JP2003532871A - ターゲットプーリングを使用するスクリーニングアッセイ及びシステム - Google Patents

ターゲットプーリングを使用するスクリーニングアッセイ及びシステム

Info

Publication number
JP2003532871A
JP2003532871A JP2001577505A JP2001577505A JP2003532871A JP 2003532871 A JP2003532871 A JP 2003532871A JP 2001577505 A JP2001577505 A JP 2001577505A JP 2001577505 A JP2001577505 A JP 2001577505A JP 2003532871 A JP2003532871 A JP 2003532871A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
target
systems
cell suspension
mixture
different
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001577505A
Other languages
English (en)
Inventor
ジャヴィア・エー．・ファリナス
エイチ．・ガレット・ワダ
Original Assignee
カリパー・テクノロジーズ・コープ．
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by カリパー・テクノロジーズ・コープ． filed Critical カリパー・テクノロジーズ・コープ．
Publication of JP2003532871A publication Critical patent/JP2003532871A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
    • B01J2219/00704—Processes involving means for analysing and characterising the products integrated with the reactor apparatus
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)

Abstract

(57)【要約】 複数のターゲットシステムをプーリングすることにより、スクリーニングアッセイの処理量を増加させる方法、装置及びシステムであり、異なる材料のライブラリ、例えば試験化合物がプールされたターゲットに対してスクリーンされることを許容し、任意の材料が１種又はそれ以上のターゲットシステムに影響するか否かを測定する該方法、装置及びシステム。好ましい態様において、個々のターゲットシステムの機能が、特にターゲットプール内のターゲットシステム対して物理、化学及び／又は光学特性の差異により特定される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願の相互参照 本出願は仮特許出願第６０／１９７，３２１号、２０００年４月１４日出願に
対して優先権を主張し、全ての目的において完全に本明細書中に援用される。
【０００２】 本発明の背景 医薬の発見及び改良は長くかつ非常に費用のかかるプロセスであり、治療が調
査されるために特定の病気及び条件の選択、病気になった条件をエミュレート（
ｅｍｕｌａｔｅ）するモデルシステムの発生、潜在的な医薬化合物の多大なライ
ブラリの発生、これらの候補の化合物、材料又はそのモデルシステムに対抗する
治療の試験、候補の化合物が生体内でこれらの条件の治療により効果を約束する
か否かの測定を含む。 この全体のプロセスの高いコストのために、コスト及びプロセスにおける種々
の段階の長さを減少させることを意図して、多くの資源が新規の及び／又は改良
された技術の発達に捧げられた。例えば、合理的な医薬品のデザイン手段が、成
功した医薬の構造について仮説を設けるために利用される。それから仮の医薬が
合成され、医薬的な有用性について試験される。これは多数の異なる及び無関係
なような化合物の試験に必要とされる時間の量を減少させために、理論付けられ
る。代わりのアプローチにおいて、医薬的用途用に試験されるための非常に多種
の分子の集合を発生させる努力において、組み合わせの化学的手段が改良された
。この方法のねらいは、例えば、数種の最低限の構造的な関連を維持しながら又
は維持せずに、可能な限り多くの異なる化合物を生じ、そして潜在的な医薬的な
有用性についてそれら全てをスクリーンすることである。この後者のアプローチ
は、医薬的な調査において、最近、最も奨励される。
【０００３】 病気のプロセスに影響を与えるシステムの発見のために、実質的な資源も捧げ
られてきた。ヒトゲノムをシークエンスする努力は、潜在的に適切なターゲット
システム、例えば特定の病気又は状態に対し適切なシステムの数に実質的に寄与
する。潜在的なターゲット及びそのように大きな速度で増加する潜在的な医薬化
合物の数とともに、高処理量医薬的スクリーニングシステムの多大な必要性が存
在する。多数の異なるグループが、それらの高処理量アッセイを行うための異な
る手段及びシステムを提案した。慣用の方法は多数のマルチウェルアッセイプレ
ート及びロボットの複雑なシステムを使用し、試薬添加及びアッセイ読み取りを
扱う。
【０００４】 技術的により進歩した方法及びシステムも提案された。例えば、米国特許第５
，９４２，４４３号は、高処理量医薬的スクリーニングに対するミクロ流体アプ
ローチを記載し、そこでは１種又はそれ以上のターゲットシステムの成分がミク
ロ流体装置を通って流れ、異なる候補化合物がチャネル内に導入される。モデル
システムの候補の効果は、チャネル内で検出される。これらのアッセイをミクロ
スケールで行うことにより、使用される試薬の量、特定の個々のアッセイが行わ
れる場所の速さ、行うことができるパラレルアッセイの数に関しての利点が得ら
れる。 これらの発達にもかかわらず、増加する数の医薬ターゲットにおける効果につ
いて、増加する数の潜在的な医薬化合物をスクリーンできる速度を拡張する要求
がすでに存在する。本発明はこれら及び種々の他の必要性に見合うものである。
【０００５】 本発明の要約 本発明は、通常、複数のターゲットシステムをプーリングすることにより、ス
クリーニングアッセイの処理量を増加させるための方法、装置及びシステムを意
図する。該方法は異なる材料、例えば試験化合物のライブラリを提供し、プール
されたターゲットに対してスクリーンされ、任意の材料が１種又はそれ以上のタ
ーゲットシステムに影響するかどうかを測定する。好ましい態様において、個々
のターゲットシステムの機能は、物理、化学及び／又は光学特性の差により特徴
付けられる。 本発明は、スクリーニングアッセイを行う方法を提供する。本方法は、第一反
応容器中で第一ターゲット混合物を提供することを含む。第一ターゲット混合物
は、少なくとも第一及び第二の異なるターゲットシステムを含む。少なくとも１
種の試験試薬がターゲット混合物中に導入され、そして第一及び第二ターゲット
システム上の試験試薬の効果が測定される。
【０００６】 本発明のさらなる態様は、高処理量スクリーニングアッセイを行うためのシス
テムである。本システムは、第一ターゲット混合物を含む反応容器を含む。第一
ターゲット混合物は、少なくとも第一及び第二ターゲットシステムを含み、第一
ターゲット混合物は第一ターゲットシステムと異なる。ターゲット試薬サンプラ
ーもターゲット試薬をサンプリングし、そして反応容器中に試験試薬を導入する
ために含まれる。本システムは、第一混合物と感知可能に連絡して配置される検
出器をも含む。検出器は第一及び第二ターゲットシステムにおける試験試薬の効
果を検出するために配列される。
【０００７】 発明の詳細な説明 Ｉ．導入 本発明は、通常、スクリーニングアッセイ操作に使用するための方法、装置、
キット及びシステムを提供する。本明細書中で使用されるように、「スクリーニ
ング」という語は、比較的多数の異なる試薬の試験を意味し、ここではターゲッ
ト試薬における潜在的な効果について、ターゲットシステムに対して「ターゲッ
ト試薬」と呼ばれる。比較的多数の試薬は、通常約５０以上、典型的には約１０
０以上、好ましくは約１０００以上、又は１００００００又はそれ以上の異なる
試験試薬又は材料を含む。典型的には、これらのスクリーニングアッセイ操作は
、ターゲットシステムにおける効果について、潜在的な医薬候補又は試験化合物
をスクリーニングすることにおいて使用される。これは通常、本明細書中で記載
される方法及びシステムの議論の焦点であるが、他のスクリーニングアッセイ、
例えば毒物学スクリーニングアッセイ、機能的ゲノムアッセイ等が本発明の方法
及びシステムと結合させて、同様に使用される。本発明の方法及びシステムは、
１種より多いターゲットシステムを含む単一の混合物を提供することを含む「タ
ーゲットプーリング」を利用する。処理量を増すために潜在的な医薬化合物をプ
ールする方法とは違い、ターゲットプーリング方法はプールされたターゲット間
の潜在的なクロスオーバー効果を被らない。特に、候補の化合物をプールするこ
とにおいて、２種又はそれ以上のプールされた化合物は、１つの化合物が自身に
より有する効果を変化させ得るという危険を犯す。混合物中で組み合わされる場
合、これは共同的な効果であることができ、又は効果の減退又は消滅であること
ができ、それにより潜在的に有用な化合物をバイパスすることを発生させる。
【０００８】 通常は、プールされたターゲットは反応容器内に静置され、そしてプールされ
たターゲット混合物は多数のもの、又は本明細書中で「試験試薬」又は「試験化
合物とも呼ばれる」異なる化合物の「ライブラリ」に対して別々にスクリーンさ
れる。これらの試験試薬又は化合物は、種々の異なる材料又は材料の混合物の任
意のものであることができる。例えば、医薬的スクリーニング操作において、試
験化合物は、通常小さい分子、医薬のような化合物、細胞表面にて存在し又は表
されるペプチド又はタンパク質、ファージ表示ライブラリ等を含む。しかし、こ
れらの及び他のスクリーニング適用において、試験化合物は高分子集合物又は複
合物、植物、菌、動物、バクテリアの抽出物、或いは他の材料を含むことができ
る。スクリーニング操作のために、試験化合物は溶液中に存在することができ、
それらは粒子、例えばビード又はセルと連結することができる。 医薬的なスクリーニング操作において、全体のライブラリ又はそれらの実質的
な部分は、多数の異なるターゲットシステムに対し典型的にスクリーンされる。
たとえあるとしても、プールされたターゲットの任意の１つにおける特定の試験
化合物の効果が、それから検出される。プール内の異なるターゲットは、随意に
同じ方法及び特性により検出可能であり又は検出用の異なるベースを有する。単
一の検出機構、例えば単一の波長の蛍光がプールされた各ターゲットをモニタす
るのに使用される場合には、肯定的な結果は、直ちにターゲットプール内の単一
のターゲットシステムによるものとすることはできない。
【０００９】 従ってこのような場合、与えられたプール内の各ターゲットシステムに対して
見込みのある候補を個々にスクリーンすることが必要であり得る。特定のライブ
ラリにおける見込みのある候補の周波数が典型的に比較的小さくなるときに、典
型的にはそのことに関する特異性の欠如は疑いがない。代わりの好ましい態様に
おいては、異なる検出法が、与えられたプール内における各ターゲットシステム
のために行われ、それにより特定のターゲットシステムに対する見込みのある化
合物の効果を特徴付けることを許容する。 プールされるターゲットの使用は個々のターゲットスクリーンが起こる速度を
必ず増加させるものでなはいが、それはスクリーニング設備を許容することによ
りスクリーニング設備の全体の処理量を増加させ、単一のスクリーニングプロセ
スにおける異なるスクリーンを多重送信する。特にターゲットをプーリングする
ことにより、プールされたターゲットの数と等しいか実質的に等しい要素により
全体のスクリーニング設備又は操作の処理量を増加させることができる。本発明
について、ターゲットは液体混合物として例えば液体試薬の混合物として、例え
ばターゲットシステムの成分又は試薬が固体支持体、例えばビードに束縛される
場合は粒子組成物として、又は細胞がターゲットシステムを含有する場合は細胞
懸濁液としてプールされることができる。特に細胞懸濁液は２種又はそれ以上の
ターゲットを含有する細胞群、例えば細胞群又は複数の異なる細胞群の細胞によ
り表される、を含み、各群は単一のターゲットシステムのみを含む。
【００１０】 II．プールされるターゲット Ａ．ターゲットシステム ターゲットシステムは、典型的には、そのシステムの活性をモジュレートする
試薬が有用である任意の生物学的及び／又は生化学的システムの１種又はそれ以
上の成分を含むことができる。例えば、特定の病気又は状態の病理学において影
響を受けるものとして特徴づけられるシステムは、病理学におけるそのシステム
の状況に影響を与える試薬を特定するために、スクリーンされることができる。
通常は、そのようなターゲットシステムは、リード医薬化合物を特徴付けるため
にスクリーンされることができ、見捨てられた（ｏｒｐｈａｎ）レセプタシステ
ム等についてリガンドを特徴付ける努力がなされている。複数の特定の興味深い
生化学システムの数種の例は、レセプタ−リガンドシステム、信号伝達システム
、イオンチャネル又はポンプシステム、酵素−基体相互作用、特定の結合相互作
用、例えば核酸と他の核酸又はタンパク質との相互作用、タンパク質−タンパク
質相互作用、抗体−抗原システム等を含む。これらの関連する生化学システムか
ら、１種又はそれ以上の特定成分は、システム内の臨界的な又は重要な機能を供
給することとして特徴付けられる、ここで該機能は特定の病理又は条件の場合に
開始され又は変化されることができる。数種の場合において、特徴付けられた機
能を有さない生化学システムの成分は、薬理学的に適切なターゲットシステムの
特徴づけを容易化するために、ターゲットとして使用される。１種又はそれ以上
の成分はそれから「ターゲット」として特徴付けられ、それに対して化合物のラ
イブラリはスクリーンされ、これらの化合物がターゲット上で任意の上で効果、
例えばその機能、ターゲットシステムと他の成分とのその相互作用又はターゲッ
トの作用又は機能により発生するイベント、を有するか否かを測定する。
【００１１】 １．レセプタターゲットシステム 上記のように、ターゲットシステムの例の１つはレセプタ又はレセプタ−リガ
ンドシステムである。特に、レセプタとそのリガンドとの相互作用、その相互作
用における変化、及び／又は相互作用の後に続く下流のイベントは、得意に病理
学において重要なイベントである。そのように、スクリーニングアッセイは、ス
クリーニングターゲット（しばしば本明細書中では「ターゲットシステム」と呼
ばれる）として、モデルレセプタ−リガンドシステムをしばしば使用する。しば
しば使用されるレセプタターゲットシステムの数種の例は、Ｇ−タンパク質結合
レセプタ（「ＧＰＣＲ」）システムを含む。特に、これらのレセプタシステムは
、通常、心血管、神経、免疫、消化器及び他の薬理学を含む広範囲の異なる病理
において影響される。通常有用であるレセプタターゲットシステムの他のクラス
は、核ホルモンレセプタ、リガンド架橋イオンチャネル及びタンパク質キナーゼ
レセプタを含む。
【００１２】 通常は、レセプタターゲットシステムは、典型的には少なくとも２種の生化学
システム、すなわち選択されたレセプタ及びリガンド又はレセプタに対する作用
薬を含む。しかし数種の場合においては、与えられたレセプタに対し作用薬又は
リガンドについてスクリーンする。そのような場合において、レセプタターゲッ
トシステムは、適切なレポータ機構と同様に、単にシステムのレセプタ部分を含
むことができる。与えられたターゲットシステムにおけるレセプタは、水性又は
溶解性の調製物として存在できる。しかし、好ましい態様において、システムの
レセプタ成分は、生存能力のある全体細胞の懸濁液中の全体細胞の一部として、
例えば細胞表面レセプタ又は内部レセプタとして）含まれる。レセプタは使用さ
れるセルラインに対してネガティブであることができ、又はセルラインは所望の
レセプタを表すように実行されることができ、それにより細胞はレセプタのため
のキャリア及び／又はレポータシステムとして機能する。 レポータシステムは、典型的にはリガンド結合又は与えられた細胞に関連する
レセプタの活性を、検出可能なイベント、すなわち検出可能なタンパク質、例え
ばβ―ガラクトシダーゼ等又は他の物質の製造の細胞による最終的な表現と連結
させ、ある物理的特性等を変化させる。酵素システムとリンクするレセプタの処
理は、当業界における通常の技術の者により行われ、そして通常は、例えばＭｅ
ｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｕｋ
ａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ， Ｂｏｔｈｗｅｌｌ， Ｙａｍａｃｏｐｏｕｌｏ
ｓ ａｎｄ Ａｌｔ （Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ， Ｂｏｓｔｏ
ｎ ＭＡ）に記載される。
【００１３】 多くのレセプタターゲットシステムの場合、レセプタの自然の作用又は機能は
、ターゲットシステムをモニタすることに使用できる。例えばＧＰＣＲを利用す
るターゲットシステムにおいて、細胞のイオンフラックスの変化はレセプタのリ
ガンドに対する応答におけるレセプタ活性の変化をモニタすることに使用できる
。典型的には、イオンフラックスにおける変化は、異なるイオン種、例えばカル
シウム、ナトリウム、プロトン等について特定的である細胞内指示薬ダイを使用
して直ちにモニタされる。このようなダイは、典型的には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ, Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）より市販入手でき、そし
て蛍光励起におけるシフト又は結合カルシウムにおける発光最大値を生成するフ
ラ−２（Ｆｕｒａ−２）、フルオ−２（Ｆｌｕｏ−２）及びインド−１（Ｉｎｄ
ｏ−１）、並びに結合カルシウムにおける蛍光強度の増加を生成するフルオ−３
（Ｆｌｕｏ−３）及びカルシウムグリーン−２（Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ−
２）のようなＢＡＰＴＡ（１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，
Ｎ，Ｎ' ，Ｎ' −テトラ酢酸）の類似物を含む通常使用されるカルシウム指示薬
を含む。米国特許第５，５１６，９１１号も参照されたい。ナトリウム及びカリ
ウム感受性ダイは、それぞれＳＢＦＩ及びＰＢＦＩを含む（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓより市販入手もできる）。市販入手できる塩化物感受性指示薬の
例は、６−メトキシ−Ｎ−（スルホプロピル）キノリニウム（ＳＰＱ）、Ｎ−（
スルホプロピル）アクリジニウム（ＳＰＡ）、Ｎ−（６−メトキシキノリル）酢
酸及びＮ−（６−メトキシキノリル）アセトエチルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｐｒｏｂｅｓ, Ｉｎｃ．）を含み、それらの全てが通常塩化物イオンの存
在で消光する。蛍光のレベルにおける変化はそれから特徴付けることができ、レ
セプタ活性により生じるイオンフラックスにおいて変化する。
【００１４】 代わりの配列において、レセプタとリガンドとの間の相互作用は、２種の成分
の結合を示す方法を使用して、又は結合相手に対するレセプタの結合により、例
えばターゲットシステムより発光される復極された蛍光のレベルの変化を測定す
ることによりモニタされる。特にレセプタ、リガンド又は結合相手の１つが蛍光
ラベルを伴い提供される。このラベルされた成分は、複合化された形体でない場
合、例えばリガンドがそのレセプタにより結合していない場合に、偏光された光
源を使用して励起された場合には、比較的小さくラベルされた成分の回転する散
乱のために、特定のレベルの復極された蛍光を発光する。例えば、ラベルされた
リガンドのレセプタによる結合により生じるラベルされた成分のサイズの変化は
、ラベルされた群の回転拡散を減じ（今は錯体）、発光された復極した蛍光のレ
ベルにおける減少を生じる。この復極した蛍光のレベルは、２種間の相互作用の
レベルの定量測定を提供する。モニタリングプロセスは、試験化合物がターゲッ
トシステム内に導入されるように実行され、レセプタとリガンド間の相互作用に
おける化合物の任意の影響が測定される。代わりに、ラベルされた成分のサイズ
の変化は、蛍光相関分光学により測定できる。 上述のように、種々の異なる広範囲のレセプタシステムは、レセプタの機能又
はそのレセプタ機能における変化が測定できる場合は、提供された本発明の方法
におけるターゲットシステムのようにスクリーンされる。これらは、例の方法に
より、ＧＰＣＲｓ、チロシンキナーゼレセプタ、サイトカインレセプタ、付着要
素レセプタ、抗原レセプタ（例えば免疫グロブリンの表面）、Ｔ−細胞レセプタ
等を含む。
【００１５】 ２．酵素ターゲットシステム 医薬的な調査において、種々の酵素もターゲットシステムとして使用できる。
例えばキナーゼ及びホスファターゼ酵素は、例えばタンパク質及びメッセンジャ
ー化合物の下流のリン酸化又は脱リン酸化を通じて、重要な細胞の信号を送るカ
スケードそれらの活性のために特に興味深く、それらは多数の重要な病理学的な
イベントにおいて影響を受ける。プロテアーゼも医薬的な調査において、それら
の免疫システム回避、血液凝固、タンパク質回転（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）及び種々
の他の病理学的な関連イベントにおける役割について、普通にスクリーンされる
。他の酵素クラスは、例えばカルボハイドラーゼ（例えばアミラーゼ、グルカナ
ーゼ等）、ヌクレアーゼ等である。
【００１６】 酵素ターゲットシステムは、典型的には酵素ターゲットのためのサブストレー
トを含む。通常のサブストレートが使用できるけれども、典型的には、酵素が親
和力を有するようなモデルサブストレートを使用することが望ましい。より好適
なスチールは酵素の機能を検出及びモニタリングを、最終的には容易化するサブ
ストレートである。例えば蛍光原サブストレートの使用が、それらの使用の容易
化のためにもっとも好ましい。このようなサブストレートは、典型的に、特定の
蛍光プロファイル、例えば高い又は低い蛍光、蛍光発光又は特定波長における励
起を有する。しかし、興味深い酵素により作用される場合は、生成物は検出可能
に異なるプロファイル、例えば低い又は高い蛍光或いは励起又は蛍光スペクトル
のシフトを有する。ほとんどの場合、蛍光原サブストレートは非蛍光であり、又
は与えられた波長で比較的低い蛍光を有する、しかし興味深い酵素により作用さ
れた場合は、同じ波長で実質的により高い蛍光を有する生成物を生成する。通常
は、より重要な酵素のクラスについての蛍光原サブストレートは、例えばＢａｃ
ｈｅｍ 又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．より市販入手できる
。例えば、フルオレセインジホスフェート及びジＦＭＵＰが、市販入手できるホ
スファターゼサブストレートの例である。同様に、ＢＯＣ−フルオレセイン化ペ
プチド、例えばＢｏｃ−フルオレセインーＳＲＡＭＣ及びＺＧＳＲＡＭＣは、蛍
光原プロテアーゼサブストレートとして、一般的に有用である。
【００１７】 非蛍光原サブストレートも本発明の方法において有用である。特に、ある場合
には、与えられる酵素活性について直ちに有用でないかもしれない。例えば、蛍
光原サブストレートは、例えばリン酸化生成物がサブストレートよりも明確に異
なるフルオレセインのレベルを有する場合には、キナーゼ酵素については広く利
用することができない。しかし、その代わり、このような生成物は実質的に異な
るチャージのレベルを所有することを行う。チャージにおける差は、それからモ
ビリティシフト／電気泳動分離検出方法、例えば定量によりサブストレートと生
成物を分離すること、のいずれかを使用して検出可能である。非蛍光原サブスト
レートの例は、蛍光的にラベルされたキナーゼについてリン酸化可能なペプチド
、それは直ちに合成され又は、例えばＳｙｎＰｅｐ，Ｉｎｃ．を通じて商業的に
入手できる、並びに通常同じソースを通して入手できるプロテアーゼについての
蛍光ペプチドサブストレートを含む。
【００１８】 その代わりに、比較的大きなポリイオン種、例えばポリリシン、ポリアルギニ
ン等を加え、そしてフルオレセイン極性化を変化させることにより生成する複合
物を検出することにより、そのような分子チャージの変化をアッセイするための
方法が記載される。それゆえ、より大きな又はより小さなチャージを有する生成
物が生成される場合は、それは異なる程度で加えられたイオンへ結合し、フルオ
レセイン非極性化における差の変化を生じる。この方法は、公共に与えられた国
際特許出願００／７２０１６に実質的に詳細に記載され、全ての目的において参
考として完全に本明細書中に援用される。 操作において、２種又はそれ以上の酵素は、単一のプールされたターゲット混
合物中に提供される。酵素はそれからそれぞれのサブストレートと連結し、典型
的にはプールもされる。それから酵素活性のベースレベルは、測定される。この
アッセイは、それから個々の試験化合物の存在下で繰り返され、サブストレート
上の酵素活性のレベルがモニタされる。テスト化合物無しに対するテスト化合物
存在下における酵素活性における逸脱が見られる場合に、テスト化合物は１種又
はそれ以上のプールされた酵素／サブストレートシステムの効果を有することが
わかる。典型的には、テスト化合物はプールされたサブストレートが加えられる
前に、酵素プール中に導入され、或いはプールされた酵素へ加えられる前にサブ
ストレートプール内へ導入される。
【００１９】 ３．核酸システム 核酸及びそれらの他の生化学的な種との相互作用は、医薬的スクリーニング操
作におけるターゲットシステムとして実行される。例えば、多くの例において、
高処理量フォーマットにおいて、潜在的な医薬的な候補が核酸と核酸結合タンパ
ク質との間の相互作用における効果を有するか否かを確認できることが望ましい
。このような相互作用は、特定の遺伝子（ｇｅｎｅｓ）の増加した又は減少した
表現を導く細胞の活性経路においてしばしば重要である。典型的にはこのような
ターゲットシステムは、スクリーンされる核酸結合タンパク質についての認識シ
ークエンスを含む核酸シークエンスを含む。核酸は、通常はターゲットプール内
に、長さにおいて２００個のヌクレオチドよりも少なく、好ましくは５０個のヌ
クレオチドよりも少なく、より好ましくは約３０又は２０個のヌクレオチドの長
さの短いプローブとして供給される。ターゲットシステムは、典型的には核酸プ
ローブの一部又は複合部分に対して認識及び結合するタンパク質も含む。さらに
上記のように、核酸プローブ及び結合タンパク質は、溶液中に自由に提供され、
又はそれらは細胞懸濁液中に導入され又は存在することができる。この型のスク
リーニングアッセイの実行は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３５６５７中に
記載され、全ての目的のために完全に本明細書中に参考として援用される。 他の種に対する核酸の結合の検出は、典型的には非蛍光原アッセイに関して記
載された方法を使用して、及び好ましくは蛍光偏光ベースの検出を使用して達成
される、ここで核酸プローブは蛍光グループを運ぶ、或いはラベルされていない
成分、例えば核酸プローブに対する複合物の電気泳動モビリティの変化として達
成される。
【００２０】 ４．イオンチャネルシステム イオンチャネルは、本発明の方法及びシステムの使用に対してスクリーンされ
るターゲットシステムの他のクラスを表す。イオンチャネルは細胞又は細胞小器
官の透過膜電位を規制することにおいて重要であり、及び神経システムにおける
電気的な信号プロセスにおいて重要な役割を果たす。イオンチャネル活性の変化
は、典型的には：イオンチャネルに対してリガンドを結合させ；チャネルの移動
前の改変；透過膜電位の変化；又は機械的な刺激；によりコントロールされる。
種々の生物学的システムにおけるこれらのシステムの重要性のために、試薬を特
定するためにしばしばスクリーンが行われ、それは、これらのチャネルの通常の
機能に影響し得る。
【００２１】 典型的には、イオンチャネルターゲットシステムは、イオンチャネルが属する
細胞膜、細胞小器官膜、細胞膜フラグメント、人工膜又は脂質ミセルとともに１
種又はそれ以上のイオンチャネルのサブユニットを含む。好適な態様において、
スクリーンされるイオンチャネルは、生細胞のプラズマ膜の一部として表される
。このような場合、イオンチャネルターゲットは、使用されているセルラインに
対しネイティブであることができ又はホストセルライン中で異質構造で表される
ことができる。イオンチャネルシステムの活性は、典型的には膜を横切るイオン
のフラックスにおける変化を検出することにより、又は透過膜電位の変化を検出
することにより、又はイオンチャネルの機能、例えばレポータ遺伝子活性から流
れる下流イベントを検出することにより測定される。イオンフラックス及び下流
イベントにおける変化は、上記レポータシステムについて記載されるような態様
にて、通常、測定されることができる。
【００２２】 透過膜電位測定の場合、種々の方法が、本明細書中に記載された方法及びシス
テムにおいて直接的に利用できる透過膜電位の変化の測定に利用できる。例えば
Ｔｓｉｅｎ等（米国特許５，６６１，０３５）は、移動する蛍光アニオンと膜に
対して非対称に隣接して配置するフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）と
の間で、ＦＲＥＴの変化を測定することにより透過膜電位の光学的検出方法を記
載し、それは透過膜電位から生ずる変化を変化させる。その代わりに、全ての目
的において参考として本明細書中に援用される国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／
２７６５９は、膜透過性蛍光イオンのアプテーク（ｕｐｔａｋｅ）の速度を測定
することにより透過膜電位の変化を測定する方法を記載し、それは透過膜電位に
依存して変化する。
【００２３】 ５．その他 医薬的に適切なターゲットシステムの長いリストは、当業界における通常の者
により公知であり、及び通常は、全ての目的において参考として本明細書中に完
全に援用される米国特許５，９４２，４４３に概説された生化学的活性の全ての
範囲に及ぶ。通常、このようなシステムは、例えばＧ−タンパク質連結レセプタ
（膜と核の両方）、イオンチャネル、トランスポータ、ポンプ、異化及び同化作
用酵素システム（例えばプロテアーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ等）結合パー
トナー（タンパク質―タンパク質、核酸、核酸―タンパク質）等を含む。要する
に、実際に任意の検出可能な酵素、信号、輸送又は結合イベントは、本明細書中
に記載された方法におけるターゲットシステムとして使用できる。典型的には、
このようなタイプのシステムは、本明細書中に記載されるシステムに直ちに適用
できる。
【００２４】 Ｂ．ターゲットプール １．通常 本発明について、少なくとも第一及び第二ターゲットシステムは、第一ターゲ
ット混合物中に組み合わせられる。第一の態様において、ターゲット混合物は第
一及び第二ターゲットシステムを作成する成分の混合物からなり、少なくとも１
種のターゲットシステムが液体の形態で、例えばターゲットシステムの成分の溶
液として存在する。典型的には、このような場合、プールされたターゲットシス
テムの全てが、同じ溶液形態で存在する。例の方法により、少なくとも２種の酵
素ターゲットシステムを含むターゲット混合物をベースとする溶液中において、
ターゲット混合物は、典型的には、第一及び第二ターゲットシステムの成分であ
る第一及び第二酵素の溶液を含む。第一及び第二ターゲットシステムのための適
切なサブストレートは、数種の場合には場合にはサブストレートはスクリーニン
グ操作における後の地点、例えば試験化合物がターゲット混合物に導入された後
で加えられるが、しばしばターゲット混合物中に含まれる。
【００２５】 他の態様において、ターゲット混合物は、懸濁液中の粒子と結合する少なくと
も１種のターゲットシステムからなる。このような粒子は、例えばビードをベー
スとする懸濁液、細胞懸濁液等を含む。ビードをベースとするターゲットシステ
ムの場合、ターゲットシステムの少なくとも１種の成分においては、典型的には
流動可能な固体支持体上に、例えばアガロース、セルロース、デキストラン、ア
クリルアミド又はシリカビード上に固定される。一定の好適な態様において、タ
ーゲットシステムは細胞懸濁液を含み、ターゲットシステムは細胞懸濁液の細胞
中で少なくとも部分的に組み入れられる。ターゲットシステムは細胞懸濁液中の
細胞とネイティブに結合し、例えばここで細胞は自然にレセプタ、酵素、核酸又
は興味深い生化学システムの他の成分を表す。場合によっては、ターゲットシス
テムはターゲットシステムの成分を表すことを実行され、又はスクリーニングア
ッセイを行う前に外因で細胞中に導入されるターゲットシステムの成分を有する
。さらに、ターゲットシステムの他の成分は細胞懸濁液中に存在することができ
、又は後の地点、例えば試験化合物がターゲット混合物中に導入された後で、選
択的に導入されることができる
【００２６】 本明細書中に記載される細胞懸濁液は、典型的には１種又はそれ以上の異なる
細胞群を含み、各異なる細胞群は１種又はそれ以上の異なるターゲットシステム
を含む。例えば、数種の場合には、細胞懸濁液は少なくとも２種の異なる細胞群
を含み、１つの細胞群は第一ターゲットシステムを含む、例えば細胞は第一レセ
プタ及び関連するエレメント、すなわちレポータシステムを表す。細胞懸濁液内
の第二細胞群は、第二ターゲットシステム、例えば他のレセプタ及びレポータシ
ステムを表す。その２種の細胞群は、それから同じ懸濁液中にプールされる。数
種の場合には、少なくとも１種のターゲットシステム、例えば第一細胞群は参照
セルラインである、ところが第二細胞群は、特定のターゲットシステム、例えば
細胞表面レセプタを表すことを行うことを除いては第一と同じである。このよう
な場合、例えば参照セルラインにおける機能の通常のレベルが特定のターゲット
システムであるとき、参照セルラインはコントロールターゲットシステムとして
機能する。例えば、ホストセルラインはＧＰＣＲを用いてトランスフェクト（ｔ
ｒａｎｓｆｅｃｔ）されることができ、トランスフェクトされないホストセルラ
インは第一細胞群として機能し、第二セルラインは第二群として機能する。ホス
トセルラインの通常の機能は、第一ターゲットシステムを表し、トランスフェク
トされたセルラインはターゲットプール内の第二ターゲットシステムを表す。
【００２７】 その代わりに、又はさらに、懸濁液中の単一の細胞群は、例えば興味深い１種
以上のレセプタ／レポータシステムを表す、１種以上の異なるターゲットシステ
ムを含むことができる。この後者の場合、全体の懸濁液は全体的に単一の、複数
のターゲットシステムクレーム群を作成されることができる。しかし、さらにタ
ーゲットの数を増加させるために、それぞれ複数のターゲットシステムを含む複
数のクレーム群は、単一の細胞懸濁液中で結合されることができる。 所定の好ましい態様において、特定のターゲット混合物は、行われる種々のス
クリーニングアッセイのための全体の条件を最適化することを許容するために、
関連するターゲットシステムタイプ、例えばレセプタ／レポータシステム、酵素
システム等を含むことができる。例えば、特定の細胞懸濁液において、複数のタ
ーゲットシステムは、例えば細胞が複数の異なるレセプタ／レポータシステム、
又は少なくとも１種の異なるレセプタ／レポータシステムをそれぞれが表す複数
の異なる細胞群を表す場合、典型的には複数の異なるレセプタシステムからなる
。多くのレセプタシステムが類似又は同一の特性、例えばレポータ機能、イオン
フラックスの変化等を使用してモニタされるとき、存在する全てのターゲットシ
ステムのために、最適化されるターゲット混合物について全体の環境を提供する
ことが望ましく、最適化は種々のターゲットシステムの関連により容易化される
。
【００２８】 ２．例示的なプールされたターゲットシステム 本明細書中に記載されるプールされたターゲットシステムは、前述の医薬的に
有用なターゲットシステム、例えば、レセプタターゲットシステム、酵素ターゲ
ットシステム、核酸ターゲットシステム等の全ての例において、一般的に有用で
ある。 例の手段により、プールされたレセプタターゲットシステムは典型的には複数
のレセプタを含み、溶液中でフリーか又は細胞の懸濁液中の１種又はそれ以上の
細胞の群と結合するかのいずれかである。ターゲットプールも種々のレセプタの
ためにリガンドを含む。典型的には、それらはアッセイシステムに種々のレセプ
タに対する種々のリガンドのプールとして導入され、以下により詳細に記載され
るように、導入はスクリーンされる試験化合物を加える前又は後である。一旦、
ターゲットプールの成分、例えばレセプタとリガンドが組み合わされると、これ
らの成分間の相互作用がモニタされる。試験化合物がプールされるターゲットシ
ステム中に導入される場合、プール内の１種又はそれ以上のターゲットシステム
におけるその試験化合物の任意の効果は、試験化合物無しにおける相互作用との
差異として測定される。プールされた酵素ターゲットシステムの場合、２種の成
分の相互に最適な有用性を提供するために、細胞と連結されることと対立するも
のとして溶液中でフリーな状態で酵素及びサブストレートを提供することが一般
的に好ましい。同様に、それぞれが本明細書中で全ての目的において参考として
完全に援用されるＰＣＴ／ＵＳ００／２７６５９及び発行された国際特許出願Ｗ
Ｏ９９／６７６３９に記載されるように、核酸をベースとするターゲットプール
は溶液中で自由な状態で随意に提供もされ、又は細胞懸濁液中に分布する状態で
提供されることができる。
【００２９】 III. スクリーニングアッセイ方法 本発明の方法において、ターゲットプールは、存在する種々のターゲットシス
テムにおける潜在的な効果についてのスクリーニング試験化合物において提供及
び使用される。上述のように、これらのターゲットプールは、溶液をベースとす
る試薬を含むことができ、試薬はビードと結合し、又はそれは全体又は部分的に
細胞ベースであることができる。これらの方法において使用されるターゲットシ
ステムは、そのシステム、例えば選出可能な生成物、検出可能な相互作用等の機
能又は操作と関連する検出可能な信号を有する。
【００３０】 検出可能な信号は、随意に光学的に検出可能な信号、化学的に検出可能な信号
、電気的に検出可能な信号、物理的に検出可能な信号等である。特に好ましい態
様において、光学的に検出可能な信号が特定のターゲットシステムの機能をモニ
タするのに使用される。蛍光、化学発光及びクロミック（ｃｈｒｏｍｉｃ）信号
が光学信号の特に好ましい例であり、蛍光信号が最も好ましい。典型的には、（
例えば、その操作が蛍光種の生成を、捜査前にはそのような種が存在しなかった
場所で生じる場合に）蛍光信号はターゲットシステムの蛍光原操作に基づくこと
ができ、又は存在する蛍光種の特性を変化させるためのターゲットシステムの操
作に基づくことができる（例えば種の分子チャージを変化させ、又はその回転拡
散速度を変化させる）。後者の場合、光学的に検出可能な信号の検出は、それか
ら例えば電気泳動を通して（例えば米国特許第５，９４２，４４３号参照）、チ
ャージに基づく生成物からサブストレートを区別することにより、又は蛍光偏光
検出方法を使用することにより行われる（例えばＷＯ００／７２０１６参照）。
【００３１】 その簡単さのために、蛍光原ターゲットシステムが最も好ましい。特に、種々
の異なるサブストレート及び／又はダイが利用でき、それらが特定のターゲット
システムにより作用する場合は識別可能な蛍光信号を生成する。例えば、種々の
異なる蛍光原サブストレートは、異なる酵素システムに利用でき、サブストレー
ト上の酵素の作用は、蛍光生成物を生成する、ここでサブストレートは蛍光性で
ないか、又は生成物からのものと区別可能に異なる蛍光スペクトルを有する。同
様に、配置される環境に基づき特定の蛍光信号を発する種々のダイが利用できる
。例えば細胞ベースアッセイシステムの場合、種々のダイが利用でき、それらは
細胞中に導入され、細胞内の特定のイオンの相対的な存在又は不存在に基づく蛍
光信号を生成する。種々の異なる細胞内のイオン特定ダイはＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ（Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）により、通常、市販入手でき
る。環境に依存して異なる蛍光信号を示すこれらのシステムは、強要的な開示の
目的において、通常、一様に「蛍光原」とは呼ばないが、この蛍光原の語はこれ
らの又は類似するシステムを包含する。
【００３２】 特に好ましい態様において、プールされたターゲット混合物中のターゲットシ
ステムは、異なる信号操作を含む。例えば、第一ターゲットシステムは第一の波
長のセット内で蛍光信号を生成し、プールされた他のターゲットシステム混合物
は、異なる波長のセットを有する蛍光信号を生成する。個々に検出可能な信号又
は「読み出し（ｒｅａｄｏｕｔｓ）」、例えば区別可能な信号、を使用すること
により、全体のプールされたターゲット混合物中の、各ターゲットシステム又は
ターゲットシステムのサブセットについて、種々の異なるターゲットシステムを
個々にモニタすることができ、及びそれゆえ全体の信号の概要に対するそれらの
寄与を区別することができる。この独立したモニタリングは、同じ波長において
全てのターゲットシステムを検出することにわたり、少なくとも二重の有利さを
持つ。第一に、数種の効果が観察される場合に各ターゲットシステムを個々に再
スクリーニングすることに対抗して、ターゲットシステムを区別することにより
、与えられた試験化合物によりどの化合物が影響されるかを即座に確実なものと
することができる。さらに、独立した検出は、各ターゲットシステムについて低
い信号／ノイズ比を維持することを許容し、特定の試験化合物に基づく信号に対
する変化のより容易な特徴付けを許容する。これは単一の検出スキームに対抗す
るものであり、ターゲットシステムにおける試験化合物の影響は、残留する任意
のターゲットシステムの効果を欠くことにより信号対ノイズ比に関して希釈され
る。異なる信号操作は、異なる電気泳動モビリティ有するプローブを使用するこ
とにより得られることもできる。特に好適な態様においては、１種又はそれ以上
の細胞群を含むターゲットシステムは、異なる蛍光スペクトル（形状及び強度）
を使用して各細胞群をラベルすることにより区別される、例えば細胞群あたりの
１種又はそれ以上の異なる蛍光ラベル及び細胞蛍光は、細胞ベースにより細胞に
おいて読まれる。
【００３３】 ターゲットシステムは、試験化合物をプールされたターゲット混合物と混合す
ることにより、試験化合物に対してスクリーンされる、そしてシステムにより生
成される検出可能な信号の量における効果を検出する。この信号はそれから試験
化合物が無しのシステムにより生成される信号（「コントロール信号」）に対し
て比較される。示されるように、信号は好ましくはプールされたターゲット混合
物中の各異なるターゲットシステムについて、プール内の各ターゲットシステム
からの区別可能な信号により検出される。コントール信号にわたるターゲット信
号のずれは、特定の試験化合物が特定のターゲットシステムにおいて効果を有す
ることを示している。代わりの方法では、全体の信号が測定され、そしてコント
ロール信号レベルと比較される。ずれが生じた場合、プール内の少なくとも１種
のターゲットシステムが、試験化合物により影響を受けることを表す。それから
、ターゲットシステムのそれぞれは、独立して試験化合物に対して応答指令信号
を送り、影響を受けるターゲットシステムを特定する。
【００３４】 多くの場合、試験化合物は、ターゲットシステムの他の成分を加える前に、タ
ーゲットシステムの一部に加えられることができる。例えば、酵素ターゲットシ
ステムの場合、興味深い酵素を、試験化合物とともに、その酵素用の必要なサブ
ストレートの導入前にインキュベートすることが望ましい。 多数の異なる試験化合物が、それらを分割した量のプールされたターゲット化
合物と組み合わせることによりスクリーンされる。これは、通常、多数の分離し
た別々の容器、例えばマルチウェルプレート中のウェル、すなわち９６、３８４
又は１５３６ウェルプレート中で、或いはキャピラリ−装置若しくはシステム又
はミクロ流体チャネル中の別々のチャネルネットワーク中で行われることができ
る。代わりに、そして好ましくは、別々のスクリーニングアッセイはミクロ流体
チャネル内で行われ、別々の化合物が連続して導入され、かつプールされたター
ゲット混合物の連続流に対してスクリーンされる。
【００３５】 ＩＶ．システム 広範囲のアッセイシステムが、本明細書中に記載される方法を行うことにおい
て使用されることができる。例えば、例えば試験チューブ又はマルチウェルプレ
ートを使用する慣用のスクリーニングアッセイシステムは、プールされたターゲ
ットシステムを反応チューブ又はウェル内へ単に提供することにより、本明細書
中に記載された方法において使用できる。同様に、ミクロ流体装置及びシステム
も、本明細書中に記載されるプールされたターゲット方法を用いる高処理量スク
リーニングアッセイにおいて直ちに使用される。本発明のシステムは、検出器械
、及びデータを集め保存し、データを分析等のためのものと同様に、他の器械又
は装置をコントロールするためのコントロール器械に加え、典型的には慣用の又
はミクロ流体装置、例えば反応容器のいずれかを使用する。図１は本発明のアッ
セイシステム全体を概略的に表す。
【００３６】 示されるように、全体のシステム１００は反応容器１０２、及び（点線で示さ
れるように）反応容器１０２の内容物と感知可能に連絡する検出器１０４を含む
。検出器は、反応容器１０２の内容物に関して検出器により発生するデータを集
め、保存し及び随意に分析するプロセッサ又はコンピュータと操作可能に連絡す
る。付加的なコントローラ１０８も提供される。コントローラは典型的にはプロ
セッサ又はコンピュータ１０６と操作可能に連絡し、それはユーザプログラムさ
れた指示セットに応答してコントローラの操作を指示する。このようなコントロ
ーラは、反応容器の位置をコントロールするコントローラ、例えばプレートハン
ドリングロボット用のロボットコントローラ等を含む。代わりに又は付加的に、
コントローラは、例えば反応容器が流体通過容器、すなわちミクロ流体チャネル
又はチャネルネットワークである場合に、フローコントローラを含む。いずれか
のイベントにおいて、コントローラは典型的には反応容器と操作的、例えばロボ
ットコントローラの場合は機械的に、或いはフローコントローラの場合は電気的
に、空気式に又は流動可能に連絡する。
【００３７】 Ａ．慣用のアッセイシステム 上述のように、ターゲットプーリング方法は、慣用のアッセイフォーマットにお
いて高度に有用であり、アッセイ試薬は図１に示されるように、特定の反応容器
、例えばミクロウェルプレート内のウェル、試験チューブ等、内の反応混合物中
に加えられる。特にプールされたターゲット混合物は、通常、マルチウェルプレ
ートのウェルに加えられる。さらなる試薬、例えば試験化合物及びターゲットシ
ステムの更なる成分、例えばプールされたレセプタのためのリガンド、プールさ
れた酵素のためのサブストレート等が、プレートのウェルに加えられる。高処理
量スクリーニング方法の場合、異なる試験化合物がプレート又はプレートの集合
の各ウェルに加えられ、プールされたターゲットシステムにおける個々の影響が
、例えば試験化合物が加えられないか又はプールされたターゲットシステムにつ
いての公知のエフェクタ化号物（作動薬又は拮抗薬）が加えられた、コントロー
ルとの比較として測定される。ある場合においては、プールされたターゲットシ
ステムのそれぞれについての正の及び／又はプールされた全てのターゲットシス
テムに対しての効果を有する正のコントロールをアッセイすることが望ましい。
【００３８】 反応混合物が負のコントロールと異なる結果を生じ、又は正のコントロールの
結果に近づく場合は、ウェル内で加えられる試験化合物が、プールされたターゲ
ットシステムにおける少なくとも１種のターゲットシステムのエフェクタである
ことを表す。前に参照したように、各ターゲットシステムが他のターゲットシス
テムと区別できる信号を生成する場合は、正のスクリーニング結果は容易に適切
なターゲットシステムを特徴付ける。全体のシステムについて信号を検出できる
信号のみが使用される場合は、正のスクリーニング結果は試験化合物を確実なも
のに特定するためにユーザが必要であり、第二スクリーン内に戻り、影響を受け
た特定のターゲットシステムを特定する。これは別々の反応容器、例えばマルチ
ウェルプレート内で、通常、行われる。
【００３９】 Ｂ．ミクロ流体アッセイシステム ミクロ流体アッセイシステムも、本明細書中に記載されるターゲットプーリン
グスクリーニング方法において有用である。通常は、ミクロ流体装置又はチャネ
ルは、上述のように、たとえば図１の容器１０２のような反応容器として機能す
る。特に、プールされたターゲット混合物は、ミクロ流体装置内のミクロ流体チ
ャネル内に導入され、さらなる試薬がターゲットプールに運ばれ又は加えられ、
試験化合物、更なる試薬及びターゲットシステムの成分等を含む。ミクロ流体シ
ステムは慣用のシステムにわたり多大な利益を提供する、そこでターゲットシス
テム試薬を含むはるかに量の少ない試薬を利用する。さらに、それらの小さいス
ケール及び統合された構造は、複数の操作、例えば試薬添加、分離等を許容し、
単一の統合されたチャネルネットワーク内で実行される。
【００４０】 特に好ましい態様において、本発明の方法は流動するミクロ流体システム中で
実行される。特にプールされたターゲット混合物又はそれらの成分はメイン反応
チャネルにそって流れ、１種又はそれ以上の試験化合物は個々に、連続して又は
プール内でメインチャネル内に導入され、プールされたターゲットシステムと相
互作用する。プールされたターゲットの標準的な又はコントロール機能における
試験化合物の影響は、それからメインチャネル内で、全成分の混合地点の下流地
点において検出される。このような流動するアッセイ方法を実行するためのミク
ロ流体装置の例は、図２Ａ、２Ｂ及２Ｃに表される。
【００４１】 図２Ａは、通常，蛍光原アッセイを行うことに有用であるミクロ流体装置チャ
ネルパターンを表す。表されるように、全体装置２００はボディ構造２０２を含
む。メイン分析チャネル２０４は、装置の内部部分に配列されて提供される。反
応チャネル２０４の１つの末端は、メイン分析チャネル２０４及び外部サンプリ
ングキャピラリーエレメント（２２０、図２Ｃの側面図を参照）間の連結を形成
するキャピラリーインレット２０６である。試薬リザーバ２０８及び２１０は全
体のボディ構造中に提供され、メイン反応チャネル２０４と、それぞれ連結チャ
ネル２１２及び２１４を介して流動可能に連絡する。メインチャネルは、廃棄リ
ザーバ２１６におけるキャピラリーインレット２０６の逆の末端で終了する。
【００４２】 操作において、プールされたターゲット混合物は、例えばリザーバ２０８内に
置かれる。そしてターゲット混合物はメイン反応チャネル２０４内に、連結チャ
ネル２１２を通して流れる。これは、通常、正の圧力をリザーバ２０８に適用す
るか負の圧力を廃棄リザーバ２１６に適用するか、或いはそれら２つの組み合わ
せのいずれかにより行われ、所望の様式で物質のフローをコントロールする。試
験化合物は、それからメイン反応チャネル内へキャピラリーエレメント２２０（
図２Ｃ）及び連結／インレット２０６を通って流れる。典型的には、複数の試験
化合物が連続様式にてメインチャネル内に、続々と導入される。それから試験化
合物は、プールされるターゲット混合物と混合する。ほとんどの場合、試験化合
物がさらなる成分が加えられる前にターゲットシステムの成分と相互作用するこ
とを許容するために、ターゲット混合物の他の成分は、試験化合物が導入された
後に、アッセイ反応混合物中に導入される。例えば、図２Ａに表される装置にお
いて、プールされるターゲットのさらなる成分はリザーバ２１０内に置かれ、そ
して試験化合物が加えられた後、反応チャネル２０４に対して加えられる。さら
に、これらのさらなる成分のフローは、通常、正の圧力をリザーバ２１０に適用
するか負の圧力を廃棄リザーバ２１６に適用するか、或いはそれら２つの組み合
わせのいずれかにより行われる。典型的には、後者の場合は複数のリザーバから
の共通チャネルへの流体を正確にコントロールする能力を、同時に提供する点に
おいて好ましい。
【００４３】 例の方法により、細胞ベースのプールされたレセプタターゲットアッセイにお
いて、異なるレセプタシステムを運ぶ細胞の異なる群を含む細胞懸濁液は、リザ
ーバ２０８内に配置される。一方では、プールされたレセプタターゲットシステ
ムに対するリガンド又は作動薬は、リザーバ２１０内に配置される。プールされ
たシステム、例えば細胞懸濁液のレセプタ部分は、メイン反応チャネル内に流れ
、そして外部サンプリングキャピラリ−を通して運ばれた試験化合物と混合する
。異なるレセプタについてのリガンド又は作動薬は、それからメインチャネル内
に運ばれ、レセプタプール／試験化合物混合物中と混合する。 全体のアッセイ混合物は、メイン反応チャネルに沿って、検出領域又は窓を通
過して輸送される。検出領域又は窓は、典型的にはメインチャネルの領域として
規定され、そこで検出器が反応チャネルの内容物と感知可能に連絡する。光学的
な信号がチャネルの外へ近くの又は隣接する検出器へと透過することを許容する
ために、ほとんどの場合、検出領域又は窓は透明な領域として提供される。
【００４４】 示されるように、種々の試薬を装置のチャネルを通して輸送することは、所望
の流体フローの方向に沿って圧力差を適用しチャネルを通して流体を押し又は流
すことにより典型的には実行される。これは典型的には異なる試薬リザーバのそ
れぞれに異なる正の圧力差をそれぞれ適用し、及び／又は廃棄リザーバ２１６に
減圧を適用することにより成し遂げられる。適用される正及び負の圧力の組み合
わせが、典型的には、例えば調整されたフロー抵抗を有する調整されたチャネル
と組み合わせて使用され、試薬のフローに関して性格にコントロールする。アッ
セイの結果は、メインチャネル２０４に沿って検出領域２１８においてモニタさ
れる。 非蛍光原アッセイにおいて、異なるチャネル幾何が使用できる。例えば電気泳
動モビリティシフトスクリーニングアッセイを行うことにおいて、図２Ｂに示さ
れたチャネル幾何を有する装置が典型的には使用される（該装置は図２Ｃに示さ
れたものと同じ側面図の輪郭を有する）。共通の参照番号は本出願における異な
る図の間で共通な態様、例えば図２Ａ及び２Ｂについて使用される。
【００４５】 操作において、種々のターゲットシステム試薬はリザーバ２０８及び２１２内
に、上記図２Ａに記載されたように静置される。さらに、試験化合物は、外部サ
ンプリングキャピラリー２２０（図２Ｃ）を通って、メイン反応チャネル内へ流
れ、ここでそれらはプールされたターゲットシステム試薬と混合する。表される
ように、図２Ｂに示される装置は、メイン反応チャネルに沿って異なる地点に、
例えばチャネル２２６及び２２８をそれぞれ介して連結する２種のさらなるリザ
ーバ２２２及び２２４を含む。これらのリザーバは装置内に電極を配置するため
のアクセスポートを提供する。電極は電気ポテンシャル勾配を、メイン反応チャ
ネルに沿って発生させるために使用される。試験化合物スラグを含む反応混合物
がチャネル２２６と２２８との間のメインチャネル２０４の一部の中に通るとき
に、これらの試薬は適用された電場を受ける。適用された電場を受けるとき、チ
ャージのレベルが異なる生成物及びサブストレートは、電気泳動分離される。生
成物発生の全体速度における変化の欠如において、この電気泳動分離はシステム
において連続的に流れる試薬によりマスクされる、例えばサブストレート及び生
成物の定常状態はチャネル２２６及び２２８間のチャネル２０４の一部を通して
存在し、例えば定常状態蛍光信号を生じる。しかし、試験化合物がターゲットシ
ステムの機能において影響を有するとき、それはこの定常状態における特徴的な
ずれを生じ、その信号を伴う。特に、生成物が適用される電場のもとでより早く
移動する場合、試験化合物スラグ中の抑制剤の存在は、試験化合物プラグのより
進んだ空間において生成物の消耗を生じ（なぜならそれは反応の抑制のために生
成物で満たされないからである）及び試験化合物プラグ内又はその後で、（以下
の生成打つと同様に）より遅く移動するサブストレートの蓄積を生じる。このよ
うなモビリティシフトアッセイは、例えば米国特許５，９４２，４４３号及びＷ
Ｏ９９／６４８３６に詳細に記載される、それらの各々が全ての目的のために参
考として完全に本明細書中に援用される。
【００４６】 ミクロ流体装置の場合に、すでに混合されたターゲットプールをミクロ流体層
置内に導入すること、例えばリザーバ２０８内にプールされたターゲットシステ
ムを配置することは一般的に記載されているが、ミクロ流体システムの場合は、
ターゲットシステムをミクロ流体システムの操作を通じてプールすることが望ま
しい。特に、異なるターゲットシステムは、それぞれがメイン分析チャネルに連
結する別々のリザーバ内に、例えば１つの又は異なる連結するチャネルを通じて
提供される。それから該装置は、各ターゲットリザーバから反応チャネルへ異な
るターゲットシステム成分を移動させることにより「プールされるターゲット」
モードで実行される。スクリーニングアッセイは、それから上記のように実行さ
れる。試験化合物がプールされたターゲットシステム全体において影響を有する
場合、各ターゲットシステムを別々に輸送することにより、例えばプールされず
に、試験化合物中に混合する間に分析チャネルの下で、各異なるターゲットシス
テムを用いて、スクリーンは直ちに繰り返し、影響を受けるターゲットシステム
を特徴付けることができる。それゆえ、リザーバ２０８の代わりはメインチャネ
ル２０４に連結する複数のリザーバであり、ここで各リザーバは異なるターゲッ
トシステムを含む。
【００４７】 代わりの具体例において、独立した又は分離したチャネルネットワークが使用
され、各異なる試験化合物又は試験化合物の群をスクリーンする。特に、プール
されたターゲットシステムは、別々の反応チャネル又はチャネルと連結するリザ
ーバ内で、試験化合物と混合される。反応混合物は、それからチャネルを通って
、スクリーンの結果が検出／モニタされる検出点に輸送される。このような別々
のアッセイチャネルは、スクリーンアッセイが、例えばプールされたターゲット
システムのサブストレート及び生成物間のモビリティシフトに基づく場合に、し
ばしば使用される。
【００４８】 Ｃ．検出器 種々の検出システムは、本発明の装置及びシステムについて有用である。典型
的には、このような検出器はスクリーニングアッセイが行われる反応容器に、こ
れらの容器が流動チャネル、ウェル、又は試験チューブのいずれにせよ、感知可
能に連絡して配置される。本明細書中で使用される「感知可能に連絡」という語
句は、スクリーニングアッセイに使用される反応容器の内容物からの検出可能な
信号を受けることに使用することができるように、配置される検出器を意味する
。光学検出器の場合、感知可能な連絡は、反応容器の内容物から光学信号が検出
器へ伝達され、及び検出器により受け取られるように、検出器が反応容器の開い
た又は透明な又は半透明部分に隣接して配置されることが必要である。他の検出
システムの場合、感知可能な連絡は、センサが、例えば反応容器又はチャネル内
に配置される反応容器内容物と直接連結していることを必要とすることができる
。このような検出器は、例えば電気化学的センサ、すなわちｐＨ又は伝導センサ
、熱センサ等を含む。
【００４９】 好ましい態様において、光学検出器がスリーニング反応からの信号を検出する
ことに使用される。特に蛍光信号がスクリーニングアッセイにおいてしばしば使
用されるように、蛍光検出システムが最も好ましい。典型的には、反応容器の内
容物に向けられた光源を使用する。反応容器から発光された蛍光は、それから光
学トレイン（ｔｒａｉｎ）を通して集光され及び検出される。上記のように、プ
ールされたターゲット混合物における各異なるターゲットシステムからの信号間
で区別することができる検出システムを利用することが、しばしば望ましい。蛍
光システムの場合、このような検出システムは、異なる波長の蛍光信号を分離し
及び別々に検出することができる光学トレインを使用する。これは典型的には、
光学トレイン内の光学フィルタ、二色性（ｄｉｃｈｒｏｉｃｓ）等の包含を含む
。多数の異なる蛍光信号間を区別できる検出システムの例は、例えば米国特許第
５，８２１，０５８号に記載され、それは通常、核酸の使用においての使用、例
えばシークエンシング、検出について記載される。 上述のように、数種の場合において、蛍光偏光検出が使用され、種々のアッセ
イ結果、例えば結合又はハイブリタイズ反応、チャージ偏光反応等をモニタする
のに使用される。そのように、これらの場合は、検出システムは随意に蛍光偏光
検出を使用する。このような検出システムは、例えばＷＯ９９／６４８４０及び
ＷＯ００／７２０１６に記載され、全ての目的において参考として完全に本明細
書中に援用される。
【００５０】 Ｄ．コントロール及びデータ分析 本発明のシステムは、反応容器から受け取るデータを保存及び分析するために
及び／又はミクロ流体装置のミクロ流体チャネルのチャネルを通る物質のフロー
を方向付けるために、検出システムと操作可能に連絡するプロセッサ、及びミク
ロ流体の例の場合はフローコントローラも含む。本発明に関連して種々のプロセ
ッサ又はコンピュータが有用であり、それはインテルペンティアム（Ｉｎｔｅｌ
Ｐｅｎｔｉｕｍ）（登録商標）、ペンティアムII（Ｐｅｎｔｉｕｍ II)（登録
商標）、又は適用可能なＣＰＵ、アップルマッキントッシュ（Ａｐｐｌｅ Ｍａ
ｃｉｎｔｏｓｈ）（登録商標）等を作動させるＰＣコンピュータを含む。
【００５１】 Ｖ．キット 本発明は、過度のセットアップ、試薬調製等なしで、本明細書中に記載される
方法を行うために有用なキットも提供する。本発明のキットは、複数のターゲッ
トシステムを提供するのと同様に、別々に保存され又はプールされたターゲット
混合物として保存される反応容器、例えばマルチウェルプレート又はミクロ流体
装置を典型的に含む。このキットは検出可能なダイ、バッファ、及び上記方法を
行うのに有用な他の試薬も随意に含むことができる。最終的には、本発明のキッ
トは典型的には、特定の適用のために望ましい本明細書中に記載されたものを実
行するための命令とともにパッケージされる種々の成分を含む。
【００５２】 ＶＩ. 例 例１： Ｇ−タンパク質連結レセプタシステムアッセイにおいて証明されるタ ーゲットプーリング 本発明を、プールされたターゲットシステムとして単一の懸濁液における２種
の異なるセルラインミクロ流体フォーマットにおいて表した。一時的に、２種の
Ｊｕｒｋａｔセルラインが単一の細胞懸濁液に提供され、そこで１種のセルライ
ンがＧ−結合タンパク質を表現するために改変され、それは公知のリガンドによ
り活性化される。細胞懸濁液は、図５に示すようなチャネルレイアウトを有する
ミクロ流体層置内に導入される。２種のセルラインはシト６２（ＳＹＴＯ６２）
を用いる差異（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）ラベリングにより区別可能であった
、ここでセルラインを含むＧＰＣＲは比較的高いシト６２レベルを有したが、ネ
イティブな細胞は低いレベルのシト６２で染色された。両方のセルラインが、フ
ルオー４（Ｆｌｕｏ−４）、細胞内カルシウムイオンの存在を示す細胞内染料、
でも染色される。図３Ａ及び３Ｂは、２種のセルラインが、例えばプールされな
いフォーマットで別々に実施され、公知のＧＰＣＲリガンド（１μｍ−スクエア
ネガティブコントロール−ダイアモンド）に曝された場合の蛍光信号を表す。示
されるように、リガンドの導入は、ＧＰＣＲ−表現のＪｕｒｋａｔセルライン中
でのみ（増加するカルシウムフラックスの示す）フルオー４蛍光の増加を引き起
こす。図４は、ターゲットセルラインがプールされ、そして同じ反応チャネル内
で同時に実施される場合を示す。さらに、フルオー４蛍光における増加は、より
高いシト−６２蛍光レベルを有する細胞の副次集団、すなわちＧＰＣＲ含有セル
ラインに起因する。従って、それは２種の異なるセルラインがアッセイにおいて
、本明細書中に記載されるターゲットプーリング方法の不在において使う時間の
半分の時間でスクリーンされることを示す。
【００５３】 例２： 異なる刺激（Ｓｔｉｍｕｌｉ）に対する用量作用についての２種のタ ーゲットスクリーン 本発明を、プールされたターゲットシステムとして単一の懸濁液における２種
の異なるセルラインを使用して、さらに例証した。一時的に、カルバコールによ
って活性化されるＭ１ムスカリン（ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ）のレセプタを表現す
るＣＨＯセルラインをフルオー４でラベルした。ＴＨＰ−１セルラインをフラレ
ッド（Ｆｕｒａ ｒｅｄ）でラベルした。両方のセルラインをプールし、図５に
示すようなチャネル構造を有するミクロ流体層置内に導入した。細胞は装置のメ
インチャネルを通って流れ、青色励起光で細胞を励起した検出器を通りすぎた。
緑色の蛍光がフルオー４ラベルされたＣＨＯ細胞から分析され、試験化合物に対
するそれらの応答を測定した。異なる蛍光の測定は、検出器の光学トレインにお
ける適切な光線スプリッタ及びフィルタを通して同時に達成される。同様に、赤
色の蛍光はフラ−レッドでラベルされたＴＨＰ−１細胞から測定され、それらの
応答を測定する。異なる濃度のカルバコールは細胞と接触して流れ、そして各セ
ルラインの応答の表示として緑色及び赤色の蛍光が測定され、そして結果をプロ
ットした（図６Ａ−６Ｂ）。同様に、異なる濃度のＵＴＰもチャネルを通って流
れる細胞と接触し、そして各システムについての結果をプロットした（図６Ｃ−
６Ｄ）。図６Ａ−６Ｂから分かるように、フルオ−４ラベルを運ぶＣＨＯ−Ｍ１
細胞において予想された用量依存変化を生じるが、図６Ｃ−６Ｄは両方のセルラ
インがＵＴＰに応答する用量依存を示す。
【００５４】 全ての公報及び特許出願は、個々の公報又は特許出願のそれぞれが特別に及び個
々に参考として援用されていることを示すように、参考として、ある程度、本明
細書中に導入される。本発明は明確化及び理解の目的のために例証や実施例によ
り幾分詳細に記載されているが、一定の変化及び改変を記載された特許請求の範
囲の範囲内において実行し得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のスクリーニング方法を実行するための全体のシステムを
表す。
【図２Ａ】 本発明のミクロ流体装置を概略的に表す。
【図２Ｂ】 本発明のミクロ流体装置を概略的に表す。図２Ａ及び２Ｂは２
種の異なるミクロ流体装置を概略的に表し、本発明のスクリーニングアッセイ方
法もバリエーションを実行するために異なるレイアウトを有する。
【図２Ｃ】 両方のミクロ流体装置の横の透視図を表す。
【図３】 図３Ａ及び３Ｂは、スクリーニングアッセイ中に別々に維持され
およびモニタされる２種のターゲットシステムからのデータのプロットである。
【図４】 図３に示された同じ２種のターゲットシステムのプロットである
、ただしこのシステムは単一の反応容器内にプールされ及び同時にモニタされる
。
【図５】 本発明の方法を実行することに使用されるミクロ流体装置のチャ
ネルレイアウトを表す。
【図６Ａ】 図６は、２種のプールされた細胞ベースのターゲットシステム
のスクリーニングからのデータプロットを表す。図６Ａは、増加するカルバコー
ル濃度に対して、図６Ｂと同じプールされたセルラインの蛍光応答のプロットを
表す。
【図６Ｂ】 増加するカルバコール濃度に対して、図６Ａと同じプールされ
たセルラインの蛍光応答のプロットを表す。
【図６Ｃ】 増加するＵＴＰに対しての濃度に対するプールされたＣＨＯ−
Ｍ１細胞の傾向的に示された応答を表す。
【図６Ｄ】 増加するＵＴＰに対しての濃度に対するプールされたＴＨＰ−
１細胞の傾向的に示された応答を表す。
【符号の説明】
１０２ 反応容器 １０４ 検出器 １０６ プロセッサ又はコンピュータ １０８ コントローラ ２００ 全体装置 ２０２ ボディ構造 ２０４ メイン分析チャネル ２０６ キャピラリーインレット ２０８ 試薬リザーバ ２１０ 試薬リザーバ ２１２ 連結チャネル ２１４ 連結チャネル ２１６ 廃棄リザーバ ２１８ 検出領域 ２２０ キャピラリーエレメント ２２２ リザーバ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｆ 33/566 33/566 37/00 １０１ 37/00 １０１ Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA04 DA02 EA01 FA06 GA07 GB21 JA01 LA01 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ08 QQ62 QR07 QR13 QR16 QR32 QR77 QS22 QS36 QX01 QX02

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 第一反応容器内で第一ターゲット混合物を提供し、第一ター
    ゲット混合物は少なくとも第一及び第二の異なるターゲットシステムを含み； 少なくとも第一試験試薬をターゲット混合物中に導入し；及び 第一及び第二ターゲットシステムに対する試験試薬の影響を測定する； ことを含む、スクリーニングアッセイを行う方法。
  2. 【請求項２】 第一ターゲットシステムが、少なくとも第一生化学システム
    の第一成分及び少なくとも第二生化学システムの第一成分を含む請求項１の方法
    。
  3. 【請求項３】 第一ターゲット混合物が第一生化学システムの第一及び第二
    相互作用成分を含み、及び第二ターゲットシステムが第二生化学システムの第一
    及び第二相互作用成分を含む、請求項２の方法。
  4. 【請求項４】 第一ターゲットシステムが少なくとも３種の異なるターゲッ
    トシステムを含む請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 第一ターゲット混合物が少なくとも４種の異なるターゲット
    システムを含む請求項１の方法。
  6. 【請求項６】 第一ターゲット混合物が少なくとも６種の異なるターゲット
    システムを含む請求項１の方法。
  7. 【請求項７】 第一ターゲット混合物が少なくとも１０種の異なるターゲッ
    トシステムを含む請求項１の方法。
  8. 【請求項８】 第一ターゲット混合物が第一細胞懸濁液を含み、第一細胞懸
    濁液が第一及び第二ターゲットシステムを含む請求項１の方法。
  9. 【請求項９】 第一細胞懸濁液が、第一及び第二ターゲットシステムを含む
    ために設計される請求項８の方法。
  10. 【請求項１０】 第一細胞懸濁液が、少なくとも第一及び第二細胞群を含み
    、第一細胞群は第一ターゲットシステムを含み及び第二細胞群は第二ターゲット
    システムを含む請求項８の方法。
  11. 【請求項１１】 細胞懸濁液が、第一及び第二ターゲットシステムの両方を
    含む第一細胞群を少なくとも含む請求項８の方法。
  12. 【請求項１２】 第一及び第二ターゲットシステムがそれぞれ第一及び第二
    の検出可能な信号を生じ、第一及び第二の検出可能な信号がそれぞれ、第一及び
    第二ターゲットシステムの機能を表す請求項１の方法。
  13. 【請求項１３】 第一の検出可能な信号が第二の検出可能な信号と区別でき
    る請求項１２の方法。
  14. 【請求項１４】 第一及び第二の検出可能な信号が、第一及び第二の光学的
    に検出可能な信号を含む請求項１２の方法。
  15. 【請求項１５】 第一及び第二の光学的に検出可能な信号が蛍光信号を含む
    請求項１４の方法。
  16. 【請求項１６】 第一及び第二の光学的に検出可能な信号が、蛍光レベルの
    増加又は減少を含む請求項１５の方法。
  17. 【請求項１７】 第一及び第二の光学的に検出可能な信号が、偏光された蛍
    光レベルの増加又は減少を含む請求項１５の方法。
  18. 【請求項１８】 第一及び第二ターゲットシステムが、独立してレセプタシ
    ステム、信号変換システム、イオンチャネルシステム、酵素システム、ハイブリ
    ダイジング核酸システム、核酸−タンパク質相互作用システム、タンパク質−タ
    ンパク質相互作用システムである請求項１０の方法。
  19. 【請求項１９】 ターゲット混合物中の少なくとも１種の第一及び第二ター
    ゲットシステムが、Ｇ−タンパク質結合レセプタ（ＧＰＣＲ）システムを含む請
    求項１０の方法。
  20. 【請求項２０】 第一ターゲット混合物中の少なくとも２種の第一及び第二
    ターゲットシステムがＧＰＣＲシステムを含む請求項１９の方法。
  21. 【請求項２１】 第一ターゲット混合物中の少なくとも１種の第一及び第二
    ターゲットシステムが、ＤＮＡ結合タンパク質システムを含む請求項１０の方法
    。
  22. 【請求項２２】 第一ターゲット混合物中の少なくとも１種の第一及び第二
    ターゲットシステムが、キナーゼ酵素システムを含む請求項１の方法。
  23. 【請求項２３】 第一ターゲット混合物中の少なくとも１種の第一及び第二
    ターゲットシステムが、ホスファターゼ酵素システムを含む請求項１の方法。
  24. 【請求項２４】第一ターゲット混合物中の少なくとも１種の第一及び第二タ
    ーゲットシステムが、プロテアーゼ酵素システムを含む請求項１の方法。
  25. 【請求項２５】 ターゲット混合物が第一細胞懸濁液を含み、第一細胞懸濁
    液が第一及び第二ターゲットシステム並びに参照信号を含み、参照信号は第一細
    胞懸濁液中の細胞の全てと実質的に均一に関連する請求項１２の方法。
  26. 【請求項２６】 測定段階が第一又は第二信号及び細胞懸濁液中の細胞から
    の参照信号を検出することを含む請求項２５の方法。
  27. 【請求項２７】 第一又は第二信号及び参照信号が、第一細胞懸濁液中の個
    々の細胞から別々に検出される請求項２６の方法。
  28. 【請求項２８】 参照信号が光学信号を含む請求項２５の方法。
  29. 【請求項２９】 参照信号が蛍光信号を含む請求項２８の方法。
  30. 【請求項３０】 蛍光信号が、第一細胞懸濁液中の全ての細胞と実質的に均
    一に結合する蛍光ラベルから発光される請求項２９の方法。
  31. 【請求項３１】 内部に配置される第一ターゲット混合物を有する反応容器
    であり、ここで第一ターゲット混合物は少なくとも第一及び第二の異なるターゲ
    ットシステムを含み、第一ターゲット混合物は第一ターゲットシステムとは異な
    る該容器； 試験試薬をサンプリングし及び試験試薬を反応容器内に導入するための試験試薬
    サンプラー；並びに 第一ターゲット混合物と感知可能に連絡して配置される検出器であり、第一及び
    第二ターゲットシステムにおける試験試薬の効果を検出するために配置される該
    検出器； を含む高処理量スクリーニングアッセイを行うためのシステム。
  32. 【請求項３２】 ターゲット混合物が液体混合物を含む請求項３１のシステ
    ム。
  33. 【請求項３３】 ターゲット混合物が粒子懸濁液を含む請求項３１のシステ
    ム。
  34. 【請求項３４】 ターゲット混合物が第一細胞懸濁液を含み、第一細胞懸濁
    液が少なくとも第一及び第二ターゲット混合物を含む請求項３３のシステム。
  35. 【請求項３５】 反応容器が試験チューブ、キュベット、マルチウェルプレ
    ート内のウェル、及び流体チャネルから選択される請求項３１のシステム。
  36. 【請求項３６】 反応容器が流体チャネルを含む請求項３５のシステム。
  37. 【請求項３７】 流体チャネルが約０．１〜５００μｍの寸法の断面を少な
    くとも１つ有する請求項３６のシステム。
  38. 【請求項３８】 流体チャネルが平面サブストレートに配置される請求項３
    ６のシステム。
  39. 【請求項３９】 流体チャネルが少なくとも第二流体チャネルにより交差さ
    れる請求項３６のシステム。
  40. 【請求項４０】 少なくとも１種の第一及び第二流体チャネルが試験試薬サ
    ンプラーと流動可能に連絡する請求項３９のシステム。
  41. 【請求項４１】 第一ターゲット混合物を少なくとも流体チャネル内へ又は
    流体チャネルを通して流すためのフローコントローラをさらに含む請求項３１の
    システム。
  42. 【請求項４２】 検出器が光学検出器を含み、検出器が第一ターゲット混合
    物からの光学信号を受け取ることができるように、該光学検出器が反応容器の開
    いた又は透明な部分に隣接して配置される請求項３１のシステム。
  43. 【請求項４３】 検出器が蛍光検出器を含む請求項４２のシステム。
JP2001577505A 2000-04-14 2001-04-10 ターゲットプーリングを使用するスクリーニングアッセイ及びシステム Pending JP2003532871A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19732100P 2000-04-14 2000-04-14
US60/197,321 2000-04-14
PCT/US2001/011638 WO2001079522A2 (en) 2000-04-14 2001-04-10 Screening assay methods and systems using target pooling

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003532871A true JP2003532871A (ja) 2003-11-05

Family

ID=22728921

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001577505A Pending JP2003532871A (ja) 2000-04-14 2001-04-10 ターゲットプーリングを使用するスクリーニングアッセイ及びシステム

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20010036626A1 (ja)
EP (1) EP1280671A2 (ja)
JP (1) JP2003532871A (ja)
AU (1) AU2001253319A1 (ja)
CA (1) CA2407064A1 (ja)
WO (1) WO2001079522A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008224235A (ja) * 2007-03-08 2008-09-25 Nec Corp 創薬のマルチターゲットスクリーニング装置

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003008102A1 (en) * 2001-07-18 2003-01-30 The Regents Of The University Of Michigan Microfluidic gravity pump with constant flow rate
US8075778B2 (en) * 2003-03-25 2011-12-13 Massachusetts Institute Of Technology Fluid separation
US8016260B2 (en) 2007-07-19 2011-09-13 Formulatrix, Inc. Metering assembly and method of dispensing fluid
EP2163239A1 (de) * 2008-05-27 2010-03-17 Qiagen GmbH Produkte, die Biopartikel enthalten, Verfahren zu ihrer Herstellung
CN102159726A (zh) * 2008-09-05 2011-08-17 生命科技公司 用于核酸测序验证、校准和标准化的方法和系统
US8100293B2 (en) 2009-01-23 2012-01-24 Formulatrix, Inc. Microfluidic dispensing assembly
US9169515B2 (en) * 2010-02-19 2015-10-27 Life Technologies Corporation Methods and systems for nucleic acid sequencing validation, calibration and normalization
CN102174382B (zh) * 2011-01-18 2013-05-08 北京大学 一种实时监测生物气溶胶的系统和方法
US9927038B2 (en) 2012-08-10 2018-03-27 Massachusetts Institute Of Technology Pressure control in fluidic systems

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8702441D0 (en) * 1987-02-04 1987-03-11 Univ Strathclyde Cell screening
US5942443A (en) * 1996-06-28 1999-08-24 Caliper Technologies Corporation High throughput screening assay systems in microscale fluidic devices
US5804436A (en) * 1996-08-02 1998-09-08 Axiom Biotechnologies, Inc. Apparatus and method for real-time measurement of cellular response
EP1088229A4 (en) * 1998-06-25 2002-05-08 Caliper Techn Corp HIGH THROUGHPUT METHODS, SYSTEMS AND APPARATUS FOR CELL SCREENING TEST

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008224235A (ja) * 2007-03-08 2008-09-25 Nec Corp 創薬のマルチターゲットスクリーニング装置

Also Published As

Publication number Publication date
AU2001253319A1 (en) 2001-10-30
EP1280671A2 (en) 2003-02-05
US20010036626A1 (en) 2001-11-01
WO2001079522A3 (en) 2002-03-28
WO2001079522A2 (en) 2001-10-25
CA2407064A1 (en) 2001-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0876609B1 (en) Screening natural samples for new therapeutic compounds using capillary electrophoresis
Pode et al. Protein recognition by a pattern-generating fluorescent molecular probe
US6242209B1 (en) Cell flow apparatus and method for real-time measurements of cellular responses
Kraly et al. Microfluidic applications in metabolomics and metabolic profiling
US6558916B2 (en) Cell flow apparatus and method for real-time measurements of patient cellular responses
Sittampalam et al. High-throughput screening: advances in assay technologies
Zheng et al. High throughput assay technologies for ion channel drug discovery
Carnero High throughput screening in drug discovery
US6511815B1 (en) Method for quantitating competitive binding of molecules to proteins utilizing fluorescence polarization
Sklar et al. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening
WO1997022000A9 (en) Screening natural samples for new therapeutic compounds using capillary electrophoresis
US7236888B2 (en) Method to measure the activation state of signaling pathways in cells
Surviladze et al. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors
JP2003532871A (ja) ターゲットプーリングを使用するスクリーニングアッセイ及びシステム
EP1336101B1 (en) A method to measure the activation state of signaling pathways in cells
US20030013138A1 (en) Systems and methods for the analysis of proteins
US20060008849A1 (en) Methods for measuring chloride channel conductivity
JP4472879B2 (ja) ポリイオンを含む蛍光分極アッセイ
CN108467883A (zh) 一种三链dna分子信标结合纳米孔技术联用的抗体检测方法
Zheng et al. Screening technologies for ion channel targets in drug discovery
Englebienne High throughput screening: will the past meet the future?
Bene et al. Air bubbles Take the Stage in Flow Cytometric Drug Screening
Ganau et al. Proteomic Profiling and Predictive Biomarkers in Neuro-Traumatology and Neuro-Oncology
EP1974211B1 (en) Molecular identification through membrane-engineered cells
JP2003024064A (ja) レセプターと被検物質との結合反応を検出する方法