KR20170018538A - 뇌암 환자의 생존 기간 예측용 키트와 생존 기간 예측을 위한 정보 제공 방법 - Google Patents

뇌암 환자의 생존 기간 예측용 키트와 생존 기간 예측을 위한 정보 제공 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뇌암 환자의 생존 기간 예측용 키트와 생존 기간 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종양 중간엽 줄기 유사 세포(tumor mesenchymal stem-like cell, tMSLC)를 이용한 뇌암 환자의 생존 기간 예측용 키트와 생존 기간 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명은 뇌암의 종양 중간엽 줄기 유사세포를 이용하여 뇌암 환자의 생존기간을 비교적 정확하고 용이하게 예측할 수 있도록 한다.

Description

뇌암 환자의 생존 기간 예측용 키트와 생존 기간 예측을 위한 정보 제공 방법{Predicting kit for survival of lung cancer patients and the method of providing the information for predicting survival of lung cancer patients}
본 발명은 뇌암 환자의 생존 기간 예측용 키트와 생존 기간 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 뇌암 중간엽 줄기 유사 세포(tumor mesenchymal stem-like cell, tMSLC)를 이용한 뇌암 환자의 생존 기간 예측용 키트와 생존 기간 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
교모세포종(glioblastoma, GBM)은 환자의 생존기간이 짧고 예후가 매우 나쁜 악성 종양으로 알려져 있다. 더욱이, 교모세포종에 대한 정확한 치료법이 아직 밝혀진 바 없어, 이를 치료하기 위해 제안된 많은 방법들의 개발 또한 더디게 진행되고 있다.
한편, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 뇌 종양으로 이전하는 경향이 있어, 교모세포종 치료를 위한 매개자로 응용되고 있다. 교모세포종에서 중간엽 줄기세포의 특성을 분석하다가, 종양 중간엽 줄기 유사 세포를 상기 교모세포종으로부터 분리한 바 있다고 보고되었다. 중간엽 줄기 유사 세포는 정상 뇌로부터 분리된 바 있고, Lang et. Al.(Neurosurgery, 2010 Sep; 67(3); 711-720, Journal of Clinical Oncology, May 2008, vol. 26, no. 15_suppl 2001)에서는 신경교종(glioma)로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 내용이 보고된 바 있다. 더욱이, 종양 중간엽 줄기 유사 세포(tMSLCs)가 몇몇 인간 뇌 종양으로부터 분리됨으로써, 뇌 종양의 초기나 중기 미세환경을 형성하는데 그 역할이 제안되고 있다.
교모세포종은 분자 마커, 유전자 발현 프로파일 또는 염색체 이상 등을 기반으로 몇 종류의 중분류로 구분될 수 있다. 유전적 특성에 기반하여 분류된 교모세포종은 4종류이고, 중간엽 타입은 다른 타입의 종양보다도 예후가 더욱 나쁜 것으로 보고되고 있다. 따라서 최근에는 GBM 환자의 생존 이익과 관련한 분자 마커들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있고, MGMT 메틸레이션, IDH1/2 돌연변이와 같은 제한된 수의 마커들이 생존 기간에 긍정적 관련이 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 비록 뇌 종양에 대한 WHO 분류가 곧 개정될 예정이기는 하지만, 최근 들어서야 IDH1 야생형 GBM은 2차 교모세포종과 생존 비율이 상이하다는 근거 하에 1차 교모세포종으로 부르기 시작하였다.
1차 교모세포종의 종양 줄기세포 배양을 통하여 GBM의 자연스러운 과정을 예측할 수 있다. 최근 공표는 환자의 생존에 중요한 영향을 미칠 가능성이 있는 종양의 기질 세포로, 중간엽 줄기 유사 세포의 중요성이 시사되고 있다. 하지만, 1차 교모세포종으로부터 중간엽 줄기 유사 세포를 분리하는 것에 대한 치료적 중요성은 아직까지는 보고된 바 없다.
본 발명의 일 목적은 뇌암 중간엽 줄기 유사 세포(tumor mesenchymal stem-like cell, tMSLC)를 이용하여 뇌암 환자의 생존 기간을 예측하기 위한 키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 뇌암 중간엽 줄기 유사 세포를 이용하여 뇌암 환자의 생존 기간을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 발명자들은 뇌암, 바람직하게는 교모세포종(glioblastoma, GBM), 보다 바람직하게는 1차 교모세포종(primary glioblastoma)으로부터 뇌암 중간엽 줄기 유사세포(brain tumor mesenchymal stem-like cell, tMSLC)가 분리되는 경우, 그 환자의 생존기간이 분리되지 않는 환자에 비하여 현저히 짧은 것을 발견해 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명에서 상기 뇌암, 바람직하게는 교모세포종, 보다 바람직하게는 1차 교모세포종으로부터 분리된 중간엽 줄기 유사세포는 중간엽 줄기세포와 유사하게 CD105+, CD90+, CD73+, CD45-, CD31- 및 NG2-의 표면인자 발현 특성을 갖는다.
따라서, 본 발명의 일 구현 예에 따르면, 뇌암 중간엽 줄기 유사세포(tumor mesenchymal stem-lkie cell, tMSLC)의 진단용 마커인 CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는, 뇌암 환자의 생존 기간 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 뇌암 중간엽 줄기 유사세포(tMSLC)의 진단용 마커인 CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2 중 적어도 하나를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 프라이머를 포함하는, 뇌암 환자의 생존 기간 예측용 키트를 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 상기한 키트를 이용하여 환자의 시료가 CD105+, CD90+, CD73+, CD45-, CD31- 및 NG2-의 표면인자의 발현 특성을 갖는 경우, 뇌암 환자는 뇌암 확진을 위해 최초 수술받은 날로부터의 생존 기간을 12개월 이하로 예측할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 뇌암 중간엽 줄기 유사세포(tMSLC)의 진단용 마커인 CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 상기 환자의 시료 내 뇌암 중간엽 줄기 유사세포의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 뇌암 환자의 생존 기간을 예측하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 뇌암 중간엽 줄기 유사세포(tMSLC)의 진단용 마커인 CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2 중 적어도 하나를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 프라이머를 이용하여 상기 환자의 시료 내 뇌암 중간엽 줄기 유사세포의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 뇌암 환자의 생존 기간을 예측하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 검출하는 단계를 통하여 상기 환자의 시료가 CD105+, CD90+, CD73+, CD45-, CD31- 및 NG2-의 표면인자의 발현 특성을 갖는 경우, 상기 환자는 뇌암 확진을 위해 최초로 수술받은 날로부터의 생존 기간을 12개월 이하로 예측할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 뇌암 중간엽 줄기 유사세포란 뇌 조직, 바람직하게는 뇌암 조직, 보다 바람직하게는 교모세포종 조직, 더욱 바람직하게는 1차 교모세포종 조직에서 분리된 것으로 중간엽 세포와 유사한 성질을 갖는 세포를 의미한다. 이러한 세포들은 트릴리니지(trilineage) 분화, 플라스틱 플레이트에 대한 접착능과 비종양화(non-tumorigenesis)의 특성을 가진다.
본 발명의 일 구체예에서 생존 기간은 뇌암 환자가 뇌암 확진을 위해 첫 수술받은 날로부터의 생존하는 기간을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 예후는 환자에서의 전반적 생존 기간, 무질병 생존 기간, 무진행 생존, 이벤트가 없는 생존과, 암의 재발 가능성의 예측 및 종양의 전이 가능성을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 질병의 회복 가능성 또는 질병의 발병 가능성 또는 결과의 예측을 의미하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서 진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 　진단　마커란,　뇌암 중간엽 줄기 유사세포를 정상 세포 또는 중간엽 줄기세포성을 갖지 않는 다른 뇌암 세포, 더 나아가서는 2차 교모세포종 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로서, 일반적인 뇌암 세포에 비하여 중간엽 줄기세포의 성질을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의　진단　마커는 중간엽 줄기세포의 성질을 갖는 교모세포종 세포가 CD105+, CD90+, CD73+, CD45-, CD31- 및 NG2-의 표면 항원 발현 프로파일을 갖는지 여부를 판단할 수 있도록, 표면 항원 단백질인　CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2의 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA이다.
본 발명의 일 구체예에서 mRNA 발현 수준 측정이란, 뇌암 줄기 유사세포의 존재 여부를 확인하기 위하여 생물학적 시료에서　진단용　마커 단백질을 코딩하는 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같이 mRNA 발현 여부를 측정하는 제제는　CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현 여부를 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것일 수 있다. CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 바탕으로 당업자는 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
상기 프라이머란, 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 뇌암 줄기 유사세포의 존재 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
또한 프로브란, mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 CD105, CD90 및 CD73 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명의 일 구체예에서 단백질 발현수준 측정이란, 뇌암 환자의 예후를 진단하기 위하여 생물학적 시료에서　뇌암 줄기 유사세포의　마커 표면 항원 단백질인 CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질의 발현수준을 측정하는 제제는　뇌암 줄기 유사세포의　마커 표면 항원 단백질인 CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2 단백질의 발현수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것일 수 있다. 상기 CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2 단백질의 아미노산 서열을 바탕으로 당업자는 상기 단백질에 특이적인 항체를 디자인할 수 있다.
상기 단백질에 대한 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용할 수도 있고, 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있다.
본 발명의 일 구체예에서 키트란, 특정한 목적을 위해 필요한 조성물 및 부속품들을 모아놓은 세트를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 키트는 　뇌암 줄기 유사세포의　마커 표면 항원 단백질인 CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2의 발현수준을 이들 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현수준을 확인함으로써 생존 기간을 예측할 수 있다. 본 발명의 키트에는　뇌암 줄기 유사세포의 마커 표면 항원 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명은 뇌암의 종양 중간엽 줄기 유사세포를 이용하여 뇌암 환자의 생존기간을 비교적 정확하고 용이하게 예측할 수 있도록 한다.
이로써, 본 발명은 현재 예후가 매우 나쁜 암에 속하는 뇌암 환자의 생존기간을 보다 정확하게 예측하여 그에 따른 치료적 대비가 가능하도록 한다.
도 1은 실시예에서 tMSLC 양성 환자군과 tMSLC 음성 환자군의 생존기간을 카플란-메이어 분석을 통해 그래프로 나타낸 것이다(P=0.021, 검정 테스트(log-rank test)).
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
환자의 특성
표준적인 치료(N Engl J Med 2005; 352; 987-996)를 받은 83명의 1차 교모세포종 환자에 대하여 코호트를 분석하였다. 본 실험에서 신경교육종(gliosacroma)이나 2차 교모세포종 환자는 제외하였다. 상기 환자들의 코호트 샘플을 통해 생존기간, 절제 범위, 재발 종양의 치료, 분자 마커 및 tMSLCs의 배양 결과를 분석하였다. tMSLC를 분리하기 위하여 GBM 환자가 수술받는 중에 샘플을 채취하였다.
치료 과정
상기 83명의 환자 모두 종양 제거를 위하여 외과적 절제술을 받았고, 화학적 치료, 방사선 치료 및 보조적 화학 치료를 받았다. 종양 제거는 MR T1 이미지 확대 하에 가시적으로 종양 덩어리 100%를 제거하며 수행되었다. 총 절제술에 적합하지 않은 환자들은 종양 덩어리 크기의 90% 이상 100% 미만을 제거하는 부분 절제술이나 90% 미만을 제거하는 일부 절제술을 받았다. 수술 후 모든 환자들은 테모졸로마이드(temozolomide, TMZ) 처방과 함께 보조적 방사선 치료를 받았다.
tMSLC의 분리 및 배양
tMSLC는 신경교종 기원 세포로 중간엽 줄기세포와 유사한 특성을 가지고 있다. 수술 후, 종양 샘플을 채취하여 분쇄한 뒤, 메스를 이용하여 DMEM/F-12 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12; Mediatech, Manassas, VA, USA) 내에서 분산시키고 100㎛ 나일론 메쉬(BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 셀 트레이너를 연속하여 통과시켰다. 얻어진 세포 부유액을 MEMα 배지(Minimum essential medium-α; Mediatech, Herndon, VA, USA)에 2번 세척한 뒤, 단일 세포 부유액을 10-cm2의 세포 배양 접시에 2 X 106 세포/cm2의 밀도로 부착시켰다. 이러한 세포들을 MEMα, 10% 소 혈청(FBS; Lonza, Basel, Switzerland), 2mM L-글루타민(Mediatech) 및 항생-항진균성 용액(100x, Gibco, Invitrogen Korea, Seoul, Republic of Korea)를 포함하는 완전 MSC 배지에서 배양하였다. 24시간 경과 후, 인산화 완충 용액(PBS; Mediatech)로 2번 세척하여 비부착 세포를 제거하고, 부착 세포는 컨플루언스(confluence)에 도달할 때까지 배양하였다. 그 후 0.1% EDTA가 첨가된 0.25% 트립신을 이용하여 세포를 트립신화하고, 5,000세포/cm2의 밀도에서 계대배양하였다. 세포를 간세포/줄기세포의 역할이 일치되도록 계속하여 3 ~ 4세대 배양하였다.
tMSLC의 존재 확인
1. 플라스틱 부착능 실험
상기와 같이 얻어진 세포 배양물을 도립 위상차 현미경(inverted phase-contrast microscope, Ⅸ71 Inverted Microscope; Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
2. 유세포 분석(Flow cytometry analysis)
tMSLC의 표면 항원 발현 프로파일을 확인하기 위하여, 얻어진 세포를 PBS(Mediatech)로 세척하고, 펠렛을 FACS 버퍼(10% fluorescence-activated cell sorting가 포함된 PBS)에 5 X 105 세포/100㎕의 농도로 재부유시켰다. 이러한 단일 세포 부유액을 피코에리트린(phycoerythrin), 플루오레세인이소티오시안산염(fluoresceinisothiocyanate, FITC), 알렉사 플루오로 647(Alexa Fluor 647) 또는 알로피코시아닌(allophycocyanin)이 결합된 CD105(eBioscience, San Diego, CA, USA), CD45(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA), CD73(BD Pharmingen), CD90(eBioscience), CD31(eBioscience) 및 신경/신경교-항원 2(nerve/glial antigen 2, NG2; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)에 대한 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다. NG2 프로테오글리칸의 탐지를 위하여 1차 항체(NG2 항체; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)를 따라 FITC-결합된 2차 항체(Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용하였다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA)가 구비된 FACS 우세(vantage) SE(BD Science)를 이용하여 FACS 분석을 수행하였다. 이종의 세포들 사이에서 tMSLC 세포를 분리하기 위하여, FACS에서 세포 중 10% 이상이 표면 항원 분석에 대해 양성을 나타내고, 5% 미만이 음성을 나타내는 것으로 가정하였다.
3. 중간엽 분화(Mesenchymal differentiation)
tMSLC의 중간엽 분화능을 확인하기 위하여, 얻어진 세포에 대하여 지방세포화(adipogenic), 골원성(osteogenic) 및 연골성(chondrogenic) 계통으로 분화하는 능력을 갖는지 실험하였다.
구체적으로 지방세포화 분화 여부를 확인하기 위하여, 얻어진 tMSLC 세포를 완전 MSC 배지에서 6웰 플레이트에 2 X 104세포/cm2의 밀도로 접종하였다. 컨플루언스에 도달 시, 세포 분화는 지방세포화 분화 BulletKit(Lonza Walkersville, Walkersville, MD, USA)로부터 얻어진 지방세포화 분화 배지를 이용하여 유도되었다. 3주 동안 매 3~4일 마다 이러한 세포들에 신선한 배지를 공급하였다. 21일 되었을 때, 세포를 PBS(Mediatech)로 세척하고 10% 포르말린(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)로 상온에서 1시간 동안 고정하였다. 고정 후, 세포를 탈이온수로 여러 차례 세척하고, 60% 이소프로판올(Pharmco-AAPER, Brookfield, CT, USA)를 추가한 뒤 5분 동안 방치하였다. 그 후 각각의 웰에 오일 레드 오 솔루션(Sigma-Aldrich)을 첨가하였다. 5분 후, 세포들을 탈이온수로 세척하고, 헤마톡실린(Sigma-Aldrich)으로 대비 염색을 하였다.
골원성 분화 여부를 확인하기 위하여, tMSLC 세포를 6웰 플레이트에 3 X 103세포/cm2의 밀도로 접종하였다. 다음날 배지를 골원성 분화 BulletKit(Lonza Walkersville)로부터 얻어진 골원성 분화 배지로 교체하고, 3주 동안 매 3 ~ 4일마다 새로운 배지를 공급하였다. 21일 되었을 때, 세포를 PBS(Mediatech)로 2번 세척하고, 70% 차가운 에탄올(Pharmaco-AAPER)로 1시간 동안 고정한 뒤, 탈이온수로 세척하였다. 세포를 상온에서 10분 동안 회전시키면서 40mM 알리자린 레드(pH 4.2; Sigma-Aldrich)로 염색한 뒤, 탈온수로 5번 세척하였다.
연골 형성(chondrogenesis) 분화 여부를 확인하기 위하여, tMSLC 세포를 트립신화하고, 세럼을 포함하는 배지로 세척하였다. 0.5ml 배지에 부유화된 250,000 세포의 시료를 15ml 원뿔 폴리프로필렌 튜브(SPL, Pocheon, Gyeonggi, Republic of Korea)에 담고 150xg에서 5분동안 원심분리하여 얻어진 펠렛 형태의 세포를 연골 형성 분화 BulletKit(Lonza Walkersville)로부터 얻어진 연골 형성 분화 배지와 20㎍/ml TGF-β3(Ontogeny Research Products, Cambridge, MA, USA)에 3주 동안 배양하였다. 매 3 ~ 4일 동안 세포에 신선한 배지를 공급하였고, 대조군으로는 세포를 완전 MSC 배지에서 같은 기간 동안 배양하였다. 이러한 펠렛은 상온에서 1시간 동안 10% 포르말린으로 고정하였고, 그 후 톨루이딘 블루(Sigma-Aldrich)로 염색된 파라핀 섹션에 삽입하였다.
4. 신경교종발생(gliomagenesis) 여부 확인
신경교종발생 여부를 확인하기 위하여 4 내지 8주된 수컷 무흉선 누드 마우스(Central Lab. Animal Inc., Seoul, Republic of Korea)의 두개골 내에 상기와 같이 지방세포화, 골 형성 및 연골 형성 분화 유도될 수 있는 세포를 이식하였다. 매일 마우스의 체중을 확인하고, 마우스의 체중이 10% 이상 감소하면 안락사시킨 뒤, 뇌를 해부하여 포르말린에 담아두었다.
실험 결과, 83명의 GBM 환자의 수술 도중 분리한 종양 샘플 중 51명의 환자로 부터 얻어진 세포가 중간엽 줄기세포와 유사하게 ⅰ)플라스틱 부착능을 갖고, ⅱ) 표면 항원 프로파일이 CD105+, CD90+, CD73+, CD45-, CD31- 및 NG2-을 나타내며, ⅲ)지방세포, 골형성 및 연골형성의 분화능을 보이고, ⅳ)신경교종 발생은 일으키지 않는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 tMSLC 세포의 존재를 확인할 수 있었다.
통계적 분석
환자의 생존기간은 pGBM 진단을 확인하기 위하여 수술한 날짜에서부터 마지막 방문까지 혹은 죽음까지의 시간으로 측정하였고, 각 환자 그룹별 생존기간은 카플란-마이어 곡선(Kaplan-Meier curve)로 나타내어 그 결과를 도 1에 나타내었다. 인구통계적 특성은 피셔의 정확검정법(Fisher's exact test) 또는 T-테스트를 이용하여 수행되었으며, 통계적 분석은 SPSS 20(IBM, USA)를 이용하여 수행되었으며, p 값이 0.05 이하인 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 평가하였다.
생존기간 분석
상기한 바와 같이, 83명의 환자 중 51명(61%)의 환자 샘플에는 tMSLC가 존재하는 것을 확인할 수 있었고, 32명(39%)의 환자 샘플에는 tMSLC가 존재하지 않음을 알 수 있었다. 이들 83명 환자에 대하여 인구 통계학적 및 임상 특성을 분석하여 그 결과를하기 표 1에 나타내었다.
특징 tMSLCs 양성 환자
(N=51)		 tMSLCs 음성 환자
(N=32)		 P 값
나이
평균 57.7 61.5 0.20
범위 28~85 39~80
성별
남성 35 16 0.11
여성 16 16
평균 생존기간(개월) 10.0 16.5 0.02
병리적 진단 1차 교모세포종 1차 교모세포종
치료 외과 수술 및 Stupp's regimen 외과 수술 및 Stupp's regimen
수술 범위 (건)*
총 절제 29** 18 0.97
총 절제 근방 3 4 0.34
부분 절제 12 2 0.07
일부 절제 0 2 0.08
생체검사 1 0 0.43
분자 마커
Ki 67 22.1 27.6 0.22
1p 19q 공동삭제 by FISH 8 3 0.35
1p LOH 13 8 0.90
19q LOH 9 5 0.78
MGMT 메틸레이션 by PCR 20 17 0.26
p53 33 17 0.36
(상기 표 1에서, ** 표시한 2명의 환자는 광범위 절제술을 받았고, Ki 67 레벨은 샘플로부터 반정량적인 계수의 통계 값을 나타내었으며, MGMT는 O-6-메틸구아닌-DNA 메틸트렌스퍼라제를 의미한다.)
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 51명의 tMSLC 양성 환자군과 32명의 음성 환자군에서 절제 범위나 분자 마커의 차이는 발견할 수 없었고, 그 외에 나이, 성별, 특이 분자 마커의 발현 역시 통계적 유의성을 나타내지 않았다.
하지만, 83명의 환자의 평균 생존기간이 12.5개월이었는데, tMSLC 양성 환자군과 음성 환자군의 평균 생존기간은 각각 10.0개월, 16.5개월로 측정되었다 (p=0.02, Cox test). 즉, tMSLC 양성 환자군이 음성 환자군에 비하여 생존기간이 현저히 짧은 것을 알 수 있었다. tMSLC 양성 환자군과 음성 환자군의 생존기간 차이는 도 1을 통해서도 확인할 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시 예를 중심으로 하여 설명하였으나 이는 예시에 지나지 아니하며, 본 발명은 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 다양한 변형 및 균등한 기타의 실시 예를 이하에 첨부한 청구범위 내에서 수행할 수 있다는 사실을 이해하여야 한다.

Claims (11)

  1. 뇌암 중간엽 줄기 유사세포(tumor mesenchymal stem-lkie cell, tMSLC)의 진단용 마커인 CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는, 뇌암 환자의 생존 기간 예측용 키트.
  2. 뇌암 중간엽 줄기 유사세포(tumor mesenchymal stem-lkie cell, tMSLC)의 진단용 마커인 CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2 중 적어도 하나를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 뇌암 환자의 생존 기간 예측용 키트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 뇌암 중간엽 줄기 유사세포는 CD105+, CD90+, CD73+, CD45-, CD31- 및 NG2-의 표면인자 발현 특성을 갖는, 뇌암 환자의 생존 기간 예측용 키트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 뇌암 환자의 생존 기간은 12개월 이하로 예측되는, 뇌암 환자의 생존 기간 예측용 키트.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 뇌암은 교모세포종(glioblastoma)인 것을 특징으로 하는, 뇌암 환자의 생존 기간 예측용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 뇌암은 1차 교모세포종(primary glioblastoma)인 것을 특징으로 하는, 뇌암 환자의 생존 기간 예측용 키트.
  7. 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 뇌암 중간엽 줄기 유사세포(brain tumor mesenchymal stem-lkie cell, tMSLC)의 진단용 마커인 CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 상기 환자의 시료 내 뇌암 중간엽 줄기 유사세포의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 뇌암 환자의 생존 기간을 예측하기 위한 정보 제공 방법.
  8. 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 뇌암 중간엽 줄기 유사세포(brain tumor mesenchymal stem-lkie cell, tMSLC)의 진단용 마커인 CD105, CD90, CD73, CD45, CD31 및 NG2 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 상기 환자의 시료 내 뇌암 중간엽 줄기 유사세포의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 뇌암 환자의 생존 기간을 예측하기 위한 정보 제공 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 환자의 시료가 CD105+, CD90+, CD73+, CD45-, CD31- 및 NG2-의 표면인자 발현 특성을 보이는 경우, 뇌암 중간엽 줄기 유사세포가 검출되는 경우, 생존 기간을 12개월 이하로 예측하는 단계를 더 포함하는, 뇌암 환자의 생존 기간을 예측하기 위한 정보 제공 방법.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 뇌암은 교모세포종(glioblastoma)인 것을 특징으로 하는, 뇌암 환자의 생존 기간을 예측하기 위한 정보 제공 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 뇌암은 1차 교모세포종(primary glioblastoma)인 것을 특징으로 하는, 뇌암 환자의 생존 기간을 예측하기 위한 정보 제공 방법.
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WO2021210731A1 (ko) * 2020-04-13 2021-10-21 전남대학교산학협력단 전이성 뇌종양의 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 및 이를 이용한 진단방법

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