KR102163471B1

KR102163471B1 - 에나멜 전구 세포 판별용 바이오 마커 조성물

Info

Publication number: KR102163471B1
Application number: KR1020180094975A
Authority: KR
Inventors: 장영주
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2018-08-14
Filing date: 2018-08-14
Publication date: 2020-10-08
Also published as: KR20200019443A

Abstract

본 발명은 에나멜 전구 세포 판별용 조성물 및 이를 포함하는 키트, 이를 이용한 에나멜 전구세포 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 천연의 에나멜 전구세포 또는 인위적으로 분화 유도시켜 수득되는 에나멜 전구세포를 빠르게 선별할 수 있으므로, 혼합 세포 집단 중에서 에나멜 전구세포를 빠르게 선별하거나 에나멜 전구세포로의 분화 유도 검증에 유용하게 사용될 수 있으며, 선별 수득된 에나멜 전구세포는 손상된 치아의 에나멜을 재생하는데 유용하게 활용할 수 있다.

Description

에나멜 전구 세포 판별용 바이오 마커 조성물 {A biomarker composition for detecting of ameloblast}

본 발명은 에나멜 전구 세포 판별용 조성물 및 이를 포함하는 키트, 이를 이용한 에나멜 전구세포 판별 방법에 관한 것이다.

치아 및 주변 조직은 경조직 및 인대조직을 포함하여 혈관, 신경을 아우르는 복합조직의 형태를 이룬다. 치아 구조를 이루는 조직은 대표적으로 경조직인 에나멜(Enamel), 상아질(Dentin), 시멘트질(Cementum), 그리고 치조골과 연조직인 치수, 치주 인대세포(Periodontal ligament) 등으로 나타난다.

에나멜전구세포(Ameloblasts)는 치아의 에나멜, 즉 법랑질을 형성하는 세포로 치아 상피세포 집단, 외배엽에서 기원한다. 에나멜전구세포는 법랑질의 유기기질을 분비하고 독특한 양상의 법랑질 석회화 과정에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 에나멜전구세포가 법랑질을 형성하는 과정을 형태와 기능을 고려하여 분비 전단계 (presecretory stage), 분비기 (secretory stage) 및 성숙기 (maturation stage) 와 같은 주요 3단계로 구분할 수 있다. 에나멜전구세포는 법랑질을 형성할 때 유기 기질과 무기질을 동시에 분비하여 부분 광화된 상태로 존재하다가 성숙함에 따라 높은 함량의 유기 기질을 제거하고 석회화 기질 성분을 높여가는 형태로 법랑질을 석회화시키기 때문에, 유기 기질이 먼저 분비되고 나중에 석회화가 진행되는 뼈, 상아질 그리고 백악질의 석회화 과정과는 다르다는 사실이 당 분야에 널리 알려져 있다. 에나멜은 외배엽에서 발생하고 골은 중배엽에서 발생한다는 사실 역시 경질 조직인 뼈와 에나멜을 구분 짓는 요소이다. 또한 에나멜전구세포는 법랑질 형성 후에 치은의 접합상피 (junctional epithelium)로 잔존하는 극히 일부를 제외하고는 치아에 존재하지 않기 때문에 치아에 잔존하여 골, 상아질, 백악질의 유지와 치유 및 재생에 관여하는 골모세포, 상아모세포 그리고 백악모 세포와도 차이점이 있다.

따라서, 목적에 따라 에나멜 전구세포를 치은 섬유아세포, 치은 상피 세포, 상아모세포 및 백악모세포 등과 구별하여 검출 및 판별할 수 있는 방법에 대한 필요성이 있다.

이에 본 발명자들은 인간 에나멜 전구세포를 효과적으로 검출 및 판별할 수 있는 바이오마커에 관하여 연구한 결과, GPR56 (Adhesion G Protein-Coupled Receptor G1), JUP (Junction Plakoglobin) 및 TGM2 (Transglutaminase 2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커 외 17종의 바이오마커가 에나멜 전구세포에서 발현이 특이적으로 변화되어 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 GPR56 (Adhesion G Protein-Coupled Receptor G1), JUP (Junction Plakoglobin) 및 TGM2 (Transglutaminase 2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 에나멜 전구세포 판별용 조성물, 키트 및 이를 이용한 에나멜 전구세포 판별 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GPR56 (Adhesion G Protein-Coupled Receptor G1), JUP (Junction Plakoglobin) 및 TGM2 (Transglutaminase 2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 에나멜 전구 세포 (ameloblast) 판별용 조성물을 제공한다.

또한 GPR56 (Adhesion G Protein-Coupled Receptor G1), JUP (Junction Plakoglobin) 및 TGM2 (Transglutaminase 2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 유전자의 발현 또는 활성; 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는 에나멜 전구 세포 (ameloblast) 판별용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 에나멜 전구세포 판별용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 세포에서 GPR56 (Adhesion G Protein-Coupled Receptor G1), JUP (Junction Plakoglobin) 및 TGM2 (Transglutaminase 2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 에나멜 전구세포 판별 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 천연의 에나멜 전구세포 또는 인위적으로 분화 유도시켜 수득되는 에나멜 전구세포를 빠르게 선별할 수 있으므로, 혼합 세포 집단 중에서 에나멜 전구세포를 빠르게 선별하거나 에나멜 전구세포로의 분화 유도 검증에 유용하게 사용될 수 있으며, 선별 수득된 에나멜 전구세포는 손상된 치아의 에나멜을 재생하는데 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 인간 치은 조직으로부터 치은 상피세포를 선택적으로 분리하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2의 A는 치은 섬유아세포 (gingival fibroblasts; GF) (a) 와 치은 상피 세포(gingival epithelial; GE) (b) 의 형태를 확인한 결과를 나타낸 도이며, 도 2의 B는 섬유아세포 마커인 비멘틴의 발현을 GF 및 GF 에서 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 치아 상피세포 발현 마커인 EpCAM, 인테그린 α-6 및 p₇₅NTR (P75) 의 발현을 치은 섬유아세포 (GF) 및 치은 상피세포(GE) 에서 유세포 분석 및 형광 신호 분석을 통해 확인한 결과 및 중간엽성 마커인 CD44, CD73, CD90 및 CD146 의 발현을 치은 섬유아세포 (GF) 및 치은 상피세포(GE) 에서 유세포 분석 및 형광 신호 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도4 는 치은 상피 세포를 100 ng/ml BMP4, 100 ng/ml BMP2 및/또는 10 ng/ml TGFβ1로 7일 동안 처리한 후의 세포 표현형을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 치은 상피 세포를 100 ng/ml BMP4, 100 ng/ml BMP2 및/또는 10 ng/ml TGFβ1로 7일 동안 처리한 후, 아밀로제닌(amelogenin), 아밀로블라스틴(ameloblastin), 에나멜린(enamelin)의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.1, **P<0.01, 또는 ***P<0.0001, Student t-test).
도 6은 치은 상피 세포를 100 ng/ml BMP4, 100 ng/ml BMP2 및/또는 10 ng/ml TGFβ1로 7일 동안 처리한 후, BSP, OCN 및 OPN 의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.1, **P<0.01, 또는 ***P<0.0001, Student t-test).
도 7은 치은 상피 세포를 100 ng/ml BMP4, 100 ng/ml BMP2 및/또는 10 ng/ml TGFβ1로 7일 동안 처리한 후, ALP 활성의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 치은 상피 세포를 100 ng/ml BMP4, 100 ng/ml BMP2 및/또는 10 ng/ml TGFβ1로 처리한 후, Smad 및 p38 신호전달 경로의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 치은 상피세포 (GE), 치은 섬유아세포 (GF) 에 100 ng/ml BMP4, 100 ng/ml BMP2 및 10 ng/ml TGFβ1 를 처리한 후, 아밀로제닌(amelogenin), 아밀로블라스틴(ameloblastin), OPN 의 mRNA 발현을 qPCR 로 비교한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.1, **P<0.01, 또는 ***P<0.001, Student t-test).
도 10은 GF vs dGE, dGF vs dGE, 및 GE vs dGE 에서 상향 및 하향 조절된 유전자를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 벤다이어그램 내 중첩되는 영역은 비교군 사이에 공통인 유전자의 수를 나타낸다 (dGE: 사이토카인이 처리된 치은 상피세포, GE: 사이토카인이 처리되지 않은 치은 상피세포, dGF: 사이토카인이 처리된 치은 섬유아세포, GF: 사이토카인이 처리되지 않은 치은 섬유아세포).
도 11은 짝비교 (pairwise comparison) 에 의한 1007개 DEGs (differentially expressed genes) 의 히트 맵(Heat map) 을 나타낸 도이다. 가로와 세로는 각각 1007 DEGs(537 상향, 470 하향 조절 유전자) 및 프로파일화된 시료를 나타내며, 상대적인 발현 수준은 칼라 스케일로 나타내었다.
도 12는 4개 주요 GO 카테고리 세포 주기 (a), DNA 복제 (b), 핵분열 (c), 방추 형성 (d) 에 속한 하향 조절된 유전자의 히트맵 결과이다.
도 13의 a 및 b 는 8개 주요 GO 카테고리 세포 표면 (a), 자극에 대한 세포 반응 (b), 사이토카인 생산 (c), 발달 과정 (d), 세포외 구조 조직 (e), 세포 내 신호 전달 (f), 세포 부착 조절 (g), 세포 이동성 조절 (h) 에 속하는 상향 조절된 유전자의 히트맵 결과이다.
도 14는 3개의 주요 GO 카테고리 세포 표면, 세포외 구조 조직 및 세포 부착 조절과 관련된 20개의 선별된 유전자의 유전자 발현 프로파일을 나타낸 도이다. 히트맵은 20개 선택된 유전자에 대한 log₂FPKM 값 및 4가지 세포의 상태를 나타낸다 (녹색: 세포 표면, 보라색: 세포외 구조 조직, 올리브색: 세포 부착 조절).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 GPR56 (Adhesion G Protein-Coupled Receptor G1), JUP (Junction Plakoglobin) 및 TGM2 (Transglutaminase 2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 에나멜 전구 세포 (ameloblast) 판별용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 ACHE (acetylcholinesterase), AMTN (amelotin), CDH3 (Cadherin 3), CDH8 (Cadherin 8), CELSR1 (Cadherin EGF LAG Seven-Pass G-Type Receptor 1), CLDN4 (Claudin 4), COL17A1 (Collagen Type XVII Alpha 1 Chain), DACT2 (Dishevelled Binding Antagonist Of Beta Catenin 2), ITGB6 (Integrin Subunit Beta 6), LAMA3 (Laminin Subunit Alpha 3), LAMB3 (Laminin Subunit Beta 3), LAMC2 (Laminin Subunit Gamma 2), MMP9 (Matrix Metallopeptidase 9), MMP15 (Matrix Metallopeptidase 15), TNF (Tumor Necrosis Factor), WNT7A(Wnt Family Member 7A) 및 WNT10A (Wnt Family Member 10A) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 에나멜 전구 세포 (ameloblast) 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명의 에나멜 전구세포 판별용 조성물에 포함된 20종의 유전자는 에나멜 전구세포에서 발현 또는 활성이 특이적으로 변화된 바이오마커이며, 에나멜 전구세포를 판별하는데 효과적이다.

본 발명의 바이오마커 정보를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

본 발명에 있어 '판별' 이란, 대상 시료 중 에나멜 전구세포를 확인, 선별, 검출하는 것을 제한없이 포함하며, 전구세포로부터 에나멜 전구세포가 효과적으로 분화 유도되었는지 검증하는 것 또한 포함할 수 있다.

본 발명에 있어, 용어 “에나멜전구세포 (Ameloblasts)” 는 “에나멜아세포” 또는 “법랑모세포”와 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 에나멜로 분화될 수 있는 에나멜 특이적인 전구세포를 의미한다. 분화 유도된 에나멜 전구세포에서는 아밀로제닌(amelogenin), 아밀로블라스틴(ameloblastin) 및 에나멜린(enamelin) 과 같은 EMP (enamel matrix proteins) 의 발현이 현저하게 증가할 수 있다. 본 발명의 에나멜전구세포 (Ameloblasts)는 본 발명의 분화 유도 방법에 따라 상피세포가 중간엽성 세포로 전이되는 상피-간엽 전이(EMT) 과정을 거쳐 분화된 세포일 수 있다.

따라서 본 발명에서 판별의 대상이 되는 에나멜 전구세포는 천연에 존재하는 에나멜 전구세포 및 인위적으로 분화 유도된 에나멜 전구세포를 모두 포함할 수 있으며, 본 발명의 조성물을 이용하는 경우, 다른 세포, 예컨대 분화 전의 치은 섬유아세포, 치은 상피 세포 또는 상아모세포 및 백악모세포와 같은 다른 치아 유래 세포로부터 에나멜 전구세포만을 효과적으로 판별 및 선별해 낼 수 있다.

특히 본 발명에서 판별이 대상이 되는 에나멜 전구세포가 인위적으로 분화 유도된 에나멜 전구세포인 경우, 이는 치은 상피세포에 사이토카인을 처리하여 유도된 세포일 수 있으며, 바람직하게는 TGFβ1(Transforming growth factor β1), BMP2(bone morphogenetic protein 2) 및 BMP4(bone morphogenetic protein 4)를 처리하여 분화 유도된 세포일 수 있다.

본 발명의 TGFβ1(Transforming growth factor β1), BMP2(bone morphogenetic protein 2) 및 BMP4(bone morphogenetic protein 4) 은 치은 상피세포를 에나멜전구세포로 분화 유도시킬 수 있으며, 이들은 각각 1:10:10 의 중량비, 예컨대 바람직하게는 각각 10ng/ml, 100ng/ml, 100ng/ml 로 치은 상피세포에 처리될 수 있다. BMP2 및 BMP4 를 단독으로 치은 상피세포에 처리하는 경우 치은 상피세포를 에나멜전구세포로 효과적으로 분화 유도시킬 수 없으나, TGFβ1, BMP2 및 BMP4 를 복합 처리하는 경우 에나멜 전구세포가 분화 유도될 수 있다.

상기 TGFβ1, BMP2 및 BMP4 복합 처리는 치은 상피세포를 중간엽성으로 전이될 수 있도록 하는 치은 상피세포의 EMT (epithelial mesenchymal transition) 를 효과적으로 유도할 수 있다. 따라서 TGFβ1, BMP2 및 BMP4 의 복합 처리는 치은 조직으로부터 분리된 외배엽성의 치은 상피세포를 중간엽성으로 전이되게 하고 최종적으로 에나멜 전구세포가 수득될 수 있도록 할 수 있다. 따라서 TGFβ1, BMP2 및 BMP4 는 치은 상피 세포의 에나멜 전구세포로의 분화용 조성물 또는 키트에 사용될 수 있고 종래 외배엽에서 유래되어 세포 확보가 어려웠던 에나멜 전구세포를 효과적으로 수득하여 치아 에나멜의 재생 또는 복원에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 치은 상피세포 (gingival epithelial cells) 는 중배엽성의 치은 조직에서 분리될 수 있으며, 이는 치아의 경조직인 에나멜을 형성하는 세포원이 될 수 있다. 상기 치은 상피세포는 본 발명의 분화 유도 방법에 의하여 에나멜 전구세포로 분화유도 될 수 있는 세포이며, 치은 조직 유래의 세포 혼합물에서 선택적으로 치은 섬유아세포 (gingival fibroblasts)를 제거하여 수득될 수 있다. 본 발명의 치은 상피세포는 외배엽성으로, 전형적인 상피세포 유사 형태인 다각형(polygonal)의 형태를 나타내어, bipolar 형태를 나타내는 중배엽성의 치은 섬유아세포와는 형태학적인 차이를 나타낼 수 있고, 치은 섬유아세포 대비 비멘틴 발현 양이 감소되어 있는 세포일 수 있다.

본 발명에서 치은 상피세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간 유래의 세포일 수 있다.

본 발명의 치은 상피세포는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종(xenogenic) 세포일 수 있다.

본 발명의 에나멜 전구세포 판별용 조성물에 포함된 바이오마커인 20종의 유전자는 각각 단독으로 사용하여 에나멜 전구세포 판별에 사용될 수 있으나, 이를 조합하여 사용하는 경우, 정확도는 더욱 향상될 수 있다.

또한 본 발명은 에나멜 전구세포 판별용 조성물은 GPR56 (Adhesion G Protein-Coupled Receptor G1), JUP (Junction Plakoglobin) 및 TGM2 (Transglutaminase 2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현 또는 활성; 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는 에나멜 전구 세포 (ameloblast) 판별용 조성물을 제공한다.

또한 상기 조성물은 ACHE (acetylcholinesterase), AMTN (amelotin), CDH3 (Cadherin 3 ), CDH8 (Cadherin 8), CELSR1 (Cadherin EGF LAG Seven-Pass G-Type Receptor 1), CLDN4 (Claudin 4), COL17A1 (Collagen Type XVII Alpha 1 Chain), DACT2 (Dishevelled Binding Antagonist Of Beta Catenin 2), ITGB6 (Integrin Subunit Beta 6), LAMA3 (Laminin Subunit Alpha 3), LAMB3 (Laminin Subunit Beta 3), LAMC2 (Laminin Subunit Gamma 2), MMP9 (Matrix Metallopeptidase 9), MMP15 (Matrix Metallopeptidase 15), TNF (Tumor Necrosis Factor), WNT7A (Wnt Family Member 7A) 및 WNT10A (Wnt Family Member 10A) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현 또는 활성; 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어, 상기 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브일 수 있으며, 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 제제는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)일 수 있다.

상기 프라이머는 템플레이트 (template)와 상보적으로 결합할 수 있고, 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 템플레이트의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 특정 유전자의 핵산 서열에 상보적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7bp 내지 50bp의 길이, 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 갖는다. 상기 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 다른 염기 서열을 포함할 수도 있다. 프라이머는 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.

상기 프로브는 표적 핵산과 부분적으로 또는 완전히 상보적인 핵산 가닥으로서, 표적 핵산과 염기 특이적인 방식으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 바람직하게는, 표적 핵산에 완전 상보적인 올리고뉴클레오티드이다. 상기 프로브는 핵산뿐만 아니라, 펩티드 핵산을 포함한 상보적 결합을 할 수 있는 종래 알려진 임의의 핵산 유도체가 포함된다. 상기 프로브와 표적 핵산의 결합 (일반으로, 혼성화라고도 함)은, 서열 의존적으로 일어나는 것으로 다양한 조건에서 수행될 수 있다. 일반적으로 혼성화 반응은 특정한 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 Tm 보다 약 5℃ 낮은 온도에서 이루어진다. 상기 Tm 은 표적 서열에 상보적인 프로브의 50%가 표적 서열에 결합한 상태를 의미한다. 혼성화 반응 조건의 예는, pH 7.0 내지 8.3, 0.01 내지 1.0M Na+ 이온 농도일 수 있다. 또한, 표적 핵산과 프로브의 특이성을 높이기 위하여, 표적 핵산과 프로브의 결합을 불안정하게 하는 조건, 예를 들면, 높은 온도, 높은 농도의 불안정화제(예를 들면 포름아미드)의 존재 등을 피하여 수행될 수 있다. 상기 프로브의 길이는 표적 핵산과 서열 특이적으로 결합할 수 있는 것이며, 어떠한 길이의 폴리뉴클레오티드도 포함된다. 예를 들면, 상기 프로브의 길이는, 10 내지 200 뉴클레오티드, 10 내지 150 뉴클레오티드, 10 내지 100 뉴클레오티드, 10 내지 50 뉴클레오티드, 또는 전장 유전자의 일 가닥의 길이일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 프로브는 검출가능한 표지로 표지된 것일 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 SYBR Green I 또는 각종 프로브(TaqMan Probe)의 5'-말단에는 형광물질인 FAM, 3'-말단에는 quencher인 TAMRA로 표지하고 이에 국한하지 않는다. Cy3 또는 Cy5와 같은 형광표지, 방사성 물질표지, 기질을 발색 물질로 전환시키는 효소 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

상기 프로브 또는 프로브 세트는 마이크로어레이에 고정화되어 있는 것일 수 있다.

시료 중의 바이오마커는 상기 마이크로어레이 중의 상기 프로브와 혼성화되고, 그 혼성화 결과를 측정함으로써 그 존재 여부 및 농도가 측정될 수 있다. 혼성화 과정 중 상기 표적 핵산은 검출가능한 표지로 표지될 수 있다.

상기 항체는 항원의 항원 결정기(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 다클론 항체는 본 발명의 마커 유전자가 코딩하는 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 다양한 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

또한 본 발명은 에나멜 전구 세포 (ameloblast) 판별용 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

상기 키트는 핵산 또는 항체 이외에 유전자 발현량이나 발현 패턴의 분석 방법 또는 단백질 존재량이나 존재 패턴의 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트가 유전자의 발현량이나 발현 패턴을 검출하기 위한 키트인 경우에는, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 포함하는 키트일 수 있으며, 이러한 RT-PCR 키트는 바이오마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 구체적인 실시 양상에 따라 예를 들어 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드 (dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수 (DEPCwater), 멸균수, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 등을 포함할 수 있다. 한편, 상기 키트가 단백질의 존재 량이나 존재 패턴을 검출하기 위한 키트인 경우에는, 이 키트는 예를 들어 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 포함하는 키트일 수 있으며, 이러한 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 성분들, 예를 들어 표지된 2차 항체, 발색단 (chromopores), 효소 (예를 들어, 항체와 접합된 효소) 및 그의 기질, 및 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체 등을 포함할 수 있다. 구체적인 실시 양상에 따라서는, 상기 키트는 DNA 마이크로어레이 또는 단백질 마이크로어레이를 포함할 수 있다.

상기 유전자 발현량 또는 발현패턴은 DNA 마이크로어레이 뿐 아니라 해당 유전자의 전사로 인해 생성된 mRNA 양이나 패턴을 확인하는 통상적인 생화학적 분석 방법으로 검출될 수 있다. 이러한 mRNA의 양이나 패턴을 확인하기 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay), 노던 블랏(Northern blot) 등이 있으며, 그 외에도 당업계에서 통상적으로 수행되는 어떠한 방법이라도 사용될 수 있다.

상기 방법에 따르면 시료 내의 에나멜 전구세포 존재 판별, 에나멜 전구세포 선별, 수득이 가능하며, 분화 유도 방법에 의해 에나멜 전구세포가 분화되었는지 여부를 효과적으로 확인할 수 있다.

본 발명의 발현 또는 활성을 측정하는 단계는 상기 유전자 또는 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 당 분야에 공지된 방법을 제한없이 사용할 수 있다.

일 구현예에서 확인대상 시료의 세포에서 상기 GPR56, JUP 또는 TGM2 유전자의 발현 또는 활성이 치은 상피 세포, 치은 섬유아세포 또는 BMP2, BMP4 및 TGFβ로 처리되어 분화 유도된 치은 섬유아세포 보다 증가되어 있는 경우, 상기 세포를 에나멜 전구세포로 판별할 수 있다.

또한 ACHE (acetylcholinesterase), AMTN (amelotin), CDH3 (Cadherin 3), CDH8 (Cadherin 8), CELSR1 (Cadherin EGF LAG Seven-Pass G-Type Receptor 1), CLDN4 (Claudin 4), COL17A1 (Collagen Type XVII Alpha 1 Chain), DACT2 (Dishevelled Binding Antagonist Of Beta Catenin 2), ITGB6 (Integrin Subunit Beta 6), LAMA3 (Laminin Subunit Alpha 3), LAMB3 (Laminin Subunit Beta 3), LAMC2 (Laminin Subunit Gamma 2), MMP9 (Matrix Metallopeptidase 9), MMP15 (Matrix Metallopeptidase 15), TNF (Tumor Necrosis Factor), WNT7A (Wnt Family Member 7A) 및 WNT10A (Wnt Family Member 10A) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 판별용 마커로 사용되는 경우, 상기 유전자의 발현 또는 활성이 치은 상피 세포, 치은 섬유아세포 또는 BMP2, BMP4 및 TGFβ로 처리되어 분화 유도된 치은 섬유아세포 보다 증가되어 있는 경우, 상기 세포를 에나멜 전구세포로 판별할 수 있다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 치은 조직 (gingival tissue) 유래 치은 상피 세포 배양

치은 조직으로부터 에나멜전구세포(Ameloblasts)를 확립하기 위하여, 10명의 공여자로부터 치은 조직을 얻고 이로부터 치아 일차 상피 세포를 수득하였으며, 이와 같은 과정을 도 1에 나타내었다. 무혈청 KGM 배지(serum-free keratinocyte growth medium) 에서 선택적 이동 배양을 수행하여 1 내지 2주 차에 치은 상피 세포를 수득하였다. 선택적 배양 동안, 잔여 치은 섬유아세포 (gingival fibroblasts; GF) 들은 저농도의 트립신 처리를 통해 제거하였다.

도 2의 A 에 나타낸 바와 같이, 치은 섬유아세포 (gingival fibroblasts; GF) 는 bipolar fibroblastic 형태를 형성하는 반면 (a), 치은 상피 세포(gingival epithelial; GE)는 전형적인 상피 세포 유사 형태인 polygonal 형태를 나타내었다 (b). 또한 전형적인 섬유아세포 마커인 비멘틴의 발현은 선택적인 트립신화 이후 남아있는 세포에서 현저하게 감소된 상태임을 확인 (도 2의 B) 하였으며, 이를 통해 선택적인 트립신화를 통해 인간 치은 조직 유래 일차 상피 세포가 효과적으로 분리 수득됨을 확인하였다. 이하 수득된 세포를 인간 치은조직 유래 치은 상피세포로 이용하였다.

인테그린 α-6, EpCAM, 및 p₇₅NTR 은 인간 HERS/ERM 및 외배엽성 줄기세포에서 상피 줄기세포의 마커로 사용되는 것으로 알려져 있으며, CD44, CD73, CD90 및 CD146은 중간엽 줄기세포의 마커로 알려져 있다. 따라서, 이들의 발현을 수득한 치은 상피세포에서 유세포 분석 및 FACS 분석을 통해 확인하고 이를 치은 섬유아세포에서의 발현과 비교하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 인테그린 α-6, EpCAM, 및 p₇₅NTR 의 발현은 치은 섬유아세포와 비교하여 치은 상피세포에서 각각 8.9, 2.3 및 1.9 배 더 높은 것을 확인하였다. 반면 중간엽 줄기세포의 마커로 알려진 CD44, CD73, CD90 및 CD146의 발현은 치은 섬유아세포와 비교하여 치은 상피 세포에서 각각 5.5, 8.0, 16.7 및 3.9 배 만큼 낮은 발현 수준을 나타내었다. 이러한 결과는 성인 치은 조직에서 유래된 일차 세포는 대부분 섬유아세포이지만, 선택적 트립신화 특이적 배지에 의한 배양에 의해 치은 상피세포를 성공적으로 분리할 수 있음을 나타내는 결과이다.

실시예 2. 치은 상피세포에서 에나멜 전구세포로의 분화 유도 및 마커 발현 확인

치은 상피세포를 에나멜 전구세포로 세포 분화를 유도하기 위하여, 100 ng/ml BMP4, 100 ng/ml BMP2 및/또는 10 ng/ml TGFβ1를 7일 동안 처리하고, 치은 상피 세포 (gingival epithelial cells, GE) 및 치은 섬유아세포 (gingival fibroblasts, GF) 를 각각 KGM 배지 및 10% FBS를 포함하는 α-MEM 배지를 이용하여 배양하였다. 그 후 이들의 표현형을 관찰하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 치은 상피 세포를100ng/ml BMP4 로 7일 동안 처리(b)하였을 때, 치은 상피세포의 세포성 표현형은 그들의 초기 표현형인 대조군(con, a)과 차이가 없었다. BMP2 및 BMP4 를 함께 처리한 경우(c) 역시 치은 상피세포의 상피성 표현형이 거의 변화하지 않았다. 한편 BMP4, BMP2 및 TGFβ를 치은 상피세포에 동시에 처리(e) 하였을 때, 치은 상피세포의 표현형은 치은 섬유아세포와 같은 bipolar fibroblastic 표현으로 변화하였다.

BMP4, BMP2 및 TGFβ를 처리하는 상기 치은 상피세포의 분화 유도 조건에서 에나멜 전구세포가 법랑질 형성 (amelogenesis) 동안에 발현하는 마커인 에나멜 전구세포 특이적 마커 아밀로제닌(amelogenin), 아밀로블라스틴(ameloblastin) 및 에나멜린(enamelin) 과 같은 EMP (enamel matrix proteins) 의 발현이 증가되는지 여부를 확인하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 아밀로제닌, 에나멜린, 아밀로블라스틴의 발현은 BMP4, BMP2 및 TGFβ을 동시에 처리하는 실험군에서 이들을 각각 처리하거나 BMP 2 또는 BMP4 만 단독으로 처리하는 실험군과 비교하여 각각 1.7, 4.7, 15.9 배 각각 증가하였다.

또한, 에나멜 전구세포 특이적 마커로 골아세포 마커인 BSP, OCN 및 OPN 이 증가하는지 여부를 확인하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 골아세포 마커는 모두 BMP4, BMP2 및 TGFβ 를 처리하는 실험군에서 이들을 각각 처리하거나 BMP 2 또는 BMP4 만 단독으로 처리하는 실험군과 비교하여 현저하게 증가한 것을 확인하였다.

치아의 에나멜은 뼈와 같이 고도로 미네랄화되어 있으므로, 에나멜 유사 세포에서 에나멜의 형성을 입증하기 위하여 ALP 의 활성을 추가적을 확인하였다. BMP4, BMP2 및 TGFβ 를 각각 또는 함께 7일 동안 치은 상피세포에 처리하고, 50ug/ml 아스코르브산, 10mM β및 5uM 덱사메타손을 포함하는 배지에서 배양하여 미네랄화를 유도하였다. 그 후 ALP activity assay kit (Biovision) 를 이용하여 ALP 활성을 측정하였으며, ALP 활성 측정 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, ALP 활성은 BMP2 및 BMP4 를 단독 처리한 치은 상피 세포에서는 증가하지 않았으며, BMP 2, 4 및 TGFβ 를 복합 처리하는 경우 대조군과 비교하여 2.8 배 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 치은 상피세포가 BMP2, 4 및 TGFβ의 처리에 의하여 에나멜 전구세포 유사 (ameloblast-like) 상태로 분화된다는 것을 나타내는 결과이다. 또한 BMP2, 4 및 TGFβ의 공동처리가 에나멜 전구세로의 분화에 유의적인 시너지 효과를 나타냄을 보여주는 결과이다.

실시예 3. 상피- 중간엽 전이 (epithelial- mesenchymal transition, EMT ) 에 기초한 에나멜 전구세포 세포 분화 및 신호전달 경로

EMT 는 상피세포가 중간엽성 세포로 전이되는 과정을 말하며, 치아 상피 줄기세포(dental epithelial stem cells) 에서 유도되는 것으로 알려져 있다. 치은 상피세포에 BMP2, 4 및 TGFβ를 처리하면, 이들의 다각형 표현형은 섬유아세포성 형태로 변화하였고, 섬유아세포성 마커인 비멘틴은 증가하였으며, 중간엽 세포 마커인 CD44, CD73, CD90 및 CD146 은 뚜렷하게 증가하였다. 그러나 상피 세포성 마커인 인테그린 α-6, p75NTR 및 EpCAM 은 대조군 대비 유지되거나 증가하였다.

이러한 결과는 치은 상피 세포가 BMP2, 4 및 TGFβ 처리에 의하여 중간엽성 세포로 전이됨을 보여주는 결과이다.

에나멜전구세포 세포분화에서 신호전달 경로를 확인하기 위하여, Smad 및 p38 MAPK 활성화를 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 상피세포에 사이토카인을 처리하지 않은 경우 Smad1/5/8, Smad3, 및 p38 의 인산화 신호는 치은 상피세포에서 검출되지 않았다. Smad1/5/8 및 Smad3 은 BMP2, 4 및/또는 TGFβ 처리에 의하여 세포에서 매우 높게 인산화되었다. 또한 p38 인산화는 BMP2, 4 및 TGFβ 처리에 의하여 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. MAPK 경로는 초기 치아 발달에 관여하는 것으로 알려져 있고, 이러한 결과는 상피 세포의 에나멜 전구세포 세포 분화를 위한 EMT 동안에 canonical 경로뿐만 아니라 non-canonical pathway 가 BMP2, 4 및 TGFβ 처리에 의해 자극된다는 것을 확인하는 결과이다.

실시예 4. 사이토카인 처리에 따른 에나멜전구세포 특이적 표면 마커의 확인

에나멜 전구세포 분화 동안의 유전자 발현 프로파일을 비교 분석하기 위하여 다음과 같은 4종류의 세포를 이용하여 유전자 발현 프로파일을 분석을 수행하였다: 치은 섬유아세포(gingival fibroblasts, GF), BMPs/TGFβ-1 로 처리된 치은 섬유아세포 (gingival fibroblasts treated with BMPs/TGFβ1, dGF), 치은 상피세포 (gingival epithelial cells, GE) 및 BMPs/TGFβ-1 로 처리된 치은 상피세포 (gingival epithelial cells treated with BMPs/TGFβ-1, dGE/amelo(dGE)).

분석 전 세포 상태를 표준화하기 위하여, 에나멜 전구세포 특이적 마커를 qPCR 을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 9 에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 아밀로제닌(amelogenin), 아밀로블라스틴(ameloblastin) 및 OPN 은 사이토카인 처리되지 않은 치은 상피세포와 비교하여 치은 섬유아세포에서 더 낮게 나타났다 (도 9의 a 내지 c 의 1 및 3번 bar). BMPs/TGFβ-1 처리는 GF 에서 유전자 발현의 증가를 유도하지 않았으나 BMPs/TGFβ-1 가 처리된 치은 상피세포에서 아밀로제닌, 아밀로블라스틴 및 OPN 의 발현은 현저하게 증가하였다. 이러한 결과를 통해, BMPs/TGFβ-1가 처리된 치은 상피세포는 에나멜 전구세포인 것을 다시 한번 확인하였다.

에나멜 전구세포 특이적인 마커를 발굴하기 위하여 상기 4 종류의 세포군에서 유전자 발현 양상을 확인하고 RNA-seq 를 수행하였으며, 유전자 라이브러리를 구축하고RNA-seq 분석에서 DEGs (differentially expressed genes) 분석을 수행하였다. 총 RNA 의 정제 후, RNA 순도를 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) 를 이용하여 추정하였고, mRNA 를 oligo-dT magnetic bead 를 이용하여 농축시켰다. cDNA 합성 후, 시료를 순차적으로 end-repair 시키고 TruSeq^TM RNA prep Kit (Illumina)를 이용하여 어댑터 및 poly A에 부착하였다. 400 내지 500bps 의 cDNA 절편을 BluePippin^TM system (Sage Science) 상에서 분리하고 최종 라이브러리를 구축하였다. Illumina Hiseq2500 sequencer (Illumina)를 이용하여 paired-end sequencing mode 로 시퀀싱을 수행하였다. 리드 맵핑 전, 낮은 퀄리티를 가진 상기 로우 리드들을 in-house scripts 를 통해 필터링하였고, 필터링된 리드들을 TopHat version 2.1.0을 이용하여 인간 게놈에 대하여 정렬하여 특이적으로 맵핑된 리드 짝 (lead pair) 들을 이후의 분석에 사용하였다. FPKM (fragments per kilobase of exon per million fragments) 로 유전자 발현의 수준을 계산하고, CUFFLINKS v.2.2.1 를 이용하여 DEGs 를 결정하였다.

Ensembl gene annotation에 따라 4종류의 세포 타입에서 18,313 유전자 발현을 확인하였으며, log₂FPKM ≥ 1인 유전자들을 상호 비교하고 그 결과를 표 2에 나타내었다.

[표 2]

표 2에 나타낸 바와 같이 유전자 발현의 분포는 모든 세포 타입에서 균일한 분포 형태로 나타났으며, 이는 데이터의 신뢰성을 보여준다.

또한 dGE/amelo vs. GF, dGE/amelo vs. dGF, 및 dGE/amelo vs. GE. 의 3개의 짝 비교군을 설정하고, 이에 대하여 비교를 수행하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다:

도 10에 나타낸 바와 같이, dGE/amelo (dGE) vs. GF 에서는 1531 개의 유전자 중 700 상향 조절, 831 개 하향 조절이 확인되었으며, dGE/amelo (dGE) vs. dGF 에서 1402개의 유전자 중 816 개 상향 조절, 586개 하향 조절이 확인되었다. 또한 dGE/amelo (dGE) vs. GE 에서는 250개의 상향 조절, 245개의 하향 조절이 나타나 총 495 DEGs 를 확인하였다. 1195 중 537 개의 유전자 및 1148 중 470 의 유전자는 다른 세포와 비교하여 dGE/amelo (dGE)에서 각각 높거나 낮은 발현을 나타내었다. 특히 모든 비교군에서 34개의 상향 조절 유전자 및 44개의 하향 조절 유전자를 확인하였다.

유전자 발현 데이터에 기초하여, dGE/amelo 에서의 1007 DEG 를 이용한 계층적 군집 분석 (hierarchical clustering analysis) 을 수행하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

DEGs의 GO (Gene ontology) 분석을 Metascape (http://metascape.org/gp/index.html) 을 이용하여 수행하여, DEGs 의 클러스터링 분석을 log₂FPKM 값과 Pheatmap v1.0.8을 이용하여 생성된 히트맵(heat matp)을 확인하였다. 사이토카인 처리에 의해 유도된 dGE/ameloblast 에서 하향 조절된 470 개의 유전자의 GO 분류 및 히트맵 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 하향 조절된 유전자들은 세포 주기, DNA 복제, 핵분열 및 방추 형성 과정과 관련있는 것을 확인하였으며, 이는 치은 상피 세포가 사이토카인 자극에 의하여 증식하지 않는다는 것을 보여주는 결과이다.

사이토카인 처리에 의해 유도된 dGE/ameloblast 에서 상향 조절된238 개의 유전자의 GO 분류 및 히트멥 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 537 개중 238개의 상향 조절된 유전자는 뚜렷하게 세포 표면, 자극에 대한 세포 반응, 사이토카인 생산, 발달 과정, 세포외 구조 조직, 세포 내 신호 전달, 세포 부착 조절 및 세포 이동성 조절로 이루어진 8개의 주요 GO 카테고리로 재분류되었다.

이를 통해 증식 관련 유전자의 하향조절과 반대로, 발달 과정과 연관된 유전자들은 dGE/amelo 에서 상향 조절됨을 확인하였다. 에나멜 전구세포 특이적 세포 마커의 확인 및 선별을 위하여, GO 카테고리 중에서도 '세포 표면', '세포외 형성' 및 '세포 부착'과 같은 카테고리를 분석하였으며, 그 결과로 dGE 의 전사체 특징(transcriptome signatures) 및 생물학적인 영향을 분석하여, 20개의 유전자를 동정하고 이를 도 14에 나타내었다. 이들은 에나멜 전구세포 형성과 관련되어 있는 유전자이다: ACHE, AMTN, CDH3, CDH8, CELSR1, CLDN4, COL17A1, DACT2, GPR56, ITGB6, JUP, LAMA3, LAMB3, LAMC2, MMP9, MMP15, TGM2, TNF, WNT7A, 및 WNT10A .

각 선별된 유전자에 대한 정보를 표 3에 나타내었다.

[표 3]

상기와 같이 선별된 총 20 종의 유전자들은 다른 세포와 비교하여 에나멜 전구 세포에서 뚜렷하게 발현이 변화되는 유전자로 에나멜 전구 세포의 특이적 세포 표면 마커로 활용할 수 있음을 확인하였다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims

GPR56 (Adhesion G Protein-Coupled Receptor G1)을 포함하는 에나멜 전구 세포 (ameloblast) 판별용 조성물.
제1항에 있어서, JUP (Junction Plakoglobin), TGM2 (Transglutaminase 2), ACHE (acetylcholinesterase), AMTN (amelotin), CDH3 (Cadherin 3), CDH8 (Cadherin 8), CELSR1 (Cadherin EGF LAG Seven-Pass G-Type Receptor 1), CLDN4 (Claudin 4), COL17A1 (Collagen Type XVII Alpha 1 Chain), DACT2 (Dishevelled Binding Antagonist Of Beta Catenin 2), ITGB6 (Integrin Subunit Beta 6), LAMA3 (Laminin Subunit Alpha 3), LAMB3 (Laminin Subunit Beta 3), LAMC2 (Laminin Subunit Gamma 2), MMP9 (Matrix Metallopeptidase 9), MMP15 (Matrix Metallopeptidase 15), TNF (Tumor Necrosis Factor), WNT7A (Wnt Family Member 7A) 및 WNT10A (Wnt Family Member 10A) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는, 에나멜 전구 세포 (ameloblast) 판별용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 에나멜 전구 세포는 TGFβ1 (Transforming growth factor β1), BMP2 (bone morphogenetic protein 2) 및 BMP4 (bone morphogenetic protein 4) 처리에 의해 치은 상피세포로부터 분화 유도된 것을 특징으로 하는, 에나멜 전구 세포 (ameloblast) 판별용 조성물.
제1항에 기재된 유전자의 발현 또는 활성; 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는 에나멜 전구 세포 (ameloblast) 판별용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 에나멜 전구 세포 (ameloblast) 판별용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 제제는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)인 것을 특징으로 하는, 에나멜 전구 세포 (ameloblast) 판별용 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 에나멜 전구세포 판별용 키트.
세포에서 GPR56 (Adhesion G Protein-Coupled Receptor G1)의 발현 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 에나멜 전구세포 판별 방법.
제8항에 있어서, 상기 GPR56 유전자의 발현 또는 활성이 치은 상피 세포 또는 치은 섬유아세포보다 증가되어 있는 경우, 상기 세포를 에나멜 전구세포로 판별하는 것을 특징으로 하는, 에나멜 전구세포 판별 방법.