KR20170115858A - 줄기세포의 세포노화 검출용 키트 - Google Patents

줄기세포의 세포노화 검출용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 줄기세포의 세포노화(senescence) 검출용 키트, 검출 방법 및 세포노화 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명은 줄기세포 치료에 필수적인 줄기세포의 증식능, 분화능을 판단할 수 있는 세포노화 검출용 마커를 제공하며, 상기 마커를 이용하면 줄기세포의 세포노화를 정확하게 검출 할 수 있다.

Description

줄기세포의 세포노화 검출용 키트{Kit for Detecting Senescence of Stem cells}
본 발명은 줄기세포의 세포노화 검출용 키트에 관한 것이다.
각종 난치성 질환에 대해 기존의 치료 요법의 한계를 극복하려는 노력의 일환으로, 손상된 세포를 대체하고 재생시켜 본래 기능의 회복을 목표로 줄기세포를 이용한 재생 의학적 세포치료 연구가 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 특히 여러 줄기세포들 중 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)는 자가재생 (self-renewal) 능력과 다양한 조직의 세포로의 분화(differentiation) 능력을 지니며 면역거부반응을 억제시키고 체내 투여 시, 손상부위로 이동하여 손상된 세포를 대체하거나 다양한 성장인자 및 사이토카인들을 분비하여 질환의 억제 및 손상 부위의 재생을 촉진시킨다는 연구결과들을 토대로 매우 다양한 질환 치료에 적용하려는 노력이 활발하게 진행되고 있다(1-3).
중간엽줄기세포의 임상적용을 위해서는 무엇보다도 적은 수의 줄기세포로부터 체외에서 일련의 배양과정을 통해 치료효능을 보일 만큼의 많은 수의 세포를 확보하는 것이 핵심이며 이 과정 동안 줄기세포의 특성은 필수적으로 유지되어야 한다. 그러나 이를 위해 오랜 기간 동안 체외에서 배양이 필요한 데 배아줄기세포와 달리 체외 증식력이 제한적이어서 일정 횟수의 분열 이후에는 일반 체세포와 마찬가지로 세포노화(senescence)가 발생되며 세포의 증식률 감소 및 억제, 분화능력 감소 등과 같은 현상이 나타나게 되며 이로 인해 줄기세포의 생산성 및 품질, 치료 효능 및 안전성 등 여러 가지 측면에 있어서 중대한 영향을 미칠 수 있다(4-8).
줄기세포의 노화는 세포의 증식능력과 다분화능에 영향을 미치는 주요 원인으로 주목되고 있는 데, 줄기세포 치료제 생산에 있어서 줄기세포의 증식능력과 다분화능은 환자에 대한 치료 효능과 직접적으로 연결되는 문제이기 때문에 줄기세포의 노화판정은 줄기세포치료제의 개발 및 생산에 있어서 절대적인 파라미터라고 할 수 있다(9-12).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Mundra V, Gerling IC, Mahato RI. Mesenchymal stem cell-based therapy. Mol Pharm. 2013 Jan 7;10(1):77-89. Wang S, Qu X, Zhao RC. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 2012 Apr 30;5:19. Parekkadan B, Milwid JM. Mesenchymal stem cells as therapeutics. Annu Rev Biomed Eng. 2010 Aug 15;12:87-117. Stenderup K, Justesen J, Clausen C, Kassem M. Aging is associated with decreased maximal life span and accelerated senescence of bone marrow stromal cells. Bone. 2003 Dec;33(6):919-26. Bonab MM, Alimoghaddam K, Talebian F, Ghaffari SH, Ghavamzadeh A, Nikbin B. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 2006 Mar 10;7:14. Ryu E, Hong S, Kang J, Woo J, Park J, Lee J, Seo JS. Identification of senescence-associated genes in human bone marrow mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2008 Jul 4;371(3):431-6. Wagner W, Bork S, Horn P, Krunic D, Walenda T, Diehlmann A, Benes V, Blake J, Huber FX, Eckstein V, Boukamp P, Ho AD. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 2009 Jun 9;4(6):e5846. Wagner W, Ho AD, Zenke M. Different facets of aging in human mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part B Rev. 2010 Aug;16(4):445-53. Wagner W, Bork S, Lepperdinger G, Joussen S, Ma N, Strunk D, Koch C. How to track cellular aging of mesenchymal stromal cells? Aging (Albany NY). 2010 Apr;2(4):224-30. Li J, Pei M. Cell senescence: a challenge in cartilage engineering and regeneration. Tissue Eng Part B Rev. 2012 Aug;18(4):270-87. Boyette LB, Tuan RS. Adult Stem Cells and Diseases of Aging. J Clin Med. 2014 Jan 21;3(1):88-134. Castorina A, Szychlinska MA, Marzagalli R, Musumeci G. Mesenchymal stem cells-based therapy as a potential treatment in neurodegenerative disorders: is the escape from senescence an answer? Neural Regen Res. 2015 Jun;10(6):850-8.
본 발명자들은 재생의학적 세포 치료에 유용한 줄기세포의 노화를 정확하게 검출할 수 있는 신규한 마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 발굴된 마커인 비타민 D BP(vitamin D binding protein), 아디포넥틴(adiponectin), EGF(Epidermal Growth Factor) 및 FGF2(Fibroblast Growth Factor 2)는 세포노화를 정확하게 검출할 수 있는 마커임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 세포노화 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 세포노화 검출 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포노화 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 비타민 D BP(vitamin D binding protein), 아디포넥틴(adiponectin), EGF(Epidermal Growth Factor) 및 FGF2(Fibroblast Growth Factor 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드의 단편 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 줄기세포의 세포노화(senescence) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 재생의학적 세포 치료에 유용한 줄기세포의 세포노화를 정확하게 검출할 수 있는 신규한 마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 줄기세포의 세포배양액 내 분비되는 비타민 D BP, 아디포넥틴, EGF 및 FGF2 단백질이 세포노화를 정확하게 검출할 수 있는 마커임을 규명하였다.
본 명세서에서 용어 “세포노화”는 세포가 일정 수의 분열 후에 비가역적으로(irreversible) 세포의 분열이 중지된 상태를 의미한다. 세포노화는 증식과 분열능력은 저하되어 있지만 세포의 신진대사가 상당기간 유지된다는 점에서 세포사멸(cell death)과 차이가 있다(윤계숙, 분자세포생물학뉴스 웹진 2011).
본 발명의 마커는 세포노화에 대한 지표가 될 수 있으며, 세포노화의 발생 및 발전의 검출에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “검출”은 생물학적 시료(예컨대, 세포 또는 세포배양액) 내 하나 이상의 마커의 존재, 부재 또는 양을 확인하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트이다.
본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.
본 발명의 검출용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 비타민 D BP, 아디포넥틴, EGF 및 FGF2로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 “상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.
프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에서 확인할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 마커 중 하나인 비타민 D BP은 GenBank 접근번호 NR_001017536 또는 NM_000583, 아디포넥틴은 GenBank 접근번호 NR_046083, EGF은 GenBank 접근번호 NM_001963, FGF2은 GenBank 접근번호 NM_002006에 뉴클레오타이드 서열이 개시되어 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
본 발명의 줄기세포의 세포노화 검출용 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커들의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.
상술한 본 발명의 마커들의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 장암 여부를 판단할 수 있다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생시료는 줄기세포이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 중간엽줄기세포는 골수유래 중간엽줄기세포이다.
본 명세서에서 용어 “중간엽줄기세포”는 골아세포(osteoblast), 연골세포(chondrocyte), 근세포(myocyte) 및 지방세포(adipocyte)와 같은 다양한 세포 형태로 분화할 수 있는 다분화능 기질 세포(multipotent stromal cell)이다(https://en.wikipedia.org/wiki/Mesenchymal_stem_cell). 본 발명의 중간엽줄기세포는 골수, 지방조직, 제대혈, 탯줄, 양막, 양수, 양수 내 태아 등으로부터 유래한 모든 중간엽줄기세포를 포함한다.
프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 세포노화를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 세포노화 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 초기(primary) 줄기세포)보다 강하게 나오는 경우에는 세포노화로 판정한다.
본 명세서에서 용어 “초기 줄기세포”는 인체로부터 분리한 계대 1의 줄기세포를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 줄기세포의 세포노화 검출용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다.
본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 검출용 키트를 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 줄기세포)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.
따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.
mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 생시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(초기 줄기세포)보다 높게 나오는 경우에는 세포노화로 판정한다.
따라서 본 발명의 세포노화 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 세포노화 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.
본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 세포노화를 검출하는 데 이용될 수 있다.
이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.
본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포배양액(는 세포 시료 분해물)을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포배양액(는 세포 시료 분해물)을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.
상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 비타민 D BP, 아디포넥틴, EGF 및 FGF2로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 변형예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.
상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 세포노화를 검출할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우에는 세포노화로 판정한다.
본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 마커들은 노화된 줄기세포에서 고발현 되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 많은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커들이 초기 줄기세포와 비교하여 1.2-5.0 배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 세포노화로 판정한다. 예컨대, 비타민 D BP(GenBank Accession Number; NM_000583)는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 초기 줄기세포와 비교하여 2.0배 내지 5.0배, 2.3배 내지 5.0배, 2.6배 내지 5.0배, 2.6배 내지 4.7배, 2.6배 내지 4.4배, 2.6배 내지 4.1배 또는 2.6배 내지 3.8배 정도 고발현되는 경우 세포노화로 판정한다. 아디포넥틴(GenBank Accession Number; NR_046083)은 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 초기 줄기세포와 비교하여 1.1배 내지 2.5배, 1.3배 내지 2.5배, 1.4배 내지 2.5배, 1.4배 내지 2.3배, 1.4배 내지 2.1배, 1.4배 내지 1.9배 또는 1.4배 내지 1.7배 정도 고발현되는 경우 세포노화로 판정한다. EGF(GenBank Accession Number; NM_001963)는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 초기 줄기세포와 비교하여 1.5배 내지 4.5배, 1.8배 내지 4.5배, 2.1배 내지 4.5배, 2.4배 내지 4.5배, 2.4배 내지 4.2배 또는 2.4배 내지 3.9배 정도 고발현되는 경우 세포노화로 판정한다. FGF2(GenBank Accession Number; NM_002006)는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 초기 줄기세포와 비교하여 2.0배 내지 5.0배, 2.3배 내지 5.0배, 2.6배 내지 5.0배, 2.6배 내지 4.7배, 2.6배 내지 4.4배, 2.6배 내지 4.1배 또는 2.6배 내지 3.8배 정도 고발현되는 경우 세포노화로 판정한다(참조; 표 8).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 중간엽줄기세포는 골수유래 중간엽줄기세포이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 줄기세포 내 비타민 D BP(vitamin D binding protein), 아디포넥틴(adiponectin), EGF(Epidermal Growth Factor) 및 FGF2(Fibroblast Growth Factor 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열 또는 단백질의 발현을 검출하는 단계를 포함하는 세포노화(senescence) 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 검출 방법은 상기 검출용 키트와 검출 방식이 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 세포노화(senescence) 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 비타민 D BP(vitamin D binding protein), 아디포넥틴(adiponectin), EGF(Epidermal Growth Factor) 및 FGF2(Fibroblast Growth Factor 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 뉴클레오티드 서열 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계, 상기 뉴클레오티드서열 또는 단백질의 고발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 세포노화 억제제로 판정한다.
본 발명의 방법에 따르면, 우선 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 바람직하게는, 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포는 줄기세포이다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시료”는 본 발명의 마커의 발현량에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이어, 시료가 처리된 세포에서 본 발명의 마커의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 상기 기재한 바와 같이 실시할 수 있으며, 측정 결과, 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 고발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 세포노화 억제제로 판정될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 줄기세포의 세포노화(senescence) 검출용 키트, 검출 방법 및 세포노화 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 줄기세포 치료에 필수적인 줄기세포의 증식능, 분화능을 판단할 수 있는 세포노화 검출용 마커를 제공한다.
(c) 본 발명의 마커를 이용하면 줄기세포의 세포노화를 정확하게 검출 할 수 있다.
도 1은 중간엽줄기세포의 계대배양 일정을 나타낸다.
도 2는 중간엽줄기세포의 연속 계대배양에 따른 증식률(Cumulative Population Doubling Level)을 나타낸다.
도 3은 중간엽줄기세포의 연속 계대배양에 따른(M0401140106)의 골아세포 및 지방세포로의 분화능을 나타낸다.
도 4는 중간엽줄기세포(M0401140106)의 연속 계대배양에 의한 세포노화를 SA-β-gal(Senescence-associated beta-galactosidase) 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 중간엽줄기세포(M0401140113)의 연속 계대배양에 의한 세포노화를 SA-β-gal(Senescence-associated beta-galactosidase) 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 중간엽줄기세포(M0401140210)의 연속 계대배양에 의한 세포노화를 SA-β-gal(Senescence-associated beta-galactosidase) 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 중간엽줄기세포(M0401140213)의 연속 계대배양에 의한 세포노화를 SA-β-gal(Senescence-associated beta-galactosidase) 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 공여자들 세포의 SA-β-gal 활성을 계대별로 정량화한 그래프를 나타낸다.
도 9는 중간엽줄기세포(M0401140106)의 연속 계대배양 시 노화 관련 유전자인 Lamp1, LC3Ⅱ, p16, p21 및 p27의 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 중간엽줄기세포(M0401140113)의 연속 계대배양 시 노화 관련 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 중간엽줄기세포(M0401140210)의 연속 계대배양 시 노화 관련 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 중간엽줄기세포(M0401140213)의 연속 계대배양 시 노화 관련 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 13은 중간엽줄기세포(M0401140106)의 세포배양액의 항체 분석 결과를 나타낸다.
도 14는 중간엽줄기세포(M0401140113)의 세포배양액의 항체 분석 결과를 나타낸다.
도 15는 중간엽줄기세포(M0401140210)의 세포배양액의 항체 분석 결과를 나타낸다.
도 16은 중간엽줄기세포(M0401140213)의 세포배양액의 항체 분석 결과를 나타낸다.
도 17a 내지 17j는 공여자별 세포배양액의 항체분석 결과에서 단백질 분비량의 양적 변화를 나타낸다.
도 18은 세포노화에 따른 비타민 D BP(vitamin D binding protein)의 분비량을 나타낸다.
도 19는 세포노화에 따른 아디포넥틴(adiponectin)의 분비량을 나타낸다.
도 20은 세포노화에 따른 FGF2(Fibroblast Growth Factor 2)의 분비량을 나타낸다.
도 21은 세포노화에 따른 EGF(Epidermal Growth Factor)의 분비량을 나타낸다.
도 22는 세포노화에 따른 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)의 분비량을 나타낸다.
도 23은 세포노화에 따른 IGF-1(Insulin-like Growth Factor 1)의 분비량을 나타낸다.
도 24는 세포노화에 따른 TGF-β1(Transforming Growth Factor beta 1)의 분비량을 나타낸다.
도 25는 세포노화에 따른 HGF(Hepatocyte Growth Factor)의 분비량을 나타낸다.
도 26a 내지 26d는 선별된 노화마커의 검증을 위한 추가 공여자별 중간엽줄기세포의 증식률을 분석한 결과를 나타낸다.
도 27a 내지 27c는 추가 공여자별 중간엽줄기세포의 비타민 D BP의 분비량을 나타낸다.
도 28a 내지 28c는 추가 공여자별 중간엽줄기세포의 아디포넥틴의 분비량을 나타낸다.
도 29a 내지 29c는 추가 공여자별 중간엽줄기세포의 EGF의 분비량을 나타낸다.
도 30a 내지 30c는 추가 공여자별 중간엽줄기세포의 FGF2의 분비량을 나타낸다.
도 31a 내지 31c는 추가 공여자별 중간엽줄기세포의 VEGF의 분비량을 나타낸다.
도 32a 내지 32c는 추가 공여자별 중간엽줄기세포의 IGF-1의 분비량을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
골수유래 중간엽줄기세포 노화유도
골수유래 중간엽줄기세포의 분리 및 배양
노화유도에 사용된 골수유래 중간엽줄기세포의 공여자는 다음 표 1과 같다:
제조번호 연령 성별
M0401140106 73 여
M0401140113 75 남
M0401140210 75 여
M0401140213 67 여
공여자를 국소 마취하고 골반뼈 (pelvis)에서 골수흡입침으로 골수를 채취, 헤파린이 함유된 유리시험관 (heprin tube)에 담아 제조실로 운반한 골수혈액에 인산완충용액 (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS)을 첨가한 후, 혼합용액을 동량의 Ficoll(HISTOPAQUE-1077) 용액 위로 천천히 흘려보낸 후 2,000 rpm으로 20분간 밀도구배 원심분리(density gradient centrifugation)를 실시하여 Ficoll 위층의 상등액 중 단핵세포층을 회수한 후 DPBS를 첨가하고 1,800 rpm으로 5분간 원심 분리하여 단핵세포 (mononuclear cells) 만을 회수하였다. 회수된 단핵세포를 DPBS로 다시 세척한 후 10% FBS(fetal bovine serum) 및 젠타마이신(gentamicin, 20 ㎍/㎖)이 포함된 DMEM 배지에 부유시키고 배양용기(T-75 flask)에 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 5-7일동안 배양하고, 새로운 배지로 교체하여 용기 바닥에 부착하지 않은 세포들을 제거하고 추가 배양한 후, 부착하여 증식하는 중간엽줄기세포 콜로니(colony)들을 회수하고 DMEM 배지에 부유하여 새로운 배양용기에 접종[계대(passage) 0] 배양하였다.
중간엽줄기세포의 노화유도
중간엽줄기세포가 분비하는 노화관련 인자 (노화마커)를 동정하기 위해서는, 각 계대별로 동일한 조건(배양기간 등)으로 배양하여 이로부터 얻은 세포배양액 (conditioned medium)을 대상으로 분비인자의 계대에 따른 증감양상을 비교하여야 한다. 그러나 각 계대별로 세포를 접종한 후 세포증식에 따라 배양 세포가 배양용기의 면적의 70-80% 이상 차지하는 조건을 기준으로 배양기간을 3 또는 4일로 계대배양 하는 방법은 각 계대별 세포의 배양상태가 틀리고 특히 각 세포배양액 간 분비인자의 양적 비교가 불가능하다. 따라서 본 연구진은 새롭게 배양기간을 모든 계대에서 세포증식 양상에 관계없이 동일하게 맞추어 연속적으로 계대배양을 실시하여 추가로 중간엽줄기세포의 노화를 유도시켰다.
각 계대별 배양기간은 1주일로 고정하여 세포를 배양하였는데, 구체적으로 1 × 106 개의 세포를 T-175 플라스크에 접종(배양배지 30 ㎖), 배양하고 2, 4일째 배양배지를 교체하고 3일 동안 추가 배양한 후 다음 계대로 계대배양 하였다(도 1). 이때 각 계대별 세포가 분비하는 분비인자의 양적 비교를 위하여 마지막 3일 동안 배양한 세포배양액(MSC-conditioned medium)은 동결 저장하여 추후 분석에 사용하였다.
상기의 방법대로 공여자 4명의 중간엽줄기세포를 계대 1에서 15까지 배양한 결과, 모든 세포에서 계대가 증가함에 따라 증식률이 점진적으로 감소하는 양상을 보였는데, M0401140106은 계대 13부터, M0401140113은 계대 14부터, M0401140210은 계대 12부터 그리고 M0401140213은 계대 15부터 뚜렷한 증식률의 감소가 확인되었다(도 2).
이상의 연속적인 계대배양을 통해 계대가 증가할수록 중간엽줄기세포가 점차적으로 증식률이 감소되는 현상을 보였고 이는 노화가 점차적으로 유도됨에 따른 현상으로 추정된다.
노화세포 특성분석
(가) 세포모양
연속적인 계대배양에 의한 노화유도에서 형태학적 변화 양상은, 배양 초기 대부분의 세포가 중간엽줄기세포의 전형적인 모양인 섬유아세포(fibroblast)와 유사한 길쭉한 방추형의 형태를 가지는 반면에 연속적인 계대배양으로 인해 배양 후기에서는 점차 크고 넓적한 형태로 변하며 이와 함께 미세한 돌기와 과립(granule)이 많아지는 것을 확인하였다. 계대별 배양기간을 1주일로 고정시켜 배양한 세포들도 마찬가지로 계대가 증가할수록 세포의 모양이 점차 크고 넓적한 형태로 변화는 것을 확인하였다.
(나) 세포표현형
중간엽줄기세포는 일반적으로 특이 표면항원(specific surface antigen)으로서 CD105, CD73 및 CD90을 발현한다. 따라서 본 시험에서는 연속적인 계대배양에 따른 특이 표면항원 CD105 및1 CD73의 발현양상을 각각의 특이적인 항체(FITC conjugated anti-CD105 Antibody 및 PE-conjugated anti-CD73 Antibody)를 이용한 유세포 분석(flow cytometry analysis)을 통하여 확인하였다.
그 결과, 모든 계대의 여러 공여자 세포들에서의 CD105 및 CD73 양성 세포는 99% 이상이었다. 즉, 연속적인 계대배양에 의한 노화유도에서는 중간엽줄기세포의 특이 표면항원 발현 양상의 변화는 없음을 확인하였다.
(다) 분화능
중간엽줄기세포의 대표적인 특징 중 하나로 시험관 상에서 골아세포, 지방세포, 연골세포 및 신경세포 등으로 분화할 수 있는 다능성(multipotency)을 보유하고 있다. 이에 본 시험에서는 연속적인 계대배양이 골아세포 및 지방세포로의 분화능에 미치는 영향을 확인하였다. 골아세포 분화는 중간엽줄기세포를 분화배지 [고농도-글루코오스 DMEM, 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 0.1 μM 덱사메타손(dexamethasone), 10 mM β-글리세롤 인산염, 50 μM L-아스코르브산]에서 7-14일 동안 분화를 유도하고 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 염색법을 이용하여 분화여부를 확인하였다. 지방세포 분화는 중간엽줄기세포를 지방세포 분화유도배지[고농도-글루코오스 DMEM, 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 1 μM 덱사메타손, 10 ㎍/㎖ 인슐린, 100 μM 인도메타신, 0.5 mM 메틸 이소부틸-크산틴(methyl isobutyl-zanthine)]로 72시간 동안 배양하여 분화를 유도한 후, 지방세포 분화유지배지(고농도 글루코오스 DMEM, 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 10 ㎍/㎖ 인슐린)를 이용하여 24시간 배양하였으며 지방세포 분화유도배지와 지방세포 분화유지배지 교체를 총 3회 반복하여 지방세포로의 분화를 유도하였다. 지방세포 분화여부는 오일 레드 O에 의한 지질염색법을 이용하여 확인하였다.
골아세포 및 지방세포로의 분화유도 후 염색 결과, 모든 공여자의 세포에서 골아세포 및 지방세포 분화능이 관찰되었다. 특히 비록 노화 세포로 추정되는 후기 계대의 세포에서도 분화능이 관찰되었으나, 초기 계대의 세포에 비해 계대가 증가됨에 따라 각 세포로의 분화능이 점차적으로 감소하는 경향을 확인하였다.
이상의 결과들에서 중간엽줄기세포의 연속적인 계대배양 시 특이표면항원의 발현양상은 변화가 없으나 계대가 증가할수록 증식률이 감소하며 골아세포 및 지방세포로의 분화능이 점차적으로 감소하는 경향을 보였다. 즉 연속적인 계대배양을 통해 노화가 유도되는 과정 중 중간엽줄기세포의 자가재생능(self-renewability)과 분화능이 감소함을 확인할 수 있었다.
골수유래 중간엽줄기세포 노화검증
노화 관련 β-갈락토시다아제(Senescence-associated beta-galactosidase)
연속적 계대배양에 의한 중간엽줄기세포의 노화유도 여부 검증을 위해, 노화세포에서 특징적으로 발현되며 일반적으로 잘 알려진 노화 표지마커 중의 하나인 노화 관련 β-갈락토시다아제(SA-β-gal)의 활성을 상용의 노화 β-갈락토시다아제염색 키트(Cell signaling technology사)를 사용하여 확인하였다. SA-β-gal 염색결과, 대부분의 줄기세포 초기 계대에서 전체 세포 중 소수의 세포가 염색되었으며 염색된 세포내에서도 일부분만 염색됨을 확인하였다. 그러나 연속적인 배양에 따라 계대가 증가할수록 SA-β-gal 염색에 양성인 세포들이 증가하였으며 세포 증식률이 감소되는 후기 계대에서는 대부분의 세포가 염색됨을 확인하였다(도 4 내지 7).
다음으로 SA-β-gal 활성을 정량화하여 계대별로 비교해보았다(도 3). 구체적으로 각 계대의 세포를 M-PER(Mammalian Protein Extraction Reagent)로 용해시켜 β-갈락토시다아제 분석 시약을 넣고 30분 동안 반응시킨 후 분석 종료 용액(assay stop solution)을 넣어 반응을 중지시키고 405 ㎚에서 흡광도를 측정하여 활성을 측정하였다. 그 결과, 공여자 세포 모두 SA-β-gal 활성이 계대가 증가할수록 점진적으로 증가하며 계대 15에서는 계대 1에 비해 최소 3배 이상 차이를 보였다. 이러한 결과는 상기의 SA-β-gal 염색 결과와 일치한다.
이상의 결과를 통해 비록 초기 계대의 세포들 중 소수의 일부 세포가 SA-β-gal 염색 반응이 나타났으나 연속적인 계대배양을 거친 후기 계대의 세포에서는 전체 세포가 염색되었으며 이와 유사하게 SA-β-gal 활성 또한 증가된 것을 볼 때 이 시기의 세포들은 전반적으로 노화가 유도되었음을 확인할 수 있다.
노화관련 유전자 발현
연속적인 계대배양에 의한 중간엽줄기세포의 노화 유도여부를 검증하기위해, 세포노화에 따라 발현이 증가하는 유전자들의 발현양상을 RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 방법으로 확인하였다. 자식작용(Autophagy)은 세포 내 고분자 물질과 세포소기관을 분해하는 고도로 조절된 리소좀의 경로로 세포노화 과정 중 활성화되는 것으로 알려져 있는 바, 자식작용의 주요 마커인 Lamp1 및 LC3Ⅱ의 발현양상을 확인하였다. 이와 더불어 노화에 따라 발현이 증가되는 CDK(cyclin dependant kinase) 억제제인 p16, p21 및 p27 발현양상도 함께 확인하였다. 구체적으로 각 공여자 별로 각각의 계대의 세포에서 RNA를 추출하고 이를 cDNA 합성 키트(Gendepot사)로 cDNA를 합성하였고 이를 주형으로 표 3과 같은 프라이머를 이용하여 95℃ 5분으로 시작하여, 95℃ 60초, 각 프라이머 별 어닐링 온도 30초, 72℃ 30초로 각 프라이머 별 사이클 수로 증폭하여 PCR 산물을 만들어 확인하였다.
프라이머 서열(5‘-3’) 어닐링 온도
(℃)		 사이클 산물 크기
(bp)
GAPDH 정방향 ACCTGCCGCCTGGAGAAACC 62 25 383
역방향 GACCATGAGGTCCACCACCCTG
P16 정방향 CTTCCTGGACACGCTGGT 55 35 138
역방향 GCATGGTTACTGCCTCTGGT
P21 정방향 GGAAGACCATGTGGACCTGT 58 27 403
역방향 ATGCCCAGCACTCTTAGGAA
P27 정방향 AGTTCGGCTCTGTGAACACC 58 27 336
역방향 CCACAGTACTGCCACCACAC
Lamp1 정방향 AGAGACTGAAAACCTGTTTGGC 62 34 108
역방향 AAATGGCTGACATCCTACATGAC
LC3Ⅱ 정방향 ATGCCGTCCGAGAAGACCTTC 60 30 377
역방향 TTACACAGCCATTGCTGTC
그 결과, 모든 공여자의 세포에서 연속적인 계대배양에 따라 자식작용 활성화 관련 유전자(Lamp1 및 LC3II)와 CDK 억제제 유전자(p16, p21 및 p27)들의 발현이 점진적으로 증가하였으며 각 공여자의 후기 계대에서는 각각의 유전자 발현이 최대로 증가된 상태임을 확인하였다(도 9 내지 12).
중간엽줄기세포 노화관련 바이오마커 스크리닝
정상배양 조건의 세포배양액에서의 항체 분석
FBS가 포함된 정상 배양조건에서의 중간엽줄기세포가 분비하는 노화 관련 인자를 스크리닝 하고자 R&D systems의 Proteome Profiler™ human XL 사이토카인 분석 키트를 사용하였다. 본 분석 키트는 102개의 인간 수용성 단백질(사이토카인, 케모카인, 성장 인자 등)들을 동시에 검출할 수 있고 시료와 포획 항체가 결합된 막을 4℃ 하룻밤동안 반응시키면 시료내의 단백질이 막 상의 특이적 포획 항체와 결합하게 되고 여기에 비오틴이 결합된 추가적인 특이적 검출 항체를 결합시키고 이후 비오틴에 특이적으로 결합하는 스트렙타비딘-결합 HRP에 의해 단백질을 검출할 수 있게 된다. 이와 같은 이른바 샌드위치 방식은 분석에서 보다 특이적으로 단백질을 검출할 수 있는 장점이 있다.
각 공여자별 및 각 계대별로 동일한 조건으로 배양하고자 배양기간을 1주일로 고정하였고 이때 마지막 3일 동안 세포를 배양시킨 세포배양액을 시료로 하여 항체 분석을 수행하였다.
M0401140106의 계대 1, 5, 11 및 14에서의 세포배양액을 대상으로 분석을 실시한 결과, 초기 계대에서 후기 계대로 갈수록 배지 내에서의 양적 변화(분비량의 감소 혹은 증가)를 보이는 단백질들을 확인할 수 있었다(도 13 및 표 3). 양적 변화가 확인된 단백질들 중 대부분이 초기 계대에서 검출되지 않거나 낮은 양으로 검출되다가 계대가 증가됨에 따라 분비량이 증가함을 보였다. 반면에 VEGF (Vascular endothelial growth factor)는 계대 1에 비해 계대 5에서 양적 증가가 관찰되었으나 계대 11에서는 감소하였고 계대 14에서 그 양이 더 감소되는 양상을 보였다. FGF7(Fibroblast growth factor 7)의 경우도 계대 5에서는 계대 1에 비해 분비량이 증가하였으나 이후 계대에서는 검출되지 않았다.
Figure pat00001
M0401140113의 계대 1, 5, 11 및 14에서의 분석 결과 또한 M0401140106과 유사한 양상을 보였다(도 14 및 표 4). VEGF의 경우, 계대가 증가함에 따라 검출되는 양이 점차적으로 감소하였고 FGF-7은 계대 1에서만 검출되고 나머지 계대에서는 검출되지 않았다. 이외 에 나머지 양적 변화가 확인된 단백질들은 M0401140106과 마찬가지로 계대가 증가함에 따라 분비량이 증가됨을 관찰되었다.
Figure pat00002
M0401140210의 분석 결과는 M0401140106 및 M0401140113 결과와는 양적 변화를 보이는 단백질들의 일부 차이가 있었으나 아디포넥틴, EGF(epithermal growth factor), FGF2 및 비타민 D BP(binding protein)의 경우 계대 1에서는 검출되지 않았고 계대가 증가함에 따라 검출되며 분비량이 증가하는 결과는 일치하였다. 또한 VEGF의 경우, 계대가 증가함에 따라 분비량이 감소하는 결과가 일치하였다 (도 15 및 표 5).
Figure pat00003
M0401140213의 분석 결과는 상기 3로트 결과와 마찬가지로 아디포넥틴(adiponectin), EGF, FGF2 및 비타민 D BP의 경우 계대 1에서는 검출되지 않았으나 계대가 증가함에 따라 검출되고 그 분비량이 증가하는 결과는 모두 일치하였다. 마찬가지로 VEGF는 후기 계대에서 분비량이 감소하는 결과가 일치하였다(도 16 및 표 6).
Figure pat00004
이상의 공여자 4명의 계대별 세포배양액에서의 단백질의 분비양상을 비교한 항체 분석 결과에서 계대가 증가할수록 분비량이 증가하거나 감소하는 단백질들을 확인하였고 이러한 단백질들 중 모든 공여자에서 지방분화와 관련이 된 아디포넥틴, 비타민 D3 및 비타민 D 대사물과 결합하여 이를 운반하는 역할을 하는 비타민 D BP, 줄기세포 성장에 관여하는 EGF와 FGF2는 공통적으로 계대 1에서 전혀 검출되지 않거나 약하게 검출되었고 노화가 유도되는 시기(계대 11 또는 14)에서는 분비량이 급격하게 증가하는 양상을 보였다. 반면에 세포성장과 혈관형성에 관여하는 VEGF는 초기 계대에 비해 노화가 유도되는 후기 계대에서의 분비량이 점차적으로 감소하는 양상을 보였다(도 17a 내지 17e). 이밖에도 MMP(matrix metalloproteinase)의 유도제로 암 및 염증에 관련이 된 EMMPRIN(CD147), FGF-패밀리 중 하나로 세포성장에 관여하는 FGF-19, 골아세포에 영향을 미치는 오스테오폰틴(Osteopontin), PF4(platlet factor 4), 세포 주기 정지(cell cycle arrest)에 관여하는 RBP4(Retinol binding protein 4) 등 또한 노화가 유도되는 후기 계대에서 단백질의 분비량이 초기 계대에 비해 증가함을 확인하였다(도 17f 내지 17j). 따라서 이러한 단백질들이 잠재적으로 중간엽줄기세포의 노화여부를 판정할 수 있는 노화관련 마커로서의 적용 가능성을 확인하고자 추가적인 실험을 진행하였다.
마이크로어레이
중간엽줄기세포의 세포배양액을 대상으로 항체 분석을 이용한 노화관련 마커스크리닝 결과를 유전자 발현 수준에서 확인하기 위해 마이크로어레이를 수행하였다. 배양 중인 계대 1, 5 및 14의 세포를 대상으로 각각 총 RNA를 분리하여 cDNA를 합성하고 Affymetrix GeneChip®휴먼 진 2.0 ST 분석 시스템을 이용하여 계대별 유전자 발현 양상을 확인하였다. 시료는 M0401140106 세포를 대상으로 위의 항체 분석에 사용되었던 계대 1(P1,초기), 5(P5, 중기) 및 14(P14, 후기)의 세포를 사용하여 MSCs가 계대 배양 또는 노화가 진행되면서 중간엽줄기세포의 유전자들이 어떻게 변하게 되는 지 마이크로어레이를 통해 비교 분석하였다.
그 결과, 상기의 항체 분석 결과와 유사하게 아디포넥틴, EGF, FGF2 및 비타민 D BP 유전자는 각각 계대 1 대비 5 및 계대 1 대비 14의 세포에서 그 발현이 점진적으로 증가하였다. 아디포넥틴 유전자의 경우 계대 5의 세포에서는 계대 1에 비해 발현이 1.15배 정도 증가하였고 계대 14의 세포에서는 발현이 계대 1에 비해 1.81 배 더 증가하였다. EGF 유전자의 경우 계대 1과 5 사이의 발현 차이가 없으나 계대 14의 세포에서는 계대 1에 비해 2.98배 발현이 더 증가하였다. FGF2 유전자는 계대 5 세포에서 계대 1에 비해 발현이 1.40배 정도 증가하였고 계대 14의 세포에서는 계대 1에 비해 발현이 3.11배 더 증가하였다. 비타민 D BP 유전자는 계대 5 세포에서 계대 1에 비해 발현이 1.56배 정도 증가하였고 계대 14의 세포에서는 계대 1에 비해 발현이 3.18배 더 증가하였다. 이와는 반대로 VEGF와 RBP4의 유전자는 계대 1에 비해 계대 5와 14에서 발현이 감소하는 양상을 보였다.
이상의 항체 분석과 마이크로어레이 결과를 통해 위와 같은 인자들이 잠재적으로 중간엽줄기세포의 노화여부를 판정할 수 있는 노화관련 마커로 추정되어 이를 확인하고자 각 계대의 세포배양액을 대상으로 각 인자의 분비량 변화양상을 확인하였다.
Gene ProbeID Gene Accession Gene Symbol P1 P5/P1 P14/P1 Gene Description UniGene ID Chromosome
Adiponectin 16698122 NR_046083 ADIPOR1 1 1.49161 1.58247 adiponectin receptor 1 Hs.740387 chr1
16746696 ENST00000357103 ADIPOR2 1 1.04158 1 adiponectin receptor 2 Hs.371642 chr12
16949397 ENST00000412955 ADIPOQ 1 1.15808 1.81677 adiponectin, C1Q and collagen domain containing Hs.80485 chr3
EGF 16862721 NM_001410 MEGF8 1 1 1 multiple EGF-like-domains 8 Hs.132483 chr19
16969729 NM_001963 EGF 1 1.01234 2.98444 epidermal growth factor Hs.419815 chr4
17000724 ENST00000230990 HBEGF 1 1.26395 2.71357 heparin-binding EGF-like growth factor Hs.799 chr5
17046135 ENST00000275493 EGFR 1 1.64756 3.71482 epidermal growth factor receptor Hs.488293 chr7
FGF2 16970404 NM_002006 FGF2 1 1.40718 3.11808 fibroblast growth factor 2 (basic) Hs.284244 chr4
VEGF 16726311 NM_001243733 VEGFB 1 -1.11857 -1.24072 vascular endothelial growth factor B Hs.732095 chr11
16981730 NM_005429 VEGFC 1 -1.01365 -1.18045 vascular endothelial growth factor C Hs.435215 chr4
17009093 NM_001025366 VEGFA 1 -1.17461 -1.30461 vascular endothelial growth factor A Hs.73793 chr6
Vit D 16763764 NM_001017536 VDR 1 1.48125 1.48125 vitamin D (1,25- dihydroxyvitamin D3) receptor Hs.524368 chr12
16976676 NM_000583 GC 1 1.56498 3.18517 group-specific component (vitamin D binding protein) Hs.418497 chr4
ELISA
각 공여자의 계대별 세포배양액에서 확인된 노화관련 마커로 추정되는 단백질들과 문헌조사를 통해 노화와 관련성이 있다고 추정되는 단백질들을 대상으로 R&D system사의 ELISA 키트로 정량하여 계대별 각 단백질의 분비량 변화 양상을 확인하였다.
(1) 비타민 D 결합 단백질(Vitamin D binding protein)
계대 1, 2, 3의 세포배양액에서는 공통적으로 비타민 D BP의 정량이 불가하였다 (156 pg/㎖ 미만). 공여자마다 비타민 D BP ELISA 키트로 정량이 되기 시작하는 계대의 차이가 있지만 연속적인 계대배양에 따라 계대가 증가할수록 분비량이 점차적으로 증가하는 양상을 보여 노화가 유도된 계대 15에서는 각각 공여자 별로 분비량이 최대임을 확인하였다(도 18).
(2) 아디포넥틴(Adiponectin)
아디포넥틴의 경우, 공통적으로 계대 10까지의 세포배양액에서는 정량이 불가하였고(검출한계 62.5 pg/㎖ 이상), 공여자 별로 계대 11 또는 12부터 분비 단백질의 정량이 가능하였으며 이후 계대에서는 대체적으로 분비량이 급격하게 증가되며 계대 15에서는 분비량이 1000 pg/㎖의 농도를 유지하고 있음을 확인 할 수 있었다(도 19).
(3) FGF2
FGF2의 경우, 공통적으로 계대 8까지의 세포배양액에서는 정량이 불가하였고(검출한계 15.6 pg/㎖ 이상), 공여자 별로 계대 9 또는 10부터 분비 단백질의 정량이 가능하였다. 비록 분비량은 앞서 확인된 비타민 D BP 및 아디포넥틴의 분비량보다는 적지만 마찬가지로 이후 연속적인 계배배양에 따라 후기 계대로 갈수록 분비량이 점차적으로 증가하는 양상을 보였고 노화가 유도된 계대 15에서는 각각 공여자 별로 분비량이 최대임을 확인하였다(도 20).
(4) EGF
EGF는 아디포넥틴과 FGF2와 유사하게 비교적 늦은 계대 10까지 세포배양액에서 정량이 불가하였고(검출한계 3.91 pg/㎖ 미만), 공여자 별로 계대 11 또는 12부터 분비 단백질의 정량이 가능하였다. 이후 계대에서는 대체적으로 분비량이 급격하게 증가되며 계대 15에서는 분비량이 600 pg/㎖의 농도 이상을 유지하였다(도 21).
이와 같이 노화가 유도되는 후기 계대에서의 세포배양액 내의 비타민 D BP, 아디포넥틴, FGF2 및 EGF의 농도 증가 결과는 항체 분석에서 확인된 계대 증가에 따른 각 단백질의 스팟 세기 증가 양상과 유사하였다. 따라서 이들 단백질들을 노화를 판정할 수 있는 마커로서의 사용 가능성이 높은 것으로 추정된다.
(5) VEGF
기존의 항체 분석 결과와 마찬가지로, 모든 공여자에서 공통적으로 계대가 증가할수록 VEGF의 분비량이 점차적으로 감소하여 노화가 유도된 계대 14에서는 세포배양액 내 VEGF가 각각 최저치의 농도가 검출되었다(도 22). 따라서 VEGF 분비량의 감소가 노화를 판정할 수 있는 마커로서의 가능성이 있다. 그러나 M0401140106 세포는 항체 분석과 마찬가지로 배양 도중 계대 5와 계대 11에서 갑자기 VEGF의 농도가 증가하였다가 이후 감소하는 양상을 보이고 나머지 공여자 또한 두드러지지는 않지만 이와 유사하게 배양 도중 농도가 일시적으로 증가하였다가 감소하는 경향을 보이기때문에 이와 같은 분비량의 편차로 인해 노화 판정 기준농도를 설정하기에는 어려운 단점이 있어 노화마커로 이용하기에는 부적절하다.
(6) IGF-1, TGF-β1 및 HGF
여러 문헌에서 세포의 노화에 관련하는 것으로 알려진 IGF-1(insulin-like growth factor-1), TGF-β1 (Tumor growth factor-beta1) 및 HGF (hepatocyte growth factor)의 계대별 분비양상을 확인해보았다. IGF-1의 경우, 모든 공여자의 세포에서 계대 증가에 따라 분비량이 증가되거나 감소되는 경향성 없이 계대 별 분비량 편차가 컸다(도 23). TGF-β1은 계대 1에 비해 노화가 유도된 후기 계대의 세포에서 분비량이 증가되었으나 계대 1부터 분비량이 증가되기 시작한 계대 이전까지의 분비량 변화양상은 공여자마다 일시 증가, 감소 또는 유지되는 등 분비량의 일관된 경향성이 없었다(도 24). HGF는 3명의 공여자에서 계대의 증가에 따라 분비량이 계대 1에 비해 노화가 유도된 후기 계대의 세포에서 전반적으로 분비량이 감소되는 경향을 보였으나(도 25) 공여자 1명의 경우(M0401140113)는 HGF 분비량이 계대 3에서 일시 증가하나 이후 감소되고 후기 계대에서는 계대 1과 비슷한 수준으로 분비량이 유지되었다. 따라서 이러한 인자들의 분비량과 노화와의 관련성이 없음을 확인하였다.
결론적으로 여러 공여자의 각 계대 별 항체 분석 및 ELISA 결과를 종합해보면, 비타민 D BP, 아디포넥틴, EGF 및 FGF2가 중간엽줄기세포의 연속적인 계대배양을 통해 노화가 유도되는 과정 중 분비량이 증가되는 것을 확인할 수 있었고 따라서 이들 인자들이 노화 마커로서 노화 판정에 이용할 수 있음을 확인하였다. 한편으로 현재까지 이들 인자들이 노화와 직간접적 관련성에 대해서는 보고된 바 없다.
노화 관련 바이오마커의 검증
노화관련 바이오마커로 선별된 비타민 D BP, 아디포넥틴, EGF 및 FGF2가 실제 노화와 관련성이 있는 지를 검증하기 위해 추가적으로 15명의 공여자 세포들 (표 8)을 대상으로 연속적인 계대배양을 통해 세포노화를 유도시키고 각 계대(passage)별 세포배양액(conditioned medium)내 각각의 분비량을 ELISA법으로 확인하였다. 각 계대별 배양기간은 위와 마찬가지로 동일하게 7일로 고정하여 배양한 결과, 모든 세포에서 후기 계대로 갈수록 증식률이 감소하는 양상을 보였다(도 26a 내지 26d).
제조번호 연령 성별 제조번호 연령 성별
M07112014 37 남 M06252014 40 남
M08152014 49 여 M09282014 72 여
M09052014 59 남 M09112014 46 남
M08252014 55 남 M09152014 75 여
M10102014 41 남 M09072014 49 남
M09232014 67 남 M141001104 45 남
M102214 43 여 M140927101 51 남
M10062014 39 여
이전 결과와 마찬가지로 비타민 D BP, 아디포넥틴, EGF 및 FGF2는 초기 계대에서 분비된 단백질의 존재가 확인되지 않다가 연속적인 계대배양을 통해 계대가 증가됨에 따라 분비가 되는 것을 확인하였고 VEGF는 반대로 감소되며, IGF-1은 계대 증가와 관계없이 분비량의 편차가 컸다. 구체적인 사항은 다음과 같다:
가. 비타민 D BP
이전의 결과와 마찬가지로 공여자 별로 계대 3-5 부터 세포배양액 내 비타민 D BP의 존재가 확인되기 시작하였고 계대가 증가됨에 따라 분비량이 점차적으로 증가하였고 모든 공여자의 마지막 계대의 세포에서는 최대 농도로 분비하는 것이 확인되었다(도 27a 내지 27c).
나. 아디포넥틴(Adiponectin)
비타민 D BP 보다는 다소 늦은 시기인 계대 5-9부터 세포배양액 내 아디포넥틴의 존재가 확인되기 시작하였고 이후부터 계대가 증가됨에 따라 마찬가지로 분비량이 증가하였고 모든 공여자의 마지막 계대의 세포에서 각각 최대 농도로 분비하는 것이 확인되었다(도 28a 내지 28c).
다. EGF
계대 7-11부터 세포배양액 내 EGF의 존재가 확인되기 시작하였고 계대가 증가됨에 따라 분비량이 점차적으로 증가하는 것을 확인하였고 마찬가지로 모든 공여자의 마지막 계대의 세포에서 각각 최대 농도로 분비하는 것이 확인되었다(도 29a 내지 29c).
라. FGF2
계대 6-11부터 세포배양액 내 FGF2의 존재가 확인되기 시작하였고 다른 단백질과 마찬가지로 계대가 증가할수록 분비량이 증가하며 모든 공여자의 마지막 계대의 세포에서 각각 최대의 농도로 분비하는 것이 확인되었다(도 30a 내지 30c).
라. VEGF 및 IGF-1
VEGF의 경우, 위의 인자들과는 반대로, 계대가 증가함에 따라 분비량이 점차적으로 감소하는 경향이 확인되었다(도 31a 내지 31c). 한편으로 공여자마다 분비량이 감소되다가 다시 증가하는 패턴이 있는 경우도 확인되었다. IGF-1 또한 이전의 결과와 마찬가지로 계대가 증가됨에 따라 분비량이 증가하거나 감소되는 등의 편차가 매우 컸다(도 32a 내지 32c).
결론적으로 이전 항체 분석 및 ELISA로 확인된 노화관련 마커로 추정되는 비타민 D BP, 아디포넥틴, EGF 및 FGF2의 분비 증가를, 추가 공여자들(15명)을 대상으로 계대 별의 분비량을 확인해본 결과, 이들이 중간엽줄기세포의 연속적인 계대배양에 따라 발생되는 세포노화 시, 분비량이 증가되고 이에 따라 노화를 판정할 수 있는 노화관련 마커임을 검증하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. 비타민 D BP(vitamin D binding protein), 아디포넥틴(adiponectin), EGF(Epidermal Growth Factor) 및 FGF2(Fibroblast Growth Factor 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드의 단편 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 줄기세포의 세포노화(senescence) 검출용 키트.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 키트.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell)의 노화인 것을 특징으로 하는 키트.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 골수유래 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 줄기세포 내 비타민 D BP(vitamin D binding protein), 아디포넥틴(adiponectin), EGF(Epidermal Growth Factor) 및 FGF2(Fibroblast Growth Factor 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열 또는 단백질의 발현을 검출하는 단계를 포함하는 세포노화(senescence) 검출 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell)의 노화인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 골수유래 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 다음의 단계를 포함하는 세포노화(senescence) 억제제의 스크리닝 방법:
    (a) 비타민 D BP(vitamin D binding protein), 아디포넥틴(adiponectin), EGF(Epidermal Growth Factor) 및 FGF2(Fibroblast Growth Factor 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 뉴클레오티드 서열 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계, 상기 뉴클레오티드서열 또는 단백질의 고발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 세포노화 억제제로 판정한다.
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