CN111257562A - 一种核酸适体鉴别靶标蛋白cd63的方法及其在克服黑素瘤威罗菲尼耐药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用核酸适体LL4A识别靶标蛋白CD63的方法。本发明还包括核酸适体LL4A在制备识别靶标蛋白CD63试剂中的应用，以及一种提高黑素瘤细胞对威罗菲尼敏感性的药物。本发明通过研究证实，核酸适体LL4A可以特异识别靶标蛋白CD63，且发现靶标蛋白CD63的表达和耐药黑素瘤对威罗菲尼的敏感性具有相关性，可通过敲低靶标蛋白CD63的表达改善敏感性。

Description

一种核酸适体鉴别靶标蛋白CD63的方法及其在克服黑素瘤威 罗菲尼耐药中的应用

技术领域

本发明涉及一种利用核酸适体进行靶标蛋白CD63的识别方法，以及一种核酸适体联合靶标蛋白CD63在识别威罗菲尼耐药黑素瘤以及克服威罗菲尼耐药上的应用。

背景技术

黑素瘤是所有皮肤癌中恶性程度与致死率最高的类型，是造成绝大多数皮肤癌患者死亡的主要原因。黑素瘤早期阶段可以通过外科手术切除治愈，但仍有一部分患者会出现转移性疾病，预后很差，5年生存率约为6％。对转移性黑素瘤一般采用以内科为主的治疗策略包括免疫治疗和靶向治疗，其中MAPK/ERK通路(由RAS→RAF→MEK→ERK等蛋白激酶组成)是黑素瘤中最常见的突变通路(发生几率超过80％)，大约50％的黑素瘤患者存在BRAF突变，而BRAF 突变中最常见的突变(>90％)为BRAFV600E。威罗菲尼(又称为PLX4032) 是BRAF V600的一种选择性抑制剂，已被美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)批准用于治疗BRAF V600突变的黑素瘤。该药可显著延长患者中位总生存期(OS)和中位无进展生存期(PFS)，但疗效维持时间通常只有6-9个月，几乎所有的患者在用BRAF抑制剂治疗后没有达到肿瘤消退，并且大多数对治疗有反应的患者最终产生获得性/继发性耐药机制，导致疾病进展。因此，鉴别和探究威罗菲尼产生耐药黑素瘤的标志蛋白和分子机制，研发基于耐药标志蛋白的新型探针和抑制剂对已产生威罗菲尼耐药的黑素瘤进行临床早期识别和治疗具有重大临床医学意义。

核酸适体是一类通常含有20～100个核苷酸的单链DNA或RNA寡核苷酸分子，通过指数富集的配基系统进化(Systematic Evolution ofLigands by Exponentialenrichment，SELEX)的过程从一个庞大的随机寡核苷酸库筛选、进化而获得。核酸适体可以特异性识别靶标，包括细胞、蛋白质分子、化学接头等。核酸适体具有结构多样性、靶分子广、亲和力高、特异性强等特点，同时，相比传统抗体，核酸适体分子量小、易改造修饰、制备方便且无免疫原性。这些理想的特性使核酸适体在药物开发，临床诊断和靶向治疗方面显示出巨大的应用前景。核酸适体不仅可以检测已知的肿瘤标志物，还可以用于发现人类癌症中潜在的新型生物标志物。此外，核酸适体以高亲和力识别并特异性结合其靶标，作为载体将治疗剂递送至其靶标，这是潜在利用这些分子进行诊断和靶向治疗的主要途径。例如通过共价交联，嵌入和自组装模式装载药物，或将siRNA通过连接臂连接在核酸适体末端，利用核酸适体高特异性、高亲和性识别、结合靶标，使得药物或siRNA 高效靶向呈递从而特异性杀死肿瘤细胞。

CD63属于四跨膜蛋白超家族成员。与健康人相比，黑素瘤患者的CD63血浆水平更高，表明CD63可作为黑素瘤的潜在生物标志物。有研究表明CD63在 BRAF突变的黑素瘤患者中显著高表达，是有效区分BRAF突变型与BRAF野生型黑素瘤的最佳基因之一。然而，也有研究发现在黑素瘤细胞中CD63与威罗非尼耐药性呈负相关，过表达CD63能抑制黑素瘤细胞增殖并增强其对威罗非尼的敏感性。因此，CD63在黑素瘤产生威罗非尼中的具体功能尚存在争议，在抗威罗非尼中的应用尚未知。

发明内容

本发明的目的是旨在克服现有的技术不足，提供一种利用核酸适体鉴别靶标蛋白CD63的方法。

本发明第二目的在于，提供一种核酸适体LL4A在制备识别靶标蛋白CD63 试剂中的应用。

本发明第三目的在于，提供一种提高黑素瘤细胞对威罗菲尼敏感性的药物。

一种识别靶标蛋白CD63的方法：是利用核酸适体LL4A进行识别：

所述的核酸适体LL4A的序列为：

5’-GCTGGACTCACCTCGACCAGAGCCATTGGGTTTCCTAGGAAATAGGGCCTTTACTATGAGCGAGCCTGGCG-3’(序列见序列表SEQ ID NO.1所示)。

本发明研究发现，核酸适体LL4A能够特异识别靶标蛋白CD63，有望用于科研等非治疗目的中。

作为优选，将所述的核酸适体LL4A连接上荧光物质与生物素。如此，可以得到与所述核酸适体LL4A具有相同结合CD63蛋白能力的核酸适体衍生物。

本发明为了鉴定核酸适体的靶标，方法为：

①通过胰蛋白酶实验证明核酸适体LL4A结合威罗菲尼耐药黑素瘤细胞的膜蛋白；

②利用低渗缓冲液提取细胞膜蛋白；

③将生物素标记的LL4A或文库与膜蛋白孵育，再与琼脂糖珠孵育，离心得到与LL4A、文库结合的蛋白；

④利用SDS-PAGE胶分离蛋白，分析LL4A与文库的差异蛋白；

⑤切出差异蛋白，酶解，上质谱分析蛋白样品；

⑥再利用免疫荧光、siRNA干扰等技术验证质谱结果。

本发明通过胰蛋白酶/蛋白酶K消化威罗菲尼耐药黑素瘤细胞检测发现核酸适体LL4A的结合靶标类型为膜蛋白；通过aptamer-pull down实验结合LC-MS/ MS QSTAR分析发现核酸适体LL4A的结合靶标为CD63蛋白；CD63在威罗菲尼耐药黑素瘤细胞中高表达且在细胞膜上与核酸适体LL4A共定位；利用siRNA 敲低威罗菲尼耐药黑素瘤细胞CD63的表达后细胞与核酸适体LL4A的结合能力显著降低；CD63纯化蛋白与LL4A结合亲和力分析。用siRNA敲低威罗菲尼耐药黑素瘤细胞CD63的表达后细胞对威罗菲尼敏感性增强。

本发明还提供了一种核酸适体LL4A在制备识别靶标蛋白CD63试剂中的应用，所述的试剂中至少包含可以识别靶标蛋白CD63的的核酸适体LL4A。

作为优选，所述的应用，所述的核酸适体LL4A上允许修饰荧光物质和/或生物素。

作为优选，所述的应用，所述的靶标蛋白CD63为威罗菲尼耐药黑素瘤细胞的膜蛋白；进一步优选为威罗菲尼耐药黑素瘤细胞的膜蛋白。

本发明应用方法，可以用于威罗菲尼耐药黑素瘤细胞和亲代黑素瘤细胞之间的差异化研究。

本发明还提供了一种提高黑素瘤细胞对威罗菲尼敏感性的药物，所述的药物为可敲低罗菲尼耐药黑素瘤细胞的蛋白CD63表达的物质。本发明研究发现，所述的黑素瘤细胞的敏感性和CD63的表达水平具有正关联性，可通过敲低CD63 表达，提升黑素瘤细胞对威罗菲尼敏感性。例如，可利用siRNA干扰CD63增强威罗菲尼耐药黑素瘤细胞对威罗菲尼敏感性。

本发明为了证明CD63能够增强黑素瘤对威罗菲尼的耐药性，提供的方法为：

①通过Western Blot检测CD63在威罗菲尼耐药黑素瘤细胞中高表达。

②利用siRNA干扰等技术检测敲低CD63蛋白表达增强威罗菲尼耐药黑素瘤细胞对威罗菲尼敏感性。

作为优选，所述的药物，所述的药物修饰在权利要求1所述的核酸适体LL4A 上。

有益效果

1、本发明提供了一种全新地识别靶标蛋白CD63的方法，有望用于癌症药物开发、非治疗目的科研等的研究。

2、本发明创新地发现，所述的核酸适体LL4A能够特异性地识别靶标蛋白 CD63。

3、本发明通过实验证实，所述核酸适体LL4A识别结合威罗菲尼耐药黑素瘤细胞的机制是通过结合细胞表面的CD63蛋白，CD63蛋白在威罗非尼耐药株中的表达显著高于亲代细胞，且干扰CD63能显著增强威罗非尼耐药细胞对威罗非尼的敏感性，这为威罗菲尼耐药黑素瘤的临床诊断和治疗研究提供了新的方法和手段。

附图说明

图1为胰蛋白酶/蛋白酶K实验鉴定核酸适体LL4A靶标类型；

图2.为利用aptamer-pull down实验，基于核酸适体LL4A结合的威罗菲尼耐药黑素瘤细胞Mel28-PLX细胞膜蛋白的跑胶结果，其中泳道1为总蛋白，2为空白珠子，3为文库，4为LL4A。B.质谱分析CD63的肽指纹图谱。

图3为Cy5标记的LL4A与FTIC标记的CD63抗体在Mel28-PLX细胞膜上共定位结果。Merge代表合并图。

图4为另一株威罗菲尼耐药黑素瘤细胞系A375-PLX中aptamer-pull down 实验，检测LL4A和CD63蛋白之间存在直接相互作用。

图5为CD63纯化蛋白与LL4A结合亲和力分析。

图6为用siRNA敲低CD63蛋白的Mel28-PLX细胞，适体LL4A与其结合情况。

图7为过表达CD63蛋白的A375-PLX细胞，适体LL4A与其结合情况。

图8为Western Blot检测CD63在威罗菲尼耐药黑素瘤细胞与亲代细胞中的表达。

图9为利用siRNA敲低CD63蛋白后威罗菲尼耐药黑素瘤细胞对威罗菲尼敏感性检测。

具体实施方式

以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定于本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买所得到的。

细胞来源：

以下实施例中用到的黑素瘤亲代细胞株SK-Mel28与A375购自美国ATCC 细胞库，所用威罗菲尼耐药黑素瘤细胞株Mel28-PLX与A375-PLX由本申请发明人课题组通过逐渐增加药物浓度的方法筛选获得。

Washingbuffer：PBS溶液中含以下物质：5mM MgCl₂，4.5g/L葡萄糖；

Binding buffer：PBS溶液中含以下物质：5mM MgCl₂，4.5g/L葡萄糖， 0.1mg/mLyeast tRNA，1mg/mLBSAand 20％FBS。

低渗缓冲液：取25.2mL的Washing buffer于50mL离心管中，分别向其中加入3mL10×cocktail，1.5mL 1M的Tris-HCl，300μL 100×的PMSF，震荡混匀后4℃保存。

膜蛋白裂解液：取5m L的低渗缓冲液于15m L的离心管中，向管中加入50μL 的Triton-X-100，4℃保存。

购买的试剂：

siRNA及转染试剂购于广州市锐博生物科技有限公司；序列为： 5-GGATGCAGGCAGATTTTAATT-3，(序列见序列表SEQ ID NO.2所示)。

DPBS、BSA、EDTA、胰蛋白酶、蛋白酶K、无血清DMEM培养基等购于赛默飞公司。

cocktail，PMSF，Triton-X-100购于sigma公司。

链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶珠购于GE公司。

实施例1：核酸适体LL4A的靶标类型鉴定

实验步骤如下：

(1)ssDNA的准备：取50μM核酸适体LL4A和文库(Library)，95℃变性 5min，冰上复性10min，离心4℃5000rpm，3min，加入Binding buffer使DNA 浓度为250nM，置于冰上待用。

ssDNA序列(LL4A)：

GCTGGACTCACCTCGACCAGAGCCATTGGGTTTCCTAGGAAATAGGGCCTTTACTATGAGCGAGCCTGGCG；

(2)细胞的准备：培养四个皿的Mel28-PLX细胞至对数生长期，2mLDPBS 洗两次，向其中两个皿分别加入200μl 0.25％胰蛋白酶和200μl 0.1mg/ml蛋白酶 K室温消化10min，另外两个皿分别加入0.2％的EDTA同等条件消化，随后加入500μl完全培养基终止消化，离心800rpm 4min，吸弃上清。用Washingbuffer 洗两遍，细胞计数板计数，使每组细胞数目为3×10⁵个。

(3)ssDNA与细胞的孵育：将上述随机文库链取200μl到EDTA消化的细胞中，将LL4A分别取200μl到另外三种方式消化的细胞中，重悬细胞轻轻吹打混匀，4℃摇床避光孵育1h，孵育完后，加入Washing buffer离心洗涤两次，加入500μl Washingbuffer，将准备好的待测样品过膜，使其分散成单个细胞，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。结果如图1所示，LL4A可以靶向识别经EDTA处理的Mel28-PLX细胞，而不能识别蛋白酶K和胰蛋白酶处理的Mel28-PLX细胞，说明LL4A结合的靶标类型为蛋白。

实施例2：核酸适体靶标质谱鉴定

1)提取细胞膜蛋白

(1)将Mel28-PLX细胞接种在10个10cm培养皿中，培养至对数期；

(2)吸弃旧培养基，DPBS清洗两次；

(3)无酶消化液消化后，用DPBS将细胞收集在15mL离心管中；

(4)用Washingbuffer离心洗涤，弃上清；

(5)向15mL离心管中加入相应量低渗缓冲液(300μL/皿)，震荡混匀后在4℃摇床30min。4000rpm，10min离心弃上清。再用低渗缓冲液洗涤3次；

(6)向离心管中加相应量膜蛋白裂解液(200μL/皿)，震荡混匀后在4℃裂解30min，离心保留上清，4000rpm，4℃，10min。保留的上清液即膜蛋白样品，-80℃保存。

2)PAGE胶蛋白样品的制备

(1)链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶珠的封闭：取三个1.5mL EP管，均加入 100ul的琼脂糖凝胶珠，离心2500rpm 3min，分别标记为空白样、文库样、LL4A 样。向每个EP管中加入1mL的5％的BSA，震荡混匀，在4℃摇床封闭1h；

(2)膜蛋白的封闭：向收集的蛋白样品中加入3mL的DNA封闭液，震荡匀后在4℃，孵育1h，封闭完之后，取出适量留作全蛋白样品组；

(3)琼脂糖凝胶珠和膜蛋白封闭完之后，用Washing buffer洗涤5次， 2500rpm，4℃，3min，置于冰上待用；

(4)琼脂糖凝胶珠、文库、核酸适体与膜蛋白孵育：将封闭之后的膜蛋白均匀分成3组并各自加入3个已封闭好的琼脂糖凝胶珠的EP管中，并按相应标记分别加入文库和LL4A。震荡混匀放入4℃摇床孵育1h；

(5)孵育完之后，Washing buffer洗涤离心5次，2500rpm，4℃，3min，离心之后弃上清；

(6)蛋白质变性：加入与琼脂糖凝胶珠等体积的2×loading buffer，100℃变性10min，置于冰上10min，-80℃保存。

3)SDS-PAGE

(1)PAGE胶的制备：5％浓缩胶10％SDS-PAGE蛋白分离胶(5mL)：在小烧杯中，按顺序加入2mL ddH₂O，1.6mL30％丙烯酰胶，1.25mL 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，0.05mL10％SDS，0.05mL10％APS，0.002mL TEMED，充分混匀加入胶板中。室温放置，待胶凝固后加入5％SDS-PAGE蛋白浓缩胶。按顺序吸取3.4mL dd H₂O，0.85m L 30％丙烯酰胺，0.625mL 1.0M Tris-HCl (pH 6.8)，0.05mL 10％SDS，0.05mL10％APS，0.005mLTEMED。

(2)电泳：将配置好的SDS-PAGE胶正确装入电泳槽中，将已经准备好的样品按marker、空白珠子样、文库组珠子样、核酸适体珠子样顺序将样品加入孔内60V电压进行电泳，待溴酚蓝条带迁移至下层分离胶之后，升高电压至120 V继续电泳，直至溴酚蓝条带迁移至胶底品，完成电泳。

(3)蛋白固定：取出SDS-PAGE胶，去除浓缩胶，将分离胶放入固定液中2h，后用超纯水漂洗3次，每次15min。

(4)将PAGE胶转移到考马斯亮蓝染色液中过夜，用超纯水洗涤考马斯亮蓝染液染好的胶洗涤4次，每次15min。至胶上蛋白条带清晰可见。

(5)扫描仪扫描SDS-PAGE胶，结果如图2所示。

4)为了鉴定SDS-PAGE胶中显示出的差异蛋白，将其酶切提取，进行质谱鉴定，结果如表1所示，在检测到的蛋白质中跨膜蛋白CD63在候选蛋白中高度富集，考虑到CD63为一种跨膜蛋白，我们推测CD63蛋白很可能是LL4A结合的靶标。

表1：LL4A结合蛋白的质谱分析前20个可能的蛋白质候选物

实施例3：LL4A与CD63蛋白的共定位

激光共聚焦荧光显微镜可以直观的显示细胞表面的荧光信号，本实验利用激光共聚焦荧光显微镜做了核酸适体与CD63蛋白的共定位实验，进一步证明 LL4A的靶标就是CD63蛋白。

具体实验步骤如下：

(1)细胞的准备：Mel28-PLX细胞提前24小时接光学培养皿，使得使用时细胞的融合度达到90％-95％，Washing buffer洗三次，用1％的BSA封闭30min，封闭完之后吸弃。

(2)LL4A和抗体的准备：向装有200μL的Bindingbuffer的1.5mL的EP 管中，加入10μL的FITC标记的CD63的抗体和50pmol 5′端标记有Cy5荧光团的LL4A。

(3)细胞与LL4A和抗体的孵育：将准备好的LL4A和抗体的复合物加到 Mel28-PLX细胞中，4℃，避光孵育1h。

(4)拍照：1h之后用Washing buffer洗涤三次，加1mLWashing buffer，用激光共聚焦荧光显微镜去拍照即可，拍照倍数为60倍。结果如图3所示，Cy5 标记的LL4A与FITC标记的CD63抗体荧光在Mel28-PLX细胞膜上明显重合共定位。

实施例4：Aptamer-pull down实验

1)提取另一株威罗菲尼耐药黑素瘤细胞系A375-PLX细胞膜蛋白

(1)将A375-PLX细胞接种在10个10cm培养皿中，培养至对数期；

(2)吸弃旧培养基，DPBS清洗两次；

(3)无酶消化液消化后，用DPBS将细胞收集在15mL离心管中；

(4)用Washingbuffer离心洗涤，弃上清；

(5)向15mL离心管中加入相应量低渗缓冲液(300μL/皿)，震荡混匀后在4℃摇床30min。4000rpm，10min离心弃上清。再用低渗缓冲液洗涤3次；

(6)向离心管中加相应量膜蛋白裂解液(200μL/皿)，震荡混匀后在4℃裂解30min，离心保留上清，4000rpm，4℃，10min。保留的上清液即膜蛋白样品，-80℃保存。

2)PAGE胶蛋白样品的制备

(1)链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶珠的封闭：取三个1.5mL EP管，均加入 100ul的琼脂糖凝胶珠，离心2500rpm 3min，分别标记为空白样、文库样、LL4A 样。向每个EP管中加入1mL的5％的BSA，震荡混匀，在4℃摇床封闭1h；

(2)膜蛋白的封闭：向收集的蛋白样品中加入3mL的DNA封闭液，震荡匀后在4℃，孵育1h，封闭完之后，取出适量留作全蛋白样品组；

(3)琼脂糖凝胶珠和膜蛋白封闭完之后，用Washing buffer洗涤5次， 2500rpm，4℃，3min，置于冰上待用；

(4)琼脂糖凝胶珠、文库、核酸适体与膜蛋白孵育：将封闭之后的膜蛋白均匀分成3组并各自加入3个已封闭好的琼脂糖凝胶珠的EP管中，并按相应标记分别加入文库和LL4A。震荡混匀放入4℃摇床孵育1h；

(5)孵育完之后，Washing buffer洗涤离心5次，2500rpm，4℃，3min，离心之后弃上清；

(6)蛋白质变性：加入与琼脂糖凝胶珠等体积的2×loading buffer，100℃变性10min，置于冰上10min，-80℃保存。

3)SDS-PAGE

(1)PAGE胶的制备：5％浓缩胶10％SDS-PAGE蛋白分离胶(5mL)：在小烧杯中，按顺序加入2mL ddH2O，1.6mL30％丙烯酰胶，1.25mL 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，0.05mL10％SDS，0.05mL10％APS，0.002mL TEMED，充分混匀加入胶板中。室温放置，待胶凝固后加入5％SDS-PAGE蛋白浓缩胶。按顺序吸取3.4mL dd H2O，0.85m L 30％丙烯酰胺，0.625mL 1.0M Tris-HCl (pH 6.8)，0.05mL 10％SDS，0.05mL10％APS，0.005mLTEMED。

(2)电泳：将配置好的SDS-PAGE胶正确装入电泳槽中，将已经准备好的样品按marker、空白珠子样、文库组珠子样、核酸适体珠子样顺序将样品加入孔内60V电压进行电泳，待溴酚蓝条带迁移至下层分离胶之后，升高电压至120V 继续电泳，直至溴酚蓝条带迁移至胶底品，完成电泳。

(3)转膜：预先裁剪出大小合适的NC膜和滤纸；预先将10×转移缓冲液、 ddH2O和甲醇按照体积比为1:7:2的比例混匀配成1×转移缓冲液，将转移槽整个置于冰水浴中转膜，转膜条件为：100V恒压，90min。

(4)免疫反应：转膜结束后，用镊子轻轻取出NC膜，加入3mL牛奶封闭液(用PBST溶液配制的5％脱脂牛奶)后在室温摇床上以最低速度轻摇封闭2h；封闭完毕，加入按一定比例稀释的CD63抗体与NC膜在4℃摇床上轻摇孵育过夜；一抗孵育结束后，回收一抗，在室温摇床上用PBST溶液洗去膜表面非特异性结合的一抗，洗膜三次，每次10min；洗膜结束后加入用封闭液按1:3000稀释相应二抗与NC膜在室温条件摇床上轻摇2h，二抗孵育结束后在室温摇床上用PBST溶液洗膜三次，每次10min；

(5)显影：取适量ECL显影液，按照体积比为1：1的比例充分混合试剂 A和B，均匀滴在用滤纸吸干PBST的NC膜表面，使显影液与膜充分接触并反应，然后使用全自动凝胶成像仪曝光显影。如图4所示，CD63抗体可以与生物素标记的核酸适体LL4A捕获的蛋白质特异性结合，而文库珠子组和空白珠子组几乎检测不到CD63蛋白，表明LL4A和CD63蛋白之间存在直接相互作用关系。

实施例5：CD63纯化蛋白与LL4A结合亲和力分析

(1)将His-CD63重组蛋白用结合缓冲液稀释到1μg/mL，取200μL到加入到96孔酶标板的样品孔中，4℃孵育过夜。

(2)将蛋白稀释液弃掉，每个样品孔中加入200μL的DPBS，室温放置30 sec后将液体弃掉，重复4次。

(3)最后一次弃掉液体后，在酶标板的样品孔中加入1％的BSA，置于37℃封闭2h。

(4)将封闭液弃掉，在酶标板的样品孔中加入200μL的DPBS，室温放置 30sec后将液体弃掉，重复4次。

(5)将5’端生物素修饰的核酸适体LL4A，95℃变性10min，置于冰上10 min；然后取1nmol/L、2.5nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L 和80nmol/L加入到包被了CD63蛋白的酶标板孔中,同时在对照孔中加入相应浓度的DNA-lib作为阴性对照，室温孵育2h。

(6)将核酸适体溶液弃掉，在酶标板的样品孔中加入200μL的DPBS，室温放置30sec后将液体弃掉，重复4次。

(7)最后一次弃掉液体后，在酶标板的样品孔中，加入200μL的用结合缓冲液稀释(1:2000)的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素溶液，室温孵育1h。

(8)将辣根过氧化物酶标记链霉亲和素溶液弃掉，在酶标板的样品孔中加入200μL的DPBS，室温放置30sec后将液体弃掉，重复4次。

(9)先吸取EL-ABTS显色反应液10mL到一个15mL的干净棕色瓶子中，然后用10μL移液枪吸取EL-ABTS显色溶液A2.5μL到棕色瓶中，上下颠倒充分混匀，即为EL-ABTS显色液。最后一次弃掉液体后，在酶标板样品孔中，每孔加入100μL的EL-ABTS显色液，避光显色15min，直至绿色产物出现。分别向微孔中各加反应终止液50μL终止反应，酶标仪405nm波长检测其吸光度。

(10)用各个浓度的LL4A核酸适体405nm的吸光度减去相应浓度的Library 对照405nm吸光度，得到LL4A核酸适体在各个浓度的相对吸光度，通过公式计算LL4A与CD63蛋白的结合常数。

实施例6：干扰实验

通过siRNA干扰CD63蛋白，蛋白表达量减少的同时LL4A与Mel28-PLX 细胞结合能力也大大减弱，说明CD63是其靶标蛋白。

具体实验步骤如下：

(1)提前24小时接六孔板，设置两个siRNA浓度，一个NC对照，一个 Blank孔，使得第二天转染时Mel28-PLX细胞密度在70％左右；

(2)CD63 siRNA浓度为100nM和200nM，加于200μL无血清DMEM 培养基中再加12μL锐博转染试剂静置15min，静置之后加入相应孔中；

(4)转染48h后，收集细胞每组两份，一份细胞做流式，另一份提取蛋白做WesternBlot；

流式细胞术检测步骤：

①ssDNALL4A的准备：准备四个平行样，每组样品取45μL的Bindingbuffer 于1.5mL EP管中，加入50pmol的LL4A/Library，95℃变性10min，冰上冷却 10min，离心，5500rpm，4℃，3min，向每个EP管中加入150μL的Binding buffer，使其终浓度为250nM，置于冰上待用。

②细胞的准备：弃六孔板中的培养基，DPBS洗涤3次。2％EDTA室温消化，吹打下来转移到新的1.5mL的EP管中，用Washingbuffer洗涤两次，计数，每个样3×10⁵细胞，1000rpm，4℃，3min离心，去除上清，待用。

③ssDNALL4A与细胞的孵育：将准备好的ssDNALL4A加到相应标记的 EP管中，震荡混匀后在4℃，水平摇床上80rpm，孵育1h，孵育完之后，1000 rpm，4℃，3min，再用Washingbuffer洗涤三次，1000rpm，4℃，3min每次。洗涤完之后，用400μLBinding buffer重悬，流式细胞术检测细胞的荧光强度即可，FITC电压为300V。

结果如图6所示，CD63 siRNA 100nM/200nM干扰之后的Mel28-PLX细胞均不再与核酸适体LL4A结合，而NC序列干扰之后的Mel28-PLX仍与核酸适配体LL4A结合，表明LL4A与Mel28-PLX细胞的结合是通过结合细胞膜上的 CD63蛋白。

实施例7：过表达实验

通过过表达质粒过表达CD63蛋白的同时LL4A与A375-PLX细胞结合能力也大大增强，进一步表明CD63是LL4A靶标蛋白。

具体实验步骤如下：

(1)提前24小时接六孔板，设置CD63过表达孔，一个NC对照，一个 Blank孔，使得第二天转染时A375-PLX细胞密度在70％左右；

(2)CD63过表达质粒及对照载体每孔3μg，加于200μL无血清Opti-MEM 培养基中再加6μLLip3000转染试剂静置20min，静置之后加入相应孔中；

(4)转染48h后，收集细胞每组两份，一份细胞做流式，另一份提取蛋白做WesternBlot；

流式细胞术检测步骤：

①ssDNALL4A的准备：准备三个平行样，每组样品取45μL的Bindingbuffer 于1.5mL EP管中，加入50pmol的LL4A/Library，95℃变性10min，冰上冷却 10min，离心，5500rpm，4℃，3min，向每个EP管中加入150μL的Binding buffer，使其终浓度为250nM，置于冰上待用。

②细胞的准备：弃六孔板中的培养基，DPBS洗涤3次。2％EDTA室温消化，吹打下来转移到新的1.5mL的EP管中，用Washingbuffer洗涤两次，计数，每个样3×10⁵细胞，1000rpm，4℃，3min离心，去除上清，待用。

③ssDNALL4A与细胞的孵育：将准备好的ssDNALL4A加到相应标记的EP管中，震荡混匀后在4℃，水平摇床上80rpm，孵育1h，孵育完之后，1000 rpm，4℃，3min，再用Washingbuffer洗涤三次，1000rpm，4℃，3min每次。洗涤完之后，用400μLBinding buffer重悬，流式细胞术检测细胞的荧光强度即可，FITC电压为300V。

结果如图7所示，与对照组相比，过表达CD63后的A375-PLX细胞与核酸适体LL4A的结合能力明显增强，表明LL4A与A375-PLX细胞的结合是通过结合细胞膜上的CD63蛋白。

实施例8：CD63在威罗菲尼耐药黑素瘤细胞中高表达

Western Blot检测黑素瘤亲代细胞/威罗菲尼耐药黑素瘤细胞 Mel28/Mel28-PLX和A375/A375-PLX中CD63的表达水平。

步骤如下：

(1)提取Mel28/Mel28-PLX和A375/A375-PLX细胞总蛋白

1)将Mel28/Mel28-PLX和A375/A375-PLX细胞接种在10cm培养皿中，培养至对数期；

2)吸弃旧培养基，DPBS清洗两次；

3)用细胞刮子刮下细胞并收集到1.5mL EP管中，2500rpm，离心5min，弃上清，再加1mLDPBS到培养皿中，将皿内剩余细胞吹打下来收集于同一1.5 mL EP管中，吹打混匀，2500rpm，离心5min，弃上清；

4)加入适量体积含20×磷酸酶抑制剂phostop及50×蛋白酶抑制剂cocktail 的RIPA细胞裂解液，振荡混匀后放入冰水浴中裂解30min；

5)冰上超声(功率20Hz以下)，直至裂解液清澈；然后在4℃条件下， 13800rpm，离心15min，轻轻吸取上清转移至另一干净并预冷的1.5mL EP管中，于-80℃冰箱存储蛋白。

(2)BCA法测定蛋白浓度

1)按照每个样本孔200μL BCA工作液，各设置2个复孔的需求量，以A 液：B液按50:1体积比配制实验所需用量的BCA工作液，混匀后备用；

2)准备7个1.5mL EP管，用DPBS对半稀释浓度为2mg/mL的标准浓度蛋白BSA，充分混匀后分别得到浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625mg/mL的蛋白标准品溶液，备用；

3)不同样品蛋白各取5μL分别加到含45μL DPBS的1.5mL EP管中，使待测样品蛋白稀释10倍；

4)在96孔板中以每孔20μL的量分别加入配制好的蛋白标准品溶液及已稀释10倍的待测样品蛋白溶液，每个样品设置2个重复；

5)每个样品孔各加入200μL配置好的BCA工作液，轻轻振荡96孔板使充分混匀，然后置于37℃恒温箱中避光孵育30min；

6)孵育结束后，吹风机轻吹以去除气泡，用酶标仪测定OD值(激发波长为570nm)，根据蛋白标准品的OD值绘制蛋白浓度标准曲线，通过计算得出待测样品蛋白浓度和煮样蛋白量、电泳上样量，将各蛋白与2×loading buffer按照体积比1:1的比例混合，于95℃热水浴中变性10min，置于冰上待用。

(3)SDS-PAGE电泳

1)PAGE胶的制备：5％浓缩胶10％SDS-PAGE蛋白分离胶(5mL)：在小烧杯中，按顺序加入2mL ddH2O，1.6mL30％丙烯酰胶，1.25mL 1.5M Tris-HCl (pH 8.8)，0.05mL10％SDS，0.05mL10％APS，0.002mL TEMED，充分混匀加入胶板中。室温放置，待胶凝固后加入5％SDS-PAGE蛋白浓缩胶。按顺序吸取3.4mL dd H2O，0.85m L 30％丙烯酰胺，0.625mL 1.0M Tris-HCl(pH 6.8)，0.05mL 10％SDS，0.05mL10％APS，0.005mLTEMED。

2)电泳：将配置好的SDS-PAGE胶正确装入电泳槽中，将已经准备好的样品按marker、空白珠子样、文库组珠子样、核酸适体珠子样顺序将样品加入孔内 60V电压进行电泳，待溴酚蓝条带迁移至下层分离胶之后，升高电压至120V 继续电泳，直至溴酚蓝条带迁移至胶底品，完成电泳。

3)转膜：预先裁剪出大小合适的NC膜和滤纸；预先将10×转移缓冲液、 ddH2O和甲醇按照体积比为1:7:2的比例混匀配成1×转移缓冲液，将转移槽整个置于冰水浴中转膜，转膜条件为：100V恒压，90min。

4)免疫反应：转膜结束后，用镊子轻轻取出NC膜，加入3mL牛奶封闭液 (用PBST溶液配制的5％脱脂牛奶)后在室温摇床上以最低速度轻摇封闭2h；封闭完毕，加入按一定比例稀释的CD63与内参GAPDH抗体与NC膜在4℃摇床上轻摇孵育过夜；一抗孵育结束后，回收一抗，在室温摇床上用PBST溶液洗去膜表面非特异性结合的一抗，洗膜三次，每次10min；洗膜结束后加入用封闭液按1:3000稀释相应二抗与NC膜在室温条件摇床上轻摇2h，二抗孵育结束后在室温摇床上用PBST溶液洗膜三次，每次10min；

5)显影：取适量ECL显影液，按照体积比为1：1的比例充分混合试剂A 和B，均匀滴在用滤纸吸干PBST的NC膜表面，使显影液与膜充分接触并反应，然后使用全自动凝胶成像仪曝光显影。如图8所示，与亲代细胞Mel28和A375 相比，在PLX4032抗性黑素瘤细胞Mel28-PLX和A375-PLX中CD63表达升高，提示CD63参与黑素瘤细胞的威罗菲尼抗性。

实施例9：CD63增强黑素瘤细胞的威罗菲尼抗性

为了进一步确定CD63是否参与了黑素瘤细胞的威罗菲尼抗性，我们在 Mel28-PLX与A375-PLX细胞中通过CD63 siRNAs敲低CD63的表达，采用MTT 实验考察干扰CD63后的Mel28-PLX和A375-PLX细胞在不同浓度PLX4032处理后的细胞活力。

具体实验步骤如下：

(1)提前24小时接六孔板，设置一个siRNA组，一个NC对照，一个Blank 孔，使得第二天转染时Mel28-PLX细胞密度在70％左右；

(2)CD63 siRNA浓度为200nM，加于200μL无血清DMEM培养基中再加12μL锐博转染试剂静置15min，静置之后加入相应孔中；

(4)转染48h后，收集细胞做MTT检测；

MTT检测步骤：

(1)CD63 siRNA转染48h之后，吸弃培养基，用DPBS清洗一次，然后用胰酶将细胞消化收集到15mL离心管中，600rpm，离心5min，吸弃上清，加 2mL完全培养基使细胞重悬，细胞计数仪计数，在96孔板中以3×103细胞/孔的数量及每孔200μL完全培养基的体积进行接种，(每组各有三个重复)，置于37℃细胞培养箱中培养，共设0、24、48、72小时4个培养时间点；

(2)到达一定培养时间点后，每孔加20μL 5mg/mL MTT溶液，置于37℃细胞培养箱中孵育4h；

(3)孵育完后，轻轻甩出全部上清液，并倒扣在卫生纸上吸干液体，以每孔200μLDMSO的体积加到96孔板中，在振荡器上振荡10min，充分溶解蓝紫色甲臜后，在酶标仪上(波长570nm)检测每孔吸光度值。结果如图9显示，与对照组相比，敲低CD63后的Mel28-PLX和A375-PLX细胞对PLX4032处理更加敏感，表明CD63增强黑素瘤细胞的威罗菲尼抗性。

序列表

<110> 中南大学

<120> 一种核酸适体鉴别靶标蛋白CD63的方法及其在克服黑素瘤威罗菲尼耐药中的应用

<130> RZ191-232929

<141> 2019-09-03

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctggactca cctcgaccag agccattggg tttcctagga aatagggcct ttactatgag 60

cgagcctggc g 71

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggatgcaggc agattttaat t 21

Claims (9)

1.一种识别靶标蛋白CD63的方法，其特征在于，是利用核酸适体LL4A进行识别：

所述的核酸适体LL4A的序列为：

5’-GCTGGACTCACCTCGACCAGAGCCATTGGGTTTCCTAGGAAATAGGGCCTTTACTATGAGCGAGCCTGGCG-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述的核酸适体LL4A上连接荧光物质和生物素。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①通过胰蛋白酶实验证明核酸适体LL4A结合威罗菲尼耐药黑素瘤细胞的膜蛋白；

②利用低渗缓冲液提取细胞膜蛋白；

③将生物素标记的LL4A或文库与膜蛋白孵育，再与琼脂糖珠孵育，离心得到与LL4A、文库结合的蛋白；

④利用SDS-PAGE胶分离蛋白，分析LL4A与文库的差异蛋白；

⑤切出差异蛋白，酶解，上质谱分析蛋白样品；

⑥再利用免疫荧光、siRNA干扰验证质谱结果。

4.一种核酸适体LL4A在制备识别靶标蛋白CD63试剂中的应用，其特征在于，所述的试剂中至少包含可以识别靶标蛋白CD63的权利要求1所述的核酸适体LL4A。

5.如权利要求4所述的核酸适体LL4A在制备识别靶标蛋白CD63试剂中的应用，其特征在于，所述的核酸适体LL4A上允许修饰荧光物质和/或生物素。

6.如权利要求4或5所述的核酸适体LL4A在制备识别靶标蛋白CD63试剂中的应用，其特征在于，所述的靶标蛋白CD63为黑素瘤细胞的膜蛋白。

7.如权利要求6所述的核酸适体LL4A在制备识别靶标蛋白CD63试剂中的应用，其特征在于，所述的靶标蛋白CD63为威罗菲尼耐药黑素瘤细胞的膜蛋白。

8.一种提高黑素瘤细胞对威罗菲尼敏感性的药物，其特征在于，所述的药物为可敲低罗菲尼耐药黑素瘤细胞的蛋白CD63表达的物质。

9.如权利要求8所述的药物，其特征在于，所述的药物修饰在权利要求1所述的核酸适体LL4A上。

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