KR20150103431A - 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 방법 - Google Patents

인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150103431A
KR20150103431A KR1020140024898A KR20140024898A KR20150103431A KR 20150103431 A KR20150103431 A KR 20150103431A KR 1020140024898 A KR1020140024898 A KR 1020140024898A KR 20140024898 A KR20140024898 A KR 20140024898A KR 20150103431 A KR20150103431 A KR 20150103431A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hepatocytes
hepatotoxicity
human
stem cells
differentiated
Prior art date
Application number
KR1020140024898A
Other languages
English (en)
Inventor
이승효
김세윤
한용만
Original Assignee
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술원 filed Critical 한국과학기술원
Priority to KR1020140024898A priority Critical patent/KR20150103431A/ko
Priority to PCT/KR2015/002038 priority patent/WO2015133791A1/ko
Priority to CN201580020870.8A priority patent/CN106460026A/zh
Publication of KR20150103431A publication Critical patent/KR20150103431A/ko
Priority to US15/257,338 priority patent/US20170052172A1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5067—Liver cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0672—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells; Oval cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/88—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving prostaglandins or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/521—Chemokines
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/525—Tumor necrosis factor [TNF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 방법에 관한 것으로, 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포 및 인간 간세포에 에탄올, CCl4, 및 아세토아미노펜을 처리하여 간독성을 유발한 후, 상기 간세포가 분비하는 매개체 사이토카인, 케모카인 및 지질매개체를 확인하고자 분화 간세포의 면역독성물질 분석 시스템을 구축하였으며, 상기 시스템을 사용하여 간독성이 유발된 상기 세포에서 면역독성물질을 확인할 수 있음으로써, 상기 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용하여 면역 간독성 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 방법{Method for hepatotoxicity screening of immune based hepato-toxicity using human stem cell derived hepatocytes}
본 발명은 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 방법 및 면역 간독성 스크리닝 키트에 관한 것이다.
현재 신약개발에 있어서 독성으로 인한 실패율은 비임상단계에서 약 20%, 그리고 임상단계에서 약 13%로 높은 비율을 차지하고 있다. 새로운 합성 화학물(new chemical entity; NCE)로 등록된 후, 퇴출된 신약 후보물질의 독성기전 및 표적장기는 불분명하나 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb)의 1993 ~ 2006 년 자료에서 비임상단계의 표적 장기는 심장과 간을 합하여 약 42%인 것으로 보고되었다. 1990 년 이후 독성문제로 시판중에 시장에서 철수한 의약품을 임상단계에서의 원인별로 분석해본 결과 13 종(약 40%)은 간독성, 11 건(33%)은 QT 시간(QT interval) 증가에 따른 심장질환(부정맥)으로 이들 두 원인이 전체 사유의 73%를 차지하고 있는 실정이다. 또한, 2004년 이후에 매년 1개 이상의 의약품이 간독성으로 시장에서 퇴출당하고 있으며, 뿐만 아니라 현재 사용중인 의약품에서도 미국 FDA에서 블랙박스 경고(black box warning, 가장 높은 단계의 경고로 의약품의 사용에 제한을 받음)가 표시된 의약품이 전체 515개 품목에 달하며 이 중에서 대부분이 주로 간독성 및 심장 독성의 문제로 경고를 받고 있다.
현재 사용되는 의약품 중 800 종 이상이 간독성을 유발하고, 이는 미국 전체 급성 간부전(Acute liver failure)의 30% 이상을 차지하고 있으며, 황달 입원 환자의 2 내지 20%를 차지하고 있다. 약물 유래 간독성(drug induced liver injury)은 전임상단계에서 신약 개발의 중단, 임상단계에서 임상시험의 중단, 그리고 시판 후 시장에서 철수를 유발하는 가장 큰 원인이다. 간독성을 유발하는 의약품으로는 항생제나 항암제를 비롯하여 고혈압치료제, 항경련제, 고지혈증치료제, 향정신성의약품, 비스테로이드성 항염제, 흡입마취제, 당뇨병치료제, 생약제제 등으로 매우 다양하고, 최근 미국 FDA 및 유럽의약국(European Medicines Agency)에서도 약물 유래 간독성을 최소화하기 위해 노력하고 있다. 간독성 의약품의 간독성 기전을 분석하면 대사활성화가 큰 비중을 차지하며 미국 FDA에서는 2008년 2월 "약물 대사체의 산업상 안전성 검사를 위한 안내"를 발행하여 약물 대사체에 대한 연구가 신약개발에서 중요한 연구분야임을 강조하였다.
간독성으로 퇴출된 약물 14종 중 9종, 경고문이 부착된 약물 14종 중 10종에서 활성 대사체가 보고되어있고, 일반적으로 약물에 의한 간독성은 모약물(parent drug)보다는 모약물로부터 유래된 대사체에 기인하는 경우가 대부분이다. 간독성을 유발하는 약물 대사체의 물리화학적 특성중 간독성을 매개하는 특징은 친전자성이다. 따라서, 친전자성의 독성 대사체의 형성을 탐색할 수 있는 연구방법이 신약개발의 초기 단계에 제안되고 있다. 대사 활성화가 문제를 유발할 수 있는 화학적인 구조로는 1)히드라진(hydrazines) 및 히드라지드(hydrazide), 2)아릴아세트산(arylacetic acid) 및 아릴프로피온산(arylpropionic acid), 3)티오펜(thiophene), 퓨란(furan) 및 피롤(pyrrole), 4)아닐린(aniline) 및 아닐리드(anilide), 5)퀴논(quinone) 및 퀴논이민(quinoneimine), 6)중간사슬 지방산(medium chain fatty acid), 7)할로겐화 탄화수소(halogenated hydrocarbon) 및 일부 할로겐화 방향족(halogenated aromatic)(Br > Cl > F), 8)니트로방향족(nitroaromatic), 9)α,β-불포화 엔롤-성 구조(α,β-unsaturated enol-like structure), 10)티올(thiol) 또는 티오노(thiono)[티아졸리딘디온 등록특허 10-1334159(thiazolidinedione) 및 티오우레아(thiourea)], 11)아미노티아졸(aminothiazole)류 등이 있으며, 매우 다양한 구조를 갖는다.
현재 신약개발에 있어서 간독성 평가시스템의 문제점이 다양하게 존재한다. 첫째, 간독성을 예측할 수 있는 특정 표적의 부재를 들 수 있다. 예를 들어, 심장독성의 경우 HERG 채널 분석(channel assay)이 심장독성의 평가를 기준으로 제시되어 생체 내에서 효과와 연관성에 대한 논문이 보고되고 있으나, 간독성은 특정 표적 단백질로 평가 시스템을 구축하기 어렵다는 문제점이 있다.
둘째, 동물 실험결과의 인간 간독성 예측력이 미약하다. 예를 들어, 국제 생명과학 연구소(international life sciences institute)의 1999년 연구결과 238 종의 신약 후보물질 중에서 31개가 신약 개발과정에서 간독성이 있는 것으로 관찰되었으나, 동물실험에서 간독성이 관찰된 것은 58%로 동물실험에서 간독성의 예측력이 상대적으로 낮다. 또한 롱프랑 로리(Rhone-Roulenc Rorer)의 간독성 평가 결과분석에서 동물 실험결과는 임상 결과의 차이가 큰 것으로 보고되었다.
셋째, 고감수성 개체에서 특이체질성 간독성(idiosyncratic hepatotoxicity)의 발현이 확인되었다. 시장에서 철수한 간독성 약물은 특징적으로 용량 의존성과 기전이 불분명하고, 감수성이 강한 특정 개체에서 매우 심각한 독성을 유발한다(약 만명 또는 10만명 중에서 한명). 따라서, 임상 3상까지의 임상실험과정 또는 NDA(new drug application) 과정에서 발견하지 못하는 문제가 발생할 수 있다.
넷째, 고전적인 동물시험에서 간독성의 예측력은 신약개발에서 산업체의 요구에 부합하지 못한다. 종에 따른 약물 대사체 패턴의 정성 및 정량적인 차이로 종간 간독성에 차이를 발생시키고, 또한 고전적인 간독성 평가의 경우 특이체질성 간장애(idiosyncratic liver injury)에 의해 시장에서 퇴출된 약물의 간독성을 예측하지 못하였다.
다섯째, 세포배양 실험계로 인간 간암세포주인 HepG2 세포, 형질전환 HepG2 세포[시토크롬 450P(cytochrome P450, CYP) 등 약물대사효소 과발현 세포주), 불멸화된 인간 간세포(immortalized human hepatocytes)(SV40 T 항원 유전자 삽입 등), 일차 간세포(primary hepatocytes)(인간 또는 랫 등) 등이 간독성 예측 모델로 사용되고 있으나 모두 임상에서의 간독성 예측에는 큰 한계가 있다.
이에, 본 발명자들은 인간 줄기세포 유래 간세포를 기반으로 면역 간독성 검사 기술 개발을 하기 위해 노력한 결과, 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포 및 인간 간세포에 에탄올, CCl4, 및 아세토아미노펜을 처리하여 간독성을 유발한 후, 상기 간세포가 분비하는 매개체 사이토카인, 케모카인 및 지질매개체를 확인하고자 분화 간세포의 면역독성물질 분석 시스템을 구축하였으며, 상기 시스템을 사용하여 간독성이 유발된 상기 세포에서 면역독성물질을 확인하였다. 또한, 본 발명의 인간 간세포 유사 세포를 이용하여 동물 모델을 필요로 하지 않고 후보 약제 등의 검사대상 화합물의 대사나 간독성을 평가할 수 있음을 확인함으로써, 상기 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용하여 면역 간독성 스크리닝 방법 및 간독성 유발물질 검출용 키트로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 키트에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포에 피검 물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 간세포의 사멸 또는 증식 저해 수준을 측정하는 단계를 포함하는 간독성 유발물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은
1) 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 간세포의 배양액 또는 상등액을 수득하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 배양액 또는 상등액에서 사이토카인, 케모카인 또는 지질매개체를 분석하는 단계를 포함하는 간독성 유발물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포를 포함하는 간독성 유발물질 검출용 키트를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명은 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포 및 그 간세포가 분화하는 매개체 검출 시약을 포함하는 간독성 유발물질 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 방법에 관한 것으로, 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포 및 인간 간세포에 에탄올, CCl4, 및 아세토아미노펜을 처리하여 간독성을 유발한 후, 상기 간세포가 분비하는 매개체 사이토카인, 케모카인 및 지질매개체를 확인하고자 분화 간세포의 면역독성물질 분석 시스템을 구축하였으며, 상기 시스템을 사용하여 간독성이 유발된 상기 세포에서 면역독성물질을 확인할 수 있음으로써, 상기 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용하여 면역 간독성 스크리닝 방법으로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 인간 전분화능 배아줄기세포 유래 간세포 분화를 나타낸 모식도이다.
도 2는 1차 및 2차 간독성 유도를 나타낸 모식도이다.
도 3은 면역독성물질 ELISA 분석 시스템 구축을 나타낸 도이다.
도 4는 인간 배아 줄기세포로부터 분화된 간세포 및 인간 간세포에 에탄올 처리에 따른 면역독성물질 ELISA 분석을 나타낸 도이다.
도 5는 인간 배아 줄기세포로부터 분화된 간세포 및 인간 간세포에 CCL4 처리에 따른 면역독성물질 ELISA 분석을 나타낸 도이다.
도 6은 인간 배아 줄기세포로부터 분화된 간세포 및 인간 간세포에 아세토아미노펜 처리에 따른 면역독성물질 ELISA 분석을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포에 피검 물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 간세포의 사멸 또는 증식 저해 수준을 측정하는 단계를 포함하는 간독성 유발물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 줄기세포는 인간 배아 줄기 세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 분화는
a) 인간 줄기세포를 배양하여 분화를 유도하는 단계; 및
b) 상기 분화된 세포를 간세포 성장인자를 첨가한 배지에 배양하는 단계를 포함한 방법으로 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 간독성 유발 물질은 에탄올, CCl4, 아세토아미노펜으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 인간 배아 줄기세포로부터 내배엽과 같은 다른 분화적 계통 세포로의 분화여부를 확인하기 위하여, 인간 배아 줄기세포(CHA-hESC4)로부터 내배엽인 간세포(hepatocytes)로의 분화를 유도하였다. 또한, 상기 세포에 독성물질을 처리하여 나타나는 면역독성을 비교하기 위하여, 도 1에 나타난 모식도와 같은 방법으로 인간 전분화능 배아 줄기세포(CHA-hESC15)로부터 간세포로의 분화를 유도하였다(도 1). 상기 분화된 간세포를 간세포 배양 배지에서 5일 동안 배양하면서 간세포의 성숙을 유도하여 성숙된 간세포를 수득하였다.
또한, 간 독성반응은 간세포가 약물 및 독성물질에 직접적으로 반응하는 1차 독성반응과 약물에 반응하여 생성된 대사산물(metabolites)은 면역세포의 활성화 및 염증 반응을 유도하여 일어나는 2차 면역독성으로 이루어져 있다. 면역독성 분석을 하기 위하여 간세포에 의해 생성되는 단백질, 지질, 바이오 활성가스 등의 대사물질의 분석이 필요함으로써(도 2 참조), 염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 계열의 면역독성물질인 인간 IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, IFN-α/β 및 TGF-β 등 8종에 대한 ELISA 검사를 구축하였다. 각 사이토카인에 대한 항체와 각각의 사이토카인들을 확보하여 농도별 ELISA 반응을 검사하고 최적조건을 확립하였다(도 3 참조).
또한, 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포 및 인간 간세포에 약물처리에 의한 면역독성물질 분석을 확인하기 위하여, 상기 세포에 에탄올을 각기 다른 농도로 처리하였을 때, 염증성(pro-inflammatory) 사이토카인의 생성이 확인되지 않았으나, 인간 간세포에 에탄올을 처리한 경우 사이토카인이 일부 검출되는 것을 확인하였다. 따라서, 일반 독성검사 결과와 비슷한 양상으로 줄기세포 유래 간세포의 경우 에탄올(ethanol)에 대한 독성반응이 나타나지 않는 것으로 유추할 수 있다(도 4 참조).
또한, 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포 및 인간 간세포에 약물처리에 의한 면역독성물질 분석을 확인하기 위하여, 인간 배아 줄기세포(hESC4)로부터 분화된 간세포에 CCl4를 처리하였을 때, 상기 세포에서 IL-6, IL-10 및 IFN-α가 검출되었고 CCl4를 처리한 농도에 따라 일반적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 인간 간세포(hESC15)에 CCl4를 처리하였을 때, 상기 세포에서도 IL-6, IL-10 및 IFN-α가 검출되는 것을 확인하였으나, 상기 세포 배양 시 줄기세포로부터 분화된 간세포보다 세포 수가 낮은 것을 감안하면 분비되는 사이토카인의 양은 인간 간세포에서 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 5 참조)
또한, 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포 및 인간 간세포에 약물처리에 의한 면역독성물질 분석을 확인하기 위하여, 인간 배아 줄기세포(hESC4)로부터 분화된 간세포에 아세토아미노펜을 처리하였을 때, 상기 세포에서 IL-6, TNF-α 및 IFN-β가 검출되는 것을 확인하였으며, 아세토아미노펜을 처리하는 농도에 따라 일반적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 인간 간세포에 아세토아미노펜을 처리하였을 때, 상기 세포에서도 IL-6, TNF-α 및 IFN-β가 검출되는 것을 확인하였으나, 상기 세포 배양 시 줄기세포로부터 분화된 간세포보다 세포 수가 낮은 것을 감안하면 분비되는 IL-6 및 IFN-β 사이토카인의 양은 인간 간세포에서 높게 나타나는 것을 확인하였으며, 특이적으로 줄기세포 분화 간세포에서 TNF-α 사이토카인 양이 아주 높게 검출되는 것을 확인하였다(도 6 참조).
따라서, 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포 및 인간 간세포에 에탄올, CCl4, 및 아세토아미노펜을 처리하여 간독성을 유발한 후, 상기 간세포가 분비하는 매개체 사이토카인, 케모카인 및 지질매개체를 확인하고자 분화 간세포의 면역독성물질 분석 시스템을 구축하였으며, 상기 시스템을 사용하여 간독성이 유발된 상기 세포에서 면역독성물질을 확인할 수 있으므로서, 구축된 면역독성물질 분석 시스템을 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 방법으로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 간세포의 배양액 또는 상등액을 수득하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 배양액 또는 상등액에서 사이토카인, 케모카인 또는 지질매개체를 분석하는 단계를 포함하는 간독성 유발물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 줄기세포는 인간 배아 줄기세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 사이토카인은 IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, IFN-α 및 IFN-β로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 케모카인은 IL-8, IP-10, RANTES, MIP-1 및 MCP로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 지질매개체는 프로스타글란딘(prostaglandin) 및 류코트리엔(leukotriene)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 간독성 유발물질은 에탄올, CCl4, 아세토아미노펜으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 면역 간독성 스크리닝 방법은 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포 및 인간 간세포에 에탄올, CCl4, 및 아세토아미노펜을 처리하여 간독성을 유발한 후, 상기 간세포가 분비하는 매개체 사이토카인, 케모카인 및 지질매개체를 확인하고자 분화 간세포의 면역독성물질 분석 시스템을 구축하였으며, 상기 시스템을 사용하여 간독성이 유발된 상기 세포에서 면역독성물질을 확인할 수 있음으로써, 간독성 유발물질의 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포를 포함하는 간독성 유발물질 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포 및 그 간세포가 분화하는 매개체 검출 시약을 포함하는 간독성 유발물질 검출용 키트를 제공한다.
상기 방법에 있어서, 간독성 유발물질은 에탄올, CCl4, 아세토아미노펜으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 간분화 매개체는 사이토카인, 케모카인 및 지질 매개체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 매개체 검출 시약은 하기 표 1에 나타낸 검출 시약으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
Figure pat00001
본 발명의 면역 간독성 스크리닝 방법은 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포 및 인간 간세포에 에탄올, CCl4, 및 아세토아미노펜을 처리하여 간독성을 유발한 후, 상기 간세포가 분비하는 매개체 사이토카인, 케모카인 및 지질매개체를 확인하고자 분화 간세포의 면역독성물질 분석 시스템을 구축하였으며, 상기 시스템을 사용하여 간독성이 유발된 상기 세포에서 면역독성물질을 확인할 수 있음으로써, 간독성 유발물질 검출용 키트로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해서 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 인간 배아 줄기세포로부터 간세포로의 분화 유도
인간 배아 줄기세포로부터 내배엽과 같은 다른 분화적 계통 세포로의 분화 여부를 확인하기 위하여, 인간 배아 줄기세포로부터 내배엽인 간세포(hepatocytes)로의 분화를 유도하였다(Cai, J. et. al, (2007) Hepatology 45(5): 1229-1239.).
구체적으로, hESC 세포주는 CHA-hESC4 세포주로 지지세포가 없는 시스템(feeder-free system)에서 조절된 배지(conditioned medium)에 가득 차(confluent)도록 3일 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 hESC 세포를 50 ng/㎖ 액티빈A(Activin A; Peprotech 사, 미국)을 포함하는 RPMI-1640(Hyclone 사, 미국) 배지에서 5 일간 배양하여 분화를 유도하였다. 그런 다음, 상기 분화된 세포는 30 ng/㎖ 섬유아세포 성장인자 4(fibroblast growth factor4; Peprotech 사) 및 20 ng/㎖ 골형성단백질 2(bone morphogenetic protein 2, BMP2; Peprotech 사)를 포함하는 간세포 배양 배지(hepatocyte culture medium, HCM; Lonza 사, 미국)에서 5 일간 배양한 후, 20 ng/㎖ 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF; Peprotech 사)를 첨가한 간세포 배양 배지에서 5일 동안 추가로 배양하여 hESC로부터 간세포로 분화를 유도하였다. 상기 분화된 간세포는 10 ng/㎖ 온코스태틴 M(oncostatin M; R&D Systems 사, 미국) 및 0.1 μM 덱사메타손(dexametasone; 시그마-알드리치 사, 미국)을 첨가한 간세포 배양 배지에서 5 일간 배양하면서 간세포의 성숙(Maturation)을 유도하여 성숙된 간세포를 수득하였다.
< 실시예 2> 인간 전분화능 배아줄기세포로부터 간세포의 분화 유도
인간 전분화능 배아줄기세포 유래 간세포 분화를 유도하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 도 1에 나타낸 방법으로 hESC 세포주는 CHA-hESC15 세포주로 지지세포가 없는 시스템(feeder-free system)에서 조절된 배지(conditioned medium)에 가득 차(confluent)도록 3일 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 배양하여 간세포의 성숙(Maturation)을 유도하여 성숙된 간세포를 수득하였다(도 1).
< 실시예 3> 분화된 간세포의 면역독성물질 분석 시스템 구축
간 독성반응은 간세포가 약물 및 독성물질에 직접적으로 반응하는 1차 독성반응과 약물에 반응하여 생성된 대사산물(metabolites)은 면역세포의 활성화 및 염증 반응을 유도하여 일어나는 2차 면역독성으로 이루어져 있다. 면역독성 분석을 하기 위하여 간세포에 의해 생성되는 단백질, 지질, 바이오 활성가스 등의 대사물질의 분석이 필요함으로써(도 2), 하기와 같은 방법을 수행하여 염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 계열의 면역독성물질 분석 시스템을 구축하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 제조한 인간 줄기세포로부터 분화 19일째 간세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 90% 농도로 분주한 다음, 1000 mg/L DMEM-낮은 포도당(low glucose) 배양액(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 제조사 Welgene No. 001-11)을 사용하여 교체한 후 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 줄기세포 유래 간세포 배양액을 수득하였다. 상기 세포들의 부산물을 제거하기 위하여 원심분리를 12000 x g, 20분 및 4도 조건으로 실시한 후, 상등액을 수득하였다. 그런 다음, 포획 항체(capture antibody)인 2.5 μg/ml 항-IL-1β 항체, 2 μg/ml 항-IL-6 항체, 2.5 μg/ml 항-IL-10 항체, 2 μg/ml 항-IL-12 항체, 1 μg/ml 항-TNF-α 항체, 2 μg/ml 항-IFN-α항체, 1 μg/ml 항-IFN-β 항체, 및 2 μg/ml 항-TGF-β 항체를 37℃에서 2시간 동안 배양하여 96-웰 ELISA 플레이트에 코팅하고 세척한 후 0.2 %의 I-block(Foster city, CA)을 이용하여 37℃에서 2시간 동안 블록킹(blocking)을 하였다. 상기 블록킹을 한 포획 항체들을 세척한 후, 표준 물질(standard, 단백질이 결합하지 않는 유연성 플레이트(flexible plate)에 10ng/ml의 농도부터 시작하여 2 fold serial 희석을 4.88 pg/ml까지 실시하여 준비함)과 상등액을 ELISA 플레이트(Greiner, Kremsmunster, Austria)에 분주하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 배양한 후, 바이오틴화(biotinylation)가 된 검출 항체(항-IL-1β 항체: 2 μg/ml, 항-IL-6 항체:1 μg/ml, 항-IL-10 항체:1 μg/ml, 항-IL-12 항체:1 μg/ml, 항-TNF-α 항체:1 μg/ml, 항-IFN-α 항체:4 μg/ml, 항-IFN-β 항체:2 μg/ml, 항-TGF-β 항체:1 μg/ml, 마지막 농도(final concentration))를 첨가하여 37℃에서 2시간 배양하였다. 배양한 후, 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase)가 결합된 스트렙타비딘(streptavidin)을 상온에서 30분 동안 배양 시키고, 5 mM의 니트로페닐 인산 물질(nitrophenyl phosphate substrate)를 첨가하여 405 nm 파장에서 ELISA 리더를 이용해 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 계열의 면역독성물질인 인간 IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, IFN-α/β 및 TGF-β 등 8종에 대한 ELISA 검사를 구축하였다. 각 사이토카인에 대한 항체와 각각의 사이토카인들을 확보하여 농도별 ELISA 반응을 검사하고 최적조건을 확립하였다. 또한, ELISA 기법 구축을 증명하기 위하여, 각 사이토카인의 표준 곡선(standard curve)을 분석하여 R2 값이 모두 0.9 이상이 나오는 것을 확인하였다(도 3).
< 실시예 4> 분화된 간세포에 약물처리에 의한 면역독성물질 분석
<4-1> 에탄올( ethanol ) 처리에 의한 면역독성물질 확인
상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 인간 배아 줄기세포로부터 간세포로의 분화 유도된 세포에 약물처리를 하여 면역독성 물질을 분석하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 배양하여 분화 19일째 간세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 90% 농도로 분주한 다음, 1000 mg/L DMEM-낮은 포도당(low glucose) 배양액(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 제조사 Welgene No. 001-11)을 사용하여 교체한 후 2시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포에 각기 다른 농도의 0, 100 및 200 mM 에탄올(Merk, No. 100983)을 24 시간 동안 처리하였다. 줄기세포 유래 간세포와 인간 간세포에 에탄올을 처리하여 염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 생성을 비교하기 위하여, 상기 <실시예 2>에 기재된 방법으로 배양한 인간 간세포에 각기 다른 농도의 0, 100 및 200 mM 에탄올(Merk, No. 100983)을 24 시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 면역독성물질을 추출하기 위하여 상기 줄기세포 유래 간세포 및 인간 간세포 배양액을 수득하였다. 상기 세포들의 부산물을 제거하기 위하여 원심분리를 12000 x g, 20분 및 4℃ 조건으로 실시한 후, 상등액을 수득하였다. 상기 <실시예 3>에 기재된 방법으로 구축된 사이토카인 ELISA 분석 시스템을 이용하여 에탄올 처리에 따른 분화 간세포의 사이토카인 분비 프로파일링을 실시하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 인간 줄기세포(hESC4)로부터 간세포로 분화 유도된 세포에 에탄올을 각기 다른 농도로 처리하였을 때, 염증성(pro-inflammatory) 사이토카인의 생성이 확인되지 않았으나, 상기 <실시예 2>에 기재된 방법으로 배양한 인간 간세포에 에탄올을 처리한 경우 사이토카인이 일부 검출되는 것을 확인하였다. 따라서, 일반 독성검사 결과와 비슷한 양상으로 줄기세포 유래 간세포의 경우 에탄올(ethanol)에 대한 독성반응이 나타나지 않는 것으로 유추할 수 있다(도 4).
<4-2> CCl 4 처리에 의한 면역독성물질 확인
상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 인간 배아 줄기세포로부터 간세포로의 분화 유도된 세포에 약물처리를 하여 면역독성물질을 분석하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 인간 배아 줄기세포(hESC4)로부터 분화된 간세포에 CCl4(사염화탄소와 DMSO를 1:1로 혼합한 저장액(stock), Sigma, No. 319961)을 제조하여 각기 다른 농도 0, 5, 10 및 20 mM로 24 시간 동안 처리하였다. 인간 배아 줄기세포 유래 간세포와 인간 간세포에 CCl4를 처리하여 염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 생성을 비교하기 위하여, 상기 <실시예 2>에 기재된 방법으로 배양한 인간 간세포에 각기 다른 농도의 0, 5, 10 및 20 mM CCl4(Sigma, No. 319961)를 24 시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 면역독성물질을 추출하기 위하여 상기 줄기 세포 유래 간세포 및 인간 간세포 배양액을 수득하였다. 상기 세포들의 부산물을 제거하기 위하여 원심분리를 12000 x g, 20분 및 4℃ 조건으로 실시한 후, 상등액을 수득하였다. 상기 <실시예 3>에 기재된 방법으로 구축된 사이토카인 ELISA 분석 시스템을 이용하여 에탄올 처리에 따른 분화 간세포의 사이토카인 분비 프로파일링을 실시하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 인간 배아 줄기세포(hES4)로부터 분화된 간세포에 CCl4를 처리하였을 때, 상기 세포에서 IL-6, IL-10 및 IFN-α가 검출되었고 CCl4를 처리한 농도에 따라 일반적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 인간 간세포(hES15)에 CCl4를 처리하였을 때, 상기 세포에서도 IL-6, IL-10 및 IFN-α가 검출되는 것을 확인하였으나, 상기 세포 배양 시 줄기세포로부터 분화된 간세포보다 세포 수가 낮은 것을 감안하면 분비되는 사이토카인의 양은 인간 간세포에서 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 5)
<4-3> 아세토아미노펜 ( Acetoaminophen ) 처리에 의한 면역독성물질 확인
상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 인간 배아 줄기세포로부터 간세포로의 분화 유도된 세포에 약물처리를 하여 면역독성 물질을 분석하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 인간 배아 줄기세포(hESC4)로부터 분화된 간세포에 1.75 M 아세토아미노펜(Acetoaminophen, Sigma, No. A5000)을 DMSO에 용해시킨 후, 0, 10 및 20 mM 농도로 24시간 동안 처리하였다. 줄기세포 유래 간세포와 인간 간세포에 아세토아미노펜을 처리하여 염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 생성을 비교하기 위하여, 상기 <실시예 2>에 기재된 방법으로 배양한 인간 간세포(hES15)에 각기 다른 농도의 0, 10 및 20 mM 아세토아미노펜을 24 시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 면역독성물질을 추출하기 위하여 상기 줄기 세포 유래 간세포 및 인간 간세포 배양액을 수득하였다. 상기 세포들의 부산물을 제거하기 위하여 원심분리를 12000 x g, 20분 및 4℃ 조건으로 실시한 후, 상등액을 수득하였다. 상기 <실시예 3>에 기재된 방법으로 구축된 사이토카인 ELISA 분석 시스템을 이용하여 에탄올 처리에 따른 분화 간세포의 사이토카인 분비 프로파일링을 실시하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 인간 배아 줄기세포(hESC4)로부터 분화된 간세포에 아세토아미노펜을 처리하였을 때, 상기 세포에서 IL-6, TNF-α 및 IFN-β가 검출되는 것을 확인하였으며, 아세토아미노펜을 처리하는 농도에 따라 일반적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 인간 간세포(hES15)에 아세토아미노펜을 처리하였을 때, 상기 세포에서도 IL-6, TNF-α 및 IFN-β가 검출되는 것을 확인하였으나, 상기 세포 배양 시 줄기세포로부터 분화된 간세포보다 세포 수가 낮은 것을 감안하면 분비되는 IL-6 및 IFN-β 사이토카인의 양은 인간 간세포에서 높게 나타나는 것을 확인하였으며, 특이적으로 줄기세포 분화 간세포에서 TNF-α사이토카인 양이 아주 높게 검출되는 것을 확인하였다(도 6).

Claims (12)

1) 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포에 피검 물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 간세포의 사멸 또는 증식 저해 수준을 측정하는 단계를 포함하는 간 독성 유발물질의 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 인간 줄기세포는 인간 배아 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 간독성 유발물질의 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 분화는
a) 인간 줄기세포를 배양하여 분화를 유도하는 단계; 및
b) 상기 분화된 세포를 간세포 성장인자를 첨가한 배지에 배양하는 단계를 포함한 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 간독성 유발물질의 스크리닝 방법.
1) 인간 줄기세포로부터 분화된 간세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 간세포의 배양액 또는 상등액을 수득하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 배양액 또는 상등액에서 사이토카인, 케모카인 또는 지질매개체를 분석하는 단계를 포함하는 간독성 유발물질의 스크리닝 방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 1)의 줄기세포는 인간 배아 줄기세포인 것을 특징으로 하는 간독성 유발물질의 스크리닝 방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 3)의 사이토카인은 IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, IFN-α, IFN-β 및 TGF-β으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 간독성 유발물질의 스크리닝 방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 3)의 케모카인은 IL-8, IP-10, RANTES, MIP-1 및 MCP로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 간독성 유발물질의 스크리닝 방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 3)의 지질매개체는 프로스타글란딘(prostaglandin) 및 류코트리엔(leukotriene)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 간독성 유발물질의 스크리닝 방법.
제 1항 또는 4항 중 어느 한 항에 있어서, 간독성 유발물질은 에탄올, CCl4, 아세토아미노펜으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 간독성 유발물질의 스크리닝 방법.
인간 줄기세포로부터 분화된 간세포를 포함하는 간독성 유발물질 검출용 키트.
제 10 또는 제 12항 중 어느 한항에 있어서, 간독성 유발물질은 에탄올, CCl4, 아세토아미노펜으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 간독성 유발물질 검출용 키트.
인간 줄기세포로부터 분화된 간세포 및 그 간세포가 분화하는 매개체 검출 시약을 포함하는 간독성 유발물질 검출용 키트.
KR1020140024898A 2014-03-03 2014-03-03 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 방법 KR20150103431A (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140024898A KR20150103431A (ko) 2014-03-03 2014-03-03 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 방법
PCT/KR2015/002038 WO2015133791A1 (ko) 2014-03-03 2015-03-03 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 방법
CN201580020870.8A CN106460026A (zh) 2014-03-03 2015-03-03 利用源自人干细胞的肝细胞的免疫肝毒性筛选方法
US15/257,338 US20170052172A1 (en) 2014-03-03 2016-09-06 Immune hepatotoxicity screening method using hepatocytes derived from human stem cells

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140024898A KR20150103431A (ko) 2014-03-03 2014-03-03 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150103431A true KR20150103431A (ko) 2015-09-11

Family

ID=54055539

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140024898A KR20150103431A (ko) 2014-03-03 2014-03-03 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 방법

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20170052172A1 (ko)
KR (1) KR20150103431A (ko)
CN (1) CN106460026A (ko)
WO (1) WO2015133791A1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180121065A (ko) * 2017-04-28 2018-11-07 가천대학교 산학협력단 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법
KR20190027474A (ko) * 2017-09-07 2019-03-15 계명대학교 산학협력단 간독성 유발 물질 예측용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 간독성 유발 물질의 스크리닝 방법
KR102017110B1 (ko) 2018-03-08 2019-09-02 한국화학연구원 구역화된 간소엽 모사체 및 이를 이용한 구역별 간독성 평가방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7473555B2 (en) * 2000-04-27 2009-01-06 Geron Corporation Protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
US6458589B1 (en) * 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180121065A (ko) * 2017-04-28 2018-11-07 가천대학교 산학협력단 줄기세포 기반의 독성 물질 스크리닝 방법
KR20190027474A (ko) * 2017-09-07 2019-03-15 계명대학교 산학협력단 간독성 유발 물질 예측용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 간독성 유발 물질의 스크리닝 방법
KR102017110B1 (ko) 2018-03-08 2019-09-02 한국화학연구원 구역화된 간소엽 모사체 및 이를 이용한 구역별 간독성 평가방법
US10683483B2 (en) 2018-03-08 2020-06-16 Korea Research Institute Of Chemical Technology Microfabricated platform for mimicking the liver zonation and evaluating method of zonal toxicity using thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20170052172A1 (en) 2017-02-23
WO2015133791A1 (ko) 2015-09-11
CN106460026A (zh) 2017-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gough et al. Human biomimetic liver microphysiology systems in drug development and precision medicine
Bale et al. In vitro platforms for evaluating liver toxicity
Vernetti et al. A human liver microphysiology platform for investigating physiology, drug safety, and disease models
Moonen et al. Epithelial cell cycle behaviour in the injured kidney
Brown Unfinished business: target-based drug discovery
Cheong et al. High content cell screening in a microfluidic device
Kolaja Stem cells and stem cell-derived tissues and their use in safety assessment
Sah et al. The cellular senescence stress response in post-mitotic brain cells: cell survival at the expense of tissue degeneration
KR101856599B1 (ko) 분비 대사체 분석을 통한 간독성 약물 스크리닝 방법
Vinken et al. Protocols in in-vitro hepatocyte research
Knöspel et al. In vitro model for hepatotoxicity studies based on primary human hepatocyte cultivation in a perfused 3D bioreactor system
CA2950470A1 (en) Human hepatic 3d co-culture model and uses thereof
KR20150103431A (ko) 인간 줄기세포 유래 간세포를 이용한 면역 간독성 스크리닝 방법
Hargrove-Grimes et al. Microphysiological systems: What it takes for community adoption
Ramadan et al. Pharmacokinetics‐on‐a‐chip: in vitro microphysiological models for emulating of drugs ADME
Lipponen et al. In vitro and in vivo pipeline for validation of disease-modifying effects of systems biology-derived network treatments for traumatic brain injury—lessons learned
Lindoso et al. Proteomics in the world of induced pluripotent stem cells
Bilinovich et al. Integrated RNA sequencing reveals epigenetic impacts of diesel particulate matter exposure in human cerebral organoids
Kulkeaw et al. Progress and Challenges in the Use of a Liver-on-a-Chip for Hepatotropic Infectious Diseases
Chwastek et al. Inflammation-driven secretion potential is upregulated in osteoarthritic fibroblast-like synoviocytes
Liu et al. Effects of psychotropic drugs on ribosomal genes and protein synthesis
Göpferich et al. Single cell 3’UTR analysis identifies changes in alternative polyadenylation throughout neuronal differentiation and in autism
Hwang et al. Role of human primary renal fibroblast in TGF-β1-mediated fibrosis-mimicking devices
Shin et al. Quantitative evaluation of cytochrome P450 3A4 inhibition and hepatotoxicity in HepaRG 3-D spheroids
Sabbah et al. Predicting angiogenesis by endothelial progenitor cells relying on in-vitro function assays and VEGFR-2 expression levels

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E601 Decision to refuse application