WO2019050314A1 - 세포 배양을 위한 맞춤형 생장 인자 스크리닝 시스템 - Google Patents

세포 배양을 위한 맞춤형 생장 인자 스크리닝 시스템 Download PDF

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WO2019050314A1
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growth factor
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남도현
강현주
신가영
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사회복지법인 삼성생명공익재단
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    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro

Definitions

  • One aspect includes the steps of adding to the culture medium one or more growth factors and cells isolated from the subject; Culturing said cells; And measuring the proliferative activity of the cell. ≪ Desc / Clms Page number 2 >
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a method of screening a customized growth factor combination for cell culture according to an aspect of the present invention.
  • an arbitrary cell to be cultured can be selected.
  • the cells may be tumor spleoids that need to be utilized for scientific research and therapeutic purposes, commercialized cells that require increased culture efficiency, or cells that require cell culture.
  • the cells may be classified according to certain conditions as required. The conditions may be those that depend on the originating tissue, the type of disease, the severity of the disease (for example, tumor grade, genotype, or other molecular-pathologic feature in cancer).
  • the candidate growth factors to be added to the cell culture medium from the omics-based database such as dielectrics, transcripts, and proteases are classified.
  • the database may be published in a publicly accessible pathway in the art (e.g. Protein Database, http://www.proteinatlas.org/, http://www.uniprot.org/) help / uniprotkb), or it may be data stored in the laboratory by an ordinary technician.
  • the selected candidates may be a set of growth factors comprising two or more growth factors.
  • Selected candidates can be added to tens or thousands of media (wells, chips, beads) simultaneously using high throughput screening (HTS) devices and methods, and subsequent cultivation and analysis can be performed manually or in automated systems ≪ / RTI > At this time, there may be more than one kind of cells, and at the same time, more than one kind of candidate growth factor may be selected.
  • the cells or selected growth factor candidates may be dispensed into the medium as intended by those of ordinary skill in the art, or the HTS device may be randomly dispensed into the above tens or thousands of mediums. Then, if the cell growth of a specific medium is changed in comparison with the control, the HTS apparatus can be used to analyze the cells, growth factors and other substances contained in the medium.
  • HTS devices may include plates, cell and growth factor dispensers, incubators, automated delivery devices, image analyzers, data storage devices, and data analysis devices and analysis programs.
  • the degree of influence on cell growth can be measured by quantitative analysis or image analysis.
  • Figure 2 shows an overview of an assay method for screening growth factor combinations according to one aspect.
  • changes in cell proliferation, apoptosis or necrosis, invasion or migration cell characteristics (stem cell function / differentiation ability, signal And the change in the propagation path sensitivity).
  • the measurement is performed by a quantitative analysis method such as colorimetry, fluorescence measurement, luminescence measurement, or image analysis using staining such as cell morphogenesis, cell morphology, cell number, cell density, invasion / migration, cell proliferation, apoptosis, Lt; / RTI >
  • a quantitative analysis method such as colorimetry, fluorescence measurement, luminescence measurement, or image analysis using staining such as cell morphogenesis, cell morphology, cell number, cell density, invasion / migration, cell proliferation, apoptosis, Lt; / RTI >
  • An apparatus, a kit, or the like for carrying out the measurement is commercially available, and can be easily performed by an ordinary technician according to the manual provided by the seller.
  • candidates with a z-score value > 0.8 which give influence to the cell growth in more than 70% of the cell samples, were used as the first selection condition and a candidate group having a common hit for cell growth Can be selected.
  • a candidate group that has specific hits for cell growth can be selected using the candidate groups that help grow in specific cell samples (z-score value> 0.8), even if less than 70%, as the second selection condition have.
  • the candidate groups may be a growth factor set or combination of growth factor combinations comprising two or more growth factors.
  • the candidate groups that have a significant influence on the cell growth through the above measurement can be registered in a separate growth factor search platform.
  • significance means that the observed characteristic of the sample has reached a statistical probability of being able to be said to be the real property of the object, not by chance, Can be determined by a method commonly known in the art and a mathematical expression. The significance level at this time may be 5%.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating a process for selecting a growth factor according to an embodiment of the present invention.
  • a growth factor to be included in the cell culture medium for promoting cell culture can be selected.
  • the screening includes a) analysis of the components contained in the culture medium, b) information on the growth factors affecting cell growth, which is disclosed in a path easily accessible to the ordinary technician, and c) autocrine ), And ultimately to select the growth factors to be added to the cell culture medium.
  • a combination of a) a growth factor added to a culture medium, b) a known growth factor, and c) a self-secreted factor a combination of the desired growth factors, Can be performed.
  • This combination of growth factors that have been shown to be associated with cell proliferation can be used again to determine if it affects the culture of specific cell populations, such as cancer stem cells.
  • Combinations of growth factors that have a significant effect on cell growth can be registered on a separate growth factor search platform.
  • the combination of the growth factors registered in the growth factor search platform can be updated as additional data is collected, and new conditions may be added in addition to the cell or growth factor classification conditions or the selection conditions described above. Also, combinations of growth factors that do not show meaningful results can be registered with the growth factor search platform as meaningless data. These insignificant data may then be updated as additional data is collected.
  • Another aspect provides a cell-specific growth factor search apparatus for performing the above-described growth factor search.
  • the apparatus In order to carry out the cell-specific growth factor screening, the apparatus is provided with an HTS performance apparatus having several tens to several hundreds of plates (wells, chips, beads) at the same time, a measurement apparatus capable of performing quantitative or qualitative analysis of cells, an analysis program capable of performing hit selection, a database and a storage device including an algorithm capable of associating and storing a combination of growth factors with a type of cell (classification) showing a cell growth rate change of a certain level or higher .
  • the method of screening the combination of the customized growth factors for cell culture it is possible to efficiently select optimal conditions for cell culture, thereby maximizing the efficiency of cell culture.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a method of screening a customized growth factor combination for cell culture according to an aspect of the present invention.
  • Figure 2 shows an overview of an assay method for screening growth factor combinations according to one aspect.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating a process for selecting a growth factor according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the results of testing the concentration of added growth factors selected according to one aspect.
  • Figure 5 shows the results of testing the number of cells required for growth factor screening.
  • FIG. 6 shows a result of measuring the tumor-sphere forming ability of the cells to test the selected growth factor conditions according to one aspect.
  • Figure 7 shows the reproducibility of the growth factor screening method according to one aspect of the present invention.
  • Figure 8a shows that the growth factors selected according to one aspect increase cell growth statistically significantly.
  • FIG. 8b shows that the effect of selected growth factors according to one aspect is confirmed through the tumor-globule formation result.
  • FIG. 9A shows selection of cells that are affected differently for the same growth factor conditions, using a growth factor screening method according to one aspect of the present invention.
  • Figure 9b shows that the cells affected by different growth factor conditions undergo different changes in intracellular signaling pathways.
  • cancer tissues were obtained after obtaining written consent from cancer patients.
  • 384-well plate culture medium Neuroblastasal medium, N2 Supplement (0.5X to 1X), B27 Supplement w / o vitA -glutamine 200 mM
  • EGF EGF, FGF, HGF, IGF1, IL6, MDK, NRG1, PEDF, PDGF, PIGF, SEMA3A, SHH, TGFB1, RSPO1, WNT3A, NOG, A2M, ANGPT2, CHI3L1, FN1, LGALS1 , IGFBP2, TNC, CLU, GPC3, THBS1, CST3, LAMA4, LAMC1, PTGDS, IGFBP7, COL6A1, CTSB, ICAM2, CSK, MMP7, S100A10, SELP and Laminin.
  • the growth factors used for selection of the culture conditions were selected according to the process described in FIG. 3 (hereinafter, the process of selecting a suitable culture composition by measuring the cell response to the single and complex conditions of the present growth factor is referred to as GFSCAN) .
  • Concentration titration of the combination of growth factors on GFSCAN was tested in 10 species of tumor spoloids. Specifically, the growth factor combinations registered in Example 1 were cultured under the conditions of 0.2 ng / ml to 125 ng / ml (0.2 ng / ml, 1 ng / ml, 5 ng / ml, 25 ng / ml, 125 ng / Was added to the cell culture medium to measure the effect on cell growth.
  • EGF / bFGF which is a basic growth factor condition, showed the greatest effect on cell growth on average at 5 ng / ml, and no effect of addition of growth factors on cell growth ability was confirmed Respectively.
  • growth inhibitory effects of PFSF, NRG, and MDK among the growth factors in the GFSCAN were investigated. No effect of the growth factors was observed under the conditions of 1 ng / ml or higher. Rather, PEDF and MDK were found to have a negative effect on cell growth depending on the growth factors added.
  • the growth factor combination [Neurobasal medium, N2 Supplement (0.5X), B27 Supplement w / o vit A (0.5X) (L-glutamine 200 mM (Thermo fisher), 20 ng / ml of EGF and 20 ng / ml of bFGF (R & D Biosystems)]. And the growth factor conditions that can promote the cell growth and tumor - sphere forming ability were selected.
  • GFSCAN was performed on 20 species of tumor spleens in order to investigate the difference of growth ability under the same growth factors according to individual patient characteristics.
  • one of the representative conditions (EGF / bFGF 5 ng / ml + TGF-beta 1 ng / ml) was selected and tumor spermoids with enhanced or suppressed cell growth were selected under the same conditions.
  • GFSCAN results were verified through individual cell experiments.

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Abstract

배양 배지에 하나 이상의 생장 인자(growth factor) 및 개체로부터 분리된 세포를 첨가하는 단계; 상기 세포를 배양하는 단계; 및 상기 세포의 세포 생장능(proliferative activity)을 측정하는 단계를 포함하는, 세포 배양을 위한 맞춤형 생장 인자 조합을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일 양상에 따른 세포 맞춤형 세포 배양 조건을 스크리닝하는 방법에 의하면, 세포 배양을 위한 최적의 조건을 효율적으로 선별할 수 있다.

Description

세포 배양을 위한 맞춤형 생장 인자 스크리닝 시스템
본 출원은 2017년 9월7일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2017-0114696호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
종양 스페로이드 배양을 위한 맞춤형 생장 인자 스크리닝 시스템에 관한 것이다.
체외에서의 생물학적 연구를 위해서는 세포확보가 필요하다. 그러나 체내 조건과 완전히 동일한 조건을 세포 배양 배지에서 구현하기 어렵기 때문에, 인위적인 세포 생장 촉진 또는 세포 유지가 가능한 배양 조건(특히 배양 배지)을 세포배양에 적용하고 있다. 이때 세포의 원발 조직의 특성, 체외 배양 환경 및 배양 목적에 따라 다양한 배양 배지조성이 요구되며, 특히 세포의 배양 효율성 극대화 및 원발 세포의 특성을 잘 반영할 수 있는 배지 조성의 선별은 세포의 체외 배양을 위한 필수적인 요소이다.
특히 기존에 확립된 세포주(cell line)에 대한 의과학연구의 미충족요건(clinical un-met needs)들이 대두되면서, 환자의 질병 부위에서 채취한 세포(종양 스페로이드,Tumor spheroids)를 배양하여, 환자 맞춤형 치료 및 질병 매커니즘 연구에 활용하는 사례가 증가하게 됨에 따라 종양 스페로이드의 배양은 필수 불가결한 요건으로 대두되고 있다. 그러나, 환자 개인별 분자 유전학적 특성의 차이와, 원발 조직의 특성 등의 차이가 있기 때문에, 환자에서 분리된 세포(특히 질병 특이적인 세포만을)가 생장/유지 가능한 배양 조건을 선별하는 것은 어렵다. 일반적으로 알려진 배양 조건에서는 1) 질환 특이적 세포 외 타 세포의 증식 조절이 어려워 배양된 세포 내 질환 특이적 세포가 배양되지 않을 수 있고, 2) 원발 조직 내 특정 군만의 세포가 선별되어 배양될 수 있다.
따라서, 이러한 문제 영향을 최소화하고, 종양 스페로이드의 배양 효율성을 극대화할 수 있는 배양 조건을 스크리닝하는 방법을 개발할 필요성이 있다.
배양 배지에 하나 이상의 생장 인자(growth factor) 및 개체로부터 분리된 세포를 첨가하는 단계; 상기 세포를 배양하는 단계; 및 상기 세포의 세포 생장능(proliferative activity)을 측정하는 단계를 포함하는, 세포 배양을 위한 맞춤형 생장 인자 조합을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 양상은 배양 배지에 하나 이상의 생장 인자(growth factor) 및 개체로부터 분리된 세포를 첨가하는 단계; 상기 세포를 배양하는 단계; 및 상기 세포의 세포 생장능(proliferative activity)을 측정하는 단계를 포함하는, 세포 배양을 위한 맞춤형 생장 인자 조합을 선별하는 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 일 양상에 따라 세포 배양을 위한 맞춤형 생장 인자 조합을 스크리닝하는 방법을 나타내는 모식도이다.
먼저 배양하고자 하는 임의의 세포를 선정할 수 있다. 상기 세포는 의과학적 연구 및 치료의 목적으로 활용이 필요한 종양 스페로이드, 배양 효율 증가가 필요한 상업화된 세포, 또는 세포 배양이 필요한 모든 세포를 의미할 수 있다. 상기 세포는 필요에 따라 일정한 조건에 따라 분류될 수 있다. 상기 조건은 유래 조직, 질병의 종류, 질병의 중증도(예를 들어, 암의 경우 종양 등급(tumor grade), 유전형, 또는 기타 분자 병리 소견(molecular-pathologic feature)에 따르는 것일 수 있다.
선정된 세포에 따라, 유전체, 전사체, 단백체 등 오믹스 기반 데이터 베이스로부터 세포 배양 배지에 첨가하고자 하는 생장 인자 후보군을 분류한다. 상기 데이터 베이스는 당해 분야의 통상의 기술자가 접근할 수 있는 경로에 공개되어 있는 것(예를 들면, 프로테인 데이터베이스, http://www.proteinatlas.org/, http://www.uniprot.org/help/uniprotkb)이거나, 통상의 기술자가 당해 실험실 내에서 축적한 데이터일 수 있다. 이때 선별된 후보군들은 2 이상의 생장 인자를 포함하는 생장 인자 세트일 수 있다.
선별된 후보군들은 고속 대량 스크리닝(high throughput screening: HTS) 장치 및 방법을 이용하여 수십 내지 수천 개의 배지(웰, 칩, 비드)에 동시에 첨가될 수 있으며, 이후의 배양 및 분석이 수동 또는 자동화된 시스템으로 수행되는 것일 수 있다. 이때 세포의 종류는 하나 이상일 수 있으며, 동시에 선별된 생장 인자 후보군 또한 하나 이상일 수 있다. 상기 세포 또는 선별된 생장 인자 후보군은 본 과정을 수행하는 통상의 기술자가 의도한 대로 배지에 분주되거나, 또는 HTS 장치가 무작위로 상기 수십 내지 수천 개의 배지에 분주하는 것일 수 있다. 이후 특정 배지의 세포 생장능이 대조군과 비교하여 변화하면, HTS 장치를 이용하여 해당 배지에 포함된 세포, 생장 인자 및 다른 물질들이 무엇인지 분석할 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 상업화된 임의의 HTS 장치 및 방법을 이용하여 상기한 과정들을 포함하는 HTS를 수행할 수 있다. 이러한 HTS 장치는 플레이트, 세포 및 생장 인자 분주기, 항온 배양기, 자동 운반 장치, 이미지 분석기, 데이터 저장장치, 및 데이터 분석장치 및 분석 프로그램을 포함하는 것일 수 있다. 세포 생장에 영향을 미치는 정도는 정량 분석 또는 이미지 분석 등을 이용하여 수행할 수 있다.
도 2는 일 양상에 따라 생장 인자 조합을 선별하기 위한 분석 방법을 개괄적으로 나타낸다. 세포 생장에 영향을 미치는 정도를 측정하기 위하여, 세포의 생장(proliferation)의 변화, 세포 사멸(apoptosis, 또는 necrosis), 세포 이동(invasion, 또는 migration), 세포의 특성(줄기세포능/분화능, 신호전달경로 민감도)의 변화 등을 측정하여 판별할 수 있다. 상기 측정은 비색법, 형광 측정, 발광 측정 등의 양적 분석법, 또는 세포구 형성, 세포 형태, 세포 수, 세포 밀도, 침습/이동, 세포 증식, 세포 사멸, 세포 노화 등 염색을 이용한 이미지 분석법으로 수행되는 것일 수 있다. 상기 측정을 수행하기 위한 장치, 또는 키트 등은 상업적으로 판매되고 있으며, 판매자가 제공하는 메뉴얼에 따라 통상의 기술자가 쉽게 실시할 수 있다.
이 때, 70% 이상의 세포 샘플에서 세포 생장에 영향(도움)을 주는(z-score value > 0.8) 후보군들을 제1 선별조건으로 사용하여, 세포 생장에 범용적 효과(common hit)를 갖는 후보군으로 선별할 수 있다. 또한 70% 미만일 지라도, 특정 세포 샘플에서 생장에 도움을 주는(z-score value > 0.8) 후보군들을 제2 선별조건으로 사용하여, 세포 생장에 특이적 효과(specific hit)를 갖는 후보군으로 선별할 수 있다. 상기 후보군들은 2 이상의 생장 인자를 포함하는 생장 인자 세트 또는 생장 인자 조합 후보군일 수 있다. 상기 측정을 통해 세포 생장에 유의한 영향을 미치는 후보군들은 별도의 생장인자 검색 플랫폼에 등록시킬 수 있다. 용어 "유의(significance)", 또는 "통계적 유의(statistical significance)"는 표본의 관찰된 특성이 우연에 의한 것이 아니라 대상의 실재 특성이라고 말할 수 있는 정도의 통계적 확률에 도달한 것을 의미하며, 당해 분야에 통상적으로 알려진 방법 및 수학식으로 유의한 결과인지 여부를 판별할 수 있다. 이 때의 유의수준은 5%일 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 양상에 따른 생장 인자를 선정하기 위한 과정을 나타내는 모식도이다.
세포의 배양에 도움을 주는 배양 배지가 확인되면, 세포 배양을 촉진시키기 위한 세포 배양 배지에 포함될 생장 인자를 선별하는 과정을 수행할 수 있다. 상기 선별은 a) 상기 배양 배지에 포함된 성분 분석, b) 통상의 기술자가 쉽게 접근할 수 있는 경로에 공개된 세포 생장에 영향을 미치는 생장 인자에 관한 정보, 및 c) 세포로부터 자가 분비(autocrine)되는 성분을 모두 종합적으로 확인하고, 최종적으로 세포 배양 배지에 첨가될 생장 인자들을 선별하는 과정일 수 있다.
상기와 같이, a) 배양 배지에 추가된 생장 인자, b) 기존에 알려진 생장 인자, 및 c) 자가 분비된 인자들 중 원하는 생장 인자의 조합을 구성하면, 이를 포함하는 배양 배지를 이용하여 세포 배양을 실시할 수 있다. 이를 통해 세포 증식과 관련이 있는 것으로 나타난 생장 인자의 조합은, 다시 암 줄기 세포(cancer stem cell) 등 특정한 세포군의 배양에 영향을 미치는지 측정하는데 사용할 수 있다. 상기 측정을 통해 세포 생장에 유의한 영향을 미치는 생장 인자의 조합들은 별도의 생장 인자 검색 플랫폼에 등록시킬 수 있다.
상기와 같이 생장 인자 검색 플랫폼에 등록된 생장 인자 조합들은 이후 추가적인 데이터가 수집됨에 따라 갱신될 수 있으며, 앞서 제시한 세포 또는 생장 인자 분류 조건 또는 선별 조건들 이외에도 새로운 조건이 추가될 수 있다. 또한 유의미한 결과를 나타내지 못한 생장 인자 조합들도 유의미하지 않은 데이터로서 상기 생장 인자 검색 플랫폼에 등록될 수 있다. 이러한 유의미하지 않은 데이터들은 이후 추가적인 데이터가 수집됨에 따라 갱신될 수 있다.
다른 양상은 상기 생장 인자 검색을 수행하기 위한 세포 맞춤형 생장 인자 검색 장치를 제공한다.
상기 장치는 상기 세포 맞춤형 생장 인자 스크리닝을 수행하기 위해서, 동시에 수십 내지 수백 개의 플레이트(웰, 칩, 비드)를 갖는 HTS 수행 장치, 세포의 정량 또는 정성 분석을 수행할 수 있는 측정기기, 및 히트 선별(hit selection)을 수행할 수 있는 분석 프로그램, 일정 수준 이상의 세포 생장률 변화를 보인 세포의 종류(분류)와 생장 인자 조합을 연계하고 저장할 수 있는 알고리즘을 포함하는 데이터 베이스 및 저장 기기를 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 세포 배양을 위한 맞춤형 생장 인자 조합을 스크리닝하는 방법에 의하면, 세포 배양을 위한 최적의 조건을 효율적으로 선별할 수 있는바, 세포 배양의 효율성 극대화할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 양상에 따라 세포 배양을 위한 맞춤형 생장 인자 조합을 스크리닝하는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 일 양상에 따라 생장 인자 조합을 선별하기 위한 분석 방법을 개괄적으로 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 양상에 따른 생장 인자를 선정하기 위한 과정을 나타내는 모식도이다.
도 4는 일 양상에 따라 선별된 생장 인자의 첨가 농도를 테스트한 결과를 나타낸다.
도 5는 생장 인자 스크리닝을 위해 필요한 세포 수를 테스트한 결과를 나타낸다.
도 6은 일 양상에 따라 선별된 생장 인자 조건을 검증하기 위해 세포의 종양-구 형성능을 측정하여 테스트한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 양상에 따른 생장 인자 스크리닝 방법의 재현성을 나타낸다.
도 8a은 일 양상에 따라 선별된 생장 인자들이 통계적으로 유의하게 세포 생장을 증가시킴을 나타낸다.
도 8b은 일 양상에 따라 선별된 생장 인자들의 효과를 종양-구 형성능 결과를 통하여 확인하는 것을 나타낸다.
도 9a는 본 발명의 일 양상에 따른 생장 인자 스크리닝 방법을 이용하여, 동일한 생장 인자 조건에 대하여 서로 다른 영향을 받는 세포를 선별하는 것을 나타낸다.
도 9b는 동일한 생장 인자 조건에 대하여 서로 다른 영향을 받는 세포들이 세포 내 신호 전달 경로의 변화가 발생함을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 종양 스페로이드의 생장에 영향을 미치는 생장 인자 선별
삼성서울병원 임상시험윤리위원회 지침서에 따라, 암 환자로부터 서면 동의를 얻은 후 암 조직을 채취하였다.
이후 상기 암 조직들로부터 단일세포를 분리한 후, 세포를 384-웰 플레이트의 배양 배지(Neurobasal A medium, N2 Supplement(0.5X ~ 1X), B27 Supplement w/o vitA(0.5X ~1X), L-glutamine 200 mM)에 분주하고, EGF, FGF, HGF, IGF1, IL6, MDK, NRG1, PEDF, PDGF, PIGF, SEMA3A, SHH, TGFB1, RSPO1, WNT3A, NOG, A2M, ANGPT2, CHI3L1, FN1, LGALS1, IGFBP2, TNC, CLU, GPC3, THBS1, CST3, LAMA4, LAMC1, PTGDS, IGFBP7, COL6A1, CTSB, ICAM2, CSK, MMP7, S100A10, SELP, 및 Laminin의 생장인자의 단일 또는 병용 첨가를 통하여 각 조건에 따른 세포 생장능, 모양(morphology), 및 다양한 분자학적 변화(molecular change) 등에 대한 평가를 진행하였다. 이때 배양조건 선별을 위해 사용한 생장인자는 도 3에 명기된 프로세스에 따라 선정하였다 (이하, 본 생장인자의 단일 및 복합 조건에 대해 세포 반응을 측정하여 적합한 배양 조성을 선별하는 프로세스를 GFSCAN으로 지칭한다).
GFSCAN 결과 중 70% 이상의 세포 샘플에서 세포 생장 또는 종양-구 형성능 또는 초기 세포 특성 반영능에 대한 향상을 야기하는 생장인자 단일/조합을 범용적 조건(common hit)으로 선별하였고, 또는 범용적 조건에 해당하지 않지만 특정 세포에서 세포 생장 또는 종양-구 형성능 또는 세포 특성 반영능 향상에 도움을 주는 성장인자 조합들을 세포 특이적 조건(specific hit)으로 분류하였다. 적용 대상에 따라 범용적 조건 및 특이적 조건을 선정하여, 세포 배양에 활용할 수 있다.
실시예 2. 생장 인자 농도 적정성 테스트
GFSCAN에 탑재되는 생장 인자 조합의 농도 적정성을 종양 스페로이드 10종에 테스트하였다. 구체적으로 상기 실시예 1에서 등록된 생장 인자 조합들을 0.2 ng/㎖ 내지 125 ng/㎖ 조건(0.2 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 25 ng/㎖, 125 ng/㎖)으로 세포 배양 배지에 첨가하여, 세포 생장에 미치는 영향을 측정하였다.
도 4와 같이, 기본 생장 인자 조건인 EGF/bFGF의 경우 5 ng/㎖ 조건에서 평균적으로 세포 생장에 가장 큰 효과를 나타내는 것을 확인하였고, 추가적인 생장인자 첨가에 따른 세포 생장능 향상 효과는 없는 것으로 확인하였다. 또한 GFSCAN 내 탑재된 생장 인자 중 PEDF, NRG, 및 MDK 등에서 생장인자 농도에 따른 생장능 향상을 확인한 결과에서, 1 ng/㎖ 이상의 조건에서는 첨가된 생장인자의 양에 따르는 추가적인 효과가 확인되지 않았다. 오히려, PEDF, 및 MDK의 경우 첨가되는 생장 인자에 따라 세포 생장에 부정적인 효과를 미치는 것을 확인하였다.
실시예 3. 초기 세포 수 적정성 테스트
생장 인자 스크리닝시 최초에 분주되는 세포 수를 결정하기 위한 실험을 진행하였다. 500 내지 2000개 세포(500, 1000, 또는 2000 세포)를 플레이트에 분주하고, EGF/bFGF 5ng/㎖ 또는 GFSCAN에 등록된 임의의 생장 인자 조합(1 ng/㎖)을 기본 농도로 첨가하고 7일 후 자란 세포 수를 측정하여, 7일 후 세포 생존율/0일 세포 생존율을 세포 생장능(proliferative activity)으로 정의하고 계산하였다. 세포 자체의 생장율이 GFSCAN 결과에 미치는 영향 및 최적화 조건을 확인하기 위하여, 3단계의 세포 자체의 생장율의 차이를 보이는(1단계: 0.5~2, 2단계: 2~5, 3단계: 5 이상) 세포를 선정하여 각 세포의 초기세포 수를 500, 1000, 2000개로 통제하여 GFSCAN을 진행하고, 종래조건에서의 결과를 비교하였다. 도 5의 상단 표와 같이 1) 세포 자체 생장능, 2) 초기세포 수에 따라 7일 후 세포 생장능 차이를 보이는 것을 확인하였다. 이 중 모든 세포 자체 생장능 조건에서 공통적으로 7일 후 세포 생장능의 차이가 극대화되는 초기 세포 수는 500개로 나타났다(도 5 상단).
또한 초기세포 수 500개 조건에서 GFSCAN 탑재 생장 인자의 적정 농도 조건(1X: 기본농도; 2X: 기본농도의 2배 조건; 4X: 기본농도 4배 조건)을 검증한 결과, 기본 농도(1X)조건 또는 2X 조건에서 세포 생장능이 극대화됨을 확인하였다(도 5 하단).
실시예 4. GFSCAN 데이터의 적절성 테스트
GFSCAN을 통해 선정된 배양 조건에 대한 검증을 진행하기 위하여 생장인자 조합들이 실제 세포 생장 효과를 갖는 적절한 데이터인지 여부를 판별하였다. 이를 위해, 뇌종양 종양 스페로이드 3종의 일정 수(1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 400개)의 세포를 분주한 후, GFSCAN을 통해 세포 생장에 영향이 없는 것으로 판별된 무 생장 조건과 GFSCAN을 통해 세포 생장에 도움을 주는 것으로 선정된 생장인자 조합 조건에서 세포의 종양-구 형성능을 비교하였다.
그 결과 도 6과 같이, 무 생장 조건 대비하여 GFSCAN을 통해 세포 생장에 도움을 주는 것으로 선정된 생장 인자 조합[Neurobasal A medium, N2 Supplement(0.5X), B27 Supplement w/o vit A(0.5X), L-glutamine 200 mM(Thermo fisher 社), 및 EGF 20 ng/㎖ 및 bGFG 20 ng/㎖ (R & D Biosystems)]의 경우 최대 10배 이상 종양-구 형성능이 증가함을 확인하여 본 발명을 통하여 세포 생장 및 종양-구 형성능의 향상을 촉진시킬 수 있는 생장인자 조건을 선별할 있음을 검증하였다.
실시예 5. GFSCAN 데이터의 재현성 테스트
GFSCAN에 저장된 데이터들의 재현성을 평가하였다. 종양 스페로이드 2종에 임의로 추출된 생장 인자 조합을 이용하여 3회 반복실험(반복시험 주기는 1주로 진행)을 진행하였다. 그 결과 도 7과 같이 각 실험 간 상관 계수 값(correlation ecoefficiency value, R2)이 0.9898 ~ 0.9957로 재현성이 높음을 검증하였다.
실시예 6. GFSCAN 데이터의 효과 우수성 테스트
뇌종양 종양 스페로이드 20종에 대하여 GFSCAN을 적용하여, 종래의 생장 인자 조건 (EGF/bFGF 20 ng/㎖) 대비 GFSCAN을 통해 선별된 각 세포별 최적 조건(EGF/bFGF 5 ng/㎖ + SHH/PEDF 1 ng/㎖)에 따른 세포 생장능을 평가하였다.
도 8과 같이, GFSCAN 데이터의 생장 인자 조합이 세포 생장능을 통계적으로 유의하게 증가시킴을 확인하였다(a). 이때 종양 스페로이드 2종에 대하여 종래의 생장 인자 조건과 GFSCAN을 통해 선별된 조건에서 장기 배양을 진행하여 세포 모양(morphology)의 변화 및 종양-구 형성능을 확인한 결과, GFSCAN을 통해 선별된 신규조건에서 종래 조건 대비 세포 생장 또는 종양-구 형성능이 향상됨을 확인하였다.
실시예 7. GFSCAN을 통한 특이적 세포 생장 효과를 갖는 생장 인자 조건 발굴
GFSCAN을 통해 환자 개인별 특성에 따라 동일 생장인자 조건에서 생장능의 차이를 볼 수 있는지 확인하기 위하여, 종양 스페로이드 20종에 대하여 GFSCAN을 시행하였다. GFSCAN 조건 중 대표 조건 1종(EGF/bFGF 5ng/㎖ + TGF-beta 1ng/㎖)을 선정하여, 동일 조건에서 세포 생장능이 향상되거나 억제된 종양 스페로이드를 각각 선정하여, TGF-beta 유무에 따라 세포 생장능이 GFSCAN 결과와 동일하게 나타남을 개별 세포 실험을 통해 GFSCAN 결과를 검증하였다.
또한 세포 생장능이 향상된 세포에서 배양 시 TGF-beta 첨가 시 생장 촉진과 관련된 신호 전달 경로가 활성화되거나, 관련 인자가 과발현되는 양상을 보이며, 세포 사멸 및 노화 또는 전사를 억제하는 신호 전달 경로 및 관련 물질(molecule)의 감소가 발생함을 확인하였다. (도 9b).

Claims (21)

  1. 배양 배지에 하나 이상의 생장 인자(growth factor) 및 개체로부터 분리된 세포를 첨가하는 단계;
    상기 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 세포의 세포 생장능(proliferative activity)을 측정하는 단계를 포함하는, 세포 배양을 위한 맞춤형 생장 인자 조합을 스크리닝하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 질병 조직으로부터 분리된 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 세포를 유래한 개체, 유래한 조직, 질병의 종류, 질병의 중증도, 또는 유전자 정보 중 선택된 하나 이상의 조건에 따라 분류하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 생장 인자는 상기 세포의 분류에 따라 오믹스 기반 데이터 베이스로부터 세포의 증식률을 증가시킬 것으로 예측되는 목록으로부터 선정된 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 배양하는 단계 및 측정하는 단계는 고속 대량 스크리닝 장치(high throughput screening: HTS)를 이용하여 수행하는 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 측정하는 단계는 정량적 분석 또는 이미지 분석을 이용하여 수행하는 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 정량적 분석은 비색법, 형광 측정, 또는 발광 측정 중 어느 하나로 수행하는 것인 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 이미지 분석은 세포구 형성, 세포 형태, 세포 수, 세포 밀도, 침습/이동, 세포 증식, 세포 사멸, 또는 세포 노화 중 어느 하나를 분석하는 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 스크리닝하는 방법은 상기 측정하는 단계로부터 세포 생장능이 대조군에 비하여 변화한 배지(z-score value > 0.8)를 특정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 스크리닝하는 방법은 상기 세포 생장능 측정에서 70% 이상의 세포 샘플에서 세포 생장에 영향을 주는(z-score value > 0.8) 생장 인자들을 제1 선별조건으로서 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 스크리닝하는 방법은 상기 세포 생장능 측정에서 70% 미만의 세포 샘플에서 세포 생장에 영향을 주는(z-score value > 0.8) 생장 인자들을 제2 선별조건으로서 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 제2 선별조건으로 선별된 생장 인자들은 해당하는 세포 샘플에 대하여 특이적 효과를 갖는 생장 인자로서 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 스크리닝하는 방법은 상기 특정된 배지 내에 포함된 생장 인자를 분석하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 특정된 배지 내에 포함된 생장 인자를 선별된 생장 인자로서 데이터 저장장치에 저장하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 특정된 배지가 아닌 다른 배지 내에 포함된 생장 인자를 선별되지 않은 생장 인자로서 데이터 저장장치에 저장하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  16. a) 배양 배지에 하나 이상의 생장 인자(growth factor) 및 개체로부터 분리된 세포를 첨가하는 단계;
    b) 상기 세포를 배양하는 단계;
    c) 상기 세포의 세포 생장능(proliferative activity)을 측정하는 단계;
    d) 상기 측정하는 단계로부터 세포 생장능이 대조군에 비하여 변화한 배지(z-score value > 0.8)를 특정하는 단계;
    e) 상기 특정된 배지 내에 포함된 생장 인자를 선별된 생장 인자로서 데이터 저장장치에 저장하는 단계;
    f) 상기 단계 e)에서 저장된 생장 인자를 이용하여 상기 a)-d) 단계를 반복하는 단계; 및
    g) 상기 단계 f)에서 얻은 데이터를 이용하여 기존의 저장된 데이터를 갱신하는 단계를 포함하는 세포 맞춤형 세포 배양 조건을 스크리닝하는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 단계 f)는 상기 단계 a)의 생장 인자와 다른 생장 인자를 더 첨가하여 수행하는 것인 방법.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 단계 f)는 상기 단계 a)의 세포와 다른 세포를 이용하여 수행하는 것인 방법.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 측정하는 단계는 정량적 분석 또는 이미지 분석을 이용하여 수행하는 것인 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 정량적 분석은 비색법, 형광 측정, 또는 발광 측정 중 어느 하나로 수행하는 것인 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 상기 이미지 분석은 세포구 형성, 세포 형태, 세포 수, 세포 밀도, 침습/이동, 세포 증식, 세포 사멸, 또는 세포 노화 중 어느 하나를 분석하는 것인 방법.
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