ｂｉｒｎｅｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２４（１４）：２
７３０−２７３９（１９９６）に記載される。
【０１１７】 いくつかのタンパク質ファミリーおよびモチーフのＭＳＡは、公に入手可能で
ある。例えば、これらは、５４７個の異なるファミリーおよびモチーフのＭＳＡ
を含む。これらのＭＳＡは、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２８
：４０５−４２０（１９９７）にもまた記載されている。他の供給源もまた、ワ
ールドワイドウェブにおいて入手可能である。これらのＭＳＡの簡単な記載が、
Ｐａｓｃａｒｅｌｌａら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９（３）：２４９−２５１（１９
９６）に報告されている。
【０１１８】 ＭＳＡからプロフィールを構築するための技術が、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら、
前出；Ｂｉｒｎｅｙら、前出；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、第２６６巻：「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」１９９６、Ｄｏｏ
ｌｉｔｔｌｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｒｃｏｕｒｔ
Ｂｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．部門、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，
ＵＳＡに記載されている。
【０１１９】 問い合わせ配列とタンパク質ファミリーまたはモチーフとの間での類似性は、
（ａ）プロフィールに対して問い合わせ配列を比較すること、および／または（
ｂ）ファミリーもしくはモチーフのメンバーと問い合わせ配列とを整列すること
によって、決定され得る。
【０１２０】 代表的には、Ｓｅａｒｃｈｗｉｓｅのようなプログラムが使用されて、複数の
アラインメント（プロフィールとしてもまた、公知である）の統計的表示に対し
て問い合わせ配列を比較し得る。このプログラムは、Ｂｉｒｎｅｙら、前出に記
載されている。配列およびプロフィールを比較するための他の技術が、Ｓｏｎｎ
ｈａｍｍｅｒら、前出、およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、前出に記載されている。
【０１２１】 次に、Ｆｅｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．２５：３５１−３６０（１９８７
）およびＨｉｇｇｉｎｓら、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）に
よって記載される方法は、（ＭＳＡとしてもまた知られている）ファミリーもし
くはモチーフのメンバーと問い合わせ配列とを整列するために使用され得る。Ｐ
ＩＬＥＵＰのようなコンピュータープログラムが、使用され得る。Ｆｅｎｇら、
後出を参照のこと。
【０１２２】 以下の因子が、問い合わせ配列とプロフィールもしくはＭＳＡとの間に類似性
が存在するかどうかを決定するために使用される：（１）問い合わせ配列中に見
出される保存された残基の数、（２）問い合わせ配列中に見出される保存された
残基の割合、（３）フレームシフトの数、および（４）保存された残基間の間隔
（ｓｐａｃｉｎｇ）。
【０１２３】 配列の平行移動（ｔｒａｎｓｌａｔｅ）および整列の両方を行ういくつかのア
ラインメントプログラムは、ヌクレオチド配列を平行移動する場合には、最良の
アラインメントを生じるように任意の数のフレームシフトを作成し得る。整列を
生じるために必要なフレームシフトが少ないほど、問い合わせ配列とプロフィー
ルまたはＭＳＡとの間で類似性または同一性がより強い。例えば、フレームシフ
トを生じない弱い類似性は、２個のフレームシフトによって生じる強い類似性よ
りも、問い合わせ配列の活性または構造の良好な指標であり得る。好ましくは、
３個以下のフレームシフトが、アラインメントにおいて見出される；より好まし
くは、２個以下のフレームシフト；なおより好ましくは、１個以下のフレームシ
フト；なおより好ましくは、フレームシフトがないことが、問い合わせ配列およ
びプロフィールまたはＭＳＡのアラインメント中に見出される。
【０１２４】 保存された残基は、全てまたはいくつかのファミリーまたはモチーフのメンバ
ー中の特定の位置で見出されるそのようなアミノ酸である。例えば、最も知られ
ているケモカインは、４個の保存されたシステインを含む。あるいは、位置は、
特定のクラスのアミノ酸のみがファミリーのメンバーの全てまたはいくつかの特
定の位置で見出される場合に、保存されていると考えられる。例えば、Ｎ末端位
置は、正に荷電したアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン
）を含み得る。
【０１２５】 代表的には、ポリペプチドの残基は、アミノ酸のクラスまたは単一のアミノ酸
が、全てのクラスのメンバーの少なくとも約４０％；より代表的には、少なくと
も約５０％；なおより代表的には、少なくとも約６０％のメンバーにおいて特定
の位置で見出される場合に、保存されている。通常は、残基は、クラスまたは単
一のアミノ酸が、ファミリーまたはモチーフのメンバーの少なくとも約７０％；
より通常は、少なくとも約８０％；なおより通常は、少なくとも約９０％；なお
より通常は、少なくとも約９５％において見出される場合に、保存されている。
【０１２６】 残基は、３個の関連しないアミノ酸が；より通常は、２個の関連しないアミノ
酸が、いくつかまたは全てのメンバーにおいて特定の位置で見出される場合には
、保存されていると考えられる。これらの残基は、関連しないアミノ残が全ての
クラスのメンバーの少なくとも約４０％において；より代表的には、少なくとも
約５０％；なおより代表的には、少なくとも約６０％のメンバーにおいて特定の
位置で見出される場合には、保存されている。通常は、残基は、クラスまたは単
一のアミノ酸が、ファミリーまたはモチーフのメンバーの少なくとも約７０％；
より通常は、少なくとも約８０％；なおより通常は、少なくとも約９０％；なお
より通常は、少なくとも約９５％において見出される場合に、保存されている。
【０１２７】 問い合わせ配列は、問い合わせ配列がプロフィールまたはＭＳＡの保存された
残基の少なくとも約２５％；より通常は、少なくとも約３０％；なおより通常は
；少なくとも約４０％を含む場合に、プロフィールまたはＭＳＡに対して類似性
を有する。代表的には、問い合わせ配列は、問い合わせ配列がプロフィールまた
はＭＳＡの保存された残基の少なくとも約４５％；より代表的には、少なくとも
約５０％；なおより代表的には；少なくとも約５５％を含む場合に、プロフィー
ル配列またはＭＳＡに対してより強い類似性を有する。
【０１２８】 （Ｖ．プローブおよびプライマー） 腫瘍細胞（特に、結腸癌細胞株および組織）由来の遺伝子のクローニングから
決定されるヌクレオチド配列は、さらに、他の細胞型中の（例えば、他の組織由
来の）ホモログおよび他の哺乳動物の器官に由来するホモログを同定ならびに／
またはクローニングするために設計されるプローブおよびプライマーの作製を可
能にする。プローブ／プライマーとして有用なヌクレオチド配列として、配列番
号１〜５４４に列挙された配列またはそれに相補的である配列、すなわち、配列
番号１〜５４４の全てまたは一部にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
する配列の全てまたは一部が挙げられ得る。例えば、本発明はまた、実質的に精
製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーを提供する。このオリ
ゴヌクレオチドは、配列番号１〜５４４、好ましくは、配列番号１〜１６８、な
おより好ましくは、配列番号１〜３５、もしくはそれらに相補的な配列、または
それらの天然に存在する変異体からなる群より選択される、センスまたはアンチ
センス配列の、少なくとも約１２個の連続するヌクレオチド、好ましくは２５個
の連続するヌクレオチド、より好ましくは、４０個、５０個、または７５個の連
続するヌクレオチドから全長までに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするヌクレオチド配列を含む。例えば、配列番号１〜５４４、好ましくは、配
列番号１〜１６８、なおより好ましくは、配列番号１〜３５、またはそれらに相
補的な配列中に示される核酸に基づくプライマーが、その配列のホモログをクロ
ーン化するためにＰＣＲ反応において使用され得る。
【０１２９】 なお別の実施態様においては、本発明は、配列番号１〜５４４、好ましくは、
配列番号１〜１６８、なおより好ましくは、配列番号１〜３５、またはそれらの
天然に存在する変異体からなる群より選択されるセンスまたはアンチセンス配列
の、少なくとも約１２個、１６個、２５個、４０個、５０個、または７５個の連
続するヌクレオチドから全長までに対して、中程度にストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、プローブ／プライマーを提供す
る。
【０１３０】 特に、これらのプローブは、それらが本発明の野生型遺伝子中の変異を検出す
るための方法を提供するので、有用である。本発明の野生型遺伝子に対して相補
的であり、そして変異遺伝子と不適合を形成し得る核酸プローブが提供され、こ
れによって、酵素的もしくは化学的な切断による、または電気的な移動度におけ
るシフトによる検出を可能にする。
【０１３１】 同様に、本発明の配列に基づくプローブが、例えば、予後または診断アッセイ
における使用のために、同じタンパク質かまたは相同なタンパク質をコードする
転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。好ましい実施態様にお
いては、プローブはさらに、それに付着されられた標識基を含み、そして検出さ
れることが可能にされる。例えば、この標識基は、放射性同位元素、蛍光化合物
、化学発光化合物、酵素、および酵素補因子から選択される。
【０１３２】 開示される核酸を含む全長のｃＤＮＡ分子が以下のように得られる。配列番号
１〜５４４、好ましくは、配列番号１〜１６８、なおより好ましくは、配列番号
１〜３５に示される配列、またはそれらに相補的である配列の、少なくとも約１
２個、１５個、１８個、または２０個のヌクレオチドから全長までを含む本発明
の核酸またはその一部が、プローブ設計方法、クローニング方法、および米国特
許第５，６５４，１７３号「Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐ
ｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｔｈｅｍ」（本明細書中で
参考として援用されている）に記載されるようなクローン選択技術を使用して、
ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイズするメンバーを検出するためのハイブリ
ダイゼーションプローブとして使用され得る。ｃＤＮＡのライブラリーは、選択
された組織（例えば、正常な組織または腫瘍組織）から、または例えば、医薬品
で処置された哺乳動物の組織から作製され得る。好ましくは、組織は、発現され
る遺伝子を提示する核酸およびｃＤＮＡの両方として核酸を作成するために使用
されるものと同じである。最も好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーは、実施例に
おいて本明細書中で記載される生物学的物質から作製される。あるいは、多くの
ｃＤＮＡライブラリーが、市販されている。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ １９８９）。ライブラリーの構築のための細胞型の選
択は、核酸に関連する遺伝子によってコードされるタンパク質の同定の後に行わ
れ得ることが知られている。これは、どの組織および細胞型が、関連する遺伝子
を発現するようであるか、それによって、ｃＤＮＡを生成するためのｍＲＮＡを
含有するかを示す。
【０１３３】 核酸よりも大きな、そして好ましくは、ネイティブのメッセージの全配列を含
むライブラリーのメンバーを得ることができる。完全なｃＤＮＡが得られている
ことを確認するために、ＲＮＡ保護実験が以下のように行われ得る。ｍＲＮＡに
対する全長のｃＤＮＡのハイブリダイゼーションは、ＲＮａｓｅ分解からＲＮＡ
を保護し得る。次いで、ｃＤＮＡが全長ではない場合は、ハイブリダイズしてい
ないｍＲＮＡの部分は、ＲＮａｓｅ分解に供され得る。これは、ポリアクリルア
ミドゲル上での電気泳動での移動度における変化によって、または放出されたモ
ノリボヌクレオチドの検出によって、当該分野で公知のようにアッセイされ得る
。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９）。部
分的なｃＤＮＡの５’から末端までのさらなる配列を得るために、５’ＲＡＣＥ
（ＰＣＲプロトコール：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐ
ｐｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９０））が
、行われ得る。
【０１３４】 ゲノムＤＮＡは、全長のｃＤＮＡの単離と類似の様式で、核酸を使用して単離
され得る。簡潔には、核酸またはその一部が、ゲノムＤＮＡのライブラリーに対
するプローブとして使用され得る。好ましくは、ライブラリーは、核酸を作製す
るために使用された細胞型から得られる。最も好ましくは、ゲノムＤＮＡは、実
施例において本明細書中に記載される生物学的材料から得られる。このようなラ
イブラリーは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．４−９．３０に詳細に記載されるよう
に、ゲノムの大きなセグメントを保有するために適切なベクター（例えば、Ｐ１
またはＹＡＣ）中に存在し得る。さらに、ゲノム配列は、ヒトＢＡＣライブラリ
ーから単離され得る。これは、例えば、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡから市販されている。
さらなる５’または３’配列を得るために、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されるよ
うに、染色体ウォーキングが行われ得る。その結果、ゲノムＤＮＡに隣接しそし
て重複するフラグメントが単離される。これらは、制限消化酵素およびＤＮＡリ
ガーゼを使用して、当該分野で公知のように、マップされ得そして互いに結合さ
せられ得る。
【０１３５】 本発明の核酸を使用して、ｃＤＮＡライブラリーを構築しそしてプローブする
ために、対応する全長の遺伝子が、伝統的な方法およびＰＣＲ方法の両方を使用
して単離され得る。いずれかの方法を使用して、好ましくは、ノーザンブロット
が、最も早い速度でその細胞株が目的の遺伝子を発現することを決定するために
、多数の細胞株に対して行われ得る。
【０１３６】 ｃＤＮＡライブラリーを構築するための伝統的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、前出に教示されている。これらの方法を用いて、ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡから産
生され得、そしてウイルスまたは発現ベクター中に挿入され得る。代表的には、
ポリＡテイルを含むｍＲＮＡのライブラリーが、ポリ（Ｔ）プライマーを用いて
産生され得る。同様に、ｃＤＮＡライブラリーが、プライマーとして本発明の配
列を使用して産生され得る。
【０１３７】 ＰＣＲ方法が、所望される挿入物を含むｃＤＮＡライブラリーのメンバーを増
幅するために使用され得る。この場合においては、所望される挿入物は、本発明
の核酸に対応する全長のｃＤＮＡに由来する配列を含み得る。このようなＰＣＲ
方法は、遺伝子捕捉法およびＲＡＣＥ方法を含む。
【０１３８】 遺伝子の捕捉は、ベクター中へのｃＤＮＡライブラリーのメンバーの挿入を伴
い得る。次いで、ベクターは、一本鎖の分子を生じるように変性させられ得る。
次に、基質に結合したプローブ（例えば、ビオチン化されたオリゴ）が、目的の
ｃＤＮＡ挿入物を捕捉するために使用され得る。ビオチン化されたプローブは、
アビジンに結合させた固体基質に連結させられ得る。ＰＣＲ方法が、捕捉された
ｃＤＮＡを増幅するために使用され得る。全長の遺伝子に対応する配列を捕捉す
るために、標識されたプローブ配列は、本発明の核酸配列（例えば、配列番号１
〜１６８、好ましくは、配列番号１〜３５、またはそれらに相補的な配列）に基
づき得る。ランダムプライマーまたはライブラリーベクターに特異的なプライマ
ーは、捕捉されたｃＤＮＡを増幅するために使用され得る。このような遺伝子捕
捉技術は、Ｇｒｕｂｅｒら、ＰＣＴ ＷＯ９５／０４７４５およびＧｒｕｂｅｒ
ら、米国特許第５，５００，３５６号に記載されている。キットは、例えば、Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａ
ｎｄ，ＵＳＡから、遺伝子捕捉実験を行うために市販されている。
【０１３９】 「ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅」すなわちＲＡＣＥは、多数の異なるＲＮＡから
ｃＤＮＡを増幅するＰＣＲ方法である。ｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチドリンカ
ーに連結させられ得、そして２個のプライマーを使用するＰＣＲによって増幅さ
れ得る。一方のプライマーは、その全長の配列が所望される本発明の核酸に由来
する配列に基づき得る。そして第２のプライマーは、ｃＤＮＡを増幅するための
オリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズする配列を含み得る。この方法の
記載は、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９７／１９１１０に報告されている。
【０１４０】 ＲＡＣＥの好ましい実施態様においては、共通のプライマーが、ｃＤＮＡ末端
に連結させられた任意のアダプター配列に対してアニーリングするように設計さ
れる（ＡｐｔｅおよびＳｉｅｂｅｒｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８
９０−８９３、１９９３；Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
９：５２２７−５２３２、１９９１）。単一の遺伝子特異的ＲＡＣＥプライマー
が共通のプライマーと対合させられる場合は、単一の遺伝子特異的プライマーと
共通のプライマーとの間での優先的な配列の増幅が生じる。ＲＡＣＥにおける使
用のために改変された市販のｃＤＮＡプールが利用可能である。
【０１４１】 別のＰＣＲに基づく方法は、ｃＤＮＡ配列の特定の知識を必要とはせずに固定
された末端を有する全長のｃＤＮＡライブラリーを作製する。この方法は、ロッ
ク−ドッキング（ｌｏｃｋ−ｄｏｃｋｉｎｇ）プライマー（Ｉ−ＶＩ）を使用す
る。ここで、一方のプライマー（ポリＴＶ（Ｉ−ＩＩＩ））は、第１鎖の合成を
生じる真核生物ｍＲＮＡのポリＡテール上をロックし、そして第２のプライマー
（ポリＧＨ（ＩＶ−ＶＩ））は、末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼ（ＴｄＴ）によって付加されたポリＣテール上をロックする。この方法は、
ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９６／４０９９８号に記載されている。
【０１４２】 遺伝子のプロモーター領域は、一般的には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部
位に対して５’側に配置される。数百のプロモーター領域は、「ＴＡＴＡ」ボッ
クス（ＴＡＴＴＡまたはＴＡＴＡＡのような配列）を含む。これは、変異に対し
て敏感である。プロモーター領域は、遺伝子のコード領域に由来するプライマー
を使用して、５’ＲＡＣＥを実行することによって得ることができる。あるいは
、ｃＤＮＡは、ゲノム配列についてのプローブとして使用され得、そしてコード
領域に対して５’側の領域が、「ウォーキングアップ」によって同定される。
【０１４３】 遺伝子が高度に発現されるかまたは示差的に発現される場合、遺伝子に由来す
るプロモーターは、異種遺伝子についての調節構築物において使用され得る。
【０１４４】 一旦、全長のｃＤＮＡまたは遺伝子が得られると、改変体をコードするＤＮＡ
が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１５．３−１５．６３に詳細に記載される部位特異的
変異誘発によって調製され得る。置き換えられるコドンまたはヌクレオチドの選
択は、変更されたタンパク質構造および／または機能を達成するために、アミノ
酸中での最適な変化に対する本明細書中での開示に基づき得る。
【０１４５】 生物学的材料からＤＮＡまたはＲＮＡを得るための別の方法として、本発明の
１つ以上の核酸の配列を有するヌクレオチドを含む核酸が合成され得る。従って
、本発明は、核酸分子の複製および発現を含む、１つ以上の生物学的な操作に適
切な、１２個のヌクレオチド（配列番号１〜５４４、好ましくは、配列番号１〜
１６８、なおより好ましくは、配列番号１〜３５のうちの１つによって示される
核酸、もしくはそれらに相補的である配列に対して、ストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするかまたはそれに対して少なくとも８０％同一である、少な
くとも１２個の連続するヌクレオチドに対応する）から最大の長さまでの範囲の
長さの核酸分子を含む。本発明は、以下を含むが、これらに限定されない：（ａ
）全長の遺伝子の大きさを有し、そして配列番号１〜５４４、好ましくは、配列
番号１〜１６８、なおより好ましくは、配列番号１〜３５、またはそれらに相補
的である配列の少なくとも１つを含む、核酸；（ｂ）融合タンパク質の発現を可
能にするように作動可能に連結された、少なくとも１つのさらなる遺伝子をもま
た含む、（ａ）の核酸；（ｃ）（ａ）または（ｂ）を含む発現ベクター；（ｄ）
（ａ）または（ｂ）を含むプラスミド；および（ｅ）（ａ）または（ｂ）を含む
組換えウイルス粒子。（ａ）の構築は、以下のＩＶ部に記載されるように達成さ
れ得る。
【０１４６】 本発明の核酸の配列は、Ａ、Ｔ、Ｇ、および／またはＣ（ＤＮＡについて）、
ならびにＡ、Ｕ、Ｇ、および／またはＣ（ＲＮＡについて）、あるいはその改変
された塩基（イノシンおよびプソイドウリジンを含む）の任意の配列であり得る
が、これらに限定されない。配列の選択は、所望の機能に依存し、そして所望の
コード領域、所望のイントロン様領域、および所望の調節領域によって指示され
得る。
【０１４７】 （ＶＩ．本発明の核酸を保有するベクター） 本発明はさらに、宿主細胞中で遺伝子を発現させるために使用され得る、プラ
スミドおよびベクターを提供する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核
生物細胞であり得る。従って、配列番号１〜５４４、好ましくは、配列番号１〜
１６８、なおより好ましくは、配列番号１〜３５、またはそれらに相補的である
配列のいずれか１つから誘導され、タンパク質の全部または選択された部分をコ
ードするヌクレオチド配列が、微生物または真核生物の細胞性のプロセスを介し
てポリペプチドの組換え形態を産生するために使用され得る。遺伝子構築物（例
えば、発現ベクター）中へポリヌクレオチド配列を連結させること、および宿主
（真核生物（酵母、鳥類、昆虫、または哺乳相物）または原核生物（細菌細胞）
のいずれかである宿主）中に形質転換またはトランスフェクトすることは、当該
分野で周知の標準的な手順である。
【０１４８】 細胞中での核酸の発現を可能にするベクターは、発現ベクターと呼ばれる。代
表的には、発現ベクターは、少なくとも１つの転写調節配列に作動可能に連結さ
れた核酸を含む。調節配列は、当該分野で認識されており、そして本発明の核酸
の発現を指向するように選択される。転写調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎ
ｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。１つの実施態様においては、発現ベ
クターは、本発明のポリペプチドのアゴニスト活性を有するペプチドをコードす
るか、あるいは、本発明のポリペプチドのアンタゴニスト形態であるペプチドを
コードする組換え遺伝子を含む。
【０１４９】 プラスミドの選択は、増殖が所望される細胞の型、および増殖の目的に依存す
る。特定のベクターが、大量の所望されるＤＮＡ配列を増幅および作製するため
に有用である。他のベクターが、培養物中での細胞の発現のために適切である。
なお他のベクターが、全動物またはヒト中への細胞の移入およびその中での発現
のために適切である。適切なベクターの選択は、十分に当業者の技術範囲内であ
る。多くのこのようなベクターは、市販されている。核酸または全長の遺伝子は
、代表的には、ベクター中の切断された制限酵素部位に対するＤＮＡリガーゼ付
着によってベクター中に挿入され得る。あるいは、所望のヌクレオチド配列は、
インビボで相同組換えによって挿入され得る。代表的には、これは、所望のヌク
レオチド配列に隣接するベクターに対して相同である領域を付着させることによ
って、達成される。相同である領域は、オリゴヌクレオチドの連結によって、ま
たは相同の領域および所望のヌクレオチド配列の一部の両方を含むプライマーを
使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、付加される。
【０１５０】 核酸または全長の遺伝子は、所望の発現特性を得るために適切である場合には
、調節配列に連結される。これらは、プロモーター（センス鎖の５’末端または
アンチセンス鎖の３’末端のいずれかに付着される）、エンハンサー、ターミネ
ーター、オペロン、リプレッサー、およびインデューサーを含み得る。プロモー
ターは、調節され得るかまたは構成的であり得る。いくつかの状況においては、
条件的に活性なプロモーター（例えば、組織特異的または発生段階特異的プロモ
ーター）を使用することが、所望され得る。これらは、ベクターへの連結につい
ての上記の技術を使用して、所望のヌクレオチド配列に連結される。当該分野で
公知の任意の技術が使用され得る。
【０１５１】 任意の上記の宿主細胞、または他の適切な宿主細胞もしくは生物体が、本発明
のポリヌクレオチドまたは核酸を複製および／または発現させるために使用され
る場合には、得られる複製された核酸、ＲＮＡ、発現されたタンパク質、または
ポリペプチドは、宿主細胞または生物の産物として本発明の範囲内である。生成
物は、当該分野で公知の任意の適切な手段によって回収される。
【０１５２】 一旦、核酸に対応する遺伝子が同定されると、その発現は、その遺伝子が本来
あった細胞中で調節され得る。例えば、細胞の内因性の遺伝子は、米国特許第５
，６４１，６７０号、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」において開示されるように、外因性の調節配列
によって調節され得る。
【０１５３】 多数のベクターが、酵母中での組換えタンパク質の発現のために存在する（例
えば、Ｂｒｏａｃｈら（１９８３）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕ
ｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ編、
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，８３頁（本明細書中で参考として援用されてい
る）を参照のこと）。さらに、薬剤耐性マーカー（例えば、アンピシリン）が、
使用され得る。例示的な実施態様においては、配列番号１〜５４４、好ましくは
、配列番号１〜１６８、なおより好ましくは、配列番号１〜３５に示される核酸
、またはそれらに相補的である配列の１つに示される核酸の１つをサブクローニ
ングすることによって生成された発現ベクター利用して、ポリペプチドが組換え
的に産生される。
【０１５４】 好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を容易にするた
めの原核生物配列、および真核生物細胞中で発現される１つ以上の真核生物転写
ユニットの両方を含む。プラスミドの調製および宿主生物体の形質転換において
使用される種々の方法は、当該分野で周知である。原核生物細胞および真核生物
細胞の両方についての他の適切な発現系、ならびに一般的な組換え手順について
は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ およびＭａｎｉａｔｉｓ
編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ：１９８９）、第１６章および第１７章を参照のこと。遺伝子の一部のみ（例
えば、短型の変異体）を発現することが所望される場合は、発現される所望の配
列を含有するオリゴヌクレオチドフラグメントに対して開始コドン（ＡＴＧ）を
付加することが必要であり得る。Ｎ末端位置のメチオニンが、酵素メチオニンア
ミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）の使用によって酵素的に切断され得ることは、当該
分野で周知である。ＭＡＰは、Ｅ．ｃｏｌｉから（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔら（１
９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７５１−７５７）、およびＳａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍからクローン化されており、そしてイン
ビトロでのその活性が、組換えタンパク質について実証されている（Ｍｉｌｌｅ
ｒら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：２７１８−１７２２）。従って、所望される
場合は、Ｎ末端メチオニンの除去は、ＭＡＰを産生する宿主（例えば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉまたはＣＭ８９、またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でポリペプチドを発
現させることによってインビボで、あるいは精製されたＭＡＰの使用によってイ
ンビトロで（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、前出の手順）のいずれかで達成され得る
。
【０１５５】 さらに、本発明の核酸構築物はまた、アンチセンス核酸のような核酸を送達す
るための、遺伝子治療プロトコールの一部として使用され得る。従って、本発明
の別の局面は、アンチセンスオリゴヌクレオチドでのインビボまたはインビトロ
でのトランスフェクションのための発現ベクターを特徴とする。
【０１５６】 ウイルス移入方法に加えて、非ウイルス方法がまた、本発明の核酸（例えば、
配列番号１−５４４、好ましくは、配列番号１−１６８、なおより好ましくは、
配列番号１−３５の１つによって示される配列、またはそれに相補的である配列
）を動物の組織に導入するために使用され得る。ほとんどの非ウイルス性の遺伝
子の移入方法は、高分子の取り込みおよび細胞内輸送のための、哺乳動物細胞に
よって使用される正常な機構に依る。好ましい実施態様においては、本発明の非
ウイルス性の標的化手段は、標的化された細胞による本発明の核酸の取りこみの
ためのエンドサイトーシス経路による。この型の例示的な標的化手段として、リ
ポソーム送達系、ポリリジン結合体、および人工的なウイルスエンベロープが挙
げられる。
【０１５７】 配列番号１−５４４、好ましくは、配列番号１−１６８、なおより好ましくは
、配列番号１−３５、またはそれらに相補的である配列、対応するｃＤＮＡ、あ
るいは全長の遺伝子のいずれかの核酸が、部分的なまたは完全な遺伝子産物を発
現するために使用され得る。適切な核酸構築物は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ
，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されてい
るような標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、そしてＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔ
ｅｓ Ｄｅｐｔ．ＨＨＳ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅ
ａｌｔｈ （ＮＩＨ） Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈに記載される現行の規定の下で精製される。核酸に
よってコードされるポリペプチドは、例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類、およ
び哺乳動物系を含む任意の発現系中で発現され得る。適切なベクターおよび宿主
細胞が、米国特許第５，６５４，１７３号に記載されている。
【０１５８】 細菌。細菌中での発現系として、以下に記載されているものが挙げられる：
【０１５９】
【数１】 酵母。酵母中での発現系として、以下に記載されているものが挙げられる：
【０１６０】
【数２】 昆虫細胞。昆虫の中での異種遺伝子の発現は、以下に記載されているように達
成される：
【０１６１】
【数３】 多数のバキュロウイルス株および変異体、ならびに宿主に由来する対応する許容
性の昆虫宿主細胞が、以下に記載されている：
【０１６２】
【数４】 哺乳動物細胞。哺乳動物での発現は、以下に記載されているように達成される
：
【０１６３】
【数５】 哺乳動物発現の他の特徴は、以下に記載されているように容易にされる：
【０１６４】
【数６】 （ＶＩＩ．治療用の核酸構築物） 本発明の１つの局面は、アンチセンス治療における単離された核酸（例えば、
配列番号１−５４４、好ましくは、配列番号１−１６８、なおより好ましくは、
配列番号１−３５、またはそれらに相補的な配列）の使用に関する。本明細書中
で使用される場合は、アンチセンス治療は、細胞性のｍＲＮＡおよび／またはゲ
ノムＤＮＡと細胞の条件下で特異的にハイブリダイズ（例えば、結合）する、オ
リゴヌクレオチド分子またはそれらの誘導体の投与またはインサイチュでの生成
をいい、それによって、その遺伝子の転写および／または翻訳が阻害される。結
合は、従来の塩基対の相補性により得るか、または例えば、ＤＮＡ二本鎖への結
合の場合においては、二本鎖のヘリックスの主要な溝中での特異的な相互作用を
介し得る。一般的には、アンチセンス治療は、当該分野で一般的に使用される技
術の範囲をいい、そしてオリゴヌクレオチド配列に対する特異的な結合に依る任
意の治療を含む。
【０１６５】 本発明のアンチセンス構築物は、例えば、細胞中で転写される場合、細胞性ｍ
ＲＮＡの少なくとも特有の一部に対して相補的であるＲＮＡを生じる発現プラス
ミドとして送達され得る。あるいは、アンチセンス構築物はオリゴヌクレオチド
プローブであり、このオリゴヌクレオチドプローブは、エキソビボで生成され、
そして細胞に導入された場合には、本発明の核酸のｍＲＮＡおよび／またはゲノ
ム配列とのハイブリダイゼーションによる発現の阻害を生じる。このようなオリ
ゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、内因性のヌクレアーゼ（例えば、エキ
ソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ）に対して耐性であり、従っ
てインビボで安定である、改変されたオリゴヌクレオチドである。アンチセンス
オリゴヌクレオチドとしての使用のための例示的な核酸分子は、ＤＮＡの、ホス
ホルアミダイトアナログ、ホスホロチオエートアナログ、およびメチルホスホネ
ートアナログである（米国特許第５，１７６，９９６号；同第５，２６４，５６
４号；および同第５，２５６，７７５号をもまた参照のこと）。さらに、アンチ
センス治療において有用なオリゴマーを構築するための一般的なアプローチは、
例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら（１９８８）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ ６：９５８−９７６；およびＳｔｅｉｎら（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ ４８：２６５９−２６６８によって概説されている。アンチセンスＤＮＡに
関しては、転写開始部位（例えば、目的のヌクレオチド配列の−１０領域と＋１
０領域との間）から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが、好ましい。
【０１６６】 アンチセンスアプローチは、ｍＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチド（Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の設計を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチド
は、ｍＲＮＡ転写物に結合し、そして翻訳を妨げる。絶対的な相補性は、好まし
いが、必要ではない。従って、二本鎖のアンチセンス核酸の場合においては、二
本鎖のＤＮＡの一本の鎖が試験され得るか、または三本鎖の形成がアッセイされ
得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さ
の両方に依存する。一般的には、ハイブリダイズする核酸が長いほど、より多く
の塩基がＲＮＡと不適合となるが、この核酸は、安定な二本鎖を含み得、そして
なお安定な二本鎖（または、三重鎖（そのような場合も存在し得る））を形成す
る。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融解点を決定するための標準的な手
順の使用によって不適合の寛容性の程度を確認し得る。
【０１６７】 ｍＲＮＡの５’末端（例えば、ＡＵＧ開始コドンまでおよびそれを含む、５’
の非翻訳配列）に対して相補的であるオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害するこ
とについて最も効率よく作用するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配
列に対して相補的である配列が、ｍＲＮＡの翻訳を阻害することについて同様に
有効であることが最近示された。（Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．１９９４、Ｎａｔｕｒｅ
３７２：３３３）。従って、遺伝子の５’または３’の非翻訳領域、非コード
領域のいずれかに対して相補的なオリゴヌクレオチドが、内因性のｍＲＮＡの翻
訳を阻害するためのアンチセンスアプローチにおいて使用され得る。ｍＲＮＡの
５’非翻訳領域に対して相補的であるオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドン
の相補物を含むはずである。ｍＲＮＡコード領域に対して相補的であるアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、代表的には、翻訳のあまり有効ではないインヒビタ
ーであるが、また、本発明に従って使用され得る。本発明のｍＲＮＡの５’、３
’、またはコード領域にハイブリダイズするように設計されたかどうかにはかか
わらず、アンチセンス核酸は、少なくとも６個のヌクレオチドの長さであるはず
であり、そして好ましくは、約１００個未満、そしてより好ましくは、約５０個
未満、２５個未満、１７個未満、または１０個未満のヌクレオチドの長さである
。
【０１６８】 標的配列の選択にはかかわらず、インビトロでの研究を最初に行って、アンチ
センスオリゴヌクレオチドが遺伝子の発現を阻害する能力を定量することが好ま
しい。これらの研究は、アンチセンス遺伝子の阻害と、オリゴヌクレオチドの非
特異的な生物学的な効果との間を区別するコントロ−ルを利用することが、好ま
しい。これらの研究は、内部コントロールのＲＮＡまたはタンパク質のレベルと
、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルとを比較することもまた、好ましい。さ
らに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して得られる結果が、コントロー
ルオリゴヌクレオチドを使用して得られる結果と比較されることが想定される。
コントロールオリゴヌクレオチドが、試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さで
あり、そしてそのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、標的配列に対する
特異的なハイブリダイゼーションを妨げることを必要とするに過ぎないアンチセ
ンスとは異なることが、好ましい。
【０１６９】 オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそのキメラ混合物もし
くは誘導体もしくはその改変されたバージョン、一本鎖または二本鎖であり得る
。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で、例えば、分
子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために、改変され得る。オ
リゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、宿主細胞レセプターを標的化するため
）または細胞膜を通過する輸送を容易にする薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ
ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６
５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２；１９８８年１２月１５日に公開されたＰ
ＣＴ公開番号第ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、または血液−脳関門を通
過する輸送を容易にする薬剤（例えば、１９８８年４月２５日に公開されたＰＣ
Ｔ公開番号第ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）、ハイブリダイゼーションに
よって誘発される切断薬剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照のこと）、または内部キレート薬剤（例
えば、Ｚｏｎ、１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこ
と）のような、他の追加された群を含み得る。この目的のために、オリゴヌクレ
オチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションによって誘発
される架橋剤、輸送薬剤（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｇｅｎｔ）、ハイブリダイゼ
ーションによって誘発される切断剤など）に対して結合され得る。
【０１７０】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含むが、それらに限定されない群
から選択される、少なくとも１つの改変された塩基部分を含み得る：５−フルオ
ロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、
ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロ
キシトリエチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリ
ジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ
−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−
メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチル
アデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ
６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メ
トキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５
−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ
−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブト
キソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−
２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル
、ウラシルー５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）
、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシ
プロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【０１７１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２−フルオロアラビ
ノース、キシルロース、およびヘキソースを含むがこれらに限定されない群から
選択される、少なくとも１つの改変された糖部分を含み得る。
【０１７２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、中性のペプチド様骨格を含み得る。
このような分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマーと呼ばれ、そして例え
ば、Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１４６７０、およびＥｇｌｏｍら（１９９３）Ｎ
ａｔｕｒｅ ３６５：５６６に記載されている。ＰＮＡオリゴマーの１つの利点
は、ＤＮＡの中性の骨格に起因して、媒体のイオン強度とは本質的に独立して、
相補的なＤＮＡに対して結合するそれらの能力である。なお別の実施態様におい
ては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチ
オエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデ
ート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタ
ール、またはそれらのアナログからなる群より選択される、少なくとも１つの改
変されたリン酸骨格を含む。
【０１７３】 なおさらなる実施態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−
アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補
的なＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する。ここでは、通常のβ−ユ
ニットとは対照的に、鎖が互いに平行に伸びる（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８７、
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。オリゴヌクレオ
チドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−１２１４８）か、またはキメ
ラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２
１５：３２７−３３０）である。
【０１７４】 本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉ
ｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販される）
の使用によって、当該分野で公知の標準的な方法によって合成され得る。例とし
て、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、Ｓｔｅｉｎら（１９８８、Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９）の方法によって合成され得、メチ
ルホスホネートオリゴヌクレオチドが、制御された孔ガラスポリマー支持体（Ｓ
ａｒｉｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
８５：７４４８−７４５１）などの使用によって調製され得る。
【０１７５】 コード領域の配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが使用され得るが、転
写される非翻訳領域および開始メチオニンを含む領域に対して相補的なアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドが最も好ましい。
【０１７６】 アンチセンス分子は、インビボで標的核酸を発現する細胞に送達され得る。多
数の方法が、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に送達するために開発され
ている；例えば、アンチセンス分子は、組織部位に直接注射され得るか、または
、所望の細胞を標的化するように設計された改変されたアンチセンス分子（例え
ば、標的細胞の表面上で発現されるレセプターまたは抗原に特異的に結合するペ
プチドまたは抗体に連結したアンチセンス）が、全身的に投与され得る。
【０１７７】 しかし、内因性のｍＲＮＡ上での翻訳を抑制するために十分なアンチセンスの
細胞内濃度を達成することは、しばしば困難である。従って、好ましいアプロー
チは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ
ＩＩプロモーターの制御下に配置されている組換えＤＮＡ構築物を利用する。患
者中の標的細胞をトランスフェクトするためのこのような構築物の使用は、内因
性の転写物と相補的な塩基対を形成する一本鎖のＲＮＡの十分な量の転写を生じ
、そしてこれによって、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げる。例えば、ベクターは、イ
ンビボで導入され得、その結果、細胞によって取りこまれ、そしてアンチセンス
ＲＮＡの転写を指向する。このようなベクターは、それが所望のアンチセンスＲ
ＮＡを産生するように転写され得る限りは、エピソームのままであり得るか、ま
たは染色体に組み込まれ得る。このようなベクターは、当該分野で標準的な組換
えＤＮＡ技術方法によって構築され得る。ベクターは、哺乳動物細胞中での複製
および発現のための当該分野で公知のプラスミド、ウイルス、または他のもので
あり得る。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物中（好まし
くは、ヒト細胞）で作用することが当該分野で公知の任意のプロモーターにより
得る。このようなプロモーターは、誘導性であり得るかまたは構成的であり得る
。このようなプロモーターとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９
８１、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長
末端反復中に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ
２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎ
ｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８
：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅ
ｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９−４２）など。任意の型のプラス
ミド、コスミド、ＹＡＣ，またはウイルスベクターが、組織部位（例えば、脈絡
叢または視床下部）に直接導入され得る組換えＤＮＡ構築物を調製するために使
用され得る。あるいは、所望の組織を選択的に感染させるウイルスベクターが使
用され得る（例えば、脳については、ヘルペスウイルスベクターが使用され得る
）。このような場合においては、投与は、別の経路（例えば、全身的に）によっ
て達成され得る。
【０１７８】 本発明の別の局面においては、標的ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように
設計されたリボザイム分子が、標的ｍＲＮＡの翻訳および標的タンパク質の発現
を妨げるために使用され得る（例えば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣ
Ｔ国際公開番号第ＷＯ９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４７：１２２２−１２２５、および米国特許第５，０９３，２４６号
を参照のこと）。ｍＲＮＡを部位特異的認識配列で切断するリボザイムが、標的
ｍＲＮＡを崩壊させるために使用され得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使
用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡとの相補性の塩基
対を形成する隣接領域によって指向される位置で、ｍＲＮＡを切断する。唯一の
要件は、標的ｍＲＮＡが、以下の２つの塩基の配列５’−ＵＧ−３’を有するこ
とである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および産生は、当該分野で周知で
あり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ
、３３４：５８５−５９１に、より完全に記載されている。好ましくは、リボザ
イムは、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端の近くに配置されるように、操
作される。すなわち、効率を増大させ、そして機能的ではないｍＲＮＡ転写物の
細胞内蓄積を最少にする。
【０１７９】 本発明のリボザイムはまた、以下のようなＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（本
明細書中では以後、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）を含む：Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎ
ａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ中に天然に存在するもの（ＩＶＳまたはＬ−１９
ＩＶＳ ＲＮＡとして公知）、およびＴｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈおよび共同研究者
によって広範囲に記載されているもの（Ｚａｕｇら、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ
、２２４：５７４−５７８；ＺａｎｇおよびＣｅｃｈ、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２３１：４７０−４７５；Ｚａｕｇら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：
４２９−４３３；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｔｅｎｔｓ Ｉｎｃ．による公開
された国際特許出願番号第ＷＯ８８／０４３００；ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ、１
９８６、Ｃｅｌｌ、４７：２０７−２１６）。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、それ以
後に標的ＲＮＡの切断が起こる標的ＲＮＡ配列に対してハイブリダイズする８塩
基対の活性部位を有する。本発明は、標的遺伝子中に存在する８塩基対の活性部
位配列を標的化するこのようなＣｅｃｈ型リボザイムを含む。
【０１８０】 アンチセンスアプローチにおけるように、リボザイムは、改変されたオリゴヌ
クレオチド（例えば、改善された安定性、標的化などについて）から構成され得
、そしてインビボで標的遺伝子を発現する細胞に送達されるはずである。好まし
い送達方法は、強力な構成的なｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロモーター
の制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することを含み、そ
の結果、トランスフェクトされた細胞は、内因性のメッセージを破壊し、そして
翻訳を阻害するために十分な量のリボザイムを産生する。リボザイムが、アンチ
センス分子とは異なり、触媒的であるので、より低い細胞内濃度が効率性のため
に必要とされる。
【０１８１】 本発明のアンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡ、およびリボザイム分子は、ＤＮＡおよ
びＲＮＡ分子の合成のために、当該分野で公知の任意の方法によって調製され得
る。これらは、当該分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴ
リボヌクレオチドを化学的に合成するための技術（例えば、固相ホスホルアミダ
イト化学合成のような）を含む。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ
分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボでの転写によって生成
され得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモータ
ーのような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む広範な種々のベク
ター中に組み込まれ得る。あるいは、使用されるプロモーターに依存してアンチ
センスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物が、
細胞株に安定に導入され得る。
【０１８２】 さらに、核酸分子に対する種々の周知の改変が、細胞内安定性および半減期を
増大させる手段として、導入され得る。可能性のある改変として、分子の５’お
よび／または３’末端に対するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチ
ドの隣接する配列の付加、あるいはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内での
ホスホロジエステラーゼ結合ではなくホスホロジチオエートまたは２’Ｏ−メチ
ルの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】 （ＶＩＩＩ．本発明のポリペプチド） 本発明は、他の細胞タンパク質、特に他のシグナル伝達因子および／または転
写因子（通常、ポリペプチドと関連し得る）から単離されたか、またはさもなけ
れば実質的にそれらを含まない、有用な単離されたポリペプチドを作製する。本
発明のポリペプチドは、配列番号１〜５４４、好ましくは、配列番号１〜１６８
、なおさらに好ましくは配列番号１〜３５、もしくはそれらに相補的な配列の核
酸によりコードされるポリペプチド、または配列番号１〜５４４、好ましくは配
列番号１〜１６８、なおよりさらに好ましくは配列番号１〜３５、もしくはそれ
らに相補的な配列がフラグメントである遺伝子によりコードされるポリペプチド
を含む。本発明のポリペプチドは、腫瘍細胞、特に結腸癌誘導性細胞株において
（正常細胞（例えば、正常結腸組織および非結腸組織）に対して）示差的に調節
されるこれらのポリペプチドを含む。好ましい実施態様において、このポリペプ
チドは、腫瘍細胞、特に結腸癌誘導性細胞において上方制御される。他の実施態
様において、このポリペプチドは、腫瘍細胞、特に結腸癌誘導性細胞株において
下方制御される。異常に増殖する細胞において、オンコジーンのような上方制御
されるタンパク質、または腫瘍サプレッサーのような下方制御されるタンパク質
は、診断的または治療的技術のために標的化され得る。例えば、ｃｄｃ２遺伝子
の上方制御は、有糸分裂を誘導する。ｍｙｔ１遺伝子（有糸分裂の非活性化因子
）の過剰発現は、ｃｄｃ２の活性をネガティブに調節する。従って、異常増殖は
、ｃｄｃ２を上方制御するか、またはｍｙｔ１を下方制御するかのいずれかによ
り誘導され得る。
【０１８４】 用語「他の細胞タンパク質を実質的に含まない」（本明細書においては、「混
入タンパク質」ともいう）または「実質的に純粋または精製された調製物」は、
約２０％（乾燥重量で）未満の混入タンパク質を有する、そして好ましくは、約
５％未満の混入タンパク質を有するポリペプチドの調製物を含むと規定される。
本ポリペプチドの機能的形態は、本明細書に記載されるクローニングされた核酸
を用いることにより精製された調製物として初めて調製され得る。１つ以上の特
定のモチーフおよび／もしくはドメインに、または任意のサイズ（例えば、少な
くとも約５、１０、２５、５０、７５または１００アミノ酸長）に対応する完全
長タンパク質またはフラグメントは、本発明の範囲内である。
【０１８５】 例えば、単離されたポリペプチドは、配列番号１〜５４４、好ましくは、配列
番号１〜１６８、なおより好ましくは配列番号１〜３５のいずれかに示される核
酸配列またはそれらに相補的な配列の全てまたは一部によりコードされ得る。タ
ンパク質の単離されたペプチジル部分は、このようなペプチドをコードする核酸
の対応するフラグメントから組換えられて産生されたペプチドをスクリーニング
することにより獲得され得る。さらに、フラグメントは、当該分野で公知の技術
（例えば、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学）を用い
て化学的に合成され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、フラグメントの重
複のない所望の長さのフラグメントに任意に分割され得るか、または好ましくは
、所望の長さの重複するフラグメントに分割され得る。このフラグメントは（組
換え的にかまたは化学合成により）生成され得、そして野生型（例えば、「標準
の（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）」）のタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニスト
のいずれかとして機能し得るそれらのペプチジルフラグメントを同定するために
試験され得る。
【０１８６】 本発明の別の局面は、本発明のタンパク質の組換え形態に関する。上記の本発
明による好ましい組換えポリペプチドは、天然のタンパク質に加えて、配列番号
１〜５４４にコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、より好ま
しくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは８５％、そしてより好ましくは
９０％、そしてより好ましくは９５％同一である核酸によりコードされる。配列
番号１〜５４４の配列に少なくとも約９８〜９９％同一である核酸によりコード
されるポリペプチドはまた、本発明の範囲内である。このようなタンパク質の少
なくとも一部を含むペプチドフラグメントもまた本発明に含まれる。
【０１８７】 好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは、哺乳動物のポリペプチ
ドであり、そしてなおより好ましくはヒトのポリペプチドである。特に好ましい
実施態様では、このポリペプチドは、野生型の生物活性を保持する。特定の翻訳
後修飾、例えば、リン酸化などは、修飾されていないポリペプチド鎖に対してポ
リペプチドの見かけの分子量を増加し得ることが理解される。
【０１８８】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドの１つの組換え形態に関する。このよ
うな組換えポリペプチドは、好ましくは、添付の配列表の野生型（「標準」）ポ
リペプチドの少なくとも１つの生物学的活性のアゴニストまたはアンタゴニスト
のいずれかの役割の１つを果たし得る。タンパク質のアミノ酸配列に関して、用
語「進化的に関連する」は、天然に生じたアミノ酸配列を有するポリペプチド、
および例えばコンビナトリアル変異誘発により誘導されるヒトポリペプチドの変
異改変体の両方をいう。
【０１８９】 一般に、本明細書においてタンパク質の活性を有する（例えば「生物活性」で
ある）というポリペプチドは、配列番号１〜５４４、好ましくは配列番号１〜１
６８、なおより好ましくは、配列番号１〜３５またはそれらに相補的な配列の１
つに示される核酸配列のすべてまたは一部によりコードされるアミノ酸配列を含
むポリペプチド、および天然に存在するタンパク質の生物学的活性／生化学活性
の全てもしくは一部を模倣またはアンタゴナイズするポリペプチドとして規定さ
れる。本発明に従って、ポリペプチドは、それがタンパク質の天然に存在する形
態の特異的なアゴニストまたはアンタゴニストである場合、生物学的活性を有す
る。
【０１９０】 化合物（例えば、タンパク質またはその改変体）が、上記の生物学的活性の１
つ以上を有するか否かを決定するためのアッセイは、当該分野で周知である。特
定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、上記で概説されたような活性
を有する。
【０１９１】 別の実施態様において、このポリペプチドのコード配列は、異なるポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部として組み込まれ得る
。この型の発現系は、ポリペプチドの免疫原性フラグメントを生成するのに所望
される条件下で有用であり得る（例えば、ＥＰ公開番号：０２５９１４９；およ
びＥｖａｎｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３８５；Ｈｕａｎｇら（１
９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：３８５５；およびＳｃｈｌｉｅｎｇｅｒら（１
９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２を参照のこと）。免疫原性を増強するために
融合タンパク質を利用することに加えて、融合タンパク質はまたタンパク質の発
現を促進し得、従って、本発明のポリペプチドの発現に用いられ得ることが広く
理解される（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｎ．Ｙ．：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９１）を参照のこと）。別の実施態様においては、精製リ
ーダー配列（例えば、組換えタンパク質の所望の部分のＮ末端のポリ−（Ｈｉｓ
）／エンテロキナーゼ切断部位配列）をコードする融合遺伝子が、Ｎｉ2+金属樹
脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより発現された融合タンパク質
の精製を可能にする。次いで、この精製リーダー配列は、エンテロキナーゼ処置
により実質的に除去され、精製タンパク質を提供し得る（例えば、Ｈｏｃｈｕｌ
ｉら（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１１７；および
Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ ８８：８９７２を参照のこと）。
【０１９２】 融合遺伝子作製の技術は、当業者に公知である。本質的に、異なるポリペプチ
ド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの連結は、連結用の平滑末端化ま
たは付着末端化、適切な末端を提供するための制限酵素消化、所望されない連結
を回避するための適切なアルカリホスファターゼ処理としての粘着性末端の充填
、および酵素的連結を使用する、従来の技術に従って実施される。別の実施態様
において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により合成され
得る。あるいは、核酸フラグメントのＰＣＲ増幅は、キメラ核酸配列を生成する
ために引き続きアニーリングされ得る２つの連続的な核酸フラグメントの間で相
補的突出を生じるアンカープライマーを用いて実行され得る（例えば、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａ
ｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）
。
【０１９３】 本発明はさらに、本ポリペプチドを作成する方法に関する。例えば、本発明の
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を指向する核酸ベクターでト
ランスフェクトされた宿主細胞は、適切な条件下で培養され、ペプチドの発現が
生じることを可能にする。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。組
換えポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、限外濾過、電気泳動および、このようなペプチドに特異的な抗体を用いる
免疫親和性精製を含む、タンパク質精製のための当該分野で公知の技術を用いて
、細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から単離され得る。好ましい実施態様
において、組換えポリペプチドは、ＧＳＴ融合タンパク質のような、融合タンパ
ク質の精製を促進するドメインを含む融合タンパク質である。
【０１９４】 さらに、特定の環境下で、タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性の
サブセットのみを促進または阻害するために、アゴニスト（模倣的）またはアン
タゴニストのいずれか一方として、限定された能力で機能する本発明のポリペプ
チドの１つの相同体を提供することは利点があり得るということが一般に理解さ
れる。従って、特異的な生物学的効果は、限定された機能の相同体での処置によ
り誘発され得、そして本発明のタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性
の全てに対して指向されるアゴニストまたはアンタゴニストでの処置に関するわ
ずかな副作用を伴う。
【０１９５】 本発明のポリペプチドのそれぞれの相同体は、変異誘発、例えば、分散する点
変異または切断により生成され得る。例えば、変異は、誘導されるポリペプチド
の生物学的活性が実質的に同じままであるか、または単にそのサブセットである
相同体を生じ得る。あるいは、例えば、レセプターへの競合的結合により、タン
パク質の天然に存在する形態の機能を阻害し得る、ポリペプチドのアンタゴニス
ト的な形態が生成され得る。
【０１９６】 本発明の組換えポリペプチドはまた、野生型タンパク質の相同体、例えば、タ
ンパク質分解性切断に耐性である（例えば、タンパク質に関連するユビキチン結
合または他の酵素標的を変化する変異による）それらのタンパク質のバージョン
を含む。
【０１９７】 ポリペプチドはまた、他の化学部分（例えば、グリコシル基、脂質、リン酸、
アセチル基など）との共有結合または凝集結合の形成により誘導体を作製するた
めに化学的に修飾され得る。タンパク質の共有結合誘導体は、タンパク質のアミ
ノ酸側鎖上、またはポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端での官能基への化学部
分の連結により調製され得る。
【０１９８】 本発明のポリペプチドの構造の改変は、治療的効力または予防的効力、安定性
（例えば、エクスビボでの有効期間およびタンパク質分解への耐性）を増強する
ような目的のため、または翻訳後修飾（例えば、タンパク質のリン酸化パターン
を変化させる）であり得る。このような修飾ポリペプチドは、タンパク質の天然
に存在する形態の少なくとも１つの活性を保持するか、またはそれに対する特定
のアンタゴニストを生成するように設計された場合、本明細書において、より詳
細に記載される様に、ポリペプチドの機能的等価性が考慮される。このような改
変されたペプチドは、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加により作製され得
る。置換的改変は、保存的アミノ酸により置換されてもよいし、また非保存的ア
ミノ酸に置換されてもよい。
【０１９９】 例えば、イソロイシンまたはバリンでのロイシン、グルタミン酸でのアスパラ
ギン酸、セリンでのスレオニンの独立した置換、または構造的に関連するアミノ
酸でのアミノ酸の類似の置換（すなわち、等配電子変換および／または等電変異
）は、得られる分子の生物学的活性への大きな影響を有さないと予期することが
合理的である。保存的置換は、その側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で生
じる置換である。遺伝子コードされるアミノ酸は、以下の４つのファミリーに分
割され得る：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジ
ン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イ
ソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；およ
び（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリ
ン、スレオニン、チロシン。同様の様式で、アミノ酸レパートリーは、以下のよ
うにグループ化され得る：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）
塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）脂肪性＝グリシン、アラニン
、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン（脂肪族水酸基として
必要に応じて別にグループ化されるセリンおよびスレオニン）；（４）芳香族＝
フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、
グルタミン；ならびに（６）イオウ含有＝システインおよびメチオニン。（例え
ば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ編、ＷＨ Ｆｒｅｅ
ｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．：１９８１を参照のこと）。ペプチドのアミノ酸配列に
おける変化が機能的な（例えば、得られるポリペプチドが野生型形態を模倣する
かまたはアンタゴナイズするという意味で機能的な）相同体を生じるか否かは、
改変ペプチドが、野生型タンパク質と類似の様式で細胞における応答を生じるか
、またはこのような応答を競合的に阻害する能力を評価することにより容易に決
定され得る。
【０２００】 １つより多い置換が生じるポリペプチドは、同じ様式で容易に試験され得る。
この改変体は、タンパク質の特定の領域の生物学的活性を保持するように設計さ
れ得る。非限定的例として、Ｏｓａｗａら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ３４：１００
３〜１００９は、いくつかの異なる種由来のタンパク質のアクチン結合領域を考
察している。これらの種のこのアクチン結合領域は、それが「相同体残基群」内
に含まれるアミノ酸を有するという事実に基いて相同であると考えられる。相同
な残基は、以下の群（単一アミノ酸記号を用いる）に従って、判定される：ＳＴ
ＡＧ；ＩＬＶＭＦ；ＨＲＫ；ＤＥＱＮ；およびＦＹＷ。例えば、１つのＳ、Ｔ、
ＡまたはＧが、１つの位置に存在し得、そして機能（この場合、アクチン結合）
が保持される。
【０２０１】 アミノ酸置換のさらなるガイダンスが、タンパク質進化の研究から利用可能で
ある。Ｇｏら、１９８０、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅ
ｓ．１５：２１１〜２２４は、その利用可能性に依存して内部または外部のアミ
ノ酸残基部位を分類した。外部部位でのより頻繁な置換は、その生物学的機能お
よび補欠分子族の存在または非存在にかかわらず、相同なタンパク質ファミリー
の８つのセットにおいて一般的であることが確認された。アミノ酸残基の実質的
に全ての型は、内部よりも外部により高い変異性を有した。内部および外部のそ
れぞれにおけるアミノ酸残基の変異性と極性との間の相関関係は観察されなかっ
た。アミノ酸残基は、その極性に基いて、以下の３つの群の１つに分類された：
極性（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕ）；弱
い極性（Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、ＴｈｒおよびＳｅｒ）、ならびに非極性（Ｃ
ｙｓ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ）。タン
パク質進化の間のアミノ酸置換は、非常に保存的である：内部または外部におい
て、それぞれそれらの８８％および７６％が３つの同じ群内にある。群内での置
換は、弱い極性の残基が内部において、非極性の残基によって、より頻繁に置換
され、そして外部においては、極性残基によって、より頻繁に置換されるような
置換である。
【０２０２】 Ｑｕｅｒｏｌら、１９９６、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：２６５〜２７１は、タン
パク質の熱安定性を増大するためのアミノ酸置換の一般的規則を提供する。新し
いグリコシル化部位は、ＯｌｓｅｎおよびＴｈｏｍｓｅｎ、１９９１、Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３７：５７９〜５８５に考察されたように導入され
得る。さらなるジスルフィド結合が、以下によって考察されるように導入され得
る：ＰｅｒｒｙおよびＷｅｔｚｅｌ、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：５５
５〜５５７；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏら、１９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２６：２０７７〜２０８２；Ｍａｔｓｕｍｕｒａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ
３４２：２９１〜２９３；Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、１９９０、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇ．３：４４３〜４４８；Ｔａｋａｇｉら、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６５：６８７４〜６８７８；Ｃｌａｒｋｅら、１９９３、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ３２：４３２２〜４３２９；およびＷａｋａｒｃｈｕｋら、１９
９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．７：１３７９〜１３８６。
【０２０３】 さらなる金属結合部位が、Ｔｏｍａら、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：９７〜１０６、およびＨａｅｚｅｒｂｒｏｕｃｋら、１９９３、Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｅｎｇ．６：６４３〜６４９に従って、導入され得る。ループにおけ
るプロリンでの置換は、Ｍａｓｕｌら、１９９４、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．６０：３５７９〜３５８４；およびＨａｒｄｙら、ＦＥＢＳ Ｌｅ
ｔｔ．３１７：８９〜９２に従ってなされ得る。
【０２０４】 システイン枯渇ムテインは、本発明の範囲内にある改変体とみなされる。これ
らの改変体は、システインの他のアミノ酸での置換の方法、および置換の生物学
的活性および効果を決定する方法を開示する米国特許第４，９５９，３１４号に
開示された方法に従って構築され得る。このような方法は、例えば、ジスルフィ
ド結合形成を排除するため、このような置換に適切なシステイン残基を有する、
本発明によるタンパク質に適切である。
【０２０５】 核酸に関連する遺伝子の同一性および機能を研究するため、核酸または対応す
るアミノ酸配列は、タンパク質ファミリーのプロフィールに対してスクリーニン
グされ得る。このようなプロフィールは、それぞれのファミリーのタンパク質の
中の共通の構造的モチーフに集中している。公的に利用可能なプロフィールは上
記されている。さらなるプロフィールまたは代替のプロフィールは以下に記載さ
れる。
【０２０６】 新しい核酸を公知の配列と比較するにおいて、いくつかの整列ツールが利用可
能である。例としては、複数の配列整列を作製し、そしてＦｅｎｇら、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｅｖｏｌ．（１９８７）２５：３５１〜３６０に記載されるＰｉｌｅＵｐが
挙げられる。別の方法であるＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．（１９７０）４８：４４３〜４５３の整列方法を用いる。ＧＡＰは、配
列の全体的整列について最もよく適合する。第３の方法であるＢｅｓｔＦｉｔは
、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８
１）２：４８１〜４８９の局所相同性アルゴリズムを用いて適合数を最大化する
ようなギャップの挿入により作動する。
【０２０７】 このようなプロフィールの例は以下に記載される。
【０２０８】 （ケモカイン） ケモカインは、リンパ球輸送、炎症性疾患、新脈管形成、造血およびウイルス
感染に関連するタンパク質のファミリーである。例えば、Ｒｏｌｌｉｎｓ、Ｂｌ
ｏｏｄ（１９９７）９０（３）：９０９〜９２８、およびＷｅｌｌｓら、Ｊ．Ｌ
ｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）６１：５４５〜５５０を参照のこと。米国特許
第５，６０５，８１７号は、胎児脾臓において発現されるケモカインをコードす
るＤＮＡを開示する。米国特許第５，６５６，７２４号は、ケモカイン様タンパ
ク質および使用方法を開示する。米国特許第５，６０２，００８号は、肝臓によ
り発現されるケモカインをコードするＤＮＡを開示する。
【０２０９】 コードされるケモカインの変異体は、天然のケモカインに比べて、少なくとも
１つのアミノ酸置換、付加または欠失を保有するアミノ酸配列を有するペプチド
である。フラグメントは、天然のケモカインと同じアミノ酸配列を有する；変異
体は、アミノ末端配列および／またはカルボキシ末端配列を欠失し得る。融合は
、変異、フラグメントまたは天然のケモカインであり、それはまたアミノ末端お
よび／またはカルボキシ末端のアミノ酸伸長を含み得る。
【０２１０】 アミノ酸変化の数または型は重要でなく、またアミノ酸欠失の長さもしくは数
、または天然のケモカインのアミノ酸配列と比べてケモカインに組み込まれるア
ミノ酸伸長も重要でない。これらの改変ポリペプチドの１つをコードするポリヌ
クレオチドは、少なくとも１つの公知のケモカインと少なくとも約８０％のアミ
ノ酸同一性を保持する。好ましくは、これらのポリペプチドは、少なくとも約８
５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９０％、なおより好
ましくは、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を保持する。さらに、この
改変体は、天然のケモカインにより示される少なくとも１つの活性の、少なくと
も８０％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％を示す。ケモカイン活
性としては、天然のケモカインの免疫学的機能、生物学的機能、レセプター結合
機能およびシグナル伝達機能が挙げられる。
【０２１１】 （走化性）好中球に関する走化性のアッセイは以下に記載される：Ｗａｌｚら
、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８７）１４
９：７５５、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（ＵＳＡ）（１９８７）８４：９２３３、およびＳｃｈｒｏｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．（１９８７）１３９：３４７４；リンパ球に関する走化性のアッセ
イは以下に記載される：Ｌａｒｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４３：
１４６４、Ｃａｒｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（
１９９４）９１：３６５２；腫瘍浸潤リンパ球に関する走化性のアッセイは以下
に記載される：Ｌｉａｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）．１８２：１３
０１；造血前駆体に関する走化性のアッセイは以下に記載される：Ａｉｕｔｉら
、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９７）１８５：１１１；単核球に関する走化性の
アッセイは以下に記載される：Ｖａｌｅｎｔｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８
）２７：４１６２；そしてナチュラルキラー細胞に関する走化性のアッセイは以
下に記載される：Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）１
５６：３２２およびＡｌｌａｖｅｎａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９
９４）２４：３２３３。
【０２１２】 好酸球を誘引する生物学的活性を決定するためのアッセイは、Ｄａｈｉｎｄｅ
ｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：７５１、Ｗｅｂｅｒら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）１５４：４１６６およびＮｏｓｏら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９４）２００：１４７０
に記載される；樹状細胞の誘引については、Ｓｏｚｚａｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．（１９９５）１５５：３２９２に記載される；好塩基球の誘引については
、Ｄａｈｉｎｄｅｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：７５１、Ａ
ｌａｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２：１２９８、Ａｌａｍら、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７６：７８１に記載される；そして好中球
の活性化については、Ｍａｇｈａｚａｃｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（
１９９６）２６：３１５およびＴａｕｂら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）
１５５：３８７７に記載される。天然のケモカインは、Ｍｕｌｌｅｎｂａｃｈら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８６）２６１：７１９に記載のようにアッセ
イされた、線維芽細胞についての分裂促進因子として作用し得る。
【０２１３】 レセプター結合。天然のケモカインは、多数のレセプターと結合活性を示す。
このようなレセプターおよび結合を検出するためのアッセイの記載は、例えば、
以下に記載される：Ｍｕｒｐｈｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５３：１２
８０；Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０
：２９６７１；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９６）１８
３：２３４９；Ｓａｍｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）３５：３３６２
；Ｒａｐｏｒｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：１７６１；
Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）６０：１
４７；Ｂａｂａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２３：１４８９３；
Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２：１３８０３
；Ａｒｖａｎｎｉｔａｋｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８５：３４７。そ
して多数の他のアッセイが当該分野で公知である。
【０２１４】 キナーゼ活性化。キナーゼ活性化のためのアッセイは、Ｙｅｎら、Ｊ．Ｌｅｕ
ｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）６１：５２９；Ｄｕｂｏｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．（１９９６）１５６：１３５６；Ｔｕｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．（１９９５）１５５：２４３７により記載される。新脈管形成または細胞増殖
の阻害のためのアッセイは、Ｍａｉｏｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４
７：７７に記載される。グリコサミノグルカン産生は、天然のケモカインにより
誘導され得、Ｃａｓｔｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）（１９８３）８０：７６５に記載のようにアッセイされる。好塩基球からの
ケモカイン媒介性ヒスタミン放出は、Ｄａｈｉｎｄｅｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ
．（１９８９）１７０：１７８７；およびＷｈｉｔｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅ
ｔｔ．（１９８９）２２：１５１に記載されたようにアッセイされる。ヘパリン
結合は、Ｌｕｓｔｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１８２：２１９に
記載される。
【０２１５】 （二量体化活性） ケモカインは、二量体化活性を有し得る。これは、Ｂｕｒｒｏｗｓら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．（１９９４）３３：１２７４１；およびＺｈａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９５）１５：４８５１に従ってアッセイされ得る。天然
のケモカインは、ウイルスの炎症性応答において役割を果たし得る。この活性は
、Ｂｌｅｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８２：８２９；およびＯｂｅｒｌ
ｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８２：８３３に記載されるようにアッセイ
され得る。単球のエキソサイトーシスは、天然のケモカインによって促進され得
る。このような活性についてのアッセイは、Ｕｇｕｃｃｉｏｎｉら、Ｅｕｒ．Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）２５：６４に記載される。天然のケモカインは
また、造血幹細胞の増殖を阻害し得る。このような活性を試験するための方法は
、Ｇｒａｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４４：４４２に報告されている
。
【０２１６】 （細胞死誘導領域（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質） いくつかのタンパク質ファミリーは、細胞死誘導領域モチーフを含む（Ｆｅｉ
ｎｓｔｅｉｎおよびＫｉｍｃｈｉ、ＴＩＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９５）２０
：２４２−２４４）。いくつかの細胞死誘導領域を含有するタンパク質は、細胞
傷害性の細胞内シグナル伝達に関与する（ＣｌｅｖｅｌａｎｄおよびＩｈｌｅ、
Ｃｅｌｌ（１９９５）８１：４７９−４８２、Ｐａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９
９７）２７６：１１１−１１３、ＤｕａｎおよびＤｉｘｉｔ、Ｎａｔｕｒｅ（１
９９７）３８５：８６−８９、ならびにＣｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ（１９９６）２７４：９９０−９９２）。米国特許第５，５６３，０３９号は
、ＴＲＡＤＤ（腫瘍壊死因子レセプター−１関連細胞死誘導領域含有タンパク質
）に対して相同であるタンパク質、およびそのタンパク質の機能的な特徴を保持
しているＴＲＡＤＤの活性なドメインの改変、ならびにこのような細胞死誘導領
域を含有するタンパク質の機能を試験するためのアポトーシスアッセイを記載し
ている。米国特許第５，６５８，８８３号は、生物学的に活性なＴＧＦ−Ｂ１ペ
プチドを開示している。米国特許第５，６７４，７３４号は、Ｃ末端の細胞死誘
導領域およびＮ末端のキナーゼドメインを含むタンパク質ＲＩＰを開示している
。
【０２１７】 （白血病阻害因子（ＬＩＦ）） ＬＩＦプロフィールは、白血病阻害因子ＣＴ−１（カルジオトロピン−１）、
ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、ＯＳＭ（オンコスタチンＭ）、およびＩＬ−
６（インターロイキン−６）の配列から構築される。このプロフィールは、肝細
胞、破骨細胞、ニューロン細胞、および心筋細胞を含む多くの細胞型に対して多
面発現性効果を有する、分泌されたサイトカインのファミリーを含み、そしてこ
のようなタンパク質をコードするさらなる遺伝子を検出するために使用され得る
。これらの分子は、全て構造的に関連し、そして細胞質性のチロシンキナーゼ（
例えばｓｒｃ）による細胞内シグナル伝達を媒介する共通のコレセプター（ｃｏ
−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ｇｐ１３０を共有する。
【０２１８】 このファミリーに関連する新規のタンパク質もまた、分泌され、ｇｐ１３０を
活性化し、そして種々の細胞型の発生において機能的であるようである。従って
、このファミリーの新規のメンバーは、これらが刺激する細胞型についての増殖
または生存の因子として発生する候補である。サイトカインのこのファミリーに
ついてのさらなる詳細については、Ｐｅｎｎｉｃａら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎ
ｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９６）７：８１−９１
を参照のこと。米国特許第５，４２０，２４７号は、ＬＩＦレセプターおよび融
合タンパク質を開示している。米国特許第５，４４３，８２５号は、ヒトＬＩＦ
を開示している。
【０２１９】 （アンジオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）） アンジオポエチン−１は、ＴＩＥ−２チロシンキナーゼの分泌リガンドである
；これは、正常な血管の発達に重要な血管新生因子として機能する。アンジオポ
エチン−２は、アンジオポエチン−１の天然のアンタゴニストであり、従って、
抗血管新生因子として機能する。これらの２つのタンパク質は構造的に類似して
おり、そして同じレセプターを活性化する。（ＦｏｌｋｍａｎおよびＤ’Ａｍｏ
ｒｅ、Ｃｅｌｌ（１９９６）８７：１１５３−１１５５、ならびにＤａｖｉｓら
、Ｃｅｌｌ（１９９６）８７：１１６１−１１６９）。
【０２２０】 アンジオポエチン分子は、２つのドメイン（コイルド−コイル領域およびフィ
ブリノーゲンに関連する領域）から構成される。フィブリノーゲンドメインは、
フィコリンおよびテサスチンを含む多くの分子中に見出され、そして多くのメン
バーによって構造的に十分に規定されている。
【０２２１】 （レセプタータンパク質−チロシンキナーゼ） レセプタータンパク質−チロシンキナーゼまたはＲＰＴＫは、Ｌｉｎｄｂｅｒ
ｇ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９４）１０：２５１−３３
７に記載されている。
【０２２２】 （増殖因子：上皮増殖因子（ＥＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）） 増殖因子のスーパーファミリーの考察については、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏ
ｒｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ａ１（
ＭｃＫａｙおよびＬｅｉｇｈ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅ
ｓｓ、ＮＹ、１９９３）、２３７−２４３頁を参照のこと。
【０２２３】 ＥＧＦおよびＦＧＦのアラインメント（プリティーボックス（ｐｒｅｔｔｙ
ｂｏｘ））は、それぞれ、図１および図２に示される。米国特許第４，４４４，
７６０号は、酸性の脳の線維芽細胞増殖因子を開示している。これは、細胞分裂
および創傷の治癒の促進において活性である。米国特許第５，４３９，８１８号
は、ヒトの組換え塩基性線維芽細胞増殖因子をコードするＤＮＡを開示する。こ
れは、創傷の治癒において活性である。米国特許第５，６０４，２９３号は、組
換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を開示している。これは、創傷の治癒におい
て有用である。米国特許第５，４１０，８３２号は、脳由来および組換えの酸性
の繊維芽細胞増殖因子を開示している。これは、培養物中で、中胚葉および神経
外胚葉に由来する細胞についてマイトジェンとして作用し、そして柔組織、軟骨
組織、および筋骨格組織中での創傷の治癒を促進する。米国特許第５，３８７，
６７３号は、活性を保持しているＦＧＦの生物学的に活性なフラグメントを開示
している。
【０２２４】 （ＴＮＦファミリーのタンパク質） ＴＮＦファミリーに由来するプロフィールは、以下のＴＮＦファミリーのメン
バーの配列をアラインメントすることによって作製される：神経成長因子（ＮＧ
Ｆ）、リンホトキシン、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＤ４０リ
ガンド、ＴＲＡＩＬ、ｏｘ４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、ＣＤ２７リガン
ド、およびＣＤ３０リガンド。プロフィールは、タンパク質のこのファミリーの
新規のメンバーまたはホモログを構成するタンパク質の配列を同定するように設
計される。
【０２２５】 米国特許第５，６０６，０２３号は、変異体ＴＮＦタンパク質を開示する；米
国特許第５，５９７，８９９号および米国特許第５，４８６，４６３号は、ＴＮ
Ｆ変異体を開示する；そして米国特許第５，６５２，３５３号は、ＴＮＦα変異
体をコードするＤＮＡを開示する。
【０２２６】 タンパク質のＴＮＦファミリーのメンバーは、Ｂｕｒｒｏｗｓら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．（１９９４）３３：１２７４１およびＺｈａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．（１９９５）１５４８５１に記載されるように、多量体化すること、
およびＢｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１４７：１２３
０、Ａｎｄｒｏｌｅｗｉｃｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７
：２５４２およびＣｒｏｗｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６４：７０７に
記載されるようにレセプターに結合することが、インビトロで示されている。
【０２２７】 インビボでは、ＴＮＦは、Ｋｒｉｅｇｅｌら、Ｃｅｌｌ（１９８８）５３：４
５およびＭｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７０：２１８に記載され
ているように標的タンパク質をタンパク質分解的に切断し、そして細胞の増殖お
よび分化活性を示す。Ｔ細胞または胸腺細胞の増殖は、Ａｒｍｉｔａｇｅら、Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）２２：４４７；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、
３．１−３．１９；Ｔａｋａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８６）１３７：
３４９４−３５００、Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｉら、Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９
０）１４５：１７０６−１７１２、Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．（１９９１）１３３：３２７−３４０、Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｉら、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．（１９９２）１４９：３７７８−３７８３、およびＢｏｗｍａｎら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２：１７５６−１７６１に記載される
ようにアッセイされる。Ｂ細胞の増殖およびＩｇの分泌は、Ｍａｌｉｓｚｅｗｓ
ｋｉ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９０）１４４：３０２８−３０３３、および
Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＭｏｎｄおよびＢｒｕｎｓｗｉｃｋ
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｃｏｌｉｇ
ａｎ編、第１巻、３．８．１−３．８．１６頁、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９４、Ｋｅｈｒｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９
８７）２３８：１１４４ならびにＢｏｕｓｓｉｏｔｉｓら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ（
１９９４）９１：７００７に記載されるようにアッセイされる。
【０２２８】 他のインビボでの活性として、Ｂａｒｒｅｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１
９９１）１４６：１７２２；Ｂｊｏｒｃｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（
１９９３）２３：１７７１；Ｃｌａｒｋら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．（１９９１）９：９７；Ｒａｎｈｅｉｍら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４
）１７７：９２５；Ｙｅｌｌｉｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５３：
６６６；およびＧｒｕｓｓら、Ｂｌｏｏｄ（１９９４）８４：２３０５に記載さ
れるような、細胞の表面抗原のアップレギュレーション、同時刺激分子のアップ
レギュレーション、および細胞性の凝集／接着が挙げられる。
【０２２９】 造血細胞およびリンパ球造成細胞の増殖および分化はまた、Ｊｏｈａｎｓｓｏ
ｎら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）１５：１４１−１５１、
Ｋｅｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９３）１３：４７３−４
８６、ＭｃＣｌａｎａｈａｎら、Ｂｌｏｏｄ（１９９３）８１：２９０３−２９
１５に記載されるような胚の分化および造血についてのアッセイを使用して、そ
してＣｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ，Ｆｒｅ
ｓｈｎｅｙら編、１−２１頁、２３−２９頁、１３９−１６２頁、１６３−１７
９頁、および２６５−２６８頁、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，ＮＹ，１９９４およびＨｉｒａｊａｍａら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９９
２）８９：５９０７−５９１１に記載されているような幹細胞の生存および分化
を検出するためのアッセイを使用して、ＴＮＦについてインビボで示されている
。
【０２３０】 ＴＮＦのインビボでの活性としてまた、リンパ球の生存およびアポトーシスが
挙げられ、これらは、Ｄａｒｚｙｎｋｅｗｉｃｚら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（１９
９２）１３：７９５−８０８；Ｇｏｒｃｚｃａら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ（１９９３
）７：６５９−６７０；Ｉｔｏｈら、Ｃｅｌｌ（１９９１）６６：２３３−２４
３；Ｚａｃｈａｒｄｕｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９０）１４５：４０３７
−４０４５；Ｚａｍａｉら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（１９９３）１４：８９１−８
９７；およびＧｏｒｃｚｙｃａら、Ｉｎｔ’ｌ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．（１９９２）
１：６３９−６４８に記載されるようにアッセイされる。
【０２３１】 ＴＮＦファミリーのいくつかのメンバーは、細胞表面から切除される；他のメ
ンバーは、膜に結合したままである。ＴＮＦの三次元構造は、Ｓｐｒａｎｇおよ
びＥｃｋ、Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒｓ；前出において議論
されている。
【０２３２】 ＴＮＦタンパク質は膜貫通ドメインを含む。タンパク質は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ
ら、Ｃｅｌｌ（１９８８）５３：４５−５３、Ｐｅｒｅｚら、Ｃｅｌｌ（１９９
０）６３：２５１−２５８、およびＳｈａｗら、Ｃｅｌｌ（１９８６）４６：６
５９−６６７に記載されているような、より短い可溶性のバージョンに切断され
る。ヒトのＴＮＦαの形態については、膜貫通ドメインはアミノ酸４６と７７と
の間であり、そして細胞質ドメインは１位と４５位の間である。ＴＮＦの三次元
モチーフは、２つのプリーツ状のβシートのサンドイッチを含む。それぞれのシ
ートは、逆平行なα鎖から構成される。Ｖａｎ Ｏｓｔａｄｅら、Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９４）７（１）：５−２２およびＳｐｒａｎ
ｇら、Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒｓ；前出に記載されるよう
に、サンドイッチの反対側に対して互いに向かい合うα鎖は、短いポリペプチド
ループによって連結される。
【０２３３】 βシートの二次構造中に含まれるＴＮＦファミリーのタンパク質の残基は、Ｖ
ａｎ Ｏｓｔａｄｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９４）
７（１）：５−２２、およびＳｐｒａｎｇら、Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ
Ｆａｃｔｏｒｓ；前出に記載されるように同定されている。
【０２３４】 ＴＮＦレセプターは、米国特許第５，３９５，７６０号に開示されている。Ｔ
ＮＦレセプターファミリーに由来するプロフィールは、Ａｐｏ１／Ｆａｓ、ＴＮ
ＦＲ ＩおよびＩＩ、細胞死レセプター（ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）３（
ＤＲ３）、ＣＤ４０，ｏｘ４０、ＣＤ２７、およびＣＤ３０を含むＴＮＦレセプ
ターファミリーの配列をアラインメントすることによって作製される。従って、
プロフィールは、本発明の核酸から、タンパク質のこのファミリーの新規のメン
バーまたはホモログを構成するタンパク質の配列を同定するように設計される。
【０２３５】 腫瘍壊死因子レセプターは、ヒトにおいては２つの形態で存在する：ｐ５５
ＴＮＦＲおよびｐ７５ ＴＮＦＲ（これらの両方ともが、リガンドとの結合の際
に細胞内シグナルを提供する）。これらのレセプタータンパク質の細胞外ドメイ
ンは、システインリッチである。これらのレセプターは、膜に結合したままであ
り得るが、いくつかの形態のレセプターは切断されて可溶性のレセプターを形成
する。可溶性のＴＮＦレセプターの調節、診断、予後、および治療の価値は、Ａ
ｄｅｒｋａ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ，（１９９６）７（３）：２３１−２４０に議論されている。
【０２３６】 （ＰＤＧＦファミリー） 米国特許第５，３２６，６９５号は、血小板に由来する増殖因子アゴニストを
開示している；ＰＤＧＦ−Ｂの生物活性部分が、アゴニストとして使用される。
米国特許第４，８４５，０７５号は、生物学的に活性なＢ鎖ホモ二量体を開示し
、そして、これは、またＰＤＧＦ−Ｂ鎖の改変体および誘導体を含む。米国特許
第５，１２８，３２１号は、ＰＤＧＦアナログおよびその使用方法を開示してい
る。ＰＤＧＦと同じ生物活性を有するタンパク質（Ａ鎖タンパク質およびＢ鎖タ
ンパク質を含む）が開示されている。
【０２３７】 （キナーゼ（ＭＫＫを含む）ファミリー） 米国特許第５，６５０，５０１号は、有糸分裂および減数分裂の細胞分裂に関
するセリン／トレオニンキナーゼを開示している；このタンパク質は、そのＮ末
端にキナーゼドメインを、そしてＣ末端に３ ＰＥＳＴ領域を有する。米国特許
第５，６０５，８２５号は、セリンプロテインキナーゼである、ヒトのＰＡＫ６
５を開示する。
【０２３８】 上記の議論は、本発明の核酸と比較され得るタンパク質プロフィールのいくつ
かの例を提供する。当業者は、この核酸と相関する遺伝子を同定するために、こ
れらおよび他のタンパク質プロフィールを使用し得る。
【０２３９】 （ＩＸ．コードされる発現産物の機能の決定） リボザイム、アンチセンス構築物、優性ネガティブ変異体、および三重鎖の形
成が、核酸に関連する遺伝子の発現産物の機能を決定するために使用され得る。
【０２４０】 （Ａ．リボザイム） トランス切断触媒性ＲＮＡ（リボザイム）は、エンドリボヌクレアーゼ活性を
有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、特定の標的に対して特異的に設計され
、そして標的メッセージは、特異的なヌクレオチド配列を含まなければならない
。これらは、細胞性ＲＮＡのバックグラウンドにおいて部位特異的に任意のＲＮ
Ａ種を切断するように操作される。切断事象は、ｍＲＮＡを不安定にし、そして
タンパク質の発現を妨げる。重要なことに、リボザイムは、表現型に対する影響
を検出することによって、インビトロまたはインビボの状況においてその機能を
決定する目的のために、未知の機能の遺伝子の発現を阻害するために使用され得
る。
【０２４１】 １つの共通して使用されるリボザイムのモチーフは、ハンマーヘッド型である
。これについての基質配列の要求性は最小である。ハンマーヘッド型リボザイム
の設計は、Ｕｓｍａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ
．（１９９６）６：５２７−５３３に開示されている。Ｕｓｍａｎらはまた、リ
ボザイムの治療的な使用も議論している。リボザイムはまた、Ｌｏｎｇら、ＦＡ
ＳＥＢ Ｊ．（１９９３）７：２５；Ｓｙｍｏｎｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．（１９９２）６１：６４１；Ｐｅｒｒｏｔｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（
１９９２）３１：１６−１７；Ｏｊｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９９２）８９：１０８０２−１０８０６；および米国
特許第５，２５４，６７８号に記載されるように調製されそして使用され得る。
ＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡのリボザイムの切断は、米国特許第５，１４４，０１９号に
記載される；リボザイムを使用してＲＮＡを切断する方法は、米国特許第５，１
１６，７４２号に記載される；ならびに、リボザイムの特異性を増大させるため
の方法は、米国特許第５，２２５，３３７号およびＫｏｉｚｕｍｉら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７：７０５９−７０７１に記載さ
れる。ハンマーヘッド型構造のリボザイムのフラグメントの調製および使用はま
た、Ｋｏｉｚｕｍｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１
７：７０５９−７０７１に記載される。ヘアピン構造のリボザイムフラグメント
の調製および使用は、ＣｈｏｗｒｉｒａおよびＢｕｒｋｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９２）２０：２８３５によって記載される。リボザイ
ムはまた、ＤａｕｂｅｎｄｉｅｋおよびＫｏｏｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．（１９９７）１５（３）：２７３−２７７に記載されているようにローリン
グ型転写（ｒｏｌｌｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）によって作製され得
る。
【０２４２】 リボザイムのハイブリダイズする領域は、ＨｏｒｎおよびＵｒｄｅａ、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７：６９５９−６７に記載され
るように、分岐状構造として改変され得るかまたは調製され得る。リボザイムの
基本構造もまた、当業者に精通した方法において化学的に変更され得、そして化
学的合成されたリボザイムは、単量体ユニットによって改変された合成オリゴヌ
クレオチド誘導体として投与され得る。治療の状況においては、リポソームに媒
介されるリボザイムの送達は、Ｂｉｒｉｋｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
（１９９７）２４５：１〜１６において記載されているように、細胞性の取り込
みを改善する。
【０２４３】 本発明の核酸配列および当該分野で公知の方法を使用して、リボザイムは、対
応するｍＲＮＡ種に特異的に結合し、そしてそれを切断するように設計される。
従って、リボザイムは、開示される核酸またはそれらの全長の遺伝子によってコ
ードされる任意のタンパク質の発現を阻害するための手段を提供する。特異的な
阻害性リボザイムを設計および使用するために、全長の遺伝子が既知である必要
はない。未知の機能の核酸またはｃＤＮＡの場合においては、そのヌクレオチド
配列に対応するリボザイムは、標的転写物を切断することにおける効力について
インビトロで試験され得る。インビトロで切断をもたらすこれらのリボザイムは
、インビボでさらに試験される。リボザイムはまた、Ｂｉｒｉｋｈら、Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４５：１〜１６に記載されるように、疾患
の動物モデルを作製するためにも使用され得る。有効なリボザイムは、目的の遺
伝子の機能を、その転写をブロックし、そして細胞中での変化を検出することに
より決定するために使用される。遺伝子が疾患において媒介因子であることが見
出されている場合には、遺伝子の転写および発現をブロックするための遺伝子治
療において、有効なリボザイムが設計されそして送達される。
【０２４４】 リボザイムの治療的および機能的なゲノムの適用は、阻害されるべき遺伝子の
コード配列の一部の知見を用いて開始される。従って、多くの遺伝子について、
部分的な核酸配列は、有効なリボザイムを構築するための十分な配列を提供する
。標的切断部位は、標的配列中で選択され、そしてリボザイムは、切断部位に隣
接する５’および３’ヌクレオチド配列に基づいて構築される。レトロウイルス
ベクターは、標的コード配列のｍＲＮＡを標的化する単量体および多量体のハン
マーヘッド型リボザイムを発現するように操作される。これらの単量体および多
量体のリボザイムは、標的ｍＲＮＡを切断する能力についてインビトロで試験さ
れる。細胞株は、リボザイムを発現するレトロウイルスベクターで安定に形質導
入される。そしてこの形質導入は、ノーザンブロット分析および逆転写ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって確認される。細胞は、疾患マーカーの発
現の低下または標的ｍＲＮＡの遺伝子産物の減少のような指標によって、標的ｍ
ＲＮＡの不活化についてスクリーニングされる。
【０２４５】 （Ｂ．アンチセンス） アンチセンス核酸は、ＲＮＡに特異的に結合し、それによって、ＲＮＡ−ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの形成を生じ、ＤＮＡ複製、逆転写、また
はメッセンジャーＲＮＡの翻訳を停止させるように設計される。選択された核酸
配列に基づくアンチセンスポリヌクレオチドは、対応する遺伝子の発現を妨害し
得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、代表的には、転写された鎖としてアン
チセンス核酸鎖を含むアンチセンス構築物からの発現によって細胞中で生成され
る。アンチセンス核酸は、核酸に関連するｍＲＮＡに結合し、そして／またはそ
の翻訳を妨害する。コントロール細胞およびアンチセンス構築物で処理した細胞
の発現産物は、核酸に対応する遺伝子のタンパク質産物を検出するために比較さ
れる。タンパク質は、慣用的な生化学的方法を使用して単離されそして同定され
る。
【０２４６】 核酸に対応する遺伝子の機能を決定するためにアンチセンス方法を使用するた
めの１つの原理は、アンチセンス治療の生物学的活性である。種々の癌のための
アンチセンス治療が臨床段階にあり、そして文献において広範囲に議論されてい
る。Ｒｅｅｄは、腫瘍中のＢｃｌ−２遺伝子に関するアンチセンス治療を概説し
た；腫瘍細胞株における遺伝子移入媒介性のＢｃｌ−２の過剰発現は、多くの型
の癌の薬物に対する耐性を付与した（Ｒｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｎ．Ｃ．Ｉ．（１９
９７）８９：９８８−９９０）。ｒａｓのアンチセンスインヒビターの臨床的な
開発の可能性が、Ｃｏｗｓｅｒｔ，Ｌ．Ｍ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕ
ｇ Ｄｅｓｉｇｎ（１９９７）１２：３５９〜３７１によって議論されている。
さらに重要なアンチセンス標的としては、白血病（Ｇｅｕｒｔｚ，Ａ．Ｍ．，Ａ
ｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（１９９７）１２：３４１〜３
５８）；ヒトのＣ−ｒｅｆキナーゼ（Ｍｏｎｉａ，Ｂ．Ｐ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（１９９７）１２：３２７〜３３９）；および
プロテインキナーゼＣ（ＭｃＧｒａｗら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｓｉｇｎ（１９９７）１２：３１５〜３２６）が挙げられる。
【０２４７】 アンチセンス治療において広範な背景となる文献および臨床実験が提供される
ので、当業者は、本発明の選択された核酸をさらなる可能性のある治療薬として
使用し得る。核酸の選択は、癌性細胞のゲノムの「ホットスポット」領域に結合
することについてそれらを最初に試験することによって限定され得る。「ホット
スポット」に結合するとして核酸を同定すると、その核酸を、対応する癌細胞中
でアンチセンス化合物として試験することは明らかに保証される。
【０２４８】 Ｏｇｕｎｂｉｙｉら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（１９９７）１１３
（３）：７６１〜７６６は、結腸癌における対立遺伝子の欠失の予後的な使用を
記載する；Ｂａｒｋｓら、Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ，ａｎｄ Ｃａ
ｎｃｅｒ（１９９７）１９（４）：２７８〜２８５は、悪性の黒色腫においてＦ
ＩＳＨによって検出される染色体コピー数の増大を記載する；Ｎｉｓｉｚａｋｅ
ら、Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ，ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ（１９９７）
１９（４）：２６７〜２７２は、原発性乳癌およびそれらの転移における遺伝的
な変化、ならびに改変された競合的ゲノムハイブリダイゼーションを使用する直
接的な比較を記載する；そしてＥｌｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１
９９７）５７（１６）：３３５６〜３３５９は、１６ｚ２４．１−ｑ２４．２で
のヘテロ接合性の喪失が、前立腺癌の転移性および攻撃的挙動に有意に関連する
ことを開示する。
【０２４９】 （Ｃ．ドミナントネガティブ変異） 核酸関連遺伝子の機能を同定するための代替的な方法として、ドミナントネガ
ティブ変異体が、ホモ多量体として活性である対応するタンパク質について容易
に生成される。変異体ポリペプチドは、野生型ポリペプチド（他の対立遺伝子か
ら作製される）と相互作用し、そして機能的ではない多量体を形成する。従って
、変異は、基質結合ドメイン、触媒ドメイン、または細胞局在化ドメイン中であ
る。好ましくは、変異体ポリペプチドは、過剰産生される。このような影響を有
する点変異が作製される。さらに、種々の長さの種々のポリペプチドのタンパク
質末端への融合は、ドミナントネガティブ変異体を生じ得る。ドミナントネガテ
ィブ変異体を作製するための一般的なストラテジーが、利用可能である。Ｈｅｒ
ｓｋｏｗｉｔｚ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２９：２１９〜２２２を参照のこ
と。このような技術は、機能を喪失する変異体を作製するために使用され得る。
これは、タンパク質の機能を決定するために有用である。
【０２５０】 （Ｄ．三重鎖の形成） 内因性遺伝子の発現はまた、標的化された相同組換えを使用して、遺伝子また
はそのプロモーターを不活化または「ノックアウト」することによって減少させ
られ得る。（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：
２３０〜２３４；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７、Ｃｅｌｌ
５１：５０３〜５１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８９ Ｃｅｌｌ ５：３１３
〜３２１を参照のこと；これらのそれぞれが本明細書中でその全体が参照として
援用されている）。例えば、内因性遺伝子（遺伝子のコード領域または調節領域
のいずれか）に相同なＤＮＡによって隣接される機能的ではない遺伝子（または
完全に無関係なＤＮＡ配列）である変異体が、インビボでその遺伝子を発現する
細胞をトランスフェクトするために、選択マーカーおよび／または陰性選択マー
カーを伴ってまたはそれを伴わずに、使用され得る。標的化された相同組換えを
介するＤＮＡ構築物の挿入は、遺伝子の不活化を生じる。
【０２５１】 あるいは、内因性の遺伝子発現は、体内の標的細胞中の遺伝子の転写を妨げる
三重ヘリックス構造を形成するように、標的遺伝子の調節領域（すなわち、遺伝
子のプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的であるデオキシリボヌ
クレオチド配列を標的化することによって低減させられ得る。（一般には、Ｈｅ
ｌｅｎｅ，Ｃ．１９９１、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．，６（６
）：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．ら、１９９２、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．，１９９２
，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７〜１５を参照のこと）。
【０２５２】 転写の阻害のための三重ヘリックスの形成において使用されべき核酸分子は、
好ましくは、一本鎖であり、そしてデオキシリボヌクレオチドから構成される。
これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対規則によ
って三重ヘリックス形成を促進するべきであり、これは一般的には、プリンまた
はピリミジンのいずれかのかなり大きなストレッチが二重鎖の一方の鎖上に存在
することを必要とする。ヌクレオチド配列は、ピリミジンベースであり得る。こ
れは、得られる三重ヘリックスの３個の会合された鎖にまたがるＴＡＴおよびＣ
ＧＣトリプレットを生じる。ピリミジンリッチである分子は、その鎖に平行な方
向で二重鎖の中の一本鎖のプリンリッチな領域に相補的な塩基を提供する。さら
に、例えば、Ｇ残基のストレッチを含有するプリンリッチである核酸分子が、選
択され得る。これらの分子は、ＧＣ対に富むＤＮＡ二重鎖を有する三重ヘリック
スを形成する。ここでは、プリン残基の大部分が、標的化された二重鎖の中の一
本鎖上に位置し、これによって三重鎖の３本の鎖にまたがるＣＧＣトリプレット
を生じる。
【０２５３】 あるいは、三重ヘリックス形成のために標的化され得る可能性のある配列は、
いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することによって増大させられ得る
。スイッチバック分子は、５’−３’、３’−５’を変更する様式で合成され、
その結果、それらは二重鎖の第１鎖と塩基対合し、次いで他方は、プリンまたは
ピリミジンのいずれかのかなり大きなストレッチが二重鎖の一方の鎖上に存在す
ることの必要性を排除する。
【０２５４】 本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、ならびに三重ヘリッ
クス分子は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の合成について当該分野で公知の任意
の方法によって調製され得る。これらには、例えば、固相ホスホルアミダイト化
学合成のような、当該分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリ
ゴリボヌクレオチドを化学的に合成するための技術が含まれる。あるいは、ＲＮ
Ａ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよび
インビボでの転写によって生成され得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７ポリメ
ラーゼプロモーターまたはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのような、適切なＲ
ＮＡポリメラーゼプロモーターを取り込む広範な種々のベクター中に取り込まれ
得る。あるいは、使用されるプロモーターに依存してアンチセンスＲＮＡを構成
的または誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物は、細胞株中に安定に導
入され得る。
【０２５５】 さらに、核酸分子に対する種々の周知の改変が、細胞内での安定性および半減
期を増大させるための手段として導入され得る。可能性のある改変として、分子
の５’末端および／または３’末端へのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌ
クレオチドの隣接配列の付加、あるいはオリゴレオキシリボヌクレオチド骨格内
での、ホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは２’−Ｏメ
チルの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５６】 （Ｘ．診断および予後アッセイ、ならびに薬物スクリーニング方法） 本発明は、被験体が、開示されている生体マーカー（すなわち、開示されてい
る核酸マーカー（配列番号１〜５４４）および／またはそれらによってコードさ
れる結腸癌のポリペプチドマーカー）を検出することによって、所望されない細
胞増殖によって特徴付けられる疾患または状態を発症する危険性があるかどうか
を決定するための方法を提供する。
【０２５７】 臨床的な適用においては、ヒトの組織サンプルが、本明細書中で同定された生
体マーカーの存在および／または非存在についてスクリーニングされ得る。この
ようなサンプルは、針での生検のコア、外科的な切除サンプル、リンパ節組織、
または血清からなり得る。例えば、これらの方法は、生検を得ることを包含し、
これは必要に応じて、全細胞の集団の約８０％まで腫瘍細胞を富化するように区
分する低温槽によって分画される。特定の実施態様においては、これらのサンプ
ルから抽出された核酸は、当該分野で周知の技術を使用して増幅され得る。検出
される選択マーカーのレベルは、転移性、非転移性、悪性、良性、または正常な
結腸組織サンプルの統計的に有効な群と比較される。
【０２５８】 １つの実施態様においては、診断方法は、被験体が、開示されるマーカーの異
常なｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを有するかどうかを、例えば、ノ
ーザンブロット分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、インサイ
チュハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウェスタンブロットハイブリダイゼー
ション、または免疫組織化学によって決定することを包含する。この方法に従っ
て、細胞は被験体から得られ、そして開示される生体マーカーのレベル、タンパ
ク質、またはｍＲＮＡのレベルが、決定され、そして健常な被験体中のこれらの
マーカーのレベルと比較される。生体マーカーポリペプチドまたはｍＲＮＡレベ
ルの異常なレベルは、おそらく、結腸癌のような癌の指標である。
【０２５９】 従って、１つの局面においては、本発明は、本明細書中で開示される特有の核
酸マーカーに特異的であるプローブおよびプライマーを提供する。従って、核酸
プローブは、マーカー核酸配列（この核酸配列は、配列番号１〜５４４によって
示されるか、またはそれらに相補的である配列である）のコード配列の一部に対
して相補的である、コード配列の、少なくとも１２個のヌクレオチドの長さ、好
ましくは、少なくとも１５個のヌクレオチド、より好ましくは、２５個のヌクレ
オチド、そして最も好ましくは、少なくとも４０個のヌクレオチドから、全長ま
たはほぼ全長までであるヌクレオチド配列を含む。
【０２６０】 １つの実施態様においては、この方法は、患者に由来する組織中の癌性の細胞
の存在を決定するための核酸プローブを使用する工程を包含する。詳細には、こ
の方法は以下の工程を包含する： １．コード配列（配列番号１〜５４４によって示される核酸配列またはそれら
に相補的である配列のコード配列の一部に対して相補的である）の、少なくとも
１２個のヌクレオチドの長さ、好ましくは、少なくとも１５個のヌクレオチド、
より好ましくは、２５個のヌクレオチド、そして最も好ましくは、少なくとも４
０個のヌクレオチドから、全長またはほぼ全長までであるヌクレオチド配列を含
み、そして腫瘍細胞（例えば、結腸癌細胞）中で示差的に発現される、核酸プロ
ーブを提供する工程； ２．癌性の細胞を含有する可能性のある患者から組織サンプルを得る工程： ３．実質的にその全てが非癌性である細胞を含有する第２の組織サンプルを提
供する工程； ４．核酸プローブを、（例えば、ノーザンブロットまたはインサイチュハイブ
リダイゼーションアッセイにおいて）上記の第１および第２の組織サンプルのそ
れぞれのＲＮＡとスリンジェントな条件下で接触させる工程；ならびに ５．（ａ）第１の組織サンプルのＲＮＡとのプローブのハイブリダイゼーショ
ンの量を、（ｂ）第２の組織サンプルのＲＮＡとのプローブのハイブリダイゼー
ションの量と比較する工程； ここで、第２の組織サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比較
した場合の、第１の組織サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量にお
ける統計学的に有意な差異は、第１の組織サンプル中の癌性の細胞の存在を示す
。
【０２６１】 １つの局面においては、この方法は、所定のマーカー核酸配列から誘導される
プローブとのインサイチュハイブリダイゼーションを包含する。ここでは、核酸
配列は、配列番号１〜５４４によって示されるかまたはそれらに相補的な配列で
ある。この方法は、癌性の細胞または前癌性の細胞を含有する可能性がある所定
の型の組織のサンプル、および正常な細胞と、標識されたハイブリダイゼーショ
ンプローブとを接触させる工程、ならびに、プローブが、それが同じ組織型の他
の細胞を標識する程度とは（例えば、少なくとも２倍、または少なくとも５倍、
または少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍）有意に異なる程度に所定の
組織型のいくつかの細胞を標識するかどうかを決定する工程を、包含する。
【０２６２】 所定のヒト組織に由来する試験細胞の表現型を決定する方法（例えば、細胞が
（ａ）正常であるか（ｂ）または癌性もしくは前癌性であるかどうか）もまた、
本発明に含まれる。この方法は、配列番号１〜５４４によって示される核酸配列
のコード配列の一部、またはそれらに相補的である配列に対して相補的である配
列の、少なくとも１２個のヌクレオチドの長さ、好ましくは、少なくとも１５個
のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチド、そして最
も好ましくは、少なくとも４０個のヌクレオチドから、全長またはほぼ全長まで
であり、そして所定の組織型の正常な細胞と比較した場合に腫瘍細胞中で示差的
に発現される核酸プローブと、試験細胞のｍＲＮＡとを接触させる工程；ならび
に、試験細胞が癌性または前癌性であるという指標である、その組織型の正常な
細胞のｍＲＮＡを用いて見られるよりも多いかまたはそれよりも少ないかのいず
れかであるハイブリダイゼーションの量である、ｍＲＮＡに対するプローブのハ
イブリダイゼーションのおおよその量を決定する工程による。
【０２６３】 あるいは、上記の診断アッセイは、マーカーの核酸配列（この核酸配列は、配
列番号１〜５４４によって示されるか，またはそれらに相補的な配列である）に
よってコードされるタンパク質産物を検出するために、抗体を使用して行われ得
る。従って、１つの実施態様においては、アッセイは、配列番号１〜５４４また
はそれらに相補的な配列によって示される核酸（マーカー核酸は、試験細胞と同
じ組織型の正常な細胞中での所定のコントロールレベルで発現されるものである
）の遺伝子産物に特異的である抗体と試験細胞のタンパク質とを接触させる工程
、ならびに、試験細胞の抗体およびタンパク質による免疫複合体の形成のおよそ
の量を決定する工程を包含する。ここで、同じ組織型の正常な細胞と比較して試
験細胞のタンパク質とともに形成される免疫複合体の量における統計的に有意な
差異が、試験細胞が癌性または前癌性であることの指標である。
【０２６４】 別のこのような方法は、以下の工程を包含する：配列番号１〜５４４によって
示されるマーカー核酸配列の遺伝子産物、所定の組織型（例えば、結腸組織）の
癌性の組織中に、同じ組織型の非癌性の組織中の遺伝子産物のレベルよりも高い
かまたはそれよりも低いレベルで存在する遺伝子残物に特異的な抗体を提供する
工程、所定の組織型の組織の第１のサンプル（このサンプルは、癌性の細胞を含
む可能性がある）を患者から得る工程；同じ組織型（これは、同じ患者に由来し
得るか、または正常なコントロール（例えば、別の個体または培養細胞）に由来
し得る）の組織の第２のサンプル（この第２のサンプルは、正常な細胞を含有し
本質的に癌性細胞を含有しない）を提供する工程；サンプル中に存在する抗体と
マーカー核酸配列の産物との間での免疫複合体の形成を可能にする条件下で第１
および第２のサンプルのタンパク質（これは、溶解されているが未分画の細胞に
おいてか、またはインサイチュでにおいて、部分的に精製され得る）と抗体とを
接触させる工程；ならびに、（ａ）第１のサンプル中での免疫複合体の形成の量
と、（ｂ）第２のサンプル中での免疫複合体の形成の量とを比較する工程。ここ
で、第２のサンプル中での免疫複合体の形成の量と比較した場合の、より少ない
第１のサンプル中での免疫複合体の形成の量における統計学的に有意な差異は、
第１の組織サンプル中の癌性の細胞の存在を示す。
【０２６５】 本発明はさらに、被験体から得られた細胞サンプルが、異常な量のマーカーポ
リペプチドを有するかどうかを決定する方法を提供する。この方法は、以下の工
程を包含する：（ａ）被験体から細胞のサンプルを得る工程、（ｂ）そのように
して得られたサンプル中のマーカーポリペプチドの量を定量的に決定する工程、
および（ｃ）既知の標準でそのように決定されたマーカーポリペプチドの量と比
較し、その結果、それによって、被験体から得られた細胞のサンプルが異常な量
のマーカーポリペプチドを有するかどうかを決定する工程。このようなマーカー
ポリペプチドは、免疫組織化学アッセイ、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ
などによって検出され得る。
【０２６６】 イムノアッセイは、一般的には、細胞のサンプル中のタンパク質のレベルを定
量するために使用され、そして多くの他のイムノアッセイ技術が当該分野で公知
である。本発明は、特定のアッセイ手順には限定されず、従って、同種および異
種の手順の両方を含むように意図される。本発明に従って行われ得る例示的なイ
ムノアッセイとして、蛍光局在化イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノアッ
セイ（ＦＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、比濁阻害イムノアッセイ（Ｎ
ＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセ
イ（ＲＩＡ）が挙げられる。指標部分または標識基は、本発明の抗体に付着させ
られ得、そしてアッセイ等価物および匹敵するイムノアッセイ手順の利用可能性
によってしばしば示される方法の種々の使用の用件を満たすように選択される。
上記の種々のイムノアッセイを実行することにおいて使用される一般的な技術は
、当業者に公知である。
【０２６７】 別の実施態様においては、患者の生物学的な液体（例えば、血液または尿）中
のコードされる産物（すなわち、配列番号１〜５４４またはそれに相補的な配列
によってコードされる産物）のレベルは、その患者の細胞中のマーカー核酸配列
の発現のレベルをモニターする方法として決定され得る。このような方法は、患
者から生物学的な液体のサンプルを得る工程、コードされるマーカーポリペプチ
ドに特異的な抗体とサンプル（またはサンプルに由来するタンパク質）とを接触
させる工程、および抗体による免疫複合体の形成の量を決定する工程を包含する
。ここで、免疫複合体の形成の量は、サンプル中のマーカーによってコードされ
る産物のレベルの指標である。この決定は、正常な個体から採取されたコントロ
ールサンプル中、または同じヒトから以前にもしくは続いて得られた１つ以上の
サンプル中の同じ抗体による免疫複合体の形成の量と比較した場合に、特に有用
である。
【０２６８】 別の実施態様においては、この方法は、細胞中に存在するマーカーポリペプチ
ドの量を決定するために使用され得る。これは次いで、過剰増殖性の障害（例え
ば、結腸癌）の進行と相関し得る。マーカーポリペプチドのレベルは、細胞のサ
ンプルが、形質転換された細胞であるかまたは形質転換された細胞となる素因を
有する細胞を含有するかどうかを評価するために、予測的に使用され得る。さら
に、本発明の方法は、形質転換されることが既知である細胞の表現型を評価する
ために使用され得る。表現型の決定は、特定の治療レジメを計画することにおい
て有用である。例えば、サンプル細胞中の非常に高いレベルのマーカーポリペプ
チドは、結腸癌のような癌の強力な診断および予後のマーカーである。マーカー
ポリペプチドレベルの観察は、例えば、より積極的な治療の使用に関する決定に
利用され得る。
【０２６９】 上記に示すように、本発明の１つの局面は、患者から単離された細胞の状況に
おいては、マーカーポリプチドのレベルがサンプル細胞中で有意に減少させられ
ているかどうかを決定するための診断アッセイに関する。用語「有意に低下させ
られた」は、細胞が類似の組織起源の正常な細胞と比較してマーカーポリペプチ
ドの減少した細胞性の量を有する細胞の表現型をいう。例えば、細胞は、正常な
コントロール細胞のマーカーポリペプチドの、約５０％、２５％、１０％、また
は５％未満を有し得る。詳細には、アッセイは、試験細胞中のマーカーポリペプ
チドのレベルを評価する、そして好ましくは、少なくとも１つのコントロール細
胞（例えば、正常な細胞および／または既知の表現型の形質転換された細胞）中
で検出されるマーカーポリペプチドを用いて測定されるレベルを比較する。
【０２７０】 本発明に特に重要なことは、正常または異常なマーカーポリペプチドのレベル
に関連する細胞の数によって決定されるような、マーカーポリペプチドのレベル
を定量する能力である。特定のマーカーポリペプチドの表現型を有する細胞の数
は、次いで、患者の予後に関連し得る。本発明の１つの実施態様においては、病
変のマーカーポリペプチドの表現型は、マーカーポリペプチドの異常に高い／低
いレベルを有することが見出される、生検中の細胞の割合として決定される。こ
のような発現は、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＡ
などによって検出され得る。
【０２７１】 組織サンプルが使用される場合は、免疫組織化学的染色は、マーカーポリペプ
チドの表現型を有する細胞の数を決定するために試用され得る。このような染色
のためには、組織の複数のブロックが、生検または他の組織サンプルから採取さ
れ、そしてプロテアーゼＫまたはペプシンのような薬剤を使用するタンパク質分
解性の加水分解に供される。特定の実施態様においては、サンプル細胞から核の
画分を単離し、そして核の画分中のマーカーポリペプチドのレベルを検出するこ
とが所望され得る。
【０２７２】 組織サンプルは、ホルマリン、グルタルアルデヒド、メタノールなどの試薬で
の処理によって固定される。次いで、サンプルは、マーカーポリペプチドに対す
る結合特異性を有する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）とともにインキ
ュベートされる。この抗体は、続く結合の検出のための標識に結合体化させられ
得る。サンプルは、免疫複合体の形成に十分な時間インキュベートされる。次い
で、抗体の結合が、この抗体に結合体化させられた標識によって検出される。抗
体が標識されていない場合は、第２の標識された抗体（例えば、これは、抗−マ
ーカーポリペプチド抗体のイソ型に特異的である）が使用され得る。使用され得
る標識の例は、放射性核種、蛍光、化学発光、酵素などを含み得る。
【０２７３】 酵素が使用される場合は、酵素の基質は、発色または蛍光産物を提供するよう
に、サンプルに付加され得る。結合体中での使用に適切な酵素の例として、西洋
ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、マレイン酸デヒドロゲナー
ゼなどが挙げられる。市販されていない場合は、このような抗体−酵素結合体は
、当業者に公知の技術によって容易に産生される。
【０２７４】 １つの実施態様においては、アッセイは、ドットブロットアッセイとして行わ
れる。ドットブロットアッセイは、それが、細胞の予め決定された数から産生さ
れる細胞を含まない抽出物中のマーカーポリペプチドの量に相関することによっ
て単一の細胞に関連するマーカーポリペプチドの平均の量の決定が可能である場
合に、組織サンプルが使用される特定の適用を見出す。
【０２７５】 同じ型の腫瘍細胞（例えば、乳房腫瘍および／または結腸腫瘍細胞）が、個々
のオンコジーンの均一に増大させられた発現、または個々の腫瘍サプレッサー遺
伝子の均一の低下させられた発現を示し得ないが、癌の文献において十分に確立
されている。また、所定の型の癌の細胞間でもなお、所定のマーカー遺伝子の発
現のレベルが変化し得、さらに、単一の試験よりもむしろ一連の試験による必要
性を強調する。従って、１つの局面においては、本発明は、診断試験の信頼度お
よび／または正確性を改善するために、本発明の多数のプローブを利用する一連
の試験を提供する。
【０２７６】 １つの実施態様においては、本発明はまた、核酸プローブが組織化されたアレ
イでのＤＮＡチップ上に固定される方法を提供する。オリゴヌクレオチドは、種
々のプロセス（リトグラフを含む）によって固体支持体に結合させられ得る。例
えば、チップは、２５０，０００オリゴヌクレオチドまでを保持し得る（Ｇｅｎ
ｅＣｈｉｐ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）。これらの核酸プローブは、配列番号１〜
５４４によって示されるマーカー核酸配列のコード配列の一部に対して相補的で
ある、少なくとも約１２個のヌクレオチドの長さ、好ましくは、少なくとも約１
５個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約２５個のヌクレオチド、そ
して最も好ましくは、少なくとも約４０個のヌクレオチドから、全長またはほぼ
全長の配列までであるヌクレオチド配列を含み、そして腫瘍細胞（例えば、結腸
癌細胞）中で示差的に発現される。本発明は、種々の癌（例えば、結腸癌）の利
用可能な試験を超える有意な利点を提供する。なぜなら、これは、単一のチップ
上の核酸マーカーのアレイを提供することによって試験の確実性を増大させるか
らである。
【０２７７】 この方法は、生検を得る工程を包含し、これは、必要に応じて、腫瘍細胞に富
む細胞から全細胞の集団の約８０％まで腫瘍細胞を富化するように区分する低温
槽によって分画される。次いで、ＤＮＡまたはＲＮＡが、抽出され、増幅され、
そしてマーカー核酸配列の存在または非存在を決定するためにＤＮＡチップを用
いて分析される。
【０２７８】 １つの実施態様においては、核酸プローブは、２次元マトリックスまたはアレ
イ中の基質に対してスポットされる。核酸のサンプルは標識され得、次いで、プ
ローブに対してハイブリダイズさせられ得る。二本鎖の核酸（プローブ核酸に結
合した標識されたサンプル核酸を含む）は、一旦サンプルの結合していない部分
が洗い流されて検出され得る。
【０２７９】 プローブ核酸は、ガラス、ニトロセルロースなどを含む基質上にスポットされ
得る。プローブは、疎水性相互作用のような共有結合または非特異的相互作用の
いずれかによって、基質に結合され得る。サンプル核酸は、放射活性標識、蛍光
団、発色団などを使用して標識され得る。
【０２８０】 アレイを構築するための技術およびこれらのアレイを使用する方法は、ＥＰ第
０ ７９９ ８９７号；ＰＣＴ第ＷＯ ９７／２９２１２；ＰＣＴ第ＷＯ ９７
／２７３１７；ＥＰ第０ ７８５ ２８０号；ＰＣＴ第ＷＯ ９７／０２３５７
；米国特許第５，５９３，８３９号；米国特許第５，５７８，８３２号；ＥＰ第
０ ７２８ ５２０号；米国特許第５，５９９，６９５号；ＥＰ第０ ７２１
０１６号；米国特許第５，５５６，７５２号；ＰＣＴ第ＷＯ９５／２２０５８；
および米国特許第５，６３１，７３４号に記載されている。
【０２８１】 さらに、アレイは、遺伝子の異なった発現を試験するために使用され得、そし
て遺伝子機能を決定するために使用され得る。例えば、目的の核酸配列のアレイ
は、任意の核酸配列が、例えば、正常な細胞と癌細胞との間で示差的に発現され
るかどうかを決定するために使用され得る。癌細胞中での特定のメッセージの高
い発現（これは、対応する正常な細胞中では観察されない）は、癌の特異的なタ
ンパク質の指標であり得る。
【０２８２】 なお別の実施態様においては、本発明は、本発明のマーカーポリペプチドに対
して生成される抗体のパネルを使用することが意図される。ここで、ポリペプチ
ドは、配列番号１〜５４４によってコードされる。このような抗体のパネルは、
結腸癌の確実な診断プローブとして使用され得る。本発明のアッセイは、マーカ
ーポリペプチドの存在または非存在を決定するために、コードされる産物の１つ
以上に対する抗体のパネルと、生検サンプルを含む細胞（例えば、結腸細胞）と
を接触させる工程を包含する。
【０２８３】 本発明の診断方法はまた、処置の事後調査として使用され得る（例えば、マー
カーポリペプチドのレベルの定量は、現在もしくは以前に使用された癌治療の有
効性の指標、および患者の予後に対するこれらの治療の効果の指標であり得る）
。
【０２８４】 従って、本発明は、例えば、細胞の腫瘍原性の形質転換によって生じる増殖性
の障害の診断および表現型を決定することを補助するために、細胞に由来するマ
ーカーポリペプチドの獲得および／または欠失の検出のための利用可能な診断ア
ッセイおよび試薬を作製する。
【０２８５】 上記に記載される診断アッセイは、予後のアッセイとして使用されるように十
分に適合され得る。このような適合は、腫瘍の進行における特徴的な段階で行わ
れる事象に対して、本発明のアッセイの感受性の利点を利用する。例えば、所定
のマーカー遺伝子は、おそらく、細胞が悪性に進行することを可逆的に確約され
る前に、非常に初期の段階でアップレギュレートされるかまたはダウンレギュレ
ートされ得る。一方、別のマーカー遺伝子は、はるかに後期の段階でのみ、特徴
的にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされ得る。このような方法は
、腫瘍の進行の異なる段階で癌性または前癌性の細胞中での種々の特徴的なレベ
ルで発現される所定のマーカー核酸に由来する核酸プローブと、試験細胞のｍＲ
ＮＡとを接触させる工程、および細胞のｍＲＮＡに対するプローブのハイブリダ
イゼーションのおおよその量を決定する工程（このような量は、細胞中での遺伝
子の発現のレベルの指標であり、従って、細胞の腫瘍の進行の段階の指標である
）を包含し得る；あるいは、アッセイは、試験細胞のタンパク質と接触させられ
た、所定のマーカー核酸の遺伝子産物について特異的である抗体を用いて行われ
得る。このような一連の試験は、腫瘍の存在および位置のみを開示するだけでは
なく、医師が腫瘍に最も適切な処置の態様を選択すること、および処置の成功の
可能性を示唆することを可能にする。
【０２８６】 本発明の方法はまた、腫瘍の臨床的な経過を追跡するためにも使用され得る。
例えば、本発明のアッセイは、患者に由来する組織サンプルに対して適用され得
る。癌についての患者の処置後、別の組織サンプルが採取され、試験が繰り返さ
れる。良好な処置は、癌性または前癌性の細胞の特徴的な示差的発現を実証する
全ての細胞の除去、またはこれらの細胞中の遺伝子の発現における実質的な増大
（おそらく、正常なレベルに近づくかまたはなお並外れて）のいずれかを生じる
。
【０２８７】 なお別の実施態様においては、本発明は、被験体が、配列番号１〜５４４の核
酸によってコードされるポリペプチドの任意の１つの異常な活性に関連する、癌
（例えば、結腸癌）の発症の素因のような、疾患を発症する危険性を有するかど
うかを決定するための方法を提供する。ここで、ポリペプチドの異常な活性は、
以下の少なくとも１つによって特徴付けられる遺伝的な病変の存在または非存在
を検出することによって特徴付けられる：（ｉ）マーカーポリペプチドをコード
する遺伝子の完全性に影響を与える変化、または（ｉｉ）コードする核酸の誤っ
た発現。例示のために、このような遺伝的な病変は、以下の少なくとも１つの存
在を確認することによって検出され得る：（ｉ）核酸配列からの１つ以上のヌク
レオチドの欠失、（ｉｉ）核酸配列への１つ以上のヌクレオチドの付加、（ｉｉ
ｉ）核酸配列の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）核酸配列の全体的な染
色体再配列、（ｖ）核酸配列のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける全
体的な変化、（ｖｉｉ）核酸配列の（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターン
の）異常な改変、（ｖｉｉ）遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型の
スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）マーカーポリペプチドの非野生型
のレベル、（ｉｘ）遺伝子の対立遺伝子の欠失、および／または（ｘ）マーカー
ポリペプチドの不適切な翻訳後改変。
【０２８８】 本発明は、コードする核酸配列中の損傷を検出するためのアッセイ技術を提供
する。これらの方法は、配列分析を含む方法、サザンブロット分析、制限酵素部
位マッピング、および分析される核酸とプローブとの間で対合するヌクレオチド
の非存在の検出を含む方法を含むが、これらに限定されない。
【０２８９】 特異的な疾患または障害（例えば、遺伝的な疾患または障害）は、特定の遺伝
子の多型性の領域の特異的な対立遺伝子変異体に関連する。これは、必ずしも変
異したタンパク質をコードするわけではない。従って、被検体中での遺伝子の多
型性の領域の特異的な対立遺伝子変異体の存在は、被験体を特異的な疾患または
障害を発症する可能性を有するようにし得る。遺伝子中の多型性の領域は、個体
の集団中の遺伝子のヌクレオチド配列を決定することによって同定され得る。多
型性の領域が同定されると、特定の疾患との関係が、個体（例えば、特異的な疾
患（例えば、結腸癌）を発症した個体）の特異的な集団を研究することによって
決定され得る。多型性の領域は、遺伝子の任意の領域（例えば、エキソンのコー
ド領域または非コード領域、イントロン、およびプロモーター領域）中に配置さ
れ得る。
【０２９０】 例示的な実施態様においては、ヌクレオチド配列の領域を含む核酸プローブを
含む核酸組成物が提供される。ヌクロチド配列の領域は、遺伝子のセンスまたは
アンチセンス配列、あるいはその天然に存在する変異体、あるいは５’または３
’隣接配列、あるいは被験体遺伝子またはその天然に存在する変異体と天然に関
連するイントロン配列に対してハイブリダイズし得る。細胞の核酸は、ハイブリ
ダイゼーションのために利用可能にされ、プローブは、サンプルの核酸と接触さ
せられ、そしてサンプル核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションが検出
される。このような技術は、ゲノムまたはｍＲＮＡレベルのいずれかで、損傷ま
たは対立遺伝子変異体（欠失、置換などを含む）を検出するために、およびｍＲ
ＮＡの転写レベルを決定するために使用され得る。
【０２９１】 好ましい検出方法は、変異または多型性部位を重複しており、そして変異また
は多型性の領域の周辺に約５個、１０個、２０個、２５個、または３０個のヌク
レオチドを有するプローブを使用する対立遺伝子に特異的なハイブリダイゼーシ
ョンである。本発明の好ましい実施態様においては、対立遺伝子変異体に特異的
にハイブリダイズし得るいくつかのプローブが、固相支持体（例えば、「チップ
」）に付着させられる。「ＤＮＡプローブアッセイ」とも呼ばれる、オリゴヌク
レオチドを含有するこれらのチップを使用する変異検出分析は、例えば、Ｃｒｏ
ｎｉｎら、（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７：２４４に記載され
ている。１つの実施態様においては、チップは、遺伝子の少なくとも１つの多型
性領域の対立遺伝子変異体の全てを含む。固相支持体は次いで、試験核酸と接触
させられ、そして特異的なプローブに対するハイブリダイゼーションが検出され
る。従って、１つ以上の遺伝子の多数の対立遺伝子変異体の実態は、単純なハイ
ブリダイゼーション実験において同定され得る。
【０２９２】 特定の実施態様においては、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を
参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲ，またはＲＡＣＥ ＰＣＲ）、あるいは
、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら、（１９８８）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら、（
１９９４）ＰＮＡＳ ９１：３６０−３６４を参照のこと）において、プローブ
／プライマーを利用することを含む。後者は、遺伝子中の点変異を検出するため
に特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら、（１９９５）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ ２３：６７５−６８２を参照のこと）。単なる例示的な実施態様におい
ては、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）患者から細胞のサンプルを回
収する工程、（ｉｉ）サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡ、ま
たは両方）を単離する工程、（ｉｉｉ）核酸（存在するならば）のハイブリダイ
ゼーションおよび増幅が生じる条件下で、核酸配列に特異的にハイブリダイズす
る１つ以上のプライマーと核酸サンプルとを接触させる工程、ならびに（ｉｖ）
増幅産物の存在または非存在を検出する工程、あるいは増幅産物のサイズを検出
し、コントロールサンプルに対して長さを比較する工程。ＰＣＲおよび／または
ＬＣＲは、本明細書中で記載される変異を検出するために使用される任意の技術
と組み合せて、予備増幅工程として使用されることが所望され得ることが予想さ
れる。
【０２９３】 別の増幅方法は、以下を含む：自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ
．ら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８
７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら、１９８９．Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ
−βレプリカ−ゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら、１９８８、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）または任意の他の核酸増幅方法、当該分野で周知
の技術を使用する、続く増幅された分子の検出。これらの検出スキームは、この
ような分子が非常に少ない数で存在する場合に、核酸分子の検出に特に有用であ
る。
【０２９４】 このアッセイの好ましい実施態様においては、サンプル細胞に由来する遺伝子
における変異、またはその対立遺伝子変異体は、制限酵素切断パターンにおける
変化によって同定される。例えば、サンプルおよびコントロールＤＮＡは、単離
され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化さ
れ、そしてフラグメントの長さの大きさがゲル電気泳動によって決定される。さ
らに、配列特異的リボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号
を参照のこと）は、リボザイム切断部位の発生または欠失による特異的な変異の
存在についてスコア付けするために使用され得る。
【０２９５】 本発明の別の局面は、異常な増殖によって特徴付けられる細胞の分化および増
殖を調節し得る薬剤を同定することに関する。これに関しては、本発明は、マー
カー核酸（配列番号１〜５４４）の発現を調節し、そして／または例えば、コー
ドされるポリペプチドの生体活性を阻害するように変更する化合物を決定するた
めのアッセイを提供する。
【０２９６】 いくつかのインビボでの方法は、マーカー核酸（配列番号１〜５４４）の発現
を調節する、および／または例えば、コードされるポリペプチドの生体活性を変
更する（例えば、阻害する）化合物を同定するために使用され得る。
【０２９７】 薬物スクリーニングは、細胞のサンプルに対して試験化合物を添加し，そして
効果をモニターすることによって行われる。試験化合物を受容していない対応す
るサンプルもまた、コントロールとしてモニターされる。次いで、処理された細
胞および未処理の細胞が、以下を含むがこれらに限定されない任意の適切な表現
型の基準によって比較される：顕微鏡分析、生存性試験、複製能力、組織学的試
験、細胞に関連する特定のＲＮＡまたはポリペプチドのレベル、細胞または細胞
溶解物によって発現される酵素活性のレベル、および他の細胞または化合物と相
互作用する細胞の能力。処理された細胞と未処理の細胞との間での差異は、試験
化合物に起因し得る効果を示す。
【０２９８】 試験化合物の所望される効果として、癌に関連するマーカー核酸配列によって
付与された任意の表現型に対する効果が挙げられる。例として、ｍＲＮＡの過剰
な豊富さを制限する試験化合物、コードされるタンパク質の産生を制限する試験
化合物、または、タンパク質の機能的な効果を制限する試験化合物が挙げられる
。試験化合物の効果は、処理された細胞と未処理の細胞との間での結果を比較す
る場合に明らかである。
【０２９９】 従って、本発明はまた、インビトロで核酸マーカー（配列番号１−５４４）の
発現を阻害する薬剤をスクリーニングする方法を含む。この方法は、細胞または
組織（ここで、マーカー核酸ｍＲＮＡは、培養された細胞中で検出可能である）
を、薬剤がｍＲＮＡの産生を阻害し得るかどうかを決定するために薬剤に対して
暴露する工程；および暴露された細胞または組織中のｍＲＮＡのレベルを決定す
る工程（ここで、薬剤に対する細胞株の暴露後のｍＲＮＡのレベルの低下は、マ
ーカー核酸のｍＲＮＡの産生の阻害の指標である）を包含する。
【０３００】 あるいは、スクリーニング方法は、細胞または組織（ここで、マーカータンパ
ク質は、培養された細胞中で検出可能である）を、マーカータンパク質の産生を
阻害することが予想される薬剤に対してインビトロでスクリーニングする工程；
および細胞または組織中のマーカータンパク質のレベルを決定する工程（ここで
、薬剤に対する細胞または組織の暴露後のマーカータンパク質のレベルの低下は
、マーカータンパク質の産生の阻害の指標である）を包含する。
【０３０１】 本発明はまた、マーカー核酸の発現を阻害する薬剤をスクリーニングするイン
ビボでの方法を含む。この方法は、腫瘍細胞を有する哺乳動物（ここで、マーカ
ーｍＲＮＡまたはタンパク質は検出可能である）を、マーカーｍＲＮＡまたはタ
ンパク質の産生を阻害することが予想される薬剤に対して暴露する工程；および
暴露された哺乳動物の腫瘍細胞中のマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質のレベル
を決定する工程を包含する。薬剤に対する哺乳動物の暴露後のマーカーｍＲＮＡ
またはタンパク質のレベルにおける低下は、マーカー核酸の発現の阻害の指標で
ある。
【０３０２】 従って、本発明は、マーカー核酸（配列番号１−５４４）を発現する細胞を、
試験化合物とともにインキュベートする工程、およびｍＲＮＡまたはタンパク質
レベルを測定する工程を包含する方法を提供する。本発明はさらに、細胞の集団
中のマーカー核酸の発現のレベルを定量的に決定するための方法、および薬剤が
細胞の集団中のマーカー核酸の発現のレベルを増大または減少させ得るか否かを
決定するための方法を提供する。薬剤が細胞の集団中のマーカー核酸の発現のレ
ベルを増大または減少させ得るか否かを決定するための方法は、以下の工程を包
含する：（ａ）コントロールおよび薬剤で処理した細胞の集団から細胞の抽出物
を調製する工程、（ｂ）細胞の抽出物からマーカーポリペプチドを単離する工程
、（ｃ）上記のポリペプチドに特異的な抗体とマーカーポリペプチドとの間での
形成された免疫複合体の量を定量する（例えば、並行して）工程。本発明のマー
カーポリペプチドはまた、その生体活性についてアッセイすることによって定量
され得る。マーカー核酸の発現を増大させるように誘導する薬剤は、コントロー
ル細胞中で形成された免疫複合体の量と比較した場合に、処理された細胞中で形
成される免疫複合体の量を増大させるそれらの能力によって同定され得る。類似
の様式において、マーカー核酸の発現を低下させる薬剤は、コントロール細胞と
比較した場合に、処理された細胞抽出物中で形成される免疫複合体の量を減少さ
せるそれらの能力によって同定され得る。
【０３０３】 ｍＲＮＡのレベルは、ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって決定
され得る。ｍＲＮＡレベルはまた、ＰＣＲを含む方法によって決定され得る。ｍ
ＲＮＡを測定するための他の敏感な方法（これは、ハイスループットアッセイ（
例えば、ＤＥＬＦＩＡ終点検出および定量方法を使用する方法）において使用さ
れ得る）、例えば、ＷｅｂｂおよびＨｕｒｓｋａｉｎｅｎ（１９９６）Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １：１１９に
記載されている。マーカータンパク質のレベルは、配列番号１−５４４によって
コードされるタンパク質産物を特異的に認識する抗体を使用して、免疫沈降また
は免疫組織化学によって決定され得る。
【０３０４】 薬物スクリーニングアッセイにおいて活性であるとして同定される薬剤は、細
胞の増殖活性をブロックするそれらの能力について試験される候補である。これ
らの薬剤は、細胞（特に、結腸細胞）の異常な増殖に関連する障害を処置するた
めに有用である。
【０３０５】 種々のアッセイ形式が十分であり、そして、本発明の開示に照らして、本明細
書中で明白には記載されていないものが、それにもかかわらず、当業者によって
理解される。例えば、アッセイは、多くの種々の形式で作製され得、そして細胞
を含まないシステムに基づくアッセイ（例えば、精製されたタンパク質または細
胞溶解物）、およびインタクトな細胞を利用する細胞に基づくアッセイを含む。
【０３０６】 多くの薬物スクリーニングプログラム（これは、化合物のライブラリーおよび
天然の抽出物を試験する）においては、ハイスループットアッセイが、所定の期
間に調査される化合物の数を最大にするために所望され得る。本発明のアッセイ
（これは、細胞を含まないシステム（例えば、精製されたかもしくは半精製され
たタンパク質を用いて、または溶解物を用いて誘導され得る）において行われる
）は、しばしば、「一次」スクリーニングに好ましい。ここでは、これらは、試
験化合物によって媒介される分子の標的における変化を迅速に生じることおよび
比較的容易に検出することを可能にするように生成され得る。さらに、試験化合
物の細胞性の毒性および／またはバイオアベイラビリティーの効果は、一般的に
は、インビトロのシステムにおいては無視され得る。このアッセイは、代わりに
分子標的に対する薬物の効果に対して主に焦点があてられており、この効果は、
他のタンパク質との結合親和性における変化、または分子標的の酵素的な特性に
おける変化において明らかにされ得る。
【０３０７】 （Ａ．マッピングおよび組織プロファイリングプローブにおけるプローブとし
ての核酸の使用） （プローブ） 上記のようなポリヌクレオチドプローブ（例えば、配列番号１−５４４、好ま
しくは、配列番号１−１６８、なおより好ましくは、配列番号１−３５に示され
るような核酸のヌクレオチド配列、またはそれらに相補的な配列から選択される
、少なくとも１２個連続するヌクレオチドを含む）は、ヒトの染色体の同定およ
び転写レベルの決定を含む種々の目的のために使用される。核酸配列の好ましい
領域についてのさらなる開示は、添付の表において見出される。
【０３０８】 ヌクレオチドプローブは、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチン化標識、
または化学発光標識で標識され、そして選択された特定の標識について適切な周
知の方法によって検出される。核分裂中期の染色体の調製物に対するヌクレオチ
ドプローブのハイブリダイゼーションのためのプロトコールもまた、当該分野で
周知である。ヌクレオチドプローブは、プローブのヌクレオチド配列に相補的で
ある染色体調製物中のヌクレオチド配列に対して特異的にハイブリダイズする。
核酸に特異的にハイブリダイズするプローブは、他の無関係な配列を用いて提供
されるバックグラウンドのハイブリダイゼーションよりも、少なくとも５倍、１
０倍、または２０倍高い検出シグナルを提供するはずである。
【０３０９】 限定的ではない例においては、市販のプログラムが、疾患（例えば、癌）に一
般的に関連する染色体の領域を同定するために利用可能である。本発明の核酸は
、これらの領域をプローブするために使用され得る。例えば、プロフィールの検
索を通じて、核酸が、キナーゼをコードする遺伝子に対応するとして同定される
場合、癌に関連する染色体領域に結合するその能力は、腫瘍細胞の発生／増殖の
１つ以上の段階においてキナーゼとしてのその役割を示唆する。いくつかの実験
がその役割を明らかにするために必要とされるが、核酸は、癌の診断または治療
を開発する可能性を有する特定のタンパク質を単離するための新規の物質を構成
する。
【０３１０】 ヌクレオチドプローブは、核酸に対応する遺伝子の発現を検出するために使用
される。例えば、ノーザンブロットにおいては、ｍＲＮＡは電気泳動で分離され
、そしてプローブと接触される。プローブは、特定の大きさのｍＲＮＡ種に対し
てハイブリダイズする場合に検出される。ハイブリダイゼーションの量は、発現
の相対的な量を決定するために例えば、特定の条件下で定量される。プローブは
また、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅の産物を検出するために使用される。反
応の産物はプローブとハイブリダイズされ、そしてハイブリッドが検出される。
プローブは、発現を検出するために細胞に対してインサイチュハイブリダイゼー
ションにおいて使用される。プローブはまた、ハイブリダイズしている配列の診
断的な検出のためにインビボで使用され得る。プローブは、代表的には、放射性
同位体で標識される。他の型の検出可能な標識（例えば、発色団、蛍光団、およ
び酵素）が、使用され得る。
【０３１１】 特異的なｍＲＮＡの発現は、種々の細胞型において変化し得、そして組織特異
的であり得る。種々の細胞型におけるこのｍＲＮＡレベルのバリエーションは、
組織型を決定するための核酸プローブアッセイを用いて説明され得る。例えば、
ＰＣＲ、分岐したＤＮＡプローブアッセイ、または配列番号１−５４４、好まし
くは、配列番号１−１６８、なおより好ましくは、配列番号１−３５の核酸配列
、またはそれらに相補的な配列に対して実質的に同一であるかまたは相補的であ
る核酸プローブを利用するブロッティング技術は、標的ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ
の存在または非存在を決定し得る。
【０３１２】 ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイの例は、Ｕｒｄｅａら、ＰＣＴ ＷＯ９２／０２５２６、およびＵｒｄｅａら、米国特許第５，１２４，２４６
号に記載されており、これらの両方は本明細書中で参考として援用されている。
これらの参考文献は、サンドイッチヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセ
イの例を記載する。
【０３１３】 あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｍｅｔｈ．
Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５５：３３５−３５０；米国特許第４，６８３
，１９５号；および米国特許第４，６８３，２０２号（これらの全てが、本明細
書中で参考として援用されている）に記載されているように、少量の標的核酸を
検出するための別の手段である。２つのプライマーポリヌクレオチドヌクレオチ
ドが標的核酸とハイブリダイズし、そして反応をプライムするために使用される
。これらのプライマーは、配列表のポリヌクレオチドの内部または３’および５
’の配列から構成され得る。あるいは、プライマーがこれらのポリヌクレオチド
についての３’および５’である場合は、これらは、それらまたはそれらの相補
物に対してハイブリダイズする必要はない。熱安定性ポリメラーゼは、鋳型とし
てもともとの標的核酸を使用してプライマーから標的核酸のコピーを作製する。
大量の標的核酸がポリメラーゼによって生成されたあと、これは、サザンブロッ
トのような方法によって検出される。サザンブロット方法を使用する場合は、標
識されたプローブが、配列表のポリヌクレオチドまたはそれらの相補物にハイブ
リダイズする。
【０３１４】 さらに、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１
９８９）に記載されている伝統的なブロッティング技術によって検出され得る。
ポリメラーゼ酵素を使用してｍＲＮＡから生成されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは
精製され得、そしてゲル電気泳動を使用して分離され得る。次いで、ゲル上の核
酸は固体支持体（例えば、ニトロセルロース）上にブロットされる。固体支持体
は、標識されたプローブに曝され、次いで、任意のハイブリダイズしていないプ
ローブを除去するために洗浄される。次に、標識されたプローブを含有する二本
鎖が検出される。代表的には、このプローブは、放射能を用いて標識される。
【０３１５】 （マッピング） 本発明の核酸は、対応する遺伝子が位置する染色体を同定するために使用され
る。正常な分裂中期のスプレッド（ｓｐｒｅａｄ）に対するインサイチュハイブ
リダイゼーションにおける蛍光（ＦＩＳＨ）を使用して、比較ゲノムハイブリダ
イゼーションは、ＤＮＡ配列の相対的なコピー数における変化の全ゲノムの評価
を可能にする。ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＳａｍａｄ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ
ｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）８：７０−７４；Ｋ
ａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ（１９９３）４：４１−４６；ＶａｌｄｅｓおよびＴａｇｌｅ，Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）６８：１、Ｂｏ
ｕｌｔｗｏｏｄ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪを参照のこと
。
【０３１６】 ヒトの分裂中期染色体の調製物は、ヒトの初代組織または細胞株から標準的な
細胞遺伝子学的技術を使用して調製される。配列番号１−５４４、好ましくは、
配列番号１−１６８、なおより好ましくは、配列番号１−３５のヌクレオチド配
列、またはそれらに相補的な配列から選択される少なくとも１２個の連続するヌ
クレオチドを含有するヌクレオチドプローブが、対応する染色体を同定するため
に使用される。ヌクレオチドプローブは、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオ
チン標識、または化学発光標識で標識され、そして選択された特定の標識につい
て適切な周知の方法によって検出される。分裂中期の染色体の調製物にヌクレオ
チドプローブをハイブリダイズさせるためのプロトコールもまた、当該分野で周
知である。ヌクレオチドプローブは、プローブのヌクレオチド配列に相補的であ
る染色体調製物中のヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする。標的遺伝
子に特異的にハイブリダイズするプローブは、無関係なコード配列を用いて提供
されるバックグラウンドのハイブリダイゼーションよりも少なくとも５倍、１０
倍、または２０倍高い検出シグナルを提供する。
【０３１７】 核酸は、例えば、照射ハイブリッド、または染色体特異的ハイブリッドパネル
を使用して、特定の染色体にマッピングされる。Ｌｅａｃｈら、Ａｄｖａｎｃｅ
ｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９５）３３：６３−９９；Ｗａｌｔｅｒら、
Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）７：２２−２８；Ｗａｌｔｅｒお
よびＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９２
）９：３５２を参照のこと。照射ハイブリッドマッピングのためのパネルは、Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｎｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌ
ａｂａｍａ，ＵＳＡから入手可能である。種々のパネルを使用するマーカーのデ
ータベースは、ワールドワイドウェブを通じてｈｔｔｐ：／Ｆ／ｓｈｇｃ−ｗｗ
ｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ；および他のサイトから、入手可能である。統計
学的なプログラムである、ＲＨＭＡＰが、他に対して１ケタの相対的な見込みの
尺度を有する照射ハイブリゼーションによるデータに基づいてマップを構築する
ために使用され得る。ＲＨＭＡＰは、ワールドワイドウェブを通じて、ｈｔｔｐ
：／／ｗｗｗ．ｓｐｈ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｓｔａｔｇｅｎ／ｓ
ｏｆｔｗａｒｅで入手可能である。
【０３１８】 このようなマッピングは、既知の機能を有する他の遺伝子へのその接近によっ
て、標的遺伝子の機能を同定することにおいて有用であり得る。機能はまた、特
定の症候群または疾患が同じ染色体にマッピングされる場合に、標的遺伝子に割
り当てられ得る。
【０３１９】 （組織プロファイリング） 本発明の核酸は、所定のサンプルが由来する組織型を決定するために使用され
得る。例えば、転移性の病変が、その器官または組織の特定のマーカーの発現を
同定することによって、その発生の器官または組織の供給源によって同定される
。核酸が、特定の組織型においてのみ発現され、そして転移性の病変がその核酸
を発現することが見出される場合は、次いでその病変の発生の起源が同定される
。特定の核酸の発現は、対応するｍＲＮＡまたはタンパク質産物のいずれかの検
出によってアッセイされる。免疫学的な方法（例えば、抗体染色）は、特定のタ
ンパク質産物を検出するために使用される。ハイブリダイゼーション方法（イン
サイチュハイブリダイゼーションおよびノーザンブロッティングを含むがこれら
に限定されない）は、特定のｍＲＮＡ種を検出するために使用され得る。
【０３２０】 （多型性の使用） 核酸は、遺伝子の対応する領域がヒトの集団において多型性である場合、法医
学、遺伝的分析、マッピング、および診断の適用において有用である。核酸の特
定の多型性形態は、疑わしい被験体に由来するサンプルを同定するか、または疑
わしい被験体に由来するサンプルの可能性を除外するかのいずれかのために使用
され得る。遺伝子中の多型性を検出するための任意の手段が使用され、これらは
、タンパク質の多型性変異体の電気泳動、制限酵素切断に対する異なる感受性、
および対立遺伝子特異的プローブに対するハイブリダイゼーションを含むが、こ
れらに限定されない。
【０３２１】 Ｂ．抗体を惹起するための核酸およびコードされるポリペプチドの使用 核酸、対応するｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ、または対応する完全な遺伝子の発
現産物が調製され、そして実験的、診断的、および治療的目的のための抗体を惹
起するために使用される。それに対応する遺伝子が割り当てられていない核酸に
ついては、これは、対応する遺伝子を同定するさらなる方法を提供する。核酸ま
たは関連するｃＤＮＡは、上記のように発現され、そして抗体が調製される。こ
れらの抗体は、コードされるポリペプチド上のエピトープに対して特異的であり
、そして細胞もしくは組織調製物中、またはインビトロの発現システムの細胞を
含まない抽出物中の対応する天然のタンパク質を沈殿させるかまたはそれらに結
合し得る。
【０３２２】 抗体を惹起するための免疫原は、アジュバントと、本発明の核酸によってコー
ドされるポリペプチドとを混合することによって調製される。あるいは、ポリペ
プチドは、大きな免疫原性タンパク質に対して融合タンパク質として作製される
。ポリペプチドはまた、他の大きな免疫原性タンパク質（例えば、キーホールリ
ンペットヘモシアニン）に対して共有結合する。免疫原は、代表的には、経皮的
に、皮下的に、または筋肉内で投与される。免疫原は、抗体を作製するために、
ウサギ、ヒツジ、およびマウスのような実験動物に投与される。必要に応じて、
動物の脾臓細胞が単離され、そしてモノクローナル抗体を分泌するハイブリドー
マを形成するように、骨髄腫細胞と融合される。このような方法は当該分野で周
知である。当該分野で公知の別の方法に従うと、核酸は、直接（例えば、筋肉内
注射によって）投与され、そしてインビボで発現される。発現されたタンパク質
は、タンパク質の投与に匹敵する抗体の産生を含む種々のタンパク質特異的免疫
応答を生じる。
【０３２３】 核酸によってコードされるタンパク質およびポリペプチドについて特異的なポ
リクローナルおよびモノクローナル抗体の調製は、当該分野で公知の標準的な方
法を使用して行われる。抗体は、配列番号１〜５４４、好ましくは、配列番号１
〜１６８、なおより好ましくは、配列番号１〜３５の核酸、またはそれらに相補
的な配列によってコードされるポリペプチド中に存在するエピトープに特異的に
結合する。別の実施態様においては、抗体は、配列番号１〜５４４によってコー
ドされるポリペプチド中に存在するエピトープに特異的に結合する。代表的には
、少なくとも約６個、８個、１０個、または１２個の連続するアミノ酸が、エピ
トープを形成するために必要とされる。しかし、連続的ではないアミノ酸を含む
エピトープは、例えば、少なくとも約１５個、２５個、または５０個のアミノ酸
をさらに必要とし得る。次いで、核酸の短い配列は、対応する新規のタンパク質
を同定するために抗体を惹起するためのエピトープトしての使用には適切ではあ
り得ない。なぜなら、既知のタンパク質との交差反応性の可能性があるからであ
る。しかし、抗体は、他の目的について、特に、それらが既知のタンパク質およ
び本発明の核酸によってコードされる新規のポリペプチドの共通の構造的な特徴
を同定する場合に、有用であり得る。
【０３２４】 ヒトの核酸によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体は、ウ
ェスタンブロット、または他の免疫化学的アッセイにおいて使用される場合には
、他のタンパク質を用いて提供される検出シグナルよりも、少なくとも約５倍、
１０倍、または２０倍高い検出シグナルを提供するはずである。好ましくは、核
酸Ｔによってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学的
アッセイにおいては他のタンパク質を検出せず、そして溶液から核酸によってコ
ードされるタンパク質を免疫沈降させ得る。
【０３２５】 ヒトの集団中の核酸によってコードされるポリペプチドに対する血清抗体の存
在を試験するために、ヒト抗体が、当該分野で周知の方法によって精製される。
好ましくは、抗体は、核酸によってコードされるタンパク質、ポリペプチド、ま
たは融合タンパク質が結合したカラムに、抗血清を通過させることによってアフ
ィニティー精製される。次いで、結合した抗体は、例えば、高塩濃度の緩衝液を
使用して、カラムから溶出され得る。
【０３２６】 上記で議論される抗体に加えて、遺伝子操作された抗体の誘導体（例えば、単
鎖抗体）が、作製される。
【０３２７】 抗体は、当該分野で公知の標準的なプロトコールを使用して作製され得る（例
えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａ
ｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅ
ｓｓ：１９８８）を参照のこと）。哺乳動物（例えば、マウス、ハムスター、ま
たはウサギ）は、ペプチドの免疫原性の形態（例えば、抗体応答を誘発し得る哺
乳動物のポリペプチドもしくは抗原性フラグメント、または上記のような融合タ
ンパク質）を用いて免疫化され得る。
【０３２８】 １つの局面においては、本発明は、対象ポリペプチドが結腸直腸組織または腫
瘍組織（特に、結腸癌組織または結腸癌に由来する細胞株）中で高度に発現され
ることを示す、モノクローナル抗体を含む。従って、１つの実施態様においては
、本発明は、一般的に、そして特に、結腸癌の診断薬として、対象ポリペプチド
の発現の分析のための診断ツールを提供する。
【０３２９】 タンパク質またはペプチドに対して免疫原性を付与するための技術としては、
当該分野で周知のキャリアまたは他の技術に対する結合が挙げられる。タンパク
質の免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与され得る。免疫化の進行は、
血漿または血清中の抗体力価の検出によってモニターされ得る。標準的なＥＬＩ
ＳＡまたは他のイムノアッセイが、抗体のレベルを評価するための抗原としての
免疫原を用いて使用され得る。好ましい実施態様においては、対象の抗体は、哺
乳動物のタンパク質の抗原性決定基（例えば、配列番号１〜５４４の１つによっ
てコードされるタンパク質、または密接に関連するホモログ（例えば、少なくと
も９０％同一である、およびより好ましくは、少なくとも９５％同一である）の
抗原性決定基）に対して免疫特異的である。
【０３３０】 ポリペプチドの抗原性調製物での動物の免疫化後、抗血清が得られ得、そして
所望される場合は、ポリクローナル抗体が血清から単離され得る。モノクローナ
ル抗体を産生するために、抗体を産生する細胞（リンパ球）が、免疫化された動
物から回収され得、そして骨髄腫細胞のような不死化細胞を用いる標準的な体細
胞融合手順によって、ハイブリドーマ細胞を生じるように融合させられる。この
ような技術は、当該分野で周知であり、そして例えば、ハイブリドーマ技術（Ｋ
ｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９
５−４９７によって最初に開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏ
ｚｂａｒら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２）、お
よびヒトのモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（
Ｃｏｌｅら、（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎ
ｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．７７−
９６頁）を含む。ハイブリドーマ細胞は、本発明のポリペプチドと特異的に反応
する抗体の産生のために免疫化学的にスクリニングされ得、そしてモノクローナ
ル抗体が、このようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離され得る。
【０３３１】 用語、抗体は、本明細書中で使用される場合、対象ポリペプチドの１つともま
た特異的に反応するそのフラグメントを含むことが意図される。抗体は、従来技
術を使用して断片化され得、そしてフラグメントは、上記と同じ様式において、
全抗体について有用性についてスクリーニングされる。例えば、Ｆ（ａｂ）2フ
ラグメントは、ペプシンで抗体を処理することによって生成され得る。得られた
Ｆ（ａｂ）2フラグメントは、Ｆａｂフラグメントを産生するためのジスルフィ
ド結合を減少させるように処理され得る。本発明の抗体はさらに、抗体の少なく
とも１つのＣＤＲ領域によって付与されたポリペプチドに対する親和性を有する
、二重特異的、単鎖、およびキメラ、ならびにヒト化分子を含むことが意図され
る。好ましい実施態様においては、抗体は、さらに、それに付着させられた標識
を含み、そして検出されることが可能である（例えば、標識は、放射性同位元素
、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）。
【０３３２】 抗体は、例えば、被験体が異常なタンパク質レベルに関連する疾患または症状
（例えば、結腸癌）を有するかどうかを決定するために、またはこのような障害
を罹患している個体について所定の処置レジメの効力の決定を可能にするために
、個体中のタンパク質レベルをモニターするために使用され得る。ポリペプチド
のレベルは、体液（例えば、血液サンプル）中の細胞から測定され得る。
【０３３３】 本発明の抗体の別の適用は、発現ベクター（例えば、ｇｔ１１、ｇｔ１８−２
３、ＺＡＰ、およびＯＲＦ８）中で構築されたｃＤＮＡライブラリーの免疫学的
なスクリーニングにおいてである。この型のメッセンジャーのライブラリー（正
確なリーディングフレームおよび方向で挿入されたコード配列を有する）は、融
合タンパク質を生成し得る。例えば、ｇｔ１１は、そのアミノ末端がβ−ガラク
トシダーゼアミノ酸配列から構成され、そしてそのカルボキシ末端が外来ポリペ
プチドから構成される融合タンパク質を生成する。次いで、タンパク質の抗原性
エピトープ（例えば、特定のタンパク質の他のオルトログまたは同じ種に由来す
る他のパラログ）が、抗体を用いて、例えば、感染プレートから取り上げたニト
ロセルロースフィルターを抗体と反応させることによって、検出され得る。この
アッセイによって検出されたポジティブなファージは、次いで、感染プレートか
ら単離され得る。従って、ホモログの存在が検出され得、そして他の動物からク
ローン化され得、ヒトに由来する別の異性体（スプライシング変異体を含む）で
あり得る。
【０３３４】 別の実施態様においては、モノクローナル抗体のパネルが使用され得る。ここ
でエピトープに関連する機能の各々は、モノクローナル抗体によって提示される
。パネル中のモノクローナル抗体の結合の欠失または摂動は、タンパク質、従っ
て、対応する遺伝子の変異性の警告の指標である。
【０３３５】 Ｃ．異なる発現 本発明はまた、ヒトにおける異常な組織または疾患の組織を同定するための方
法を提供する。上記のようなタンパク質ファミリーのプロフィールに対応する核
酸については、組織の選択は、推定の生物学的機能によって示され得る。特異的
な核酸に対応する遺伝子の発現は、疾患が疑われる第１の組織と、ヒトの正常な
組織である第２の組織との間で比較される。正常な組織はヒトの任意の組織（特
に、脳、胸腺、精巣、心臓、前立腺、胎盤、脾臓、小腸、骨格筋、すい臓、およ
び結腸の粘膜の内層を含むがこれらに限定されない、標的遺伝子を発現する組織
）である。
【０３３６】 異常であるかまたは疾患であると疑われる組織は、ヒトの種々の組織型から誘
導され得るが、好ましくは、それは、同じ組織型から誘導される；例えば、小腸
のポリープまたは他の異常な増殖は、正常な腸組織と比較されるはずである。比
較される２つの組織中での標的遺伝子、ｍＲＮＡ、またはタンパク質の間の差異
（例えば、分子量、アミノ酸もしくはヌクレオチド配列、または相対的な量）は
、遺伝子もしくはそれを調節する遺伝子における変化、または疾患であると疑わ
れるヒトの組織における変化を示す。
【０３３７】 ２つの組織における標的遺伝子が、当該分野で公知の任意の手段によって比較
される。例えば、２つの遺伝子が配列決定され、そして疾患であると疑われる組
織中の遺伝子の配列が、正常な組織中の遺伝子配列と比較される。２つの組織中
の標的遺伝子またはその一部が、例えば、配列表に示されるヌクレオチド配列に
基づくヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増
幅される。増幅された遺伝子または遺伝子の一部は、配列番号１−５４４に示さ
れる対応するヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチドプローブに対してハ
イブリダイズされる。正常なヌクレオチド配列と比較された、疾患であると疑わ
れる組織中の標的遺伝子のヌクレオチド配列における差異は、疾患における核酸
コードタンパク質の役割を示唆し、そして治療薬を調製するための指針を提供す
る。ヌクレオチドプローブは、種々の方法（例えば、放射性標識、ビオチン化、
または蛍光もしくは化学発光タグを用いた標識）によって標識され、そして当該
分野で公知の標準的な方法によって検出される。
【０３３８】 あるいは、２つの組織中の標的ｍＲＮＡが比較される。ポリＡ+ＲＮＡは、当
該分野であるように公知の２つの組織から単離される。例えば、当業者は、２つ
の組織間での標的ｍＲＮＡ転写物の大きさまたは量における差異を、ノーザンブ
ロットおよび配列表に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチドプ
ローブを使用して、容易に決定し得る。正常な組織中の同じ標的ｍＲＮＡの発現
と比較して、疾患であると疑われる組織サンプル中の標的ｍＲＮＡの増大または
低下した発現は、発現されるタンパク質が疾患において役割を有することを示唆
し、そしてまた、治療的な薬剤を調製するための指針を提供する。
【０３３９】 タンパク質を分析するための任意の方法は、適合したサンプルから２つの核酸
コードタンパク質を比較するために使用される。２つの組織中のタンパク質の大
きさが、例えば、２つの組織に由来するタンパク質抽出物のウェスタンブロット
において核酸をコードするタンパク質を検出するための本発明の抗体を使用して
、比較される。他の変化（例えば、発現レベルおよび細胞小器官の局在化）もま
た、対応するタンパク質に対する抗体を使用して免疫学的に検出され得る。正常
な組織中の同じ核酸コードタンパク質の発現レベルと比較される、疾患であると
疑われる組織中での核酸コードタンパク質の発現のより高いかまたはより低いレ
ベルは、発現されるタンパク質がその疾患において役割を有することの指標であ
り、そして治療薬を調製するための別の指針を提供する。
【０３４０】 同様に、遺伝子配列または遺伝子発現産物（例えば、ｍＲＮＡおよびタンパク
質）の、疾患であると疑われるヒトの組織とヒトの正常な組織との間での比較は
、ヒトにおける疾患の進行または緩解を追跡するために使用される。遺伝子、ｍ
ＲＮＡ、またはタンパク質のこのような比較は、上記に記載されているように行
われる。
【０３４１】 例えば、新生物であると疑われる組織中の標的遺伝子の増大または減少した発
現は、組織中の新生物細胞の存在を示し得る。正常な組織中での遺伝子の発現と
比較した新生物組織中での標的遺伝子の増大した発現の程度、または長期にわた
る新生物組織中の標的遺伝子の増大した発現量の差異は、その組織中の新生物の
進行を評価するため、または経時的な治療プロトコールに対して新生物組織の応
答をモニターするために、使用される。
【０３４２】 任意の２つの細胞型（例えば、低いおよび高い転移性の腫瘍細胞株、または治
療薬に曝されているか、または曝されていない組織に由来する細胞）の発現パタ
ーンが比較され得る。ヒトにおける疾患に対する遺伝的な素因は、正常な標的遺
伝子、ｍＲＮＡ、またはタンパク質と、胎児の組織中の標的遺伝子、ｍＲＮＡ、
またはタンパク質を比較することによって検出される。この目的のために使用さ
れる胎児の組織として、羊水、絨網膜絨毛、血液、およびインビトロで受精させ
られた胚の割球が挙げられるが、これらに限定されない。比較可能な正常な標的
遺伝子は、任意の組織から得られる。ｍＲＮＡまたはタンパク質は、標的遺伝子
が発現されるヒトの正常な組織から得られる。胎児の標的遺伝子またはｍＲＮＡ
のヌクレオチド配列もしくは大きさにおける変化、または胎児の標的タンパク質
の分子量、アミノ酸配列、もしくは相対的な量における変化のような差異は、胎
児の標的遺伝子における生殖系の変異を示し得る。この変異は、疾患の遺伝的な
素因を示す。
【０３４３】 （Ｄ．ペプチドアナログおよびアンタゴニストをスクリーニングするための核
酸およびコードされるポリペプチドの使用） 本発明の核酸（例えば、配列番号１−５４４、好ましくは、配列番号１−１６
８、なおより好ましくは、配列番号１−３５、またはそれらに相補的な配列、お
よび対応する全長の遺伝子）によってコードされるポリペプチドは、ペプチドラ
イブラリーをスクリーニングして、コードされるポリペプチドの中から結合パー
トナー（例えば、レセプター）を同定するために使用され得る。
【０３４４】 ペプチドのライブラリーは、米国特許第５，０１０，１７５号およびＰＣＴ
ＷＯ９１／１７８２３に開示されている方法に従って合成され得る。以下に簡潔
に記載されるように、当業者は、ペプチドの混合物を調製し、次いでこれは、所
望のシグナル伝達およびレセプター結合活性を示すペプチドを同定するためにス
クリーニングされる。’１７５号特許の方法においては、適切なペプチド合成支
持体（例えば、樹脂）が、適切に保護され、活性化されたアミノ酸の混合物に結
合される。反応混合物中での各アミノ酸の濃度は、生成物が、出発樹脂に結合し
たアミノ酸の等モルの混合物であるように、その結合反応速度に対して反比例し
て平衡化または調節される。次いで、結合したアミノ酸は、脱保護され、そして
全ての可能性のあるジペプチドの等モルの混合物を形成するように、別の平衡化
されたアミノ酸の混合物と反応させられる。このプロセスは、所望の長さ（例え
ば、ヘキサマー）のペプチドの混合物が形成されるまで、繰り返される。当業者
は、各工程において全てのアミノ酸を含む必要がないに留意のこと：当業者は、
いくつかの工程においては、１つまたは２つのアミノ酸だけを含み得（例えば、
特定のアミノ酸が所定の位置で必須であることが既知である場合）、従って、混
合物の複雑さを軽減する。ペプチドライブラリーの合成が完了した後、ペプチド
の混合物は、選択されたポリペプチドに対する結合についてスクリーニングされ
る。次いで、ペプチドは、活性を阻害するかまたは増強するそれらの能力につい
て試験される。次いで、所望の活性を示すペプチドが単離され、そして配列決定
される。
【０３４５】 ＷＯ ９１／１７８２３に記載される方法は同様である。しかし、合成樹脂を
活性化アミノ酸の混合物と反応させる代わりに、樹脂は、２０個の等しい部分に
（または、その工程で付加される異なるアミノ酸の数に対応する部分の数に）分
けられ、そして各アミノ酸は、樹脂のその部分に対して別々に結合される。次い
で、樹脂部分は、組み合わせられ、混合され、そして第２のアミノ酸との反応の
ために多数の等しい部分に再度分けられる。この様式においては、各反応は、完
了するように容易に駆動され得る。さらに、当業者は、各工程で全ての樹脂を混
合するよりもむしろ、同時に部分を処理することによって、別々の「サブプール
」を維持し得る。これによって、ペプチドが任意の観察されるレセプター結合ま
たはシグナル伝達活性について応答性であることを決定するプロセスを単純化す
る。
【０３４６】 このような場合は、それぞれ、例えば、１〜２，０００個の候補を含有するサ
ブプールが、本発明の１つ以上のポリペプチドに曝される。次いで、ポジティブ
な結果を生じる各サブプールは、例えば、２０〜１００個の候補を含有するより
小さいサブプール（サブ−サブプール）の群として再合成され、そして再度アッ
セイされる。ポジティブなサブ−サブプールは、個々の化合物として再合成され
得、そして高い結合定数を示すペプチドを決定するために最終的にアッセイされ
る。これらのペプチドは、天然の活性を阻害または増強するそれらの能力につい
て試験され得る。ＷＯ ９１／７８２３および米国特許第５，１９４，３９２号
（本明細書中で参考として援用される）に記載されている方法は、自動化された
技術によって同時にこのようなプールおよびサブプールを調製することが可能で
あり、その結果、全ての合成および再合成は、およそ数日で行われ得る。
【０３４７】 ペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、任意の利用可能な方法（例えば
、シグナル伝達、抗体結合、レセプター結合、有糸分裂促進アッセイ、走化性ア
ッセイなど）を使用してスクリーニングされる。本明細書中で記載される方法が
、現在、好ましい。アッセイ条件は、理想的には、天然の活性がインビボで示さ
れる条件下（すなわち、生理学的なｐＨ、温度、およびイオン強度）に類似する
べきである。適切なアゴニストまたはアンタゴニストは、被験体中で毒性の副作
用を生じない濃度で、天然の活性の強力な阻害または増強を示す。天然のポリペ
プチドに対する結合について競合するアゴニストまたはアンタゴニストは、天然
の濃度に等しいかまたはそれよりも大きい濃度を必要とし得、一方、ポリペプチ
ドに不可逆的に結合し得るインヒビターは、天然の濃度の程度の濃度で添加され
得る。
【０３４８】 このようなスクリーニングおよび実験の最終的な結果は、本発明の核酸によっ
てコードされる少なくとも１つの新規のポリペプチドの結合パートナー（例えば
、レセプター）であり、そして新規の結合パートナーの少なくとも１つのペプチ
ドアゴニストもしくはアンタゴニストである。このようなアゴニストおよびアン
タゴニストは、それに対するレセプターが天然である細胞中の、または遺伝子操
作の結果としてのレセプターを保有する細胞中の、レセプター機能を調節、増強
、もしくは阻害するために使用され得る。さらに、新規のレセプターが既知のレ
セプターと生物学的に重要な特徴を共有する場合は、アゴニスト／アンタゴニス
トの結合についての情報は、既知のレセプターの改良されたアゴニスト／アンタ
ゴニストを開発することを補助し得る。
【０３４９】 （Ｅ．薬学的組成物および治療的使用） 薬学的組成物は、本願発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレオチドを
含み得る。この薬学的組成物は、本願発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌ
クレオチドのいずれかの、治療有効量を含む。
【０３５０】 本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」とは、所望の疾患または状
態を処置、回復、または予防するための治療剤の量、または検出可能な治療効果
または予防効果を示すための治療剤の量をいう。この効果は、例えば、化学的マ
ーカーレベルまたは抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、物理的
症状の減少（例えば、体温の低下）を含む。被験体に対する正確な有効量は、そ
の被験体の大きさおよび体重、その状態の性質および程度、ならびに投与に選択
される治療剤または治療剤の組み合わせに依存する。従って、事前に正確な有効
量を特定することは有用でない。しかし、所定の状況に対する有効量は、慣用的
実験によって決定され得、臨床医の判断内である。
【０３５１】 本発明の目的のために、有効用量は、投与される被験体において、約０．０１
ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤ
ＮＡ構築物である。
【０３５２】 薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的
に受容可能なキャリア」とは、治療剤（例えば、抗体またはポリペプチド、遺伝
子、ならびに他の治療剤）の投与のためのキャリアをいう。この用語は、この組
成物を受ける個体に対して有害な抗体の産生をそれ自体で誘導せず、そして過度
の毒性を伴わずに投与され得る任意の薬学的キャリアをいう。適切なキャリアは
、大きな、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッカリド
、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および
不活性なウイルス粒子）であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知であ
る。
【０３５３】 薬学的に受容可能な塩は、その中で使用され得、例えば、鉱酸塩（例えば、塩
酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）；および有機酸塩（例えば、酢酸
塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など）である。薬学的に受容可能
な賦形剤の詳細な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）にお
いて入手可能である。
【０３５４】 治療組成物における薬学的に受容可能なキャリアは、液体（例えば、水、生理
食塩水、グリセロールおよびエタノール）を含み得る。さらに、補助物質（例え
ば、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）は、このようなビヒクル中に存在し得
る。代表的に、治療組成物は、液体溶液または液体懸濁液のいずれかとして、注
射可能物質として調製され；注射前に液体ビヒクルへの溶解または懸濁に適切な
固体形態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの
定義内に含まれる。
【０３５５】 （送達方法） 一旦処方されると、本発明の核酸組成物は、（１）被験体に直接投与され得る
か；（２）被験体由来の細胞に、エキソビボで送達され得るか；または、（３）
組換えタンパク質の発現のためにインビトロで送達され得る。
【０３５６】 この組成物の直接送達は、一般的に、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内のい
ずれかでの注射によって達成されるか、組織の間質空間に送達される。この組成
物はまた、腫瘍または病変内に投与され得る。他の投与形態としては、経口投与
および肺投与、坐剤、および経皮適用、針、ならびに遺伝子銃またはハイポスプ
レーが挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジ
ュールであり得る。
【０３５７】 エキソビボ送達および形質転換細胞の被験体への再移植のための方法は、当該
分野で公知であり、そして例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１４７７８に記載さ
れる。エキソビボ適用に有用な細胞の例としては、例えば、幹細胞（特に、造血
幹細胞）、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、または腫瘍細胞が挙げられる
。
【０３５８】 一般的に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は
、例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポ
リブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーシ
ョン、ポリヌクレオチドのリポソーム中へのカプセル化、およびＤＮＡの核への
直接微量注入によって達成され得、これら全ては、当該分野で周知である。
【０３５９】 一旦、本発明の遺伝子が、増殖障害（例えば、新形成、形成異常、および過形
成）と相関することが見出されると、この障害は、その核酸または対応するポリ
ペプチドに基づく治療剤の投与による処置を受け入れ得る。
【０３６０】 アンチセンスポリペプチドの調製は、上記に議論される。このアンチセンス組
成物によって処置される新形成としては、頸部癌、メラノーマ、結腸直腸腺癌、
ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞ｗ腫、肉腫、筋肉腫、肺癌、白血病（例えば、慢性
骨髄性白血病、前骨髄球性白血病、単球性白血病、および骨髄性白血病）、およ
びリンパ種（例えば、細網肉腫）が挙げられるが、これらに限定されない。この
治療組成物によって処置される増殖性障害としては、無発汗性（ａｎｈｙｄｒｉ
ｃ）遺伝性外胚葉性形成異常、先天性肺胞性形成異常、頸部の上皮形成異常、骨
の線維性形成異常、および乳房形成異常のような障害が挙げられる。過形成（例
えば、子宮内膜、副腎、乳房、前立腺または甲状腺の過形成、あるいは皮膚の偽
上皮腫性増殖症）は、アンチセンス治療組成物によって処置される。対応する遺
伝子における変異が推定されない障害においてでさえ、核酸関連遺伝子発現のダ
ウンレギュレーションまたは阻害は、治療適用を有し得る。例えば、核酸関連遺
伝子発現の減少は、その遺伝子の発現の増強が推定される腫瘍の抑制を助け得る
。
【０３６１】 このアンチセンス組成物の用量および投与方法の両方は、その治療組成物の特
質、患者の状態、年齢および体重、疾患の進行、ならびに他の関連する因子に基
づいて決定される。本発明の治療アンチセンス薬剤の投与としては、注射、経口
投与、微粒子銃またはカテーテル投与を含む、局所的投与または全身性投与、な
らびに局部投与が挙げられる。好ましくは、この治療アンチセンス組成物は、プ
ロモーター、および核酸のアンチセンス鎖の少なくとも約１２、２２、２５、３
０または３５の連続するヌクレオチドのポリヌクレオチドセグメントを含む発現
構築物を含む。この発現構築物内では、このポリヌクレオチドセグメントは、プ
ロモーターの下流に配置され、そしてこのポリヌクレオチドセグメントの転写は
、このプロモーターで開始される。
【０３６２】 治療組成物を身体の特定の部位に直接投与するために、種々の方法が使用され
る。例えば、小さい転移性病変を位置づけて、そしてこの治療組成物を、腫瘍本
体内のいくつかの異なる位置に数回注射する。あるいは、腫瘍に供給する動脈を
同定し、そしてこの治療組成物を、このような動脈に注射して、この組成物をそ
の腫瘍内に直接的に送達する。壊死性中心を有する腫瘍を吸引し、そしてこの組
成物を、現時点で空になったその腫瘍の中心に直接的に注射する。このアンチセ
ンス組成物は、腫瘍の表面に、例えば、この組成物の局所適用によって直接的に
投与される。Ｘ線画像化を使用して、特定の上記の送達方法を補助する。
【０３６３】 特定の組織への、アンチセンスポリヌクレオチド、サブゲノム（ｓｕｂｇｅｎ
ｏｍｉｃ）ポリヌクレオチド、または抗体を含む、治療組成物のレセプター媒介
性の標的化された送達もまた使用される。レセプター媒介ＤＮＡ送達技術は、例
えば、以下のものに記載される：Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２−２０５；Ｃｈｉｏｕら、（１９
９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．
Ａ．Ｗｏｌｆｆ編）；ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）
２６３：６２１−２４；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９
：５４２−４６；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ
ＳＡ）（１９９０）８７：３６５５−５９；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
（１９９１）２６６：３３８−４２。好ましくは、本発明の抗体を含む治療組成
物の、レセプター媒介性の標的化された送達は、その抗体を特定の組織へ送達す
るために使用される。
【０３６４】 アンチセンスサブゲノムポリヌクレオチドを含む治療組成物は、遺伝子治療プ
ロトコルにおける局所投与について、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲のＤＮ
Ａで投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１ｍｇ〜約２ｍｇ、約５ｍｇ〜
約５００ｍｇ、および約２０ｍｇ〜約１００ｍｇの濃度範囲のＤＮＡもまた、遺
伝子治療プロトコルの間に使用され得る。形質転換および発現の作用方法および
効力のような因子は、このアンチセンスサブゲノム核酸の最終的な効力に必要と
される投薬量に影響を及ぼす考慮すべき事柄である。より多い発現がより大きな
面積の組織にわたって所望される場合、より大量のアンチセンスサブゲノム核酸
、または投与の連続的プロトコルにおいて再投与される等量、または異なる隣接
または近隣の組織部分（例えば、腫瘍部位の）への数回の投与が、ポジティブな
治療結果をもたらすのに必要とされ得る。全ての場合において、臨床試験の慣用
的実験が、最適な治療効果のための特定の範囲を決定する。遺伝子治療ベクター
（特に、レトロウイルスベクター）のより完全な記載は、米国特許出願第０８／
８６９，３０９号（本明細書中に明確に援用される）、および以下の第Ｆ節に含
まれる。
【０３６５】 抗炎症活性を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子に関し
て、適切な使用、用量および投与は、米国特許第５，６５４，１７３号（本明細
書中に参考として援用される）に記載される。治療剤はまた、米国特許第５，６
５４，１７３号に記載のように、本発明の核酸によってコードされるタンパク質
およびポリペプチドに対する抗体を含む。
【０３６６】 （Ｆ．遺伝子治療） 本発明の治療核酸は、遺伝子送達ビビクル中で利用され得る。この遺伝子送達
ビビクルは、ウイルス起源または非ウイルス起源であり得る（一般的に、Ｊｏｌ
ｌｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−６４；
Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５
−８５２；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９
５）１：１８５−１９３；およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ（１９９４）６：１４８−１５３を参照のこと）。本発明の治療剤のコード
配列を含む構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所的または全身的の
いずれかで投与され得る。これらの構築物は、ウイルスベクターアプローチまた
は非ウイルスベクターアプローチを利用し得る。このようなコード配列の発現は
、内因性の哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して、誘導され
得る。このコード配列の発現は、構成的または調節性のいずれかであり得る。
【０３６７】 本発明は、目的の選択された核酸分子を運搬または発現するために構築される
組換えレトロウイルスを使用し得る。使用され得るレトロウイルスベクターとし
ては、以下のものに記載されるベクターが挙げられる：ＥＰ ０４１５７３１；
ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９
３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３／１１２３０；Ｗ
Ｏ９３／１０２１８；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９
９３）５３：３８６０−３８６４；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．（１９９３）５３：９６２−９６７；Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（
１９９３）５３：８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒ
ｅｓ．（１９９２）３３：４９３−５０３；Ｂａｂａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒ
ｇ．（１９９３）７９：７２９−７３５；米国特許第４，７７７，１２７号；Ｇ
Ｂ特許第２，２００，６５１号；ならびにＥＰ０３４５２４２．好ましい組換え
レトロウイルスとしては、ＷＯ９１／０２８０５に記載のレトロウイルスが挙げ
られる。
【０３６８】 上記のレトロウイルスベクター構築物を用いる使用に適切なパッケージング細
胞株は、容易に調製され得（ＰＣＴ公開ＷＯ９５／３０７６３およびＷＯ９２／
０５２６６を参照のこと）、そして組換えベクター粒子の産生のためのプロデュ
ーサー細胞株（ベクター細胞株とも呼ばれる）を作製するために使用され得る。
本発明の特に好ましい実施態様において、パッケージング細胞株は、ヒト親細胞
株（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製され、これによ
って、ヒト血清における不活化を耐え得る組換えレトロウイルスの産生を可能に
する。
【０３６９】 本発明はまた、遺伝子送達ビビクルとして機能し得る、アルファウイルスベー
スのベクターを使用する。このようなベクターは、広範な種々のアルファウイル
スから構築され得、これらとしては、例えば、シンドビスウイルスベクター、セ
ムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロ
ス川ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベ
ネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５
０；ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）が挙げられる。この
ようなベクター系の代表的な例としては、米国特許第５，０９１，３０９号；同
第５，２１７，８７９号；および同第５，１８５，４４０号；ならびにＰＣＴ公
開番号ＷＯ９２／１０５７８；ＷＯ９４／２１７９２；ＷＯ９５／２７０６９；
ＷＯ９５／２７０４４；およびＷＯ９５／０７９９４に記載のベクターが挙げら
れる。
【０３７０】 本発明の遺伝子送達ビビクルはまた、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
のようなパルボウイルスを使用し得る。代表的な例としては、Ｓｒｉｖａｓｔａ
ｖａ（ＷＯ９３／０９２３９）、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９
）６３：３８２２−３８２８；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．（１９８８
）１６６：１５４−１６５；およびＦｌｏｔｔｅら、ＰＮＡＳ（１９９３）９０
：１０６１３−１０６１７によって開示されるＡＡＶベクターが挙げられる。
【０３７１】 アデノウイルスベクターの代表的な例としては、以下のものに記載されるアデ
ノウイルスベクターが挙げれられる：Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ（１９８８）６：６１６−６２７；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
（１９９１）２５２：４３１−４３４；ＷＯ／９３／１９１９１；Ｋｏｌｌｓら
、ＰＮＡＳ（１９９４）９１：２１５−２１９；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐ
ＮＡＳ（１９９３）９０：１１４９８−１１５０２；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃ
ｕｌａｔｉｏｎ（１９９３）８８：２８３８−２８４８；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉ
ｒ．Ｒｅｓ（１９９３）７３：１２０２−１２０７；Ｚａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ
（１９９３）７５：２０７−２１６；Ｌｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（
１９９３）４：４０３−４０９；Ｃａｉｌａｕｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉ．（１９９３）５：１２８７−１２９１；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｎａｔ．Ｇｅ
ｎｅｔ．（１９９３）５：１３０−１３４；Ｊａｆｆｅら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ
．（１９９２）１：３７２−３７８；およびＬｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ（１９
９１）１０１：１９５−２０２。本発明において使用可能な例示的なアデノウイ
ルス遺伝子治療ベクターとしてはまた、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３
７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４
およびＷＯ９５／００６５５に記載のベクターが挙げられる。Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈ
ｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７−１５４に記載のような殺
傷したアデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与が、使用され得る。
【０３７２】 他の遺伝子送達のビヒクルおよび方法が使用され得、これらとしては、殺傷し
たアデノウイルス単独に連結されたか、または連結されていないポリカチオン性
縮合ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９２
）３：１４７−１５４）；リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１６９８５−１６９８７を参照のこと）；真核
生物細胞送達ビビクル細胞（例えば、米国特許出願第０８／２４０，０３０号（
１９９４年５月９日出願）および米国特許出願第０８／４０４，７９６号を参照
のこと）；光重合化ヒドロゲル材料の沈着；米国特許第５，１４９，６５５号に
記載されるような、手持ち型遺伝子移入パーティクルガン；米国特許第５，２０
６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載のような、電離放射線；核電荷
中和（ｎｕｃｌｅｉｃ ｃｈａｒｇｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）または
細胞膜との融合が挙げられる。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９４）１４：２４１１−２４１８、およびＷｏｆｆ
ｅｎｄｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５
８１−１５８５に記載される。
【０３７３】 裸のＤＮＡもまた、使用され得る。例示的な裸のＤＮＡの導入方法は、ＷＯ９
０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。取り込み
効率は、生分解性ラテックスビーズを使用して改善され得る。ＤＮＡをコートし
たラテックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシスの開始後に細胞内へ効
率的に輸送される。この方法は、疎水性を増加するようビーズを処理することに
よってさらに改善され得、そしてこれによって、エンドソームの破壊およびＤＮ
Ａの細胞質への放出を促進し得る。遺伝子送達ビビクルとして作用し得るリポソ
ームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ番号ＷＯ９５／１３７９６、
ＷＯ９４／２３６９７およびＷＯ９１／１４４４５、ならびにＥＰ第０５２４９
６８号に記載される。
【０３７４】 使用に適切なさらなる非ウイルス性送達としては、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）９１（２４）：１１
５８１−１１５８５に記載されるアプローチのような、機械的送達系が挙げられ
る。さらに、コード配列およびその発現産物は、光重合化ヒドロゲル材料の沈着
によって送達され得る。コード配列の送達に使用され得る、遺伝子送達のための
他の従来の方法としては、例えば、米国特許第５，１４９，６５５号に記載され
るような、手持ち型遺伝子パーティクルガンの使用；米国特許第５，２０６，１
５２号およびＰＣＴ番号ＷＯ９２／１１０３３に記載のような、移入された遺伝
子を活性化するための電離放射線の使用が挙げられる。
【０３７５】 （Ｇ．トランスジェニック動物） 本発明の１つの局面は、生殖系列細胞および／または体細胞を有するトランス
ジェニック非ヒト動物に関し、ここで、１以上の遺伝子の生物学的活性は、染色
体に組込まれた導入遺伝子によって変更される。
【０３７６】 好ましい実施態様において、この導入遺伝子は、野生型タンパク質の生物学的
機能の少なくとも一部と拮抗するドミナントネガティブなタンパク質のような、
変異体タンパク質をコードする。
【０３７７】 なお別の好ましいトランスジェニック動物は、アンチセンス転写物をコードす
る導入遺伝子を含み、このアンチセンス転写物は、導入遺伝子から転写される場
合、ある遺伝子またはそのｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、そしてその遺伝
子の発現を阻害する。
【０３７８】 １つの実施態様において、本発明は、所望の非ヒト動物または動物（ヒトを含
む）細胞を提供し、これらは、この非ヒト動物または動物細胞を癌に罹りやすく
する、予め定義された、特定かつ所望の変更を含む。具体的には、本発明は、腫
瘍抑制遺伝子の２つの対立遺伝子の少なくとも１つを欠損する、遺伝的に変更さ
れた非ヒト動物（最も好ましくは、マウス）、または培養物中の細胞（非ヒト動
物またはヒトのいずれか）に関する。これらの腫瘍抑制対立遺伝子の少なくとも
１つの不活化は、腫瘍誘導、または他の増殖性もしくは分化性障害、あるいは異
常なシグナル伝達（例えば、サイトカインまたは増殖因子からの）によって特徴
付けられる障害に、より高い感受性を有する動物を生じる。この型の遺伝的に変
更されたマウスは、遺伝性の癌について有用なモデルおよび発癌物質研究のため
の試験動物として役立ち得る。本発明はさらに、研究および医薬における、この
ような非ヒト動物または動物細胞、およびこれらの子孫の使用に関する。
【０３７９】 さらに、本発明のトランスジェニック動物の細胞は、他の導入遺伝子（例えば
、第２の腫瘍抑制遺伝子または癌遺伝子の生物学的活性を変更する導入遺伝子）
を含み得ることが意図される。例えば、この第２の導入遺伝子は、第２の腫瘍抑
制遺伝子（例えば、ｐ５３、ｐ７３、ＤＣＣ、ｐ２１cip1、ｐ２７kip1、Ｒｂ、
ＭａｄまたはＥ２Ｆ）の生物学的活性を機能的に破壊し得る。あるいは、この第
２の導入遺伝子は、以下のような癌遺伝子の過剰発現または調節の損失を引き起
こし得る：ｒａｓ、ｍｙｃ、ｃｄｃ２５ホスファターゼ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−
６、トランスフォーミング増殖因子、ｎｅｕ、ｉｎｔ−３、ポリオーマウイルス
ミドルＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスＥ６タンパク質、パ
ピローマウイルスＥ７タンパク質、ＣＤＫ４、またはサイクリンＤ１。
【０３８０】 本発明の好ましいトランスジェニック非ヒト動物は、ある遺伝子の１以上の対
立遺伝子が、染色体に組込まれた導入遺伝子によって破壊される、生殖系列細胞
および／または体細胞を有する。ここで、この導入遺伝子は、このトランスジェ
ニック動物の細胞中のこの導入遺伝子の存在を同定するための、検出可能なシグ
ナルを提供するマーカー配列を含み、そしてその遺伝子の少なくとも一部を置換
するか、その遺伝子の中に挿入されるか、野生型タンパク質の発現を破壊する。
【０３８１】 本発明のなお別の局面は、機能的に破壊された内因性の遺伝子を有する、ヒト
以外の動物およびそれを有する幹細胞を作製するための方法に関する。好ましい
実施態様においては、この方法は以下の工程を包含する： （ｉ）以下を含有するトランスジーン構築物を構築する工程：（ａ）遺伝子の
少なくとも一部を有する組換え領域（ここで、この組換え領域は、この遺伝子と
のトランスジーンの組換えを指向する）、および（ｂ）マーカー配列（これは、
このトランスジーンの存在を細胞中で同定するための検出可能なシグナルを提供
する）； （ｉｉ）このトランスジーンをヒト以外の動物の幹細胞に移入する工程； （ｉｉｉ）トランスジーンとこの遺伝子との間に正確に標的化された相同組換
えを有する幹細胞を選択する工程； （ｉｖ）ヒト以外の胚盤胞中に工程（ｉｉｉ）で同定した細胞を移入し、そし
て得られたキメラ胚盤胞をヒト以外の雌性に移植する工程；ならびに （ｖ）正確に標的化された組換えを有する内因性遺伝子対立遺伝子を有する子
孫を回収する工程。
【０３８２】 本発明のなお別の局面は、以下によって、薬剤の発癌性の可能性を評価するた
めの方法を提供する：（ｉ）本発明のトランスジェニック動物と試験薬剤とを接
触させる工程、および（ｉｉ）処置した動物由来のサンプル中の形質転換された
細胞の数を、未処置のトランスジェニック動物またはコントロール薬剤で処置し
たトランスジェニック動物に由来するサンプル中の形質転換された細胞の数と比
較する工程。コントロール薬剤での処置の非存在下で形質転換された細胞の数と
比較した、処置された動物中での形質転換された細胞の数における差異は、この
試験化合物が発癌性である可能性を示す。
【０３８３】 本発明の別の局面は、試験化合物の抗増殖性活性を評価する方法を提供する。
好ましい実施態様においては、この方法は、本発明のトランスジェニック動物ま
たはこのような動物に由来する細胞のサンプルを、試験薬剤と接触させる工程、
およびトランスジェニック動物に由来する標本中かまたは細胞のサンプル中の、
形質転換された細胞の数を決定する工程を包含する。試験薬剤の非存在下で形質
転換された細胞の数と比較した、形質転換された細胞の数における統計学的に有
意な減少は、試験化合物が抗増殖性の薬剤である可能性を示す。
【０３８４】 本発明の実施は、他に記載されない限りは、細胞生物学、細胞培養、分子生物
学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来
技術（これらは当該分野の技術範囲内である）を使用する。このような技術は、
文献において完全に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、
ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）
；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇ
ｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａ
ｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ
，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．
Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，
Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍ
ａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、
１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４巻および第１５５巻（
Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ
Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅ
ｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ−ＩＶ
巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；Ｍａ
ｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）を参照のこと。
【０３８５】 上記のように、本明細書中で記載されている配列は、結腸癌に関して特定の有
用性を有すると考えられる。しかし、これらはまた、他の型の癌および他の疾患
状態に関しても有用であり得る。
【０３８６】 本発明は、特定の有利な実施態様を示す以下の実施例を参照してここで説明さ
れる。しかし、これらの実施態様は、例示的であって、そして本発明をいかよう
にも制限するようには解釈されないことが留意されるべきである。
【０３８７】 （ＸＩ．実施例） （Ａ．示差的に発現される配列の同定） （ライブラリーの説明） 配列番号１〜５４４を、以下に記載されるように、ＤＥおよびＰＡと称される
ライブラリーから誘導した。ＤＥライブラリーは、標準化された、結腸癌特異的
なサブトラクトされたｃＤＮＡライブラリーである。ＤＥライブラリーは、結腸
癌［近位および遠位のデュークスＢ、マイクロサテライト不安定性陰性（ＭＳＩ
−）］中で発現される配列について特異的であるが、正常な組織（正常な結腸組
織を含む）中では発現されない。ＰＡライブラリーは、標準化された、結腸特異
的なサブトラクトされたｃＤＮＡライブラリーである。ＰＡライブラリーは、正
常結腸組織において発現される配列に特異的であるが、他の正常組織において発
現されない。
【０３８８】 （結腸癌特異的なライブラリーの構築） サブトラクトされた結腸癌特異的なライブラリーを、結腸、末梢血白血球（Ｐ
ＢＬ）、肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、小腸、骨格筋、および前立腺組織のｃＤ
ＮＡから作製された、プールしたドライバー正常ｃＤＮＡの組み合わせに対して
、近位のＢ段階ＭＳＩ-および遠位のＢ段階ＭＳＩ-のプールした腫瘍組織のｃＤ
ＮＡをサブトラクトすることにより作製した。以下のＲＮＡサンプルを、Ｏｒｉ
ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒ
ｙｌａｎｄから入手し、そしてこれを使用してプールしたドライバーｃＤＮＡを
合成した：＃ＨＴ−１０１５正常結腸総ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００５肝臓総ＲＮＡ
、＃ＨＴ−１００４脾臓総ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００９肺総ＲＮＡ、＃ＨＴ−１０
０３腎臓総ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００６末梢血白血球総ＲＮＡ、＃ＨＴ−前立腺総
ＲＮＡ、＃ＨＭ−１００２心筋ポリＡ＋ＲＮＡ、＃ＨＭ−１００７腸ポリＡ＋Ｒ
ＮＡ、および＃ＨＭ−１００８骨格筋ポリＡ＋ＲＮＡ。第一鎖ｃＤＮＡを、それ
ぞれ、１マイクログラムのＲＮＡを使用して調製した。第一鎖ｃＤＮＡの偏りの
あるプールを調製した。これは、５０％の正常結腸の第一鎖ｃＤＮＡ反応および
各々５．５６容量％の残りの組織の第一鎖ｃＤＮＡ反応を含んだ。８つの個々の
増幅反応（各々は、１マイクロリッターの偏りのある第一鎖ｃＤＮＡ反応プール
を含む）を、１８サイクル行った。８つ全ての増幅反応からの二本鎖ｃＤＮＡ産
物を、後のサブトラクティブハイブリダイゼーションでの使用のためにプールし
そして精製した。結腸癌に特異的なサブトラクトされたライブラリーをＤＥと呼
び、そしてこのライブラリーに由来する個々のクローンをＤＥの後に番号を付け
て称した。
【０３８９】 標準化されサブトラクトされたＤＥ結腸癌特異的ｃＤＮＡライブラリーおよび
プールした正常ヒト組織特異的ｃＤＮＡライブラリー（上記のドライバーｃＤＮ
Ａの成分としては同じ）を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｅｉｓ，Ｉ
ｎｃ．，ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡサブトラクションキット（ＰＴ１１１
７−１）を使用して、公表された手順（Ｄａｉｔｃｈｅｎｋｏら，１９９６ Ｐ
ＮＡＳ ９３：６０２５−６０３０、Ｇｕｒｓｋａｙａら，１９９６ Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４０：９０−９７）に従って生成
した。各サブトラクション実験のために、４５倍重量が過剰なドライバーｃＤＮ
Ａ（４５０ナノグラム）を使用した。テスターｃＤＮＡのドライバーｃＤＮＡと
のサブトラクティブハイブリダイゼーションを２回行った（各時間は約８〜１２
時間）。サブトラクトした癌特異的なＤＥ ｃＤＮＡを、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰ
Ｏプラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａ
ｒｌｓｂａｄ ＣＡ）に連結し、そしてウルトラコンピテントＥｐｉｃｕｒｉａ
ｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊ
ｏｌｌａ，ＣＡ）に化学的に形質転換した。逆ライブラリーもまた構築した（こ
こで、テスターサンプルとドライバーサンプルとを交換した）；このライブラリ
ーをＭＤと称した。
【０３９０】 （正常結腸特異的ライブラリーの構築） この正常結腸組織特異的ライブラリーを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔキット（Ｋ１８０４−１）をユーザ
ーズマニュアル（ＰＴ１１１７−１）の指示に従って使用して作製した。
【０３９１】 各々の正常非癌性患者サンプルからの４つのＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ｃＤＮＡ増
幅反応（１００μｌ）を行った。この反応は、それらのそれぞれの第一鎖ｃＤＮ
Ａ反応物からの１μｌを用いて開始した。各サンプルを、以下のＰＣＲ条件を使
用して１８サイクルのみ増幅した；９５℃−１０秒、６８℃−５分、９６００Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ装置を使用。以下は、増幅したｃＤＮＡサンプルのＢａ
ｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃサンプル識別番号である：ＮＰＢ（−）２７３４
７、ＮＰＢ（−）２７８５９、ＮＰＢ（−）２８１４７、ＮＰＢ（−）２８１６
２、ＮＤＢ（−）２８８００、ＮＤＢ（−）２９２４３、ＮＤＢ（−）２９２４
４、およびＮＤＢ（−）４２４７２。これらは、近位のＢ段階ＭＳＩ−および遠
位のＢ段階ＭＳＩ−癌サンプルを提供する、同じ患者から得られた正常結腸組織
サンプルであり、これらは、上記したＤＥライブラリーを作製するために使用さ
れた。等容積の８つの正常結腸ｃＤＮＡをプールした。サブトラクトした正常結
腸組織特異的ライブラリーを、末梢血白血球（ＰＢＬ）、肝臓、脾臓、肺、腎臓
、心臓、小腸、骨格筋、および前立腺組織のｃＤＮＡから作製された、プールし
たドライバー正常ｃＤＮＡの組み合わせに対して、正常結腸ｃＤＮＡプールをサ
ブトラクトすることによって作製した。以下は、プールしたドライバーｃＤＮＡ
を合成するために使用したＲＮＡサンプルである：＃ＨＴ−１００５肝臓総ＲＮ
Ａ、＃ＨＴ−１００４脾臓総ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００９肺総ＲＮＡ、＃ＨＴ−１
００３腎臓総ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００６末梢血白血球総ＲＮＡ、＃ＨＴ−前立腺
総ＲＮＡ、＃ＨＭ−１００２心筋ポリＡ＋ＲＮＡ、＃ＨＭ−１００７腸ポリＡ＋
ＲＮＡ、および＃ＨＭ−１００８骨格筋ポリＡ＋ＲＮＡ。第一鎖ｃＤＮＡを、そ
れぞれ、１マイクログラムのＲＮＡを使用して調製した。次いで、第一鎖ｃＤＮ
Ａ反応物のプールを作製し、これは、等容積の９つのドライバー組織第一鎖ｃＤ
ＮＡ反応物からなった。８つの個々の増幅反応（各々は、１マイクロリッターの
第一鎖ｃＤＮＡ反応プールを含む）を、１８サイクル行った。８つ全ての増幅反
応からの二本鎖ｃＤＮＡ産物を、後のサブトラクティブハイブリダイゼーション
での使用のためにプールしそして精製した。正常結腸組織に特異的なサブトラク
トされたライブラリーをＰＡと呼び、そしてこのライブラリーに由来する個々の
クローンをＰＡの後に番号を付けて称した。
【０３９２】 標準化されサブトラクトされたＰＡ正常結腸特異的ｃＤＮＡライブラリーおよ
びサブトラクトされた正常ヒト組織特異的ｃＤＮＡライブラリー（上記に列挙し
たヒト組織からなる）を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．，ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡサブトラクションキット（ＰＴ１１１７
−１）を使用して、公表された手順（Ｄａｉｔｃｈｅｎｋｏら，１９９６ ＰＮ
ＡＳ ９３：６０２５−６０３０、Ｇｕｒｓｋａｙａら，１９９６ Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４０：９０−９７）に従って生成し
た。ライブラリー構築およびクローニングを、結腸癌特異的ライブラリーについ
て上記のように実行した。示差的発現について分析した１１５２クローンのうち
、約６９％が示差的に発現した。
【０３９３】 サブトラクトライブラリーを作製するために使用したｃＤＮＡは、ＲｓａＩ（
平均サイズ約６００塩基対のフラグメントを生成する４つの塩基カッター制限エ
ンドヌクレアーゼ）で制限されていたので、上記のライブラリーの各々から単離
された各ＥＳＴは、部分的なｍＲＮＡ転写物に由来する配列に相当する。
【０３９４】 （結腸癌中での示差的な発現の確認） このライブラリー中に見出された示差的に発現された配列が結腸癌に特異的で
あることを確認するために、結腸癌特異的ライブラリー（Ｄｅｌａｗａｒｅ（Ｄ
Ｅ））および正常な組織特異的ライブラリー（Ｍａｒｙｌａｎｄ（ＭＤ））から
調製したｃＤＮＡを用いて、クローンをスクリーニングした。
【０３９５】 ｃＤＮＡクローンを、公表された方法（Ｊｉｎら，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ ２３：１０８３−１０８６）に従って合成したプローブを使用し
て、ｖｏｎ Ｓｔｅｉｎら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ２５（１３）：２５９８−２６０２によって開発された手順に従って
、示差発現について分析した。示差的発現について分析した１２４８クローンの
うち、約８３％が示差的に発現した。
【０３９６】 （示差的に発現されるクローンの配列決定および分析） 示差的に発現されることが示されているクローンに由来する挿入物のヌクレオ
チド配列を、サンガー配列決定法により、蛍光標識したジデオキシヌクレオチド
を使用する、Ｔ７またはＭ１３プロモーター部位のいずれかからの一通過（ｓｉ
ｎｇｌｅ−ｐａｓｓ）の配列決定によって決定した。配列を、本文（ＸＩ．，実
施例；Ｂ．公のデータベース検索の結果）に記載される方法に従って分析した。
【０３９７】 各核酸は、少なくとも部分的なｍＲＮＡ転写物に由来する配列に相当する。本
発明の核酸に、配列識別番号（添付物を参照のこと）を割り当てた。核酸配列は
、添付した配列表に提供される。
【０３９８】 示差的に発現されるクローンを同定するための実験の例を、図「示差的発現の
分析」に示す。サブトラクトしたクローンに由来する挿入物を、上記のように増
幅し、電気泳動し、そしてメンブレン上にブロットした。このゲルを、上記のよ
うに、ＲＳＡ１で切断したＤＥおよびＭＤのｃＤＮＡプローブとハイブリダイズ
させた。
【０３９９】 図において、個々のクローンを各レーンの上部に番号で示す；ブロットを、同
じクローンが上部（「癌プローブ」）および下部（「正常なプローブ」）のブロ
ットの両方において同じ縦のレーンに示されるように配置する。「Ｏ」で表示さ
れたレーンは、過剰発現されるクローン（すなわち、同じレーン中で、下部のブ
ロット（「正常なプローブ」）において観察されるバンドと比較して、上部のブ
ロット（「癌プローブ」）においてより濃い、より顕著なバンドを示す）を示す
。「Ｕ」で表示されたレーンは、過少発現されるクローン（すなわち、同じレー
ン中で、上部のブロット（「癌プローブ」）において観察されるバンドと比較し
て、下部のブロット（「正常なプローブ」）においてより濃い、より顕著なバン
ドを示す）を示す。「Ｍ」で表示されたレーンは、癌細胞および正常細胞でわず
かに過剰発現されるクローンを示す。
【０４００】 Ｂ．公のデータベース検索の結果 配列番号１〜５４４のヌクレオチド配列は、公に利用可能である個々の配列と
ともにアラインメントされた。ＧｅｎｂａｎｋおよびＧｅｎＢａｎｋの部門（例
えば、ｄｂＥＳＴ、ＣＧＡＰ、およびＵｎｉｇｅｎｅ）は、配列類似性検索を行
うために使用した主なデータベースであった。特許データベースＧＥＮＥＳＥＱ
もまた利用した。
【０４０１】 全部で５４４個の配列を分析した。配列をベクターに由来する配列を同定する
ためにまずマスクし、続いてこれを除去した。残りの配列情報を、配列表（配列
番号１〜５４４）を作製するために使用した。これらの配列のそれぞれを、上記
に列挙したデータベースに対するＢｌａｓｔ２検索を行うために、問い合わせ配
列として使用した。Ｂｌａｓｔ２検索は、これが２つの配列の最適なアラインメ
ントを生じるためにギャップの導入することを可能にするという点で、伝統的な
Ｂｌａｓｔ検索とは異なる。
【０４０２】 専有のアルゴリズムを開発してＢｌａｓｔ２検索による出力を利用し、そして
高い類似性（ｅ値＜１ｅ−４０）またはＧｅｎｂａｎｋデータベースおよびｄｂ
ＥＳＴデータベース中に含まれるエントリーに対する同一性に基づいて、配列を
分類した。以下のような３つのカテゴリーを作製した：１）既知のヒト遺伝子に
一致するもの、２）ヒトのＥＳＴ配列に一致するもの、および３）１または２の
いずれにも有意に一致せず、従って潜在的に新規のヒト配列であるもの。
【０４０３】 当業者は、本明細書中に記載される本発明の特定の実施態様に対する多くの等
価物を、せいぜい慣用的な実験を使用して認識するかまたは確認し得る。このよ
うな特定の実施態様および等価物は、上記の特許請求の範囲によって包含される
ことが意図される。
【０４０４】 本明細書中で引用される全ての特許、公開された特許出願、および刊行物は、
本明細書中で十分に示されるのと同様に、参考として援用される。
【０４０５】
【表１】 *１９９８年８月３１日出願の仮出願（６０／０９８，６３９）において、ク
ローンＰＡ０２９３ｔ７を誤ってクローンＰＡ００２３ｔ７と表示した。その誤
りを正確なクローン名を反映するようにここにおいて訂正した。
【０４０６】
【表２】
【０４０７】
【表３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、細胞中の遺伝子産物の示差的な発現を決定するための例示的なアッセ
イ結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 16/32 ４Ｂ０６５ Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ ４Ｃ０８４ Ｃ０７Ｋ 14/82 1/40 Ｂ ４Ｈ０４５ 16/32 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｍ 1/00 1/19 1/40 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/19 1/68 Ａ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/574 Ａ 1/68 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ 33/574 Ｆ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (71)出願人 100 Ｂａｙｅｒ Ｒｏａｄ， Ｐｉｔｔ ｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ 15205，ＵＳＡ (72)発明者 スタインマン， キャサリーン イー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01890， ウィンチェスター， ユニット ３ビー， ワシントン ストリート 115 (72)発明者 アストル， ジョン エイチ． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02780， タウントン， ショート スト リート 42 (72)発明者 バーゲス， クリストファー シー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02090， ウエストウッド， カントン テラス 97 (72)発明者 キャロル， エディー ザ サード アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02062， ノーウッド， ワシントン ス トリート 1175， アパートメント ３ (72)発明者 カティーノ， セオドア ジェイ． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02702， アトルボロ， ジョー ポール ドライブ 18 (72)発明者 ドウィベディ， プアーニマ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02052， メドフィールド， ヘイベン ロード 10 (72)発明者 フォード， ドナ エム． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02762， プレインビル， モーニングサ イド ロード ８ (72)発明者 ルイス， マーシャ イー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02025， コハセット， ウィールライト ファーム 67 (72)発明者 モリノ， ゲイリー エイ． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02056， ノーフォーク， エセックス ストリート ３ (72)発明者 モナハン， ジョン イー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02081， ウォルポール， ウエスト ス トリート 942 (72)発明者 シュルゲル， ロバート アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02466， オウバーンデール， メルロー ズ ストリート 211 Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA40 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 AA19 BA41 BA80 CA04 CA09 CA12 DA02 DA05 DA12 EA04 FA01 GA11 HA12 HA13 HA15 HA17 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 FA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ13 QQ18 QQ53 QR01 QR32 QR56 QR62 QR82 QS11 QS25 QS33 QS34 QX02 4B064 AG01 AG27 CA02 CA06 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA72X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 CA18 CA25 CA53 NA14 ZB262 4H045 AA10 AA11 BA10 CA41 DA75 DA76 EA28 EA51 FA72 FA73 FA74

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１〜３５の配列またはそれらに相補的な配列に対し
    てストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単
    離された核酸。
  2. 【請求項２】 配列番号１〜３５のうちの１つまたはそれに相補的な配列の
    少なくとも約１５個の連続するヌクレオチドに対応する配列と少なくとも８０％
    同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  3. 【請求項３】 配列番号１〜３５のヌクレオチド配列またはそれに相補的な
    配列を含む、単離された核酸。
  4. 【請求項４】 前記ヌクレオチド配列を発現ベクターとしての使用に適切に
    するために、該ヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節配列をさらに
    含む、請求項１に記載の核酸。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載の核酸を含む、原核生物細胞および真核生物
    細胞の少なくとも１つにおいて複製が可能である、発現ベクター。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた、
    宿主細胞。
  7. 【請求項７】 トランスジェニック動物であって、該動物の細胞中に取り込
    まれた請求項１に記載の核酸のトランスジーンを有し、ここで、該トランスジー
    ンが、該核酸の発現のレベル、該核酸のｍＲＮＡ転写物の安定性、または該核酸
    のコードされる産物の活性を改変する、トランスジェニック動物。
  8. 【請求項８】 配列番号１〜１６８のうちの１つまたはそれに相補的な配列
    の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドに対応する核酸プローブに対してス
    トリンジェントな条件下でハイブリダイズする、実質的に純粋な核酸。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載の核酸によってコードされるアミノ酸配列ま
    たはその少なくとも２５個のアミノ酸を含むフラグメントを含む、ポリペプチド
    。
  10. 【請求項１０】 実質的に純粋なオリゴヌクレオチドを含有するプローブ／
    プライマーであって、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１６８から選択さ
    れるセンス配列またはアンチセンス配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオ
    チドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
    の領域を含有する、プローブ／プライマー。
  11. 【請求項１１】 固相支持体に付着された、請求項１０に記載の少なくとも
    １０個の異なるプローブを含むアレイ。
  12. 【請求項１２】 請求項１０に記載のプローブ／プライマーであって、該プ
    ローブ／プライマーに付着されており、そして検出され得る標識基をさらに含む
    、プローブ／プライマー。
  13. 【請求項１３】 前記標識基が、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、およ
    び酵素補因子から選択される、請求項１２に記載のプローブ／プライマー。
  14. 【請求項１４】 請求項９に記載のポリペプチドと免疫反応性である、抗体
    。
  15. 【請求項１５】 配列番号１〜３５のうちの１つまたはそれに相補的である
    配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドに対してストリンジェントな条
    件下でハイブリダイズし、そしてヌクレアーゼによる切断に対して耐性である、
    アンチセンスオリゴヌクレオチドアナログ。
  16. 【請求項１６】 患者から単離された細胞のサンプル中の配列番号１〜５４
    ４の核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸のレベル
    を測定するための、請求項１２に記載のプローブ／プライマーを含有する、形質
    転換された細胞の表現型を決定するための試験キット。
  17. 【請求項１７】 配列番号１〜５４４の核酸のいずれか１つに対してストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質
    に対して特異的な抗体を含有する、形質転換された細胞の表現型を決定するため
    の、試験キット。
  18. 【請求項１８】 細胞の表現型を検出する方法であって、以下：配列番号１
    〜５４４の１つに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なく
    とも１つの核酸の、正常な細胞と比較して示差的な発現を検出する工程であって
    、ここで、該核酸が、少なくとも２倍示差的に発現される、工程を包含する、方
    法。
  19. 【請求項１９】 患者由来の細胞のサンプル中の細胞の表現型を決定するた
    めの方法であって、以下： ｉ．配列番号１〜５４４のいずれかの少なくとも１２個の連続するヌクレオチ
    ドを有するヌクレオチド配列を含む核酸プローブを提供する工程； ｉｉ．患者から細胞のサンプルを得る工程； ｉｉｉ．実質的に全てが非癌性である、細胞の第２のサンプルを提供する工程
    ； ｉｖ．該核酸プローブを、該第１の細胞サンプルおよび第２の細胞サンプルの
    それぞれのｍＲＮＡとストリンジェントな条件下で接触させる工程；ならびに ｖ．（ａ）該第１の細胞のサンプルのｍＲＮＡとの該プローブのハイブリダイ
    ゼーションの量と、（ｂ）該第２の細胞のサンプルのｍＲＮＡとの該プローブの
    ハイブリダイゼーションの量とを比較する工程であって、ここで、該第２の細胞
    のサンプルのｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比較した場合の、該第
    １の細胞のサンプルのｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量における、少な
    くとも２倍の差異は、該第１の細胞のサンプル中の細胞の表現型の指標である、
    工程 を包含する、方法。
  20. 【請求項２０】 細胞の表現型を検出する方法であって、以下：配列番号１
    〜５４４の１つに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸に
    よってコードされる少なくとも１つのタンパク質の、正常な細胞と比較して示差
    的な発現を検出する工程であって、ここで、該タンパク質が、少なくとも２倍示
    差的に発現される、工程を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 前記タンパク質のレベルが、イムノアッセイにおいて検出
    される、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 細胞中の配列番号１〜１６８の１つに対してストリンジェ
    ントな条件下でハイブリダイズする核酸の存在または非存在を決定するための方
    法であって、請求項１０に記載のプローブと該細胞とを接触させる工程を包含す
    る、方法。
  23. 【請求項２３】 細胞中の配列番号１〜３５の１つに対してストリンジェン
    トな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドの存在
    または非存在を決定するための方法であって、請求項１４に記載の抗体と該細胞
    とを接触させる工程を包含する、方法。
  24. 【請求項２４】 配列番号１〜５４４の核酸またはそれらに相補的な配列に
    対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする試験核酸中の変異を検出
    するための方法であって、以下： ｉ．患者から細胞のサンプルを回収する工程、 ｉｉ．該サンプルの該細胞から核酸を単離する工程、 ｉｉｉ．該核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で
    、配列番号１〜５４４の核酸配列に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプラ
    イマーと、該核酸サンプルとを接触させる工程、ならびに ｉｖ．増幅産物の存在、非存在、または大きさを正常な細胞の増幅産物に対し
    て比較する工程 を包含する、方法。
  25. 【請求項２５】 配列番号１〜５４４の１つまたはそれに相補的な配列に対
    してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の細胞中での発現のレ
    ベルを変化させる薬剤を同定するための方法であって、以下： ｉ．細胞を提供する工程； ｉｉ．試験薬剤で該細胞を処理する工程； ｉｉｉ．配列番号１〜５４４の１つまたはそれに相補的な配列に対してストリ
    ンジェントな条件下ハイブリダイズする核酸の該細胞中での発現のレベルを決定
    する工程；ならびに ｉｖ．処理していない細胞中での該核酸の発現のレベルと該処理した細胞中で
    の該核酸の発現のレベルとを比較する工程であって、ここで、該処理していない
    細胞中の該核酸の発現のレベルと比較した、該処理した細胞中での該核酸の発現
    のレベルにおける変化は、細胞中の該核酸の発現のレベルを変化させる薬剤の指
    標である、工程 を包含する、方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２５に記載の方法によって同定された薬剤を含有す
    る、薬学的組成物。
  27. 【請求項２７】 請求項１〜５４４の１つまたはそれに相補的な配列に対し
    てストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸
    を含有する、薬学的組成物。
  28. 【請求項２８】 請求項１〜５４４の１つまたはそれに相補的な配列に対し
    てストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸
    によってコードされるポリペプチドを含有する、薬学的組成物。
  29. 【請求項２９】 配列番号３６〜１６８のヌクレオチド配列またはそれに相
    補的な配列の一部を含む、単離された核酸。
  30. 【請求項３０】 配列番号１〜３５の１つに対してハイブリダイズする、遺
    伝子。
  31. 【請求項３１】 配列番号１〜５４４の１つ以上がプローブとして使用され
    る、癌を検出するための方法であって、以下： ｉ．患者から細胞のサンプルを回収する工程、 ｉｉ．該サンプルの該細胞から核酸を単離する工程、 ｉｉｉ．該核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で
    、配列番号１〜５４４の核酸配列に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプラ
    イマーと、該核酸サンプルとを接触させる工程、ならびに ｉｖ．増幅産物の存在、非存在、または大きさを正常な細胞の増幅産物に対し
    て比較する工程 を包含する、方法。
  32. 【請求項３２】 前記癌が結腸癌である、請求項３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 患者のサンプル中の癌を検出するための方法であって、配
    列番号１〜５４４によってコードされるタンパク質に対する抗体を使用して該サ
    ンプル中のタンパク質と反応させる、方法。
  34. 【請求項３４】 前記癌が結腸癌である、請求項３３に記載の方法。
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