JP2006262813A - 受容体発現細胞とそれを用いた標的物質の機能の評価方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】遺伝子工学的手法により、チャネルゲートレセプター機能を有する取り扱い容易な細胞を構築すること、そしてそれを用いた機能計測システムを構築すること。
【解決手段】特定の機能を有する受容体とレポータータンパク質との融合タンパク質を発現し得る遺伝子を、培養容易な細胞に形質導入して得られる受容体発現細胞。そして、この細胞の発現するレポータータンパク質の活性を測定することによって、受容体の特定の機能を定量的に評価し、活性が標準化されたモデル細胞とする。これに標的物質を作用させ、モデル細胞が接触する電極の電位変化を測定、あるいは、モデル細胞周辺のイオン濃度の変化を測定することによって、標的物質と受容体との相互作用を評価するシステムが提供される。
【選択図】図1
【解決手段】特定の機能を有する受容体とレポータータンパク質との融合タンパク質を発現し得る遺伝子を、培養容易な細胞に形質導入して得られる受容体発現細胞。そして、この細胞の発現するレポータータンパク質の活性を測定することによって、受容体の特定の機能を定量的に評価し、活性が標準化されたモデル細胞とする。これに標的物質を作用させ、モデル細胞が接触する電極の電位変化を測定、あるいは、モデル細胞周辺のイオン濃度の変化を測定することによって、標的物質と受容体との相互作用を評価するシステムが提供される。
【選択図】図1
Description
本発明は、特定の機能を有する受容体を発現する受容体発現細胞、発現された受容体の機能の評価方法、及び、得られた受容体発現細胞を用いた標的物質の機能の評価方法に関する。
バイオセンサは、酵素や抗体といった生体分子が持つ高度な分子特異性を利用して、in situに目的分子の定量を行うことのできる、非常に優れた分析ツールである。酵素センサを中心として、既に事業化されているバイオセンサも数多くある。これらは特定の分子を測定することを目的としており、その限りにおいては有用なものである。
本発明者らは、様々な物質がヒトへ与える影響を測定するために、「細胞バイオセンシング」という概念の下に、ヒトに役立つバイオセンサの開発を進めてきた(例えば、下記非特許文献1参照)。この概念は、細胞が有する生体応答機能に基づいて、細胞が外部から受けた刺激(化学的又は物理的)の質を評価しようとする技術である。かかる技術は、簡便・迅速(high through-put)で、且つ、定量性の高いバイオアッセイであり、医薬品開発や安全性試験に非常に有用であると同時に、それらの試験・開発コストを下げ、開発に要する時間の短縮にも寄与しうると考えられる(例えば、下記非特許文献2参照)。
T.Haruyama, Advanced Drug Delivery Reviews,55,393-401(2003) 春山哲也、バイオマテリアル、20,(3),1-6(2002)
T.Haruyama, Advanced Drug Delivery Reviews,55,393-401(2003) 春山哲也、バイオマテリアル、20,(3),1-6(2002)
ところで、酵素等のタンパク質を用いたセンサは、in vivo、 in vitroのいずれの場合でも、タンパク質分解酵素による消化を受け、その機能を失ってしまう。また、生体親和性などの特性が必ずしも十分ではない。従って、従来の酵素等のタンパク質を用いたセンサは、「細胞バイオセンシング」の下ではバイオセンサとして利用することはできず、新たなバイオセンサが必要になるのである。
例えば、医薬品の開発においては、通常、動物実験あるいは培養細胞実験によるバイオアッセイが、その薬効を見極めるためのスクリーニング手法として採用されている。ところが、医薬品の中でも中枢神経系に直接作用する薬は、これから益々需要が高まることが予想されているが、神経系は培養細胞でのスクリーニング系の構築が難しい。これまで、神経系医薬設計の主要なターゲットである、神経トランスミッターレセプターへのリガンドアッセイが、培養細胞系では試みられている(非特許文献3参照)。しかし、リガンドアッセイは結合性を評価するのみであり、影響・効果等の機能活性を評価する情報は得られない。そのため、多くを動物実験に依存しなければならないという問題がある。
R. Dingledine, et al., Pharmacol. Rev., 51, 7-61 (1999)
R. Dingledine, et al., Pharmacol. Rev., 51, 7-61 (1999)
本発明者らは、「細胞バイオセンシング」の概念の下で、神経トランスミッターレセプター機能への作用を評価できるシステムの構築を検討してきた。そして、バイオアッセイで着目する分子機能だけを遺伝子工学的に切り出し、その機能をアッセイ上で取り扱いやすい、培養容易な細胞に形質導入し発現させるという、モデル細胞化とそのシステム化を提案した(下記非特許文献4と5参照)。しかしながら、本発明者らの提案においても、モデル細胞によって特定の分子機能を定常的に発現させることは可能であっても、その機能の発現量を一定にすることは分子生物学的に非常に困難であった。そして、その結果、かかる細胞をバイオセンサとした場合には、定量的で再現性のある測定結果が得られない、という問題があった。
T.Haruyama,et.al.,Analytical Chemistry,75(4),918-921(2003) 春山哲也、Chemical Sensors,Vol.20,No.4(2004)
T.Haruyama,et.al.,Analytical Chemistry,75(4),918-921(2003) 春山哲也、Chemical Sensors,Vol.20,No.4(2004)
本発明は、例えば、神経系医薬の開発がシナプス機能(リガンド開閉型チャネル機能又はチャネルゲートレセプター機能)をターゲットとして行われている一方で、有効なバイオアッセイモデルが存在しないことに着目し、遺伝子工学的手法により、チャネルゲートレセプター機能を有する取り扱い容易な細胞を構築し、且つ、その機能計測システムを構築すること、そして、更にその手法を一般化することを目的・課題としている。
本発明は、特定の機能を有する受容体とレポータータンパク質との融合タンパク質を発現し得る遺伝子を、培養容易な細胞に形質導入して得られる受容体発現細胞である。
本発明の他の態様は、特定の機能を有する受容体とレポータータンパク質とからなる融合タンパク質を、培養容易な細胞で発現させ、前記レポータータンパク質の活性を測定することによって、前記受容体の特定の機能を定量的に評価することを特徴とする受容体の機能の評価方法である。
本発明のもう一つの態様は、本発明の受容体発現細胞を利用した特定の受容体機能の評価システムに関するものであり、特定の機能を有する受容体とレポータータンパク質との融合タンパク質を発現し得る遺伝子を、培養容易な細胞に形質導入して得られる受容体発現細胞に、標的物質を作用させ、前記受容体発現細胞が接触する電極の電位変化を測定することによって、前記標的物質と前記受容体との相互作用を測定することを特徴とする標的物質の機能の評価方法である。
そして、本発明の更に他の態様も、本発明の受容体発現細胞を利用した特定の受容体機能の評価システムに関するものであり、特定の機能を有する受容体とレポータータンパク質との融合タンパク質を発現し得る遺伝子を、培養容易な細胞に形質導入して得られる受容体発現細胞に、標的物質を作用させ、前記受容体発現細胞周辺のイオン濃度の変化を測定することによって、前記標的物質と前記受容体との相互作用を測定することを特徴とする標的物質の機能の評価方法である。
本発明においては、例えば、GluR-GFP遺伝子を細胞に形質導入し、GluR-GFP融合タンパク質を発現させ、その発現量の確認を行うことができる。かかる細胞及び手法を用いることにより、ある標的物質をGluRに作用させるときの測定前、測定中および測定後、リアルタイムでGluRの発現量を確認することができ、例えば、細胞外電位測定あるいは細胞外イオン濃度測定(ISFET)により、標的物質のGluR機能の評価データ(イオン流入強度)を、GFPによる発現量評価データにより補正することができる。その結果、初めて、標的物質のGluR機能の評価を、定量的に行い得る。
本発明においては、特定の機能を有する受容体とレポータータンパク質との融合タンパク質を発現し得る遺伝子を、培養容易な細胞に形質導入して、特定の機能を有する受容体とレポータータンパク質とからなる融合タンパク質を発現する受容体発現細胞が得られる。本発明においては、かかる融合タンパク質は、細胞表層に提示されるので、発現されたレポータータンパク質の活性を測定することによって、受容体の特定の機能を定量的に評価することができるのである。特定の機能を有する受容体とは、分子機能評価及びバイオアッセイの目標となる受容体や、チャネルまたはチャネル型受容体、シナプス機能(リガンド開閉型チャネル機能又はチャネルゲートレセプター機能)を有する受容体等がある。本発明において好ましいのは、細胞膜貫通型タンパク質で、チャンネル型受容体の一つであるグルタミン酸レセプター(GluR)を始めとする神経トランスミッターレセプターである。
リポータータンパク質としては、公知のものを採用することができるが、好ましいのは、緑、黄、赤、青、紫等の蛍光を発するタンパク質である。典型的なものは、緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein,GFP)である。例えば、GFP遺伝子と、特定の機能を有する受容体の遺伝子の融合遺伝子を作成し、これを宿主の細胞内へ形質導入すると細胞内でGFPがくっついた融合タンパク質が作られ、そのGPFが発現し緑色の蛍光を発する。従って、この蛍光を定量的に測定・評価することによって、細胞内での受容体の発現量、提示量等を知ることができる。この融合タンパク質は、リーダー領域が挿入されているので、細胞の表層に提示される。
本発明において用いられる培養容易な細胞としては、アッセイ上で取扱い易い、培養容易な細胞で、以後の目的ためにモデル細胞として利用可能なものであれば特に制限はない。好ましいのは、昆虫細胞、哺乳類細胞(COS細胞等)、微生物細胞(酵母細胞)である。神経細胞は、一般的に培養や分化が難しいので好ましくない。なお、本発明において融合遺伝子の作成、細胞への形質導入、発現等は何ら特別な方法・手段を採用する必要は無く、通常の遺伝子工学上の手法で実施することができる。
次に、本発明においては、前記の如くして得られた受容体発現細胞は、標的物質がこの受容体に与える影響、例えば、機能の発現、高進又は抑制を測定・評価するために、細胞バイオセンサとして用いられる。特に、本発明においては、かかる受容体細胞を、レポータータンパク質の活性で分類・分別あるいは調整することによって、特定の機能を一定の基準で有するモデル細胞とすることができる。
本発明における標的物質の機能の評価方法の一つ目は、本発明の受容体発現細胞に、標的物質を作用させ、前記受容体発現細胞が接触する電極の電位変化を測定(細胞外電位測定方法)することによって、前記標的物質と前記受容体との相互作用を測定することを特徴とする方法である。細胞外電位測定方法としては、公知の方法・手段、あるいは装置を使用することができる(例えば、前記非特許文献4参照)。
受容体発現細胞としては、発現される特定の機能の活性が標準化されたモデル細胞を用いるのが好ましい。モデル細胞は、レポータータンパク質の活性で分類・分別して一定の基準値のものを集めるか、あるいは複数のフラクションのものを混合調整することによって得られる。かかる特定の機能を一定の基準で有するモデル細胞を用いて、測定の前、測定中、及び測定後を通じてレポータータンパク質の活性をモニターし、その結果を経時的ベースラインとして、受容体の機能の測定結果を示すことにより、得られた結果の定量性を飛躍的に高めることができる。
本発明において標的物質は、特に限定されるものではないが、例えば、医薬品の対象となりうるような化学物質である。受容体のアゴニスト又はアンタゴニストが適当である。
本発明における標的物質の機能の評価方法の二つ目は、特定の機能を有する受容体とレポータータンパク質との融合タンパク質を発現し得る遺伝子を、培養容易な細胞に形質導入して得られる受容体発現細胞に、標的物質を作用させ、前記受容体発現細胞周辺のイオン濃度の変化を測定(細胞外局所イオン濃度測定方法)することによって、前記標的物質と前記受容体との相互作用を測定する方法である。細胞外局所イオン濃度は、例えば、イオン選択性電界効果型トランジスタ(Ion Sensitive Field Effect Transistor、ISFET)を用いた測定系で、イオン種特異的にその局所濃度を連続的に測定することができる。また、受容体発現細胞としては、発現される特定の機能の活性が標準化されたモデル細胞を用いるのが好ましい。
上記いずれの方法においても、受容体が、シナプス機能(リガンド開閉チャネル型)を有する受容体であるのがこのましい。また、レポータータンパク質としては、GFPが特に好ましい。
本発明の実施の一つの態様を、クローニングした神経トランスミッターレセプターを、培養容易な細胞の一つである昆虫細胞に形質導入し、シナプスモデル細胞を構築し、それを用いて細胞バイオセンシングにより中枢医薬品のスクリーニングを行う例で説明する。
クローニングされた神経トランスミッターレセプター(グルタミン酸レセプター)遺伝子とGFR遺伝子の融合遺伝子を、公知の方法で昆虫細胞であるSf-9に形質導入して受容体発現細胞を構築する(本発明の中の請求項1の発明)。構築された受容体発現細胞では、グルタミン酸レセプターがチャネルゲートレセプター機能を保持して、しかも多発現系により大量に細胞表層に提示されていることが確認される。グルタミン酸レセプターはチャネルゲートレセプター(リガンド結合によりチャネルが開き、イオン流入を行う)である。このレセプターの機能を発現又は抑制させることの出来るアゴニストやアンタゴニストが医薬品の候補となる。
ところで、受容体発現細胞によって特定の分子機能を定常的に発現させることは可能であっても、その機能の発現量を一定にすることは分子生物学的に非常に困難である。そこで本発明では、受容体発現細胞で発現されている融合タンパク質(受容体とレポータータンパク質であるGFRとの融合タンパク質)のGFRの蛍光を定量的に測定(本発明の中の請求項4の発明)することによって、受容体機能が一定範囲のものを分別あるいは混合・調整して、シナプスモデル細胞を得る。
チャネルゲートレセプターは、その機能として、アゴニストの結合により、チャネルゲートが開き、特定イオンの細胞内への流入を行う。そこで、シナプスモデル細胞と同程度の大きさの電極に、チャネルゲートレセプター機能を有する細胞を密着させ、細胞内へのイオン流入に伴う参照電極との間の電位変化を測定する(細胞外電位測定方法)(本発明の中の請求項7の発明)。その状態を図1に示した。図1に示す様に、グルタミン酸レセプターを発現・表層提示したシナプスモデル細胞を電極(作用極)に密着させる。この電極と、同じ溶液中で細胞が接触していない参照極との間の電位差を測定する。そして、この系に、標的物質である、例えば、神経トランスミッター(グルタミン酸)(アゴニスト)を添加すると、電位変化が現れる。その程度を測定・評価することによって、その標的物質の持つチャネルゲート機能を知ることができる。
あるいは、上記系にアンタゴニストを共存させると、更に電位差の変化が現れる(電位差変化が減少する)。これは、チャネルゲートレセプターへのアゴニスト(グルタミン酸)の作用が、アンタゴニストの作用により競争的に阻害されることを示している
(これも本発明の中の請求項7の発明である)。電位差の測定のための装置は、例えば、アレイ型微小電極と電位記録装置コネクタを用いることができる。
(これも本発明の中の請求項7の発明である)。電位差の測定のための装置は、例えば、アレイ型微小電極と電位記録装置コネクタを用いることができる。
本発明における標的物質の機能の評価方法の二つ目の方法である細胞外局所イオン濃度測定方法においては、標的物質と受容体との相互作用を、例えば、イオン選択性電界効果型トランジスタ(ISFET)を用いた測定系で、イオン種特異的にその局所濃度を連続的に測定し、界面電位差を検出・解析する。
以下、実施例により、本発明を更に具体的に説明する。本発明は下記実施例に限定されるものではない。シナプスの情報伝達に介するイオンチャネル型レセプターの一種であるグルタミン酸レセプター(GluR)は、グルタミン酸添加によりナトリウムイオンチャネルを開口させ、細胞内へのナトリウムイオンを流入させる。このナトリウムイオンの細胞への流入量は、GluR発現量及びその機能活性に依存する。GluRを多発現した昆虫細胞Sf-9細胞をシナプスモデル細胞とし、GluRはGFPと共発現させることで、その発現量を定量化することが可能になる。そして、発現量を均一化した細胞を用いることで、初めてその機能活性を測ることが可能となる。そこで、GluR提示量を標準化した細胞を用いたレセプター機能評価を、細胞外電位測定法(OCP)で測定した例を実施例1、ISFETで測定した例を、実施例2として示した。
[実施例1]
[発現細胞]
シナプスモデル細胞には、GluR-GFP 多発現Sf-9細胞を用いた。Sf-9細胞(Invitrogen社製)は、グレース昆虫細胞培地(Grace’s
Insect Cell Culture Medium)(Invitrogen社製)に、10%FBSと50U/mlペニシリン、50U/mlストレプトマイシンを含む培地を用いて、27℃で培養し、数日ごとに培地を交換した。細胞の継代は、セルスクレーパーで細胞を剥離させた後、800rpmで5分間遠心し、培地を吸引した後、細胞数5×105個になるように新しい培地を加え、懸濁し、75mlのカルチャーボトルで培養した。
[発現細胞]
シナプスモデル細胞には、GluR-GFP 多発現Sf-9細胞を用いた。Sf-9細胞(Invitrogen社製)は、グレース昆虫細胞培地(Grace’s
Insect Cell Culture Medium)(Invitrogen社製)に、10%FBSと50U/mlペニシリン、50U/mlストレプトマイシンを含む培地を用いて、27℃で培養し、数日ごとに培地を交換した。細胞の継代は、セルスクレーパーで細胞を剥離させた後、800rpmで5分間遠心し、培地を吸引した後、細胞数5×105個になるように新しい培地を加え、懸濁し、75mlのカルチャーボトルで培養した。
細胞の保存は、10%DMSOを含む培地で1×106cells/mlの細胞懸濁液を作成し、−80℃のディープフリーザで凍結保存した。凍結の際には、バイセル(BICELL)を用いて温度を徐々に−80℃まで低下させた。解凍の際には、37℃の恒温槽で急速解凍し、培地で洗浄することでDMSOの除去を行った。
[GluR-GFP発現ウイルスベクターの構築]
GFP遺伝子とGluR遺伝子のフュージョンは、pIRES2-EGFPベクター(Clontech社製)にGluR遺伝子を導入することで行った。GluR-GFP遺伝子のSf-9細胞への導入は、Bac
to Bacシステム(Invitrogen社製)を用いた。pIRES2-EGFPベクターにGFP遺伝子を導入したベクターから、GluR-GFP遺伝子を制限酵素で切り出して、pFastBacベクターに導入した。得られたpFastBacベクターを、DH10Bac
コンピテント細胞(competent cell)に形質導入した。先ず、100μlのDH10Bac コンピテント細胞を、エッペンチューブに移し、5μlのpFastBacを加え、氷上で30分放置した。その後、42℃で45秒間ヒートショックを行い、900μlのS.O.C培地(Invitrogen社製)を加えた。これを15mlチューブに移し、225rpm、37℃で4時間培養した。
GFP遺伝子とGluR遺伝子のフュージョンは、pIRES2-EGFPベクター(Clontech社製)にGluR遺伝子を導入することで行った。GluR-GFP遺伝子のSf-9細胞への導入は、Bac
to Bacシステム(Invitrogen社製)を用いた。pIRES2-EGFPベクターにGFP遺伝子を導入したベクターから、GluR-GFP遺伝子を制限酵素で切り出して、pFastBacベクターに導入した。得られたpFastBacベクターを、DH10Bac
コンピテント細胞(competent cell)に形質導入した。先ず、100μlのDH10Bac コンピテント細胞を、エッペンチューブに移し、5μlのpFastBacを加え、氷上で30分放置した。その後、42℃で45秒間ヒートショックを行い、900μlのS.O.C培地(Invitrogen社製)を加えた。これを15mlチューブに移し、225rpm、37℃で4時間培養した。
その後、50μg/mlのカナマイシン、7μg/mlのゲンタマイシン、10μg/mlのテトラサイクリン、100μg/mlのX-gal、40μg/mlのIPTGを含むLBプレートに播種し、37℃で48時間培養し、トランスポジションされたE.coliのコロニーを得た。ブルーホワイトアッセイによってホワイトコロニーを選び、50μg/mlのカナマイシン、7μg/mlのゲンタマイシン、10μg/mlのテトラサイクリンを含む1mlのLB培地にて、48時間培養し、GluR-GFP遺伝子を有するバクミドDNAを、Quantum
Prep Plasmid Prep Kit (BioRad社製)を用いて抽出・精製した。得られたDNAを、GluR-GFP遺伝子含有バクミドDNAとした。
Prep Plasmid Prep Kit (BioRad社製)を用いて抽出・精製した。得られたDNAを、GluR-GFP遺伝子含有バクミドDNAとした。
GluR-GFP含有バクミドDNAのSf-9細胞への導入には、リポフェクション法を用いた。1μgのバクミドDNAを、100μlのグレース昆虫細胞培地に加えた。同様に、6μlのCellfectin
Regentを、100μlのグレース昆虫細胞培地に加えた。両者を緩やかに混合し、45分間、室温にて放置した後、0.8mlのグレース昆虫細胞培地を加え、Sf-9細胞にローディングし、27℃で5時間培養した。その後、Sf-9細胞をグレース昆虫細胞培地で2回洗浄し、27℃で72時間培養した。72時間後、細胞からDNAを抽出し、PCRによってGluR-GFPの発現確認を行った。また、ウェスタンブロッティングにてGluR-GFPの発現も確認した。回収した培地をウイルスベクター溶液として4℃で遮光保存した。ウイルス感染は4mlのグレース昆虫細胞培地と、1mlのウイルス溶液を混合し、培養中のSf-9細胞の培地と交換することで行った。かくして目的とする受容体の遺伝子を、昆虫細胞内に形質導入した。
Regentを、100μlのグレース昆虫細胞培地に加えた。両者を緩やかに混合し、45分間、室温にて放置した後、0.8mlのグレース昆虫細胞培地を加え、Sf-9細胞にローディングし、27℃で5時間培養した。その後、Sf-9細胞をグレース昆虫細胞培地で2回洗浄し、27℃で72時間培養した。72時間後、細胞からDNAを抽出し、PCRによってGluR-GFPの発現確認を行った。また、ウェスタンブロッティングにてGluR-GFPの発現も確認した。回収した培地をウイルスベクター溶液として4℃で遮光保存した。ウイルス感染は4mlのグレース昆虫細胞培地と、1mlのウイルス溶液を混合し、培養中のSf-9細胞の培地と交換することで行った。かくして目的とする受容体の遺伝子を、昆虫細胞内に形質導入した。
[発現量、提示量の確認(蛍光)]
Sf-9細胞にGluR-GFPウイルスベクターをインフェクションして3日間培養したものを、シナプスモデル細胞(Sf-9;GluR-GFP)として測定に使用した。培地をすべて除去した後、PBSに懸濁し、蛍光顕微鏡(Nikon社製)により、各細胞のGFP発現を確認した。また、ウエスタンブロットより求めたGluR発現量と、GFP蛍光強度が比例していることが明らかになった。これより、GFP蛍光を指標にして、レセプター数の標準化が行えることがわかった。そこで、蛍光強度が同じものをマニュピレーターにて選定し、5×105cells/mlになるようにPBSに懸濁することで、細胞当たりのGluR提示量を標準化した。また、蛍光強度の異なる細胞を用いる場合は、蛍光強度の値比率から、相互の結果を補正することが可能であった。
Sf-9細胞にGluR-GFPウイルスベクターをインフェクションして3日間培養したものを、シナプスモデル細胞(Sf-9;GluR-GFP)として測定に使用した。培地をすべて除去した後、PBSに懸濁し、蛍光顕微鏡(Nikon社製)により、各細胞のGFP発現を確認した。また、ウエスタンブロットより求めたGluR発現量と、GFP蛍光強度が比例していることが明らかになった。これより、GFP蛍光を指標にして、レセプター数の標準化が行えることがわかった。そこで、蛍光強度が同じものをマニュピレーターにて選定し、5×105cells/mlになるようにPBSに懸濁することで、細胞当たりのGluR提示量を標準化した。また、蛍光強度の異なる細胞を用いる場合は、蛍光強度の値比率から、相互の結果を補正することが可能であった。
[OCP確認]
基板の中央部に、64個の微小白金黒電極(50μm×50μm)が8×8のアレイ上に配置され、その外側に、基準電極が配置されているアレイ型基板電極を用いて、細胞外電位の変化を測定した。この基準電極における電位を基準にして、64個の微小電極との間で、細胞周辺における電位変化の測定を行った。基板上の微小電極は、電極表面に白金黒メッキが施され、電極表面を有効倍率200倍にインピーダンスを下げることにより、安定した信号記録を実施できるものである。
基板の中央部に、64個の微小白金黒電極(50μm×50μm)が8×8のアレイ上に配置され、その外側に、基準電極が配置されているアレイ型基板電極を用いて、細胞外電位の変化を測定した。この基準電極における電位を基準にして、64個の微小電極との間で、細胞周辺における電位変化の測定を行った。基板上の微小電極は、電極表面に白金黒メッキが施され、電極表面を有効倍率200倍にインピーダンスを下げることにより、安定した信号記録を実施できるものである。
基板上の微小電極からの信号測定は、チャネルジャンクション機と、シグナル増幅とノイズカット機器、PC(パソコン)上のソフトを用いて行った。このアレイ型微小電極上に、GFP発現量でレセプター数を標準化した細胞懸濁液を添加して、数分間静置した。その後、カバーガラスかけることによって、細胞と電極の密着を図った。細胞の様子は顕微鏡で観察し、細胞が接している電極を作用極、細胞が接していない電極を参照極として選択して、グルタミン酸の添加に伴う細胞外電位の変化を測定した。測定データは、PC上のソフトにおいて「電位vs時間」の波形グラフとして表示される。
測定を開始して、基準電位が安定していることを確認し、グルタミン酸を添加して細胞外電位の変化を測定し、結果を図2に示した。Sf-9細胞においては、グルタミン酸によって刺激しても、細胞外電位の変化は一切起こらなかった(図2のA)。一方、シナプスモデル細胞では、2mMのグルタミン酸の刺激によって、図2のBに示した様な細胞外電位の変化が観察された。
リガンドであるグルタミン酸に特異的な反応であることを確かめるために、アミノ酸の基本的な構造を持つグリシン、グルタミン酸と近似の構造骨格を持つグルタミン、グルタミン酸と同じ酸性アミノ酸であるアスパラギン酸の3種のアミノ酸を用いて、シナプスモデル細胞を刺激し、細胞外電位の変化を測定した。結果は図3に示した通りであった。即ち、2mMのアスパラギン酸(図3のC)、2mMグルタミン(図3のD)、2mMグリシン(図3のE)を滴下した場合には、細胞外電位に変化は見られなかった。これらのことから、細胞外電位の変化を指標として、GluRの機能をモニタリングできることが示唆された。
[実施例2]
シナプスモデル細胞の構築、発現の確認、及び、レセプター数の標準化は実施例1と同様に行った。
シナプスモデル細胞の構築、発現の確認、及び、レセプター数の標準化は実施例1と同様に行った。
[ISFET(
Ion Sensitive Field Effect Transistor)を用いた細胞外局所ナトリウムイオン測定法]
実施例1の細胞外電位測定法は、細胞が接触する界面のイオン濃度が、細胞表層のレセプター機能によるイオンの細胞内への流入によって変化し、これが電極界面の電位変化をもたらすことに着目した測定法である。この方法は、測定原理的にはイオン種の選択性が無いため、溶液条件に大きく依存する。一方、以下に示すISFETに基づく測定系を用いた場合、イオン種特異的にその局所濃度を連続的に測定することが可能である。グルタミンレセプター(リガンド開閉型イオンチャンネル)の場合は、Naイオンのみを流入させるため、その場合はNa選択性のISFETを用い、これを細胞に密着した状態で測定を行う。これにより溶液条件による影響を極小にし、再現性および定量性の高い結果を得ることが出来る。
Ion Sensitive Field Effect Transistor)を用いた細胞外局所ナトリウムイオン測定法]
実施例1の細胞外電位測定法は、細胞が接触する界面のイオン濃度が、細胞表層のレセプター機能によるイオンの細胞内への流入によって変化し、これが電極界面の電位変化をもたらすことに着目した測定法である。この方法は、測定原理的にはイオン種の選択性が無いため、溶液条件に大きく依存する。一方、以下に示すISFETに基づく測定系を用いた場合、イオン種特異的にその局所濃度を連続的に測定することが可能である。グルタミンレセプター(リガンド開閉型イオンチャンネル)の場合は、Naイオンのみを流入させるため、その場合はNa選択性のISFETを用い、これを細胞に密着した状態で測定を行う。これにより溶液条件による影響を極小にし、再現性および定量性の高い結果を得ることが出来る。
ISFETのゲート上のナトリウムイオン感応膜に、溶液が接すると、溶液中のナトリウムイオン活量に応じて界面電位(E)
が発生する。そこで、ナトリウムイオン感応物質Na+-イオノフォア(Bis(12-crown-4),(Dojindo))を、ニードル型ISFET(BAS)のゲート部に塗布することにより、細胞外ナトリウムイオンセンサーとして利用した。ISFET電極基板上からの信号測定は、電気化学検出器;HZ3000(北斗電工社製)、及び、PC上のソフトを用いて行った。
が発生する。そこで、ナトリウムイオン感応物質Na+-イオノフォア(Bis(12-crown-4),(Dojindo))を、ニードル型ISFET(BAS)のゲート部に塗布することにより、細胞外ナトリウムイオンセンサーとして利用した。ISFET電極基板上からの信号測定は、電気化学検出器;HZ3000(北斗電工社製)、及び、PC上のソフトを用いて行った。
先ず、GFP発現量によりレセプター数を標準化した細胞懸濁液から、マニュピレーターを用いて、Sf-9細胞をゲート部に塗布し、ナトリウムイオン感応膜化した電極上に添加し、数分間静置した。細胞の様子は顕微鏡で観察し、細胞が接していることを確認した後、グルタミン酸の添加に伴う、細胞内へのナトリウムイオン流入による細胞外電位の変化を測定した。測定データは、PC上のソフトにおいて「電位vs時間」の波形グラフとして表示される。
測定を開始して基準電位が安定していることを確認し、グルタミン酸を添加して細胞外電位の変化を測定した。Sf-9細胞においては、グルタミン酸によって刺激しても、細胞外電位の変化は見られなかった。一方、シナプスモデル細胞では、2mMのグルタミン酸刺激において、ナトリウムイオン流入による細胞外電位の変化が観察された。
また、GluR機能に影響を及ぼす薬剤として、アゴニストであるカイニン酸、アンタゴニストであるCNQXを用い、レセプター機能の評価をISFETで計測した。グルタミン酸添加の場合と同様に、カイニン酸の添加においても細胞外電位変化が観察された。一方CNQXに関しては、CNQX単体を添加した場合、細胞外電位変化は観察されず、また、CNQXで処理した細胞を用いて、グルタミン酸添加による細胞外電位応答を計測したところ、その電位変化は減少した。これより、カイニン酸はグルタミン酸と同様に、GluRのイオンチャネルを開口させる機能を有し、また、CNQXは、GluRに結合しリガンドやアゴニストの効果を阻害する、アンタゴニスト機能を有することが確認できた。
次に、神経系に影響を与えることが知られている薬剤で、その作用点がまだ不明であるドウモイ酸、バルビツール酸に関して、レセプター数を標準化した細胞を用い、ISFET用いた電位変化測定により、これらの薬剤の作用を検討した。その結果、ドウモイ酸は、グルタミン酸と同様な作用、即ち、アゴニストとして、一方バルビツール酸は、CNQXと同様な作用、即ち、アンタゴニストとして作用していることが分かった。
中枢系医薬の創薬現場では、適切・簡便なスクリーニング法(バイオアッセイ法)が無く、high-through-put化ができていない。本発明は、競争が激化する中枢系医薬開発における全く新しい一次スクリーニングツールとなることが見込まれ、本発明に基づく技術は潜在的に高い需要を持っていると考えられる。
Claims (16)
- 特定の機能を有する受容体とレポータータンパク質との融合タンパク質を発現し得る遺伝子を、培養容易な細胞に形質導入して得られる受容体発現細胞。
- 受容体が、シナプス機能を有する受容体である請求項1記載の受容体発現細胞。
- レポータータンパク質が、GFPである請求項1又は2記載の受容体発現細胞。
- 特定の機能を有する受容体とレポータータンパク質とからなる融合タンパク質を、培養容易な細胞で発現させ、前記レポータータンパク質の活性を測定することによって、前記受容体の特定の機能を定量的に評価することを特徴とする受容体の機能の評価方法。
- 受容体が、シナプス機能を有する受容体である請求項4記載の受容体の機能の評価方法。
- レポータータンパク質が、GFPである請求項4又は5記載の受容体の機能の評価方法。
- 特定の機能を有する受容体とレポータータンパク質との融合タンパク質を発現し得る遺伝子を、培養容易な細胞に形質導入して得られる受容体発現細胞に、標的物質を作用させ、前記受容体発現細胞が接触する電極の電位変化を測定することによって、前記標的物質と前記受容体との相互作用を測定することを特徴とする標的物質の機能の評価方法。
- 受容体が、シナプス機能を有する受容体である請求項7記載の受容体の機能の評価方法。
- レポータータンパク質が、GFPである請求項7又は8記載の受容体の機能の評価方法。
- 受容体発現細胞として、発現される受容体の特定の機能の活性が標準化されたものを用いる請求項7〜9記載の受容体の機能の評価方法。
- 標的物質が、受容体のアゴニスト又はアンタゴニストである請求項7〜10記載の受容体の機能の評価方法。
- 特定の機能を有する受容体とレポータータンパク質との融合タンパク質を発現し得る遺伝子を、培養容易な細胞に形質導入して得られる受容体発現細胞に、標的物質を作用させ、前記受容体発現細胞の周辺のイオン濃度の変化を測定することによって、前記標的物質と前記受容体との相互作用を測定することを特徴とする標的物質の機能の評価方法。
- 受容体が、シナプス機能を有する受容体である請求項12記載の受容体の機能の評価方法。
- レポータータンパク質が、GFPである請求項12又は13記載の受容体の機能の評価方法。
- 受容体発現細胞として、発現される受容体の特定の機能の活性が標準化されたものを用いる請求項12〜14記載の受容体の機能の評価方法。
- 標的物質が、受容体のアゴニスト又はアンタゴニストである請求項12〜15記載の受容体の機能の評価方法。
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JP2005087695A JP2006262813A (ja) | 2005-03-25 | 2005-03-25 | 受容体発現細胞とそれを用いた標的物質の機能の評価方法 |
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JP2010094048A (ja) * | 2008-10-14 | 2010-04-30 | Toyama Univ | 検体の毒物検出方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004044003A2 (en) * | 2002-11-11 | 2004-05-27 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Use of edg2 receptor in an animal model of heart failure |
JP2004180668A (ja) * | 2002-02-22 | 2004-07-02 | Takeda Chem Ind Ltd | リガンドの決定方法 |
-
2005
- 2005-03-25 JP JP2005087695A patent/JP2006262813A/ja active Pending
Patent Citations (2)
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