JP6068354B2 - 母体血液中の胎児細胞の濃縮及び同定及びこれに使用するリガンド - Google Patents

母体血液中の胎児細胞の濃縮及び同定及びこれに使用するリガンド Download PDF

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Description

胎児疾患及び遺伝的異常の早期発見のための胎児細胞の検査は、多くの妊娠、特に母体年齢が高い場合(35歳以上)或いは家族に遺伝的疾患が知られている場合の妊娠に関連して実施される。胎児細胞は、羊水穿刺、即ち羊膜嚢内の羊膜腔からの羊水の取り出し、或いは胎盤から生険材料を取り出す絨毛生検という所謂侵襲的試料採取により取得し得る。
出生前異数性スクリーニングでは、異常頻度の最も高い染色体、特に、胎児の13番、18番、21番、X、及びY染色体の数的異常を解明するための従来の染色体分析又は染色体特異的DNAプローブを利用する。
上述した試料採取方法の侵襲性及び流産のリスクのため、例えば、母体血液試料の使用等、非侵襲的手法により胎児診断を行うことが有利となる。
妊娠中、胎児を起源とする様々な細胞種は、胎盤を通過して母体末梢血中を循環する。母体循環内の胎児細胞を診断目的で使用することは、胎児細胞が非常に限られた数しか母体血液に存在せず、報告されている数が105乃至108個の有核母親細胞当たり胎児細胞1個、又は母体血液1ml当たり胎児細胞1乃至10個からであるという事実により実現が妨げられている。加えて、殆どの胎児細胞は、形態のみを基準に母親細胞から区別することが不可能であるため、胎児細胞を同定する代替方法が研究されてきた。
US2007/0015171には、胎児DNAを単離及び検出する非侵襲的方法が記載されている。方法では、母親細胞と特異的に結合する抗体及び/又は胎児細胞と特異的に結合する抗体を用いて、母体血液試料を濃縮する。発明者らは、具体的に挙げた幾つかの抗体の使用を提案している。HLe-1は、成人の白血球及び非常に未成熟な赤血球前駆体には存在するが、成熟した有核赤血球には存在しない抗原を認識する抗体である。したがって、この抗体を用いて、胎児の有核赤血球を認識せずに母親の赤血球を認識できることが示唆されている。抗単球抗体(M3)及び抗リンパ球抗体(L4)も、試料から母親細胞を除去のために提案されている。最後に、執筆者らは、胎児細胞上のトランスフェリン受容体(TfR)を認識するモノクローナル抗体を用いることを提案している。単離された胎児細胞からのDNAは、その後、検出及び診断に利用することができる。
WO2008/132753には、アネキシンIV、サイトケラチン7、サイトケラチン8、及びサイトケラチン19からなる群から選択されたトロホブラストマーカの発現を生体試料の細胞内で検出することによりトロホブラストを同定する方法が記載されている。トロホブラストは、哺乳類胚又は胎児の胎盤に由来する上皮細胞とされ、トロホブラストは、通常、子宮壁に接触している。絨毛細胞栄養芽層、合胞栄養芽層、及び絨毛外栄養芽層という3種類のトロホブラストに言及している。重要な点として、発明者らは、ビメンチンに対してモノクローナル抗体を用い、妊娠第一期の胎盤から単離したトロホブラストの線維芽細胞の汚染の範囲を推定している。したがって、これらの発明者により単離されたトロホブラストは、ビメンチンを含んでいない。
Gussinら(2004)は、造血培養条件に反応しない母体血液中の胎児細胞は、内皮細胞を表すという仮説を立てた。Gussinらは、胎児を起源とする内皮前駆細胞を、CD133又はCD105の発現に基づいて母体血液から選択し、培養下で増殖させ得るかを研究した。執筆者らは、母親の血液から単離したCD133+及びCD105+細胞を内皮の条件下においてin vitroで増殖可能であると結論している。こうした細胞は、胎児ではなく、母親が起源であると思われる。
したがって、出生前検出及び診断を容易にするために、母体血液試料から胎児細胞を単離する改良された方法に対する必要性が依然として存在する。
本発明は、母体血液試料の胎児細胞の同定及び/又は濃縮に使用可能な抗原の同定に基づく。特に、本発明は、母体血液試料中の胎児細胞が内皮及び上皮両方の特性を示すという驚くべき発見に基づく。この転換を利用することにより、発明者らは、母体血液試料中の胎児細胞を濃縮及び同定する新規の方法を提供すると共に、この目的で新規の抗原を開示する。
本発明の好適な第一の実施形態では、母体血液試料を内皮細胞マーカと接触させることにより、内皮表現型を有する細胞は、前記内皮細胞マーカに特異的な細胞を選択することで濃縮される。こうした母体血液試料中の胎児細胞を同定する方法は、
a. 母体血液試料又はその画分を提供するステップと、
b. 内皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は内皮細胞マーカに結合するリガンドに、前記試料を接触させるステップと、
c. 前記内皮細胞マーカに特異的な細胞を濃縮するステップと、
d. 上皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は上皮細胞マーカに対するリガンドに、内皮表現型を示すb)において選択された細胞を接触させるステップと、
e. ステップc)の上皮細胞マーカにも結合する、内皮表現型を有する細胞を検出するステップと、
f. 随意により、d)において検出された細胞の遺伝的内容を診断及び/又は予測するステップと、を備え、
ステップb乃至eは、任意の順序で実行し得る。
X及びY特異的プローブにより同定した男児胎児細胞を示す図である。矢印は、胎児細胞を示す。 母体血液1ml当たりの胎児細胞の頻度を示す図である。 パンサイトケラチン染色を示す胎児細胞を示す図である。矢印は、胎児細胞を示す。 サイトケラチン7染色を示す胎児細胞を示す図である。矢印は、胎児細胞を示す。 ビメンチン染色を示す胎児細胞を示す図である。矢印は、胎児細胞を示す。 サイトケラチン(緑)と、21番染色体(赤)及びX染色体(青)に対するFISHプローブとにより染色した胎児細胞を示す図である。矢印は、胎児細胞内の21番染色体の3個のコピーを示す。母親細胞の背景は、それぞれ21番染色体の2個のコピーを含む。
本発明は、母体血液試料の胎児細胞の同定及び/又は濃縮に使用可能な抗原の同定に基づく。特に、本発明は、母体血液試料中の胎児細胞が内皮及び上皮両方の特性を示すという驚くべき発見に基づく。本発明は、母体血液試料中に存在する胎児細胞が、血液中の正常な母親細胞には生じない特有の転換を起こすことを初めて開示する。既に初期胚盤胞期から、胚細胞は、3つの胚葉、即ち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉に分化する。中胚葉は、筋肉、脂肪、血管等の軟組織の細胞を表す。外胚葉及び内胚葉は、外表面及び内表面を覆う上皮細胞を表す。中胚葉及び外胚葉細胞は、マーカ発現パターンにおいて明確な差を有する。
上皮間葉転換(EMT)は、上皮細胞が上皮の特性を失い、間葉様表現型を得る過程である。EMTは、胚上皮細胞の移動及び過渡的な脱分化が神経管の形成等に必要となる初期の胚形成において説明されている。
EMTは、更に、幾つかの発癌経路がEMTを引き起こす癌に関連して説明されている。EMTは、近年、特に転移過程に関連して研究されている。
本発明は、母体血液中に存在する胎児細胞がEMTを起こすという本発明者らによる認識に関し、この特性を利用することにより、本発明は、母体血液試料中に存在する胎児細胞を単離及び同定する新規の方法を提供する。中胚葉マーカ(即ち、内皮マーカ)を正の選択マーカとして利用することにより、母体血液試料中にごく少数存在する胎児細胞を一部の母親細胞と共に濃縮する。その後、残存細胞を上皮マーカに接触させることにより、EMT現象を利用して、胎児細胞の正の同定を行う。血液試料中に存在する正常な母親細胞には、上皮マーカを発現するものは存在しない。
この転換を利用することにより、本発明者らは、母体血液試料中の胎児細胞を濃縮及び同定する新規の方法を提供すると共に、この目的で新規の抗原を開示する。
したがって、本発明の方法は、内皮細胞マーカを発現する細胞を単離し、その後、更に上皮細胞マーカを発現する細胞を検出することを含む。
特定された抗原は、mRNA又はmRNAによりコードされたタンパク質(抗原)を検出又は定量化することにより、母体血液試料中の胎児細胞の同定に使用し得る。本明細書での使用において、検出という用語は、検出と定量化との両方を含む。しかしながら、2つの別個の実施形態において、検出という用語は、検出又は定量化の何れかを含む。一般に、当業者は、検出が定量化も含む場合、即ち、mRNAレベル又はmRNAによりコードされたタンパク質のレベルを定量化することに関する場合を認識するであろう。これは、例えば、母親細胞内に低レベルで発現される(但し、欠如していない)特定のmRNAを、同じmRNAが胎児細胞では例えば3倍高いレベルで発現される場合に検出するために必要となり得る。
本明細書において濃縮という用語が使用される場合には、試料中に存在する他の任意の細胞からの1個以上の細胞の単離が含まれる。一実施形態において、濃縮された細胞(群)は、試料から単離されず、試料中に依然として存在する間に、細胞(群)に対して任意の診断が実行される。試料は、その後、スライドガラスに配置して、顕微鏡を用いて診断を実施してよく、この実施形態において、細胞は、単離ではなく検出される。
本発明の他の発見は、母体試料の細胞を固定するステップが、試料からの胎児細胞の同定及び濃縮に非常に役立つことである。固定ステップは、本明細書に開示した胎児細胞を濃縮及び/又は同定する方法と共に、或いは、先行技術に記載された胎児細胞を濃縮及び/又は同定する方法と共に、実行し得る(例えば、背景の節において説明したUS2007/0015171)。
母体血液試料の細胞の固定
本発明の一実施形態において、発見は、母体血液試料の細胞の固定が、例えば詳しく上述したような胎児細胞の濃縮及び同定を可能にしつつ、母体血液試料中の胎児細胞の安定性を大きく高めることである。一実施形態において、固定手順は、試料採取(即ち、第一の実施形態で説明した方法のステップa)直後の非濃縮血液試料に対して実行することが可能であり、結果として、母体血液試料中の細胞成分が固定される。同時に、固定は、軽度であるため、その後の溶解ステップにおいて、母体赤血球を選択的に溶解させることができる。固定は、一実施形態において、第一の実施形態で説明した方法のステップa乃至dの任意の適切な時点に実施し得る。一実施形態において、固定は、第一の実施形態で説明した方法のステップaの後に実施される。他の実施形態において、固定は、第一の実施形態で説明した方法のステップbの後に実施される。他の実施形態において、固定は、第一の実施形態で説明した方法のステップcの後に実施される。更に他の実施形態において、固定は、第一の実施形態で説明した方法のステップdの後に実施される。
好適な実施形態において、「発明の概要」に記載の本発明の第一の実施形態の方法は、
a. 母体血液試料又はその画分を提供するステップと、
b. 前記母体血液試料の細胞を固定するステップと、
c. 内皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は内皮細胞マーカに結合するリガンドに、前記試料を接触させるステップと、
d. 前記内皮細胞マーカに特異的な細胞を濃縮するステップと、
e. 上皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は上皮細胞マーカに対するリガンドに、内皮表現型を示すb)において選択された細胞を接触させるステップと、
f. ステップc)の上皮細胞マーカにも結合する、内皮表現型を有する細胞を検出するステップと、
g. 随意により、d)において検出された細胞の遺伝的内容を診断及び/又は予測するステップと、を備え、
ステップc乃至eは、任意の順序で実行し得る。
したがって、本発明の一実施形態は、
a. 母体血液試料又はその画分を提供するステップと、
b. 試料を固定溶液に接触させるステップと、を備える方法である。
好ましくは、母体血液試料は、試料が取得された直後に固定溶液に接触させる。本文脈において使用される「直後」という用語は、固定溶液に接触させる前に、試料に他の如何なる操作も施さないことを意味する。好ましくは、試料は、試料提供後24時間以内に固定溶液に接触させる。更に好ましくは、試料は、試料提供後12時間以内、例として8時間、4時間、2時間、1時間、30分、15分以内に、固定溶液に接触させる。更に好ましくは、試料は、試料提供後1時間以内に固定溶液に接触させる。
他の好適な実施形態において、固定溶液は、全血に添加され、好ましくは、その後、例えば重力による沈殿又は遠心分離による沈殿等、任意の沈殿ステップが行われる。
固定は、好ましくは、1乃至60分間に亘り行われる。更に好ましくは、固定は、5乃至30分間、最も好ましくは5乃至15分間、例として10分間に亘り行われる。
固定溶液は、好ましくは2.5%乃至7.5%、更に好ましくは3%乃至6%、最も好ましくは4%乃至5%のパラホルムアルデヒドを含む。
パラホルムアルデヒドに加え、固定溶液は、好ましくは、塩を、0.05M乃至0.3Mの濃度で含む。更に好ましくは、濃度は、0.1乃至0.2Mであり、最も好ましくは0.125乃至0.175Mの濃度である。塩は、好ましくは、LiCl、KCl、NaCl、又はPBSであり、PBSが最も好ましい。
上述した固定溶液の濃度を使用する場合、0.2乃至10倍量の固定溶液を固定のため母体血液試料に添加し、更に好ましくは0.5乃至5倍量を添加し、最も好ましくは1乃至3倍量を添加する。通常、2/3倍量を添加する。更に他の実施形態では、1/3乃至3/3倍量、例えば2/3倍量の固定溶液を添加することが好ましい。
固定溶液を母体血液試料に添加後に所望の最終濃度とする等のために、固定溶液の様々な濃度及び希釈倍数を調整可能であることは、当業者には明らかであろう。好ましくは、パラホルムアルデヒドの最終濃度は、2乃至6%、更に好ましくは3乃至5%、最も好ましくは3.5%乃至4.5%である。一般的な最終濃度は、4%である。
好ましくは、固定ステップの後には、
c. ステップaの固定した試料を溶解緩衝液に接触させること、を含む溶解のステップが続く。
溶解緩衝液は、一般に、非イオン界面活性剤、好ましくは、Triton X-100を含む。界面活性剤の好適な濃度は、0.01%(w/w)乃至0.5%、更に好ましくは0.05%乃至0.3%、最も好ましくは0.1%である。
好適な実施形態において、溶解ステップは、固定ステップの直後に実施される。つまり、固定及び溶解は、共に第一の実施形態で説明した方法のステップaの後、ステップbの前に行われる。即ち、溶解溶液は、例えば10分間の固定後、試料に直接添加される。溶解は、一般に、15乃至120分間、更に好ましくは30乃至60分間、最も好ましくは40乃至45分間に亘り行われる。
上述したように、溶解ステップは、驚くべきことに、母体赤血球の選択的溶解を可能にする。
本発明の他の実施形態は、上述したように、母体血液試料又はその画分中の母体赤血球を選択的に溶解するための溶解緩衝液の使用である。好適な実施形態において、溶解緩衝液は、本発明の方法において用いるためのものであり、溶解緩衝液は、第一の実施形態で説明した方法のステップaの後に、母体血液試料又はその画分に添加し得る。
母体血液試料のリガンド又はプローブとの接触
本発明の一実施形態は、母体血液試料中の胎児細胞を選択する方法であって、
a. 母体血液試料又はその画分を提供するステップと、
b. 試料を、
i. 内皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は
ii. 内皮細胞マーカに対するリガンドに、接触させるステップと、
c. 先行ステップの前記ハイブリダイゼーションプローブ又は前記リガンドに結合した細胞を選択し、これにより、先行ステップの前記ハイブリダイゼーションプローブ又は前記リガンドに結合した細胞に関して、前記試料を濃縮するステップと、
d. ステップの(濃縮)試料を、
i. 上皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は
ii. 上皮細胞マーカに対するリガンドに、接触させるステップと、を備える方法を提供する。
好ましくは、方法は、更に、試料の胎児細胞を同定するステップを備える。明らかとなるように、同定は、好ましくは、胎児細胞上又は細胞内の上皮細胞マーカに対するリガンドの存在を検出すること、或いは、胎児細胞上又は細胞内の上皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブの存在を検出することを含む。
好適な実施形態において、母体血液試料は、内皮細胞マーカ又は前記マーカをコードする遺伝子と結合するリガンド又はハイブリダイゼーションプローブに接触させ、これにより、内皮表現型を有する細胞は、前記内皮細胞マーカに特異的な細胞を選択することで濃縮される。こうした方法は、
a. 母体血液試料又はその画分を提供するステップと、
b. 内皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は内皮細胞マーカに対するリガンドに、前記試料を接触させるステップと、
c. 前記内皮細胞マーカに特異的な細胞を選択し、これにより、内皮表現型を有する細胞に関して前記試料を濃縮するステップと、
d. 上皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は上皮細胞マーカに対するリガンドに、内皮表現型を示すc)において選択された前記細胞を接触させるステップと、
e. ステップd)の前記上皮細胞マーカにも結合する、内皮表現型を有する細胞を検出するステップと、
f. 随意により、e)において検出された前記細胞の遺伝的内容を診断及び/又は予測するステップと、を備え、
ステップb乃至eは、任意の順序で実行し得る。
一実施形態において、上述したステップb、c、d、e、及びfを任意の順序、好ましくは上述した順序又はb、d、c、e、fの順序、更に好ましくは上述した順序で行ってよいことは、当業者には公知であろう。したがって、一実施形態では、試料を内皮細胞マーカに対するハイブリダイゼーションプローブ又はリガンドに接触させることに続いて、同じ試料を上皮細胞マーカに対するハイブリダイゼーションプローブ又はリガンドに接触させ、その後、選択ステップを行う。
好適な実施形態において、内皮細胞マーカは、CD105、CD146又はCD141、ビメンチン、VCAM、ICAM、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、ITGA5、ITGB5、CDH11又はCDH3からなる群から選択される。本発明の内皮マーカは、内皮細胞内又は細胞上で主に発現されるマーカである。前記内皮マーカは、他の如何なる細胞種内又は細胞種上においても特に発現されない。
最も好適なものは、CD105(配列番号1及び配列番号2)である。
好適な実施形態において、上皮細胞マーカは、CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK9、CK10、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、又はCK19からなる群から選択される。本発明の上皮マーカは、上皮細胞内又は細胞上において主に発現されるマーカである。前記上皮マーカは、他の如何なる細胞種内又は細胞種上においても特に発現されない。
好適な実施形態において、方法は、更に、試料をM30抗体(又はアポトーシスCK18に対する他のリガンド)に接触させることを含む。好適な実施形態において、上皮マーカは、CK4、CK5、CK6A、CK6B、CK7、CK8、CK10、CK13、及びCK18からなる群から選択される。最も好ましいものは、CK18(配列番号12及び配列番号13)である。
本発明において使用する抗原及びコード遺伝子を表1に特定する。
第一の実施形態で説明した方法のステップbにおいて用いる抗原、及びコード遺伝子は、表2から選択されることが好ましい。したがって、発明の概要において説明した本発明の第一の実施形態の方法のステップb)の内皮細胞マーカは、表2の遺伝子によりコードされたマーカから選択されることが好ましい。
第一の実施形態で説明した方法のステップdにおいて用いる抗原、及びコード遺伝子は、表3から選択されることが好ましい。したがって、発明の概要において説明した本発明の第一の実施形態の方法のステップd)の上皮細胞マーカは、表3の遺伝子によりコードされたマーカから選択されることが好ましい。
第一の実施形態(発明の概要参照)において説明した方法のステップb及びdのハイブリダイゼーションプローブは、遺伝子のコード鎖又は非コード鎖に対して相補的となり得ることに留意されたい。好ましくは、プローブは、コード鎖(非テンプレート鎖)に対して相補的となる。関連する実施形態において、プローブは、mRNAを対象とする。mRNAを対象とする場合、プローブは、スプライス部位を対象としてよく、即ち、配列はDNAにおいて分割される。
「その画分」という用語は、母体血液試料をリガンド又はハイブリダイゼーションプローブに直接接触させ得ること、或いはリガンド又はハイブリダイゼーションに接触させる時に元の母体血液試料の画分のみを含むように、母体血液試料を前処理し得ることを示すために用いられる。母体血液試料には、リガンド又はハイブリダイゼーションプローブと接触させる前に、例えば、細胞の高濃度化、凝固ステップ、又は濃縮ステップを施し得る。
好適な実施形態において、方法は、
a. 母体血液試料又はその画分を提供するステップと、
b. 試料を、
i. ヒトビメンチンをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ及び/又は
ii. ヒトビメンチンに対するリガンドに、接触させるステップと、を含む。
他の好適な実施形態において、方法は、
a. 母体血液試料又はその画分を提供するステップと、
b. 試料を、
i. ヒトサイトケラチン7をコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ及び/又は
ii. ヒトサイトケラチン7に対するリガンドに、接触させるステップと、を含む。
更に好適な実施形態において、方法は、
a. 母体血液試料又はその画分を提供するステップと、
b. 試料を、
i. CD105をコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個のヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ及び/又は
ii. CD105(配列番号1又は配列番号2)に対するリガンドに、接触させるステップと、
c. 試料を
i. サイトケラチン7(配列番号7)をコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ及び/又は
ii. ヒトサイトケラチン7に対するリガンドに、好適な実施形態においてCD105である内皮マーカに母体血液試料を接触させた後、接触させるステップと、を含む。
更に他の好適な実施形態において、方法は、
a. 母体血液試料又はその画分を提供するステップと、
b. 試料を、
i. ヒトサイトケラチン1乃至6、8、10、及び13乃至19をコードする遺伝子からなる群内の遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含む交差反応ハイブリダイゼーションプローブ及び/又は
ii. ヒトサイトケラチン1乃至6、8、10、及び13乃至19に対する交差反応リガンドに、接触させるステップと、を含む。
本実施形態において、リガンドは、複数のサイトケラチン、即ち、サイトケラチン1乃至6、8、10、及び13乃至19と結合することができる。この交差反応は、リガンドをサイトケラチンの保存(同一)領域に方向付けることにより達成可能となる。同様に、交差反応ハイブリダイゼーションプローブは、上述したサイトケラチンをコードする遺伝子の保存(同一)領域にプローブを方向付けることにより設計可能となる。
好適な実施形態において、方法は、
a. 母体血液試料又はその画分を提供するステップと、
b. 試料を、
i. CD105をコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個のヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ及び/又は
ii. CD105に対するリガンドに、接触させるステップと、
c. 試料を
i. ヒトサイトケラチン1乃至6、8、10、及び13乃至19をコードする遺伝子からなる群内の遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含む交差反応ハイブリダイゼーションプローブ及び/又は
ii. ヒトサイトケラチン1乃至6、8、10、及び13乃至19に対する交差反応リガンドに、接触させるステップと、を含む。
更に他の実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブ又はリガンド(各抗原又は遺伝子に対して1つ)の混合物を、交差反応ハイブリダイゼーションプローブ又は交差反応リガンドの代わりに用いる。
こうした一実施形態において、方法は、
a. 母体血液試料又はその画分を提供するステップと、
b. 試料を、
i. CD105をコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個のヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ及び/又は
ii. CD105に対するリガンドに、接触させるステップと、
c. 試料を
i. ヒトサイトケラチン1乃至6、8、10、及び13乃至19をコードする遺伝子からなる群内の遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ群、ヒトサイトケラチン7をコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ、及びヒトビメンチンをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブを含むハイブリダイゼーションプローブの混合物、及び/又は
ii. ヒトサイトケラチン1乃至6、8、10、及び13乃至19に対する交差反応リガンド、ヒトサイトケラチン7に対するリガンド、及びヒトビメンチンに対するリガンドを含むリガンドの混合物に、接触させるステップと、を含む。
好適な実施形態では、その後、内皮(即ち、CD105)及び上皮マーカ(即ち、サイトケラチン7)の両方に反応する細胞を、更なる解析のため同定及び選択する。
好適な実施形態において、ステップbでは、後述するハイブリダイゼーションプローブを利用することが好ましく、ステップdでは、後述するリガンドを利用する。
全血の選択
一実施形態において、第一の実施形態で説明した方法のステップaの母体血液試料は、全血であり、即ち、血液には、内皮細胞マーカに対するリガンド又は内皮細胞マーカをコードする遺伝子に対するハイブリダイゼーションプローブに接触させる前に、如何なる分画も施さない。
固定及び選択的溶解
本発明の好適な一実施形態において、母体血液試料の細胞は、本発明の一実施形態において説明したように固定される。母親細胞の数は、母体血液試料中に存在する胎児細胞の数を大きく上回るため、濃縮のステップを含め、これにより解析対象の試料から母親細胞を除去することが有用となり得る。濃縮ステップは、手順中の任意の適切な時点で行ってよく、第一の実施形態で説明した方法のステップaの後のステップとして行うことが最も適切となる。胎児細胞を全く除去しないためには、濃縮ステップでは、異なる胎児有核細胞種を区別しないことが好適となる。血液試料中の母親細胞の大きな部分は、赤血球により構成される。赤血球を除去する幾つかの方法が公知であり、最も都合の良いものは、NH4Clの仲介による溶解により達成し得る赤血球溶解である。そのため、好適な実施形態において、母体赤血球は、固定直後に選択的に溶解させる。したがって、母体血液試料中の胎児細胞を同定する方法は、
a. 母体血液試料又はその画分を提供するステップと、
b. 前記母体血液試料に赤血球溶解を施して、胎児細胞を濃縮するステップと、
c. 残存細胞を固定するステップと、
d. 内皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は内皮細胞マーカに結合するリガンドに、試料を接触させるステップと、
e. 前記内皮細胞マーカに特異的な細胞を濃縮するステップと、
f. 上皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は上皮細胞マーカに対するリガンドに、内皮表現型を示すb)において選択された細胞を接触させるステップと、
g. ステップc)の上皮細胞マーカにも結合する、内皮表現型を有する細胞を検出するステップと、
h. 随意により、d)において検出された細胞の遺伝的内容を診断及び/又は予測するステップと、を備え、
ステップb乃至eは、任意の順序で実行してよく、好ましくは上述した順序で実行し得る。
透過化処理
更に他の実施形態において、母体血液試料の細胞には、上述したリガンド又はハイブリダイゼーションプローブに接触させる前に透過化処理を施す。即ち、透過化ステップは、第一の実施形態で説明した方法のステップbの前に行われる。このステップは、好ましくは、試料をメタノール、アセトン、又はサポニンに接触させることを含む。好ましくは、透過化剤は、メタノールである。したがって、母体血液試料中の胎児細胞を同定する方法は、
a. 母体血液試料又はその画分を提供するステップと、
b. 前記母体血液試料の細胞を透過化するステップと、
c. 内皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は内皮細胞マーカに結合するリガンドに、試料を接触させるステップと、
d. 前記内皮細胞マーカに特異的な細胞を濃縮するステップと、
e. 上皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は上皮細胞マーカに対するリガンドに、内皮表現型を示すb)において選択された細胞を接触させるステップと、
f. ステップc)の上皮細胞マーカにも結合する、内皮表現型を有する細胞を検出するステップと、
g. 随意により、d)において検出された細胞の遺伝的内容を診断及び/又は予測するステップと、を備え、
ステップb乃至eは、任意の順序で実行し得る。
正の選択
好ましくは、抗原依存濃縮は、母体血液試料を、実施例の節及び本発明の一実施形態において説明するCD105に対する抗体に接触させることを含む。即ち、一実施形態において、第一の実施形態で説明した方法のステップbは、抗原依存ステップである。
好適な実施形態において、母体血液試料は、上皮細胞に対するリガンド又はハイブリダイゼーションプローブに接触させる前(即ち、第一の実施形態で説明した方法のステップdの前)に、固定し、溶解させ、CD105に対する抗体を用いて濃縮する。
効率
本発明の好適な実施形態は、胎児細胞の同定のために解析する必要がある個別細胞数を劇的に低下させることから、胎児細胞の同定の商業化が可能となる。本発明は、試料中の細胞数を、10乃至20分の1とし、約20乃至30枚のスライドの自動走査を用いて解析可能にする。即ち、本発明は、胎児細胞の同定に用いるための胎児細胞特異的抗原を提供するだけではない。本発明は、更に、胎児細胞の同定のために解析対象となる細胞数を劇的に減少させる濃縮方法を提供する。方法は、母体血液試料の胎児細胞0.1乃至1.1個/mlの安定した同定を、僅かスライド20乃至30枚/合計細胞数106乃至107の解析により可能にする。
細胞に覆われるスライドの面積は、一般に15mm×15mmであり、これは方法の効率を更に裏付ける。
ハイブリダイゼーションプローブ
「発明の概要」節内の本発明の第一の実施形態で説明した方法のステップb及びdのハイブリダイゼーションプローブは、当該技術分野において一般的に使用されるものであり、通常はDNA又はRNA、好ましくはDNAである。好適な実施形態において、プローブは、結合親和性及び/又は結合特異性を高める非天然ヌクレオチドにより修飾される。こうした非天然ヌクレオチドの好適な例は、LNA(ロックド核酸)、TINA(ツイステッドインターカレーティング核酸)、PNA(ペプチド核酸)、INA(インターカレーティング核酸)、モルホリノ、及び2’O-メチルRNA単量体及び2’O-(2-メトキシエチル)RNA等の2’O-置換RNA単量体である。
プローブの長さは、任意の適切な長さ、例として、10乃至200ヌクレオチド、好ましくは10乃至30ヌクレオチド、更に好ましくは15乃至25ヌクレオチドの範囲としてよく、好ましくは、プローブは、ヒトサイトケラチン1、2、3、4(配列番号3)、5(配列番号4)、6A(配列番号5)、6B(配列番号6)、7(配列番号7)、8(配列番号8)、10(配列番号9)、13(配列番号10及び配列番号11)、14、15、16、17、18(配列番号12及び配列番号13)、及び19、CD105(配列番号1及び配列番号2)、及び/又はヒトビメンチンをコードする遺伝子に対して、プローブの全長に渡って完全に相補的である。
一実施形態において、プローブは、表1乃至3、好ましくは表2に記載のタンパク質の何れかをコードする遺伝子に対して、少なくとも85%の相補性、例として少なくとも90%の相補性、例えば少なくとも95%の相補性を、プローブの全長に渡って有する。プローブは、前記タンパク質をコードするDNA又はmRNAに対して相補性を有し得る。
一実施形態において、プローブは、ヒトサイトケラチン1、2、3、4(配列番号3)、5(配列番号4)、6A(配列番号5)、6B(配列番号6)、7(配列番号7)、8(配列番号8)、10(配列番号9)、13(配列番号10及び配列番号11)、14、15、16、17、18(配列番号12及び配列番号13)、及び19、CD105(配列番号1及び配列番号2)、 及び/又はヒトビメンチンをコードする遺伝子に対して、少なくとも85%の相補性、例として少なくとも90%の相補性、例えば少なくとも95%の相補性を、プローブの全長に渡って有する。プローブは、前記タンパク質をコードするDNA又はmRNAに対して相補性を有し得る。
好適な一実施形態において、プローブは、CD105(配列番号1及び配列番号2)をコードする遺伝子に対して、プローブの全長に渡って完全に相補的である。他の好適な実施形態において、プローブは、CK18(配列番号12及び配列番号13)をコードする遺伝子に対して、プローブの全長に渡って完全に相補的である。
一実施形態において、「発明の概要」節内の本発明の第一の実施形態で説明した方法のステップbにて使用するハイブリダイゼーションプローブは、CD105、ビメンチン、VCAM、ICAM、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PAI-1、及びEPCRからなる群から選択されたタンパク質をコードするヌクレオチドにハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブから選択し得る。
最も好適なものは、CD105(配列番号1及び配列番号2)である。
一実施形態において、第一の実施形態で説明した方法のステップdにて使用するハイブリダイゼーションプローブは、CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、及びCK19からなる群から選択されるタンパク質をコードするヌクレオチドにハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブから選択し得る。
最も好適なものは、CK18(配列番号12及び配列番号13)である。
レポータ染料
「発明の概要」節内の本発明の第一の実施形態で説明した方法のステップb及びdにおいて本発明により使用すべきハイブリダイゼーションプローブ及びリガンドは、レポータ染料(本明細書では標識とも呼ばれる)を含むか、或いは、好ましくはレポータ染料と結合し得る。前記ハイブリダイゼーションプローブ又はリガンドは、好ましくは、レポータ染料と共有結合する。レポータ染料は、好ましくは、蛍光レポータ染料である。好ましくは、レポータ染料は、FAMTM、TETTM、JOETM、VICTM、SYBR(登録商標) Green、6FAM、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、フルオレセイン、Cy3、Cy5、Cy5.5、テキサスレッド、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、6-カルボキシローダミン6G、Alexa Fluor、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、及びオレゴングリーン514からなる群から選択される。
一実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、更に、クエンチャ染料を含む。好適な実施形態において、クエンチャ染料は、TAMRATM、Black Hole QuencherTM、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、DDQ I、DDQ II、及びEclipse Dark Quencherからなる群から選択される。
レポータ及びクエンチャ染料の使用は、同定に加え様々な種類の定量化が可能となることから望ましい。
通常、レポータ染料及びクエンチャ染料は、ハイブリダイゼーションプローブ内で互いの近くに配置され、レポータが発する光又はレーザ誘起蛍光がクエンチャ染料により消光されるようにする。オリゴヌクレオチドが相補的テンプレート鎖に結合すると、レポータ染料及びクエンチャ染料は、互いから分離され、クエンチャがレポータからの信号を消光しなくなり、即ち、ハイブリダイゼーションが検出可能となる。
したがって、一実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、クエンチャ及びレポータ染料をステムに近接させるステムループ構造を形成することができる。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、所謂分子標識である。分子標識塩基がテンプレート鎖と対を成すと、クエンチャ及びレポータは近接しなくなる。そのため、レポータ染料からのレーザ誘起信号は、消光されなくなる。
レポータ染料及びクエンチャ染料を使用する代わりに、ドナーフルオロフォア及びアクセプタフルオロフォアを含む所謂FRET(蛍光共鳴エネルギ移動)ペアを用いてもよい。ドナーフルオロフォアは、外部光源により励起されると、アクセプタフルオロフォアを励起する波長で発光し、アクセプタフルオロフォアは、検出及び測定可能な異なる波長で発光する。ドナーフルオロフォアとアクセプタフルオロフォアとが極めて接近している場合、エネルギは、ドナーからアクセプタへのみ転送される。
好適なFRETペアは、BFP-YFP、CFP-YFP、GFP-DsRed、GFP-Cy3、GFP-mOrange、YFP-RFP、FAM-ROX、FAM-Cy5、FAM-Hex、FAM-TAMRA、及びCy3-Cy5を含む。
本発明の一実施形態において、第一の実施形態で説明した方法のステップbにおいて使用するべきハイブリダイゼーションプローブ及びリガンドは、好ましくは、同方法のステップdにおいて使用するべきハイブリダイゼーションプローブ及びリガンドに結合されたレポータ染料とは異なるレポータ染料に結合される。
リガンド
第一の実施形態で説明した方法のステップb及びdにおいて本発明の方法で使用されるリガンドは、好ましくは、抗体、ペプチド、又はアプタマである。本発明の方法において使用されるリガンドは、好ましくは他の細胞との結合よりも高い親和性で、対象となる細胞(群)と主に結合する。したがって、好ましくは、リガンドは、前記内皮細胞マーカ又は前記上皮細胞マーカと主に結合する。
リガンドは、アプタマにし得る。アプタマは、タンパク質等の抗原に結合する核酸に基づく高親和性リガンドである。通常は、SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)等のin vitro進化手法を用いて同定される。SELEXでは、初期ライブラリからの核酸の選択及び増幅の反復を用いて、高親和性アプタマの同定を行う。初期ライブラリは非常に大きく(例えば、1014種類の配列)、配列は反復中に突然変異し得るため、高親和性アプタマの同定は、定期的に行うことが可能となっており、こうした方法は当業者には公知である。好適なアプタマは、50ヌクレオチド未満の長さである。
高親和性ペプチドは、ファージディスプレイを用いて生成し得る。ファージディスプレイでは、ペプチドを提示するファージのライブラリを標的に対して選択し、その後、SELEXに似た進化プロセスにおいて増幅する。様々なファージディスプレイ用システムが存在しており、ペプチドの大きさは、特定の必要性に合わせて選択し得る。一実施形態において、本発明の方法で使用するべきペプチドは、アミノ酸50個未満の大きさである。
多くの場合、ライブラリは、スキャフォールド、例えば、抗体スキャフォールドにおいて提示される。したがって、ファージディスプレイは、高親和性抗体を同定するために使用し得る。抗体を生成するための他のin vitro進化手法には、mRNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、及び共有結合DNAディスプレイが含まれる。
リガンドは、抗体にしてもよい。本発明による抗体は、少なくとも1つの抗原結合部位を含む抗原を認識して結合することが可能なポリペプチド又はタンパク質である。前記抗原結合部位は、好ましくは、少なくとも1つのCDRを含む。抗原は、自然発生抗体、自然発生抗体のフラグメント、又は合成抗体にし得る。
「自然発生抗体」という用語は、抗原を認識及び結合することが可能な、ジスルフィド結合により相互接続された2本の同一重(H)鎖及び2本の同一の軽(L)鎖を含む、ヘテロ四量体の糖タンパク質を示す。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書においてVHと略す)及び重鎖定常領域(本明細書においてCHと略す)を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書においてVLと略す)及び軽鎖定常領域(本明細書においてCLと略す)を含む。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる保存性の高い領域に点在する相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域へ、更に分割することができる。抗体は、幾つかの同一のヘテロ四量体を含み得る。
抗体は、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ウマ等の適切な動物の免疫化を用いて生成してもよい。
本発明のために用いる抗体は、モノクローナル又はポリクローナルにし得る。両タイプの抗体を生成する方法は、当業者に周知である。上述したin vitro進化法に加え、モノクローナル抗体は、一般にハイブリドーマ技術を用いて作製される。
好適な実施形態において、リガンドは、CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、CK19、CD105、ビメンチン、VCAM、ICAM、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PAI-1、EPCR、CD9、ITGA5、ITGB5、CDH11、CDH3、CPM、CD39、CD200、EPHB4、及びPAR-1からなる群から選択された抗原を認識し結合する抗体又はアプタマである。
好適な実施形態において、「発明の概要」節内の本発明の第一の実施形態で説明した方法のステップbに用いるリガンドは、CD105、ビメンチン、VCAM、ICAM、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PAI-1、及びEPCRからなる群から選択される。
最も好適なものは、CD105(配列番号1及び配列番号2)である。
好適な実施形態において、「発明の概要」節内の本発明の第一の実施形態で説明した方法のステップdに用いるリガンドは、CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、及びCK19からなる群から選択される。
最も好適なものは、CK18(配列番号12及び配列番号13)である。
リガンドの特異性
好ましくは、第一の実施形態で説明した方法のステップb及びdに用いるリガンドは、胎児細胞と特異的に結合する。特異性とは、リガンドが母親細胞より胎児細胞に対して高い結合親和性を有することを意味する。結合親和性は、解離定数(kd)に関して表現し得るものであり、母親細胞に対する所定のリガンドのkdと、胎児細胞に対する同じリガンドのkdとの間の比としての特異性にし得る。即ち、リガンドは、母親細胞に対して10-5 M、胎児細胞に対して10-9 Mのkdを有し得る。この場合、特異性は10,000となる。しかしながら、胎児細胞と母親細胞との両方が均質集団であるとは限らないため、特異性は、所定のリガンドにより達成可能な濃縮倍数に関して表現してもよい(更に後述する)。
好適な実施形態において、リガンドは、後述する本発明の方法により生成される。即ち、リガンドの特異性は、最適化されている。
好ましくは、方法は、更に、試料の胎児細胞を同定するステップ及び/又は試料の胎児細胞を濃縮するステップを含む。好適な実施形態において、濃縮のステップは、同定のステップの前に行われる。
濃縮及び/又は同定後には、検出のステップと、予測及び/又は診断のステップとが行われる場合が多い。
同定
方法が同定のステップを含む場合、一実施形態は、胎児細胞上又は細胞内のリガンド又はハイブリダイゼーションプローブの存在を検出することを含む(第一の実施形態で説明した方法のステップe)。
検出は、リガンド又はハイブリダイゼーションプローブを蛍光染料又は検出に適した他の染料により標識することにより可能となり得る。したがって、方法は、例えば、蛍光in-situハイブリダイゼーション(FISH)にし得る。プローブは、標的に結合したハイブリダイゼーションプローブの検出を可能にする、上述したようなクエンチャとフルオロフォア又はFRETペアを含み得る。代わりに又は追加として、標的に結合するプローブは、1つ又は複数の洗浄ステップにより非結合プローブから分離される。
同定は、抗体等のリガンドを使用する免疫染色を用いて行ってもよい。
同定は、多色FISH又は多色免疫染色を用いて実行し得る。即ち、異なる蛍光標識を有する異なるハイブリダイゼーションプローブを同時に用いてよく、或いは異なる蛍光標識を有する2種類(以上)の抗体を同時に用いてよい。両方とも胎児細胞に特異的であってよく、或いは、一方が胎児細胞に、他方が母親細胞に特異的であってもよい。
一実施形態において、同定された胎児細胞には、レーザキャプチャマイクロダイセクション(LCM)を施し得る。
濃縮
好適な実施形態において、リガンド依存又はハイブリダイゼーションプローブ依存濃縮ステップは、母体試料をリガンド又はハイブリダイゼーションプローブに接触させた後、即ち、「発明の概要」節内の本発明の第一の実施形態で説明した方法のステップcの後に行われる。一実施形態において、濃縮は、第一の実施形態で説明した方法のステップdの後に行ってもよい。濃縮のためには、ハイブリダイゼーションプローブよりもリガンドが好適となる。
本発明の第一の実施形態で説明した方法のステップcに用いるリガンドは、磁性ビーズ等の金属分子に結合させることが好ましい。
濃縮とは、試料の母親細胞に対する胎児細胞の比を高めることを意味する。濃縮倍数は、好ましくは1000倍超、更に好ましくは、10,000倍超、最も好ましくは100,000倍超である。
他の実施形態において、濃縮倍数は、10倍超、100倍超、及び1000倍超、10,000倍超、100,000倍超、及び1,000,000倍超からなる群から選択される。
濃縮の基準は、胎児細胞において優先的に発現される同定されたmRNA、及びmRNAによりコードされるタンパク質である。
当業者には明らかとなるように、従来技術により公知のリガンド(又は抗原)に基づく追加の抗原依存濃縮ステップを実行し得る。こうした従来技術により公知の抗原の例は、CD34、Tra、Oct1、Crypto1、SSEA1、CD29、CD33、CD146、及びCD166である。
例えばCD105に関して上述したように、濃縮ステップは、母体試料をリガンド又はハイブリダイゼーションプローブに接触させる前、即ち、第一の実施形態で説明した方法のステップbの前に行ってもよい。
流動に基づく選別
好適な実施形態において、濃縮は、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて行われる。したがって、リガンドには、蛍光標識を施してFACSを可能にする。FACS及び適切な標識は、当業者に周知であり、例は上述したものである。
FACSの代わりに、マイクロ流体デバイス細胞選別を使用し得る。
固定化
他の好適な実施形態において、濃縮は、リガンドの固定化を用いて行われる。「発明の概要」節内の本発明の第一の実施形態で説明した方法のステップb及び/又はdに用いるリガンドは、例えば、磁性ビーズ、セファロースビーズ、アガロースビーズ等のビーズ上に固定化し得る。リガンドと、それに結合する細胞とを固定化する時、結合していない細胞は、ビーズから洗い流すことができる。こうした洗浄プロセスは、バッチ式又はコラム上で実行し得る。濃縮(分画)後、結合細胞は、高又は低塩濃度、切断可能なリンカ、低又は高pH、変性剤等を用いて溶出させることができる。更に好ましくは、結合細胞は、可溶性抗原、又は胎児細胞特異的リガンドに結合する2次リガンド、例えば、固定化に使用したリガンドの固定部分に対する抗体との競合溶出を用いて溶出させることができる。
濃縮の好適な方法は、リガンドを磁性ビーズに固定化するMACS(免疫磁気細胞選別)である。即ち、リガンドに結合した細胞は、磁力を用いて粒子を選択することにより、結合していないものから分離することができる。
好適な実施形態において、第一の実施形態で説明した方法のステップbでの濃縮は、磁性ビーズに固定化されたCD105を用いて行われる。
抗原を用いた負の選択
母親細胞に特異的に結合するリガンドも、一実施形態において濃縮に使用し得る。したがって、好適な実施形態において、方法は、更に、母体抗原に対する母親細胞特異的リガンドに、試料を接触させるステップを含む。このステップは、第一の実施形態で説明した方法のステップbの前等、任意の適切な時点に実行し得る。試料を母親細胞特異的リガンドに接触させた後、上述したように、例えば、FACS、MACS、マイクロ流体、又は固定化を用いて濃縮を実施し得る。
好ましくは、リガンドは、本発明者が同定したような、胎児細胞では発現しないが母親細胞にて優先的に発現するmRNAによりコードされる抗原に結合するリガンドからなる群から選択される。
当業者には明らかとなるように、従来技術により公知のリガンド(又は抗原)に基づく追加の抗原依存濃縮ステップ(負の選択)を実行し得る。したがって、一実施形態において、追加の抗原依存濃縮ステップが実行され、リガンドは、CD45、HLA-A、HLA-B等の従来技術により公知の母親特異的抗原、又はHLe-1、M3、及びL4からなる群から選択された抗体と結合するリガンドからなる群から選択される。
負の選択に好適な細胞種マーカは、白血球共通抗原としても知られるCD45である。CD45は、赤血球細胞及びプラズマ細胞を除く全ての分化造血細胞により発現される膜貫通蛋白質である。CD45タンパク質は、8種類の成熟mRNAを発生させて8種類のタンパク質生成物をもたらす単一の複合遺伝子から全て生じた異なる形態で存在する。全ての白血球上で発現されるが、他の細胞では発現されないため、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球(B及びT細胞)、単球、及びマクロファージ等の異なる様々な種類の白血球を含む汎白血球マーカとして機能する。
母体血液に存在する有核細胞の大部分においてCD45が発現するため、CD45を用いた負の選択は、好適となる。CD45陽性細胞の除去後、試料のCD45陰性細胞を収集する。こうした除去及び収集は、当該技術分野において公知の任意の適切な方法により行うことができる。
一実施形態において、母体血液試料中に存在する細胞又はそのフラグメントは、任意の適切な時点でCD45マーカを用いて対比染色し、これにより試料中に存在する母親細胞を同定する。試料のCD45陰性細胞は、その後、収集し得る。こうした対比染色及び収集は、当該技術分野において公知の任意の適切な方法を用いて実行し得る。
HLA
ヒト白血球抗原は、ヒトの主組織適合複合体(MHC)の一部であり、細胞表面抗原提示タンパク質及び他の遺伝子に関与する。
2つのクラスのヒト白血球抗原が存在し、クラスI抗原(A、B、及びC)及びクラスII抗原(DR、DP、及びDQ)は異なる機能を有する。両クラスとも多数の可変対立遺伝子を含む。
胎児細胞により発現されないHLA遺伝子は、試料中の母親細胞の除去に使用し得る。即ち、第一の実施形態で説明した方法のステップaに存在する母体血液試料又はその画分には、HLA遺伝子に対する抗原を与え得る。
他の濃縮方法
抗原特異的リガンドを用いない追加濃縮手法を用いてもよい。
好適な追加濃縮方法は、赤血球を選択的に溶解して有核細胞を完全な状態で残すことが可能な、NH4Clの仲介による溶解等の赤血球の溶解である。この方法は、当業者に公知である。好適な実施形態において、赤血球の溶解は、第一の実施形態で説明した方法のステップbの前に行われる。NH4Clの仲介による溶解では、濃度0.1乃至0.2mMのNH4Cl、例として0.14乃至0.18mMのNH4Cl、更に好ましくは0.15乃至0.17mMのNH4Clが用いられる。
上述した固定及び選択的溶解の方法は、濃縮のために使用し得る。
試料には、フィコール-ハイパック密度勾配遠心分離法等、大きさ又は密度に基づいた初期分離を施してもよい。これにより、血小板を含む上清層と、単核細胞層と、無核の赤血球及び顆粒球を含む凝集ペレットとが作製される。単核細胞層を他の層から分離して、胎児細胞が濃縮された母体試料を作製する。
電荷等を含め、細胞の物理特性も濃縮に利用し得る。
沈殿
血液試料中に存在する細胞は、試料中に存在する細胞の大部分を沈降させる沈殿により濃縮し得る。血液試料は、沈殿前に、0.15M NaCl等の適切な溶液において希釈させ得る。沈殿は、少なくとも5時間、又は好ましくは一晩等、完全な沈殿が生じるまで継続し得る。
好ましくは、試料は、15℃未満の温度等の室温より低い温度、例として10℃又は8℃又は6℃、好ましくは2乃至8℃、又は4℃程度の温度で沈殿させる。
低密度の細胞の小集団は、沈殿しない場合があり、0.5%パラホルムアルデヒド等における上述したような軽度の前固定と、その後の遠心分離とにより単離し得る。
リガンド及び濃縮方法の結合
理解されるように、様々なリガンド及び濃縮方法を結合し得る。したがって、内皮表現型を有する細胞(即ち、内皮細胞マーカ)に対する1、2、3、又は4種類以上の胎児細胞特異的リガンドを、同時に又は連続して使用し得る。同様に、胎児細胞特異的リガンド及び母体特異的リガンドをそれぞれ用いた反復的な濃縮を用いてもよい。
試料
胎児細胞の総数を増やすために、できるだけ多くの母体血液試料を取得することが望ましい。したがって、第一の実施形態で説明した方法のステップaの母体血液試料のサイズは、好ましくは、0.5乃至50mlの範囲、例として1乃至40mlの範囲、例として5乃至35ml、又は10乃至30mlの範囲である。
提供される母体血液試料は、好ましくは、妊娠5乃至24又は6乃至20週、更に好ましくは妊娠7乃至16週又は8乃至12週の妊婦から取得される。
希釈-濃度
本発明によれば、試料は、方法の任意の時点で希釈又は高濃度化してよい。試料は、食塩溶液及びリン酸緩衝生理食塩溶液、PBS等の等張緩衝液、及び/又は、基本培地及び組織増殖培地等の適切な増殖培地を添加することにより、少なくとも1.5倍、例として2倍、更に好ましくは少なくとも3倍、例として5倍に希釈し得る。方法ステップは、特定の方法ステップに割り当てられた様々な成分の添加による試料の希釈を含み得る。
方法を実施する際には、試料を高濃度化すること、例えば、細胞を除去することなく体積を減らすことが、様々な方法ステップを実現する上で有利となり得る。試料体積は、元の試料体積の80%未満、例として70又は60又は50%未満、或いは更に好適には元の試料体積の40%未満、例として25%未満に減少させ得る。高濃度化ステップは、遠心分離にし得る。方法は、本発明によれば、1回又は複数回の高濃度化ステップを含み得る。遠心分離は、細胞を高濃度化する好適な方法である。細胞の損傷を回避するために、300gで10分間等、穏やかな遠心分離が好適となる。
検出及び診断
好ましくは、本発明の方法は、出生前検出及び予測及び/又は診断(即ち、第一の実施形態で説明した方法のステップe及びf)のために使用し得る。したがって、同定された細胞に対して、検出及び予測及び/又は診断を、或いは胎児細胞を濃縮した母体血液試料に対して、検出及び予測及び/又は診断を実施し得る。
一実施形態において、胎児タンパク質は、例えば免疫ブロット法、タンパク質構造解析、又は質量分析法による検出に利用可能となる。
他の好適な実施形態において、検出及び/又は診断は、胎児DNA又はRNAを検出に利用可能とするステップを含む。
第一の実施形態で説明した方法のステップeの好適な検出方法は、FISH(蛍光in-situハイブリダイゼーション)、ノーザンブロット法、サザンブロット法、DNA/RNA配列決定、マイクロアレイ解析、及び増幅である。こうした方法は、例えば、出生前の疾患又は特定の疾患を罹患する傾向等、一定の条件を示す特定配列の存在を検出するために使用し得る。方法は、13トリソミ、18トリソミ、又は21トリソミ等の染色体異数性を検出するためにも使用し得る。検出方法は、Y特異的配列を検出することにより、胎児の性別を判定するために使用することもできる。
他の実施形態では、試料中の胎児細胞数を標準数と比較する。試料中の胎児細胞数の増加は、妊娠に危険があることを示す場合がある。試料(及び対照試料)中の胎児細胞数は、例えばFACSを用いて推定することができる。
特異的リガンドの同定
本発明の一実施形態は、胎児細胞特異的リガンドを同定する方法であって、
a)胎児細胞特異的リガンド候補のライブラリを提供するステップと、
b)母親細胞のプールを提供するステップと、
c)ステップaのライブラリを、ステップbの母親細胞に接触させるステップと、
d)母親細胞に結合しないリガンドを選択して、母親細胞に結合するリガンドを除去したライブラリを生成するステップと、を含む方法である。
好適な実施形態において、方法は、更に、
e)ステップaのライブラリ又はステップdのライブラリを胎児細胞に接触させるステップと、
f)胎児細胞に結合するリガンドを選択して、胎児細胞には結合するが母親細胞には結合しないリガンドが濃縮されたライブラリを生成するステップと、を備える。
ステップfのリガンドの選択には1個の細胞で十分だが、更に多くの胎児細胞を当然使用し得ることは明らかである。
一実施形態において、同定された特異的リガンドは、リガンドが確実に胎盤起源の上皮細胞に対するものとなるように選択される。
ステップb乃至fは、
g)母体血液試料を提供するステップと、
h)ライブラリを母体血液試料に接触させるステップと、
i)Y染色体のFISHデモンストレーションにより同定された、及び/又は、本発明の第5の態様の方法により同定された、個別の胎児細胞を除去することにより、胎児細胞に結合するリガンドを選択し、これらの細胞から前記リガンドのみを収集するステップにより実施し得る。
母体血液試料は、胎児細胞に関して濃縮し得る。
好適な実施形態において、方法は更に、
j)胎児細胞及び/又は母親細胞に対する付加的な選択用の増幅ライブラリを調製するため等に、選択されたリガンドを増殖/増幅させることを含む。
明らかとなるように、最善のリガンドを同定するために、複数回の選択及び増幅を実行してよい。
他の実施形態において、胎児細胞特異的リガンドを同定する方法は、PCT/DK2010/050002の実施例1に記載されるように実行される。
胎児細胞特異的リガンド候補のライブラリは、ファージ(ファージディスプレイ)、mRNA(リボソームディスプレイ又はmRNAディスプレイ)、又はDNA(共有結合ディスプレイ又はプラスミドパニング)上に提示された抗体又はペプチドのライブラリにしてよい。ライブラリは、アプタマ同定用のDNA又はRNAオリゴヌクレオチドのライブラリにしてもよい。
「候補」という用語は、ライブラリの化合物が胎児細胞と必ずしも結合しないことを示すために用いている。候補は、胎児細胞特異的リガンドの同定のために結合の試験対象となる。
一実施形態において、胎児細胞特異的リガンド候補のライブラリは、完全にランダムなライブラリである。このような場合、ライブラリは、最初に胎児細胞に対する選択及び増幅を繰り返し行ってよく、その後、母親細胞に対する対抗選択(負の選択)が行われる。
他の実施形態において、胎児細胞特異的リガンド候補のライブラリは、胎児細胞の公知のリガンドに基づいている。こうしたライブラリは、例えば、胎児細胞に結合する抗体をファージ上に提示することと、ライブラリを形成するための、抗体をコードする遺伝子の突然変異誘発とにより形成し得る。このような場合、突然変異誘発は、胎児細胞に対する親和性を維持又は更に高めつつ、特異性を改善し得る。
一実施形態において、リガンドは、ヒトサイトケラチン1、4乃至6、8、10、13、18、及び19、ヒトサイトケラチン7、及びヒトビメンチンからなる群から選択された遺伝子によりコードされる抗原に結合する。したがって、リガンドの親和性及び/又は特異性は、概説した方法を用いて最適化される。
胎児細胞特異的リガンド及びハイブリダイゼーションプローブ
本発明の一実施形態において、本発明の第一の実施形態で説明した方法のステップbの内皮特異的リガンド及びハイブリダイゼーションプローブは、
i. CD105、ビメンチン、VCAM、ICAM、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PAI-1、EPCRからなる群から選択された抗原に対するリガンドと、
ii. CD105、ビメンチン、VCAM、ICAM、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PAI-1、EPCRをコードする遺伝子からなる群から選択された遺伝子の少なくとも10個のヌクレオチドを含む核酸に対するハイブリダイゼーションプローブと、からなる群から選択し得る。
本発明の一実施形態において、本発明の第一の実施形態で説明した方法のステップdの上皮特異的リガンド及びハイブリダイゼーションプローブは、
i. ヒトCK1、CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、及びCK19からなる群から選択された抗原に対するリガンドと、
ii. CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、及びCK19をコードする遺伝子からなる群から選択された遺伝子の少なくとも10個のヌクレオチドを含む核酸に対するハイブリダイゼーションプローブと、からなる群から選択し得る。
一実施形態において、胎児細胞特異的リガンド及びハイブリダイゼーションプローブは、CD105及びCK18からなる群から選択される。
一実施形態において、リガンド及びハイブリダイゼーションプローブは、母親細胞99.9%及び胎児細胞0.1%を含む試験試料において90%正確な細胞の選択を可能にすることを特徴とする。即ち、90%正確な同定とは、本明細書において、試験試料及びリガンドにより選択を行った時、90個の胎児細胞が10個の母親細胞毎に収集されることを意味し、より高い/低い正確性についても同様となる。好適な選択方法は、MACSである。更に好適なものは、95%正確な選択、98%正確な選択、又は更に好ましくは99%正確な細胞選択を可能にするリガンドである。母体血液試料では、胎児細胞の存在量が非常に低いため、リガンドが、上述した試験試料からの99.9%、99.99%、又は99.999%正確な細胞選択を可能にすることが更に一層好適となる。
好ましくは、リガンドは、アプタマ、ペプチド、又は抗体である。最も好適なものは、抗体である。
リガンドは、好ましくは、特異性の向上等のため、上述した方法又はPCT/DK2010/050002に記載の方法を用いて同定される。
本発明の一実施形態において、上述した方法又はPCT/DK2010/050002に記載の方法を用いて同定されたリガンド又はハイブリダイゼーションプローブは、母体血液試料を胎児細胞について濃縮するため、或いは母体血液試料中の胎児細胞を同定するために用いられる。好ましくは、リガンド又はハイブリダイゼーションプローブの使用は、上述した通りとなる。
更に、上述したリガンド又はハイブリダイゼーションプローブと、使用説明書とを備えたキットが提供される。
好ましくは、キットは、濃縮用の第1のリガンドと、同定用の第2のリガンド及び/又はハイブリダイゼーションプローブとを備える。更に好ましくは、キットは、内皮細胞マーカである第1のリガンドと、上皮マーカである第2のリガンド及び/又はハイブリダイゼーションプローブとを備える。内皮細胞マーカは、胎児細胞の濃縮に用いられ、上皮マーカは、内皮及び上皮表現型の両方を含む試料中に存在する胎児細胞の同定に用いられる。
好適な実施形態において、キットは、更に、「固定及び選択的溶解」節で上述したような固定緩衝液及び溶解緩衝液を備える。
本発明の一実施形態において、リガンド又はハイブリダイゼーションプローブは、更に胎児細胞特異的リガンドの同定に用いられる。この使用の好適な実施形態において、リガンド及び/又はハイブリダイゼーションプローブは、上述した方法又はPCT/DK2010/050002に記載の方法において用いられる。
本発明の一態様は、上述した方法により同定された胎児細胞である。前記細胞は、ヒトサイトケラチン1、2、3、4(配列番号3)、5(配列番号4)、6A(配列番号5)、6B(配列番号6)、7(配列番号7)、8(配列番号8)、10(配列番号9)、13(配列番号10、及び配列番号11)、14、15、16、17、18(配列番号12及び配列番号13)、及び19、ヒトビメンチン、及びCD105(配列番号1及び配列番号2)からなる群から選択されたマーカの発現を特徴とし、CD105又はビメンチンの発現及び/又はCD105又はビメンチン及びサイトケラチンの同時発現により、他の細胞から識別可能である。好ましくは、胎児細胞は、例えば、本発明の他の態様において説明されるように単離又は同定されており、人体内には存在していない。
本発明の一態様は、上述したような検出及び診断用、或いは、例えば「特異的リガンドの同定」節に記載したような更に胎児細胞に特異的なリガンドの生成用としての、上述した方法により同定された胎児細胞の使用である。
更に他の態様は、
a.
i. 上皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は
ii. 上皮細胞マーカに対するリガンドと、
b.
i. 内皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも10個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は
ii. 内皮細胞マーカに対するリガンドと、
使用説明書と、を備えるキットである。
出生前性別判定
本発明による単離胎児細胞は、更に、雄性特異的プローブを使用するか、或いは、胎児細胞の検出のために本明細書に記載の方法により同定した抗原結合要素を利用した後、当業者に公知の適切な性別判定法により、胎児の性別の判定に使用し得る。
染色体異常の出生前診断
性別の判定と並行して、本発明は、更に、本発明に基づいて単離又は同定された抗原或いは前記胎児細胞抗原を認識する結合要素に基づいた胎児細胞の検出により、染色体異常を判定する方法に関する。こうした染色体異常判定方法は、異数性、転座、不平衡転座、再配列、サブテロメア再配列、不平衡染色体再配列、不平衡サブテロメア再配列、欠失、逆位、不平衡逆位、重複、及びテロメア不安定性及び/又は短縮等の検出に関する。染色体異常は、更に、一塩基置換、微小欠失、微小挿入、短い欠失、短い挿入、多重ヌクレオチド変化、DNAメチル化、及び/又はインプリントの喪失(LOI)であってもよい。好適な実施形態において、染色体異数性は、完全及び/又は部分的トリソミである。例として21トリソミ、18トリソミ、13トリソミ、16トリソミ、及び/又はXXX及び他の性染色体異常である。或いは、異数性は、Xモノソミ、21モノソミ、22モノソミ、16モノソミ、及び/又は15モノソミ等の完全及び/又は部分的モノソミである。
DNAハイブリダイゼーション手法を、性別判定又は染色体異常判定に使用し得る。当該技術分野において公知の手法には、蛍光in-situハイブリダイゼーション(FISH)、プライムドin-situ標識(PRINS)、定量的FISH(Q-FISH)、及び多色バンディング(MCB)が含まれる。蛍光in-situハイブリダイゼーション(FISH)は、例えば蛍光により上述したように標識された分子プローブを利用する。遺伝子又はDNA配列に対応するプローブが使用され、核の特定の遺伝子座において顕微鏡下で信号を示す。FISH手法は、間期細胞に適用し得ると共に、X、Y、13番、15番、18番、21番染色体の倍数性又は異数性の存在を確認し得る。FISHは、トリソミ及びモノソミのような染色体の異常数を特定するために有用であり、染色体の特定領域に対してプローブが利用できる場合、欠失、転座、又は重複が存在しているかを判断するために使用し得る。
上述したハイブリダイゼーション手法の代わりに、PCR法を染色体異常の判定に使用し得る。これには、幾つかの胎児細胞を最初に単離する必要が生じる場合がある。本発明によるPCR法には、上述したようなトリソミ等の異常を検出可能な、当該技術分野において公知の適切な方法が含まれる。PCR法は、更に、特定の遺伝子における突然変異の小欠失等、小さな異常の判定に利用し得る。定量蛍光PCR(QF-PCR)は、こうした方法の例であり、例えば13、18、21トリソミ、3倍体性、2重トリソミ、更にX及びY異数性の検出に適している(V. Cirigliano, 2004)。小さいにもかかわらず重篤となる染色体異常に適したプライマを設計することにより、PCR法は、例えば、必須アミノ酸フェニルアラニンが欠落したタンパク質をもたらす嚢胞性繊維症遺伝子における3bpの欠失により生じる場合が多い嚢胞性繊維症等の疾患の判定に使用し得る。
胎児細胞は、上述したように、幹細胞とし得る。幹細胞には、発生中の生成時期及び場所と汎用性の度合いとに関連して様々な種類がある。検出される胎児幹細胞は、胚幹細胞、体性幹細胞、全能性又は多能性であるもの等、任意の種類にし得る。
幹細胞の使用
本明細書に記載の手法を応用することにより、胎児幹細胞は、本発明による前記胎児細胞抗原を認識する結合要素、抗体、又は抗体フラグメントを使用することで、母体血液試料から単離し得る。幹細胞は、更に多くの幹細胞を生産可能であり、神経、血液、又は肝臓細胞等、特殊化した細胞種を生産するために使用することができる。単離された幹細胞の種類に応じて、細胞は、特定の細胞種又は組織の細胞の発生において、異なる用途を有し得る。万能性幹細胞は、任意の細胞種を発生させ得るが、多能性幹細胞は、より限定された数の細胞種を発生させ得る。例えば、血液を形成する(造血)幹細胞は、全ての種類の血液細胞を形成し得る一方、間葉系幹細胞は、間葉細胞を形成することが可能である。
幹細胞、特に万能性幹細胞は、様々な疾患の治療に使用し得る。万能性幹細胞は、従来、倫理的配慮から利用が限られている胚幹細胞である。母体血液試料から単離された幹細胞を使用する可能性は、魅力的な代替手段となる。万能性幹細胞は、従来の方法では適切な治療が提供できない複数の疾患の治療に使用し得る。
参考文献
Gussin HA, Sharma AK, Elias S. Culture of endothelial cells isolated from maternal blood using anti-CD105 and CD133. Prenat Diagn, 2004 : Mar;24(3):189-93.
実施例1
血液試料の調製
24mlの末梢血試料を、妊娠11乃至14週齢の妊婦から取得した。血液試料は、侵襲的手技の前、インフォームドコンセント後に採取した。全ての血液試料は、ヘパリン化チューブにおいて採取し、採取直後に処理した。
ヘパリン血に加え、5mlの血液をEDTAチューブに採取した。この血液は、胎児性別判定に用いた。胎児の性別は、Y染色体特異遺伝子を用いた遊離胎児DNAのリアルタイムPCRにより判定した。男児の妊娠からの血液試料のみを更に処理した。
固定
各試料について、3mlの全血を、プレコートピペット(プレコート緩衝液はCa2+及びMg2+を含まない2%BSA含有PBS)を用いて、プレコート50ml遠心チューブに等分した(1試料当たり8本)。2mlの10%ホルムアルデヒド含有PBSを、プレコートピペットを用いて、各チューブに添加した。慎重に混合した後、血液を10分間室温で固定した。
選択的溶解
固定後、30mlの0.12%Triton X-100含有PBS(Ca2+及びMg2+不含)を、各チューブに添加した。チューブを3回転倒させ、赤血球細胞を45分間、室温で溶解させた。溶解に続いて、15mlの低温(4℃)2%BSA含有PBS(Ca2+及びMg2+不含)を各チューブに添加した。チューブを2回転倒させて混合した後、未溶解細胞を、500gにて4℃で15分間遠心分離してペレット化した。上清除去後、細胞を10mlの4℃の低温PBS(Ca2+及びMg2+不含)に再懸濁し、4℃で一晩保存した。
透過化
10mlの低温(-20℃)メタノール添加後、4℃で10分間インキュベートすることにより試料を透過化した。500gで10分間の遠心分離後、プレコートピペットを用いて細胞ペレットを2本のチューブにプールした。空のチューブを、1mlの低温MASC緩衝液(PBS、0.5%BSA、2mM EDTA)によりリンスした。プールした細胞を、2本のプレコート15mlチューブに移し、500gで10分間、遠心分離した。上清除去後、各チューブの細胞を500μlのMACS緩衝液に再懸濁した。
CD105マイクロビーズ及びMACSを用いた正の選択
500μlの細胞懸濁液に対して、130μlのCD105マイクロビーズ(Miltenyi)を添加し、細胞懸濁液を60分間、4℃でインキュベートした。次に、6mlの低温MACS緩衝液を添加した後、500gで10分間遠心分離することにより細胞を洗浄した。上清を除去し、細胞を2mlの低温MACS緩衝液に再懸濁した。
CD105標識細胞懸濁液を、既にマグネット上の所定位置で洗浄済みMSカラム(Miltenyi)の上に積み重ねた洗浄済みLDカラム(Miltenyi)に付与した。LDカラムを貫流する際に、細胞を2mlの低温MACS緩衝液により2回洗浄した。MSカラムは、1mlの低温MACS緩衝液により洗浄した。次に、LDカラムをバグネットから外し、プレコート15mlチューブ上に配置し、5mlの低温MACS緩衝液を2回加えることで、細胞を溶出させた。最初の5mlの緩衝液は、プランジャを利用せずに貫流させた。2回目の5mlの緩衝液は、プランジャを利用してカラムを強制的に通過させた。次に、MSカラムをマグネットから外し、回収チューブ上に配置した。LDカラムと同じ方法で、5mlの緩衝液により2回ではなく、1mlの低温MACS緩衝液を2回用いて、細胞を溶出させた。回収チューブは、500gで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを低温MACS緩衝液に再懸濁した。次に、細胞懸濁液をポリリジンコートスライドに配置し、スライドを空気乾燥(一晩)させた後、更なる解析を行った。
X及びY染色体特異的FISH及び自動走査による男児胎児細胞の同定
ハイブリダイゼーションの前に、スライドをPBS中で5分間リンスし、60%、80%及び99.9%エタノール中でそれぞれ3分間脱水した。スペクトラムグリーンで標識した染色体特異的反復DXZ1プローブCEP XアルファサテライトDNAと、スペクトラムオレンジで標識したDYZ1プローブCEP YサテライトIII(Abbott Molecular)を、この解析に使用した。両プローブを含むハイブリダイゼーション混合液は、Xプローブを1、Yプローブを1、蒸留水を1、ハイブリダイゼーション緩衝液を7の割合で混合することにより調製した。15μlのハイブリダイゼーション混合液を加え、24×24mmカバースリップにより覆った。カバースリップをラバーセメントにより密封し、DNAをホットプレート上にて83.5℃で7分間変性させ、加湿空気中にて42℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたスライドを、0.3%のTween 20を含む0.4×SSC中において73℃で2分間、0.1%のTween 20を含む2×SSC中において室温で1分間洗浄した。スライドは、その後、Vectashield with DAPIでマウントした。
DAPI染色した核内に位置する赤のFISHシグナルを含む細胞を、2種類のスキャナを用いた自動走査により同定した。Applied Imagingが開発元であるMDS(バージョン5.8.0)スライド走査システムと、Metasystemsが開発したMetaCyte走査システムを用いた。MDS走査システムでは、scan funcion5を用いてスライドを20倍で走査した。MetaCyteでは、真のスペクトラムオレンジFISHシグナルの検出用に独自に開発及び最適化したクラシファイアを用いてスライドを10倍で走査した。走査後、スキャナにより同定した細胞を、自動リロケーションにより視覚検査した。緑のXシグナルを1つ、Xシグナルより有意に大きなYシグナルを1つ有する細胞を、男児胎児細胞として分類した。
男児胎児細胞の抗体染色
胎児細胞は、次の抗体を個別に用いて染色した。パンサイトケラチン(製品番号C2562、Sigma-Aldrich)、サイトケラチン7(製品番号M7018、DAKO Cytomation)、及びビメンチン(製品番号V2258、Sigma-Aldrich)。抗パンサイトケラチン抗体は、ヒトサイトケラチン1、4乃至6、8、10、13、18、及び19を認識する。抗サイトケラチン7抗体は、ヒトサイトケラチン7を認識し、抗ビメンチン抗体は、ヒトリンパ系細胞において検出されないヒトビメンチンのエピトープを認識する。3種類の抗体は、全てマウスモノクローナル抗体であり、アイソタイプIgG1、IgG2(サイトケラチン)、又はIgM(ビメンチン)である。
空気乾燥後、スライドを、4×SSC中で10分間、再び水和させ、10%正常ヤギ血清、1%BSA、及び0.5%ブロッキング試薬(Roche)を含む4×SSCからなる100μlブロッキング緩衝液、又は100μlのImaging Enhancer(Molecular Probes)により、室温で30分間プレインキュベートした。その後、スライドを、ブロッキング緩衝液で1:50に希釈した100μlの1次抗体により、室温で60分間インキュベートした。抗体のインキュベート後、スライドを4×SSC中で5分間、3回洗浄した。検出のため、ブロッキング緩衝液において1:200に希釈した100μlのAlexaFluor-488コンジュゲートウサギ抗マウスIgG(サイトケラチン)又はIgM(ビメンチン)(Molecular Probes)と共に、スライドを30分間、室温でインキュベートし、4×SSC中で5分間、3回洗浄後、ブロッキング緩衝液において1:200に希釈した100μlのAlexaFluor-488コンジュゲートヤギ抗ウサギIg(Molecular Probes)により室温で30分間インキュベートした。4×SSC中で5分間、2回洗浄後、2×SSCで5分間、1回洗浄し、Vectashield with DAPIでマウントした。
パンサイトケラチン染色後のビメンチン抗体染色
4×SSC中で10分間洗浄して、カバースリップを取り外した。スライドを4×SSC中で5分間リンスし、上述した100μlのブロッキング緩衝液又はImaging Enhancerにより30分間インキュベートした。次に、ブロッキング緩衝液において1:50に希釈した100μlの抗ビメンチン抗体により、スライドを室温で60分間インキュベートした。抗体のインキュベート後、4×SSC中でスライドを5分間、3回洗浄した。検出のため、ブロッキング緩衝液において1:200に希釈した100μlのAlexaFluor-555コンジュゲートウサギ抗マウスIgMにより、スライドを室温で30分間インキュベートした。4×SSC中で5分間、2回洗浄後、2×SSC中で5分間、1回洗浄後、スライドをVectashield with DAPIでマウントした。
抗体染色したスライドを走査型顕微鏡にセットし、正又は負の染色について、胎児細胞を自動リロケーションにより視覚検査した。
実施例1の実験結果
CD105プロトコルによる磁気細胞選択(MACS)により濃縮した細胞の胎児起源を、男児胎児を妊娠した女性からの32件の血液試料において試験した。X及びY染色体特異的プローブによりFISHを実施し、1つのXシグナルと、Xシグナルより有意に大きな1つのYシグナルを示した細胞を胎児細胞とした(図1)。血液1ml当たり0.1乃至1.1個の胎児細胞が母体血液試料中で検出された(図2)。試料の97%は、胎児細胞について陽性となった。1件の血液試料では、胎児細胞が検出されなかった。
21個の男児胎児細胞が、抗サイトケラチン7、抗パンサイトケラチン、及び抗ビメンチン抗体により、上述したプロトコルを用いて特徴付けされた。21個の胎児細胞のうち3個は、抗サイトケラチン7抗体による染色で陽性となり、14個のサイトケラチン7陰性細胞のうち10個は、抗パンサイトケラチン抗体による染色で陽性となる一方、サイトケラチン染色で陰性となった4個の胎児細胞のうち3個は、抗ビメンチン抗体による染色で陽性となった。加えて、4個のパンサイトケラチン陽性細胞の4個全てが、抗ビメンチン抗体による染色で陽性を示した。これらの結果は、母体血液試料のCD105に基づく磁気細胞選別(MACS)により、サイトケラチン及び/又はビメンチンを発現する母体血液試料中の新規の胎児細胞種が明らかとなり、したがって、この細胞種が胎児のトロホブラストから識別されることを示している。
実施例2
全血の選択及びカラム内染色
血液の採取
30mlの末梢血試料を、妊娠11乃至14週齢の妊婦から取得した。血液試料は、侵襲的手技の前、インフォームドコンセント後に採取した。全ての血液試料は、ヘパリン化チューブ又はEDTAチューブにおいて採取し、採取後4時間以内に処理した。
ヘパリン血に加え、5mlの血液をEDTAチューブに採取した。この血液は、胎児性別判定に用いた。胎児の性別は、Y染色体特異遺伝子を用いた遊離胎児DNAのリアルタイムPCRにより判定した。
血液試料の調製 - CD105による選択
血液1ml当たり20乃至50μlのCD105マイクロビーズ(Miltenyi)を添加し、混合後、試料を室温で30分間インキュベートした。インキュベート後、血液試料を、6本のプレコート50mlチューブ(プレコート緩衝液はCa2+及びMg2+を含まない2%BSA含有PBS)に等分し、20mlのMACS緩衝液を各チューブに添加後、445gにて4℃で12分間遠心分離した。上清を除去して、MACS緩衝液を添加し、最終体積を7.5mlとした。プレコートピペットを用いて慎重に混合した後、CD105で標識した全血を、2本の洗浄済み全血カラムに血液3mlを所定量として加えた。血液がカラムを貫流する際に、カラムを4mlのMACS緩衝液により2回洗浄し、マグネットから取り外し、プレコート15mlチューブ上に配置し、5mlの全血カラム溶出緩衝液(Miltenyi)を用いて押し出すことにより、細胞をカラムから溶出させた。445gにて4℃で12分間遠心分離した後、上清を廃棄し、プレコートピペットチップを用いて、細胞ペレットを500μlのPBS中に再懸濁した。
固定及び透過化
500μlのInside Fix(Miltenyi)を添加後、細胞を20分間固定した。固定後、10mlのMACS緩衝液を添加し、チューブを500gにて4℃で10分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを500μlのMACS緩衝液に再懸濁した。細胞は、500μlの氷温MeOHにより透過化し、4℃で10分間インキュベートした。その後、マグネット内に配置済みの洗浄済みMSカラム(Miltenyi)に細胞を付与した。細胞懸濁液がカラムに完全に入った後、500μlのMACS緩衝液をカラムに加えることにより細胞を洗浄した。
MSカラム内の細胞の染色
胎児細胞は、以下の抗体カクテルにより染色した。パンサイトケラチン(製品番号C2562、Sigma-Aldrich)、サイトケラチン7(製品番号M7018、DAKO Cytomation)、及びサイトケラチン8/18(製品18.0213、Invitrogen)。抗パンサイトケラチン抗体は、ヒトサイトケラチン1、4乃至6、8、10、13、18、及び19を認識する。抗サイトケラチン7抗体は、ヒトサイトケラチン7を認識し、抗サイトケラチン8/18は、サイトケラチン8/18を認識する。3種類の抗体は、全てマウスモノクローナル抗体アイソタイプIgG1、IgG2である。
抗体染色前に、500μlのImaging Enhancer(Molecular Probes)を加えた後、カラムを室温で10分間プレインキュベートし、500μlのMACS緩衝液を加えることにより1回洗浄した。次に、10%正常ヤギ血清、1%BSA、及び0.5%ブロッキング緩衝液(Roche)を含む4×SSCからなるブロッキング緩衝液において1:50に希釈した200μlのサイトケラチンカクテルを加えた後、カラムを室温で30分間インキュベートした。抗体のインキュベート後、500μlのMACS緩衝液によりカラムを3回洗浄した。検出のため、ブロッキング緩衝液において1:50に希釈したヤギ抗マウスIgG(Invitrogen)のAlexaFluor-488コンジュゲートF(ab)2フラグメント200μlと共に、カラムを室温で30分間インキュベートし、500μlのMACS緩衝液により3回洗浄した後、ブロッキング緩衝液において1:50に希釈されたウサギ抗ヤギIgG(Invitrogen)のAlexaFluor-488コンジュゲートF(ab)2フラグメント200μlと共に、室温で30分間インキュベートした。インキュベート後、MACS緩衝液500μlにより1回、Ca2+及びMg2+を含まないPBS 500μlにより2回、カラムを洗浄した。カラムをマグネットから15mlチューブへ移し、500μlのMACS緩衝液を2回加え、2回目にMACS緩衝液を加える際にはプランジャを用いることにより、細胞を回収した。500gにて4℃で10分間遠心分離することにより細胞をペレット化した後、細胞ペレットをCa2+及びMg2+を含まないPBSに再懸濁し、細胞をスライドに塗布し、スライドを暗所にて一晩空気乾燥させた後、Vectashield with DAPI(Vector Laboratories)でマウントした。
サイトケラチン染色スライド
サイトケラチン染色細胞の同定
抗サイトケラチン抗体カクテルにより染色した胎児細胞は、Metasystemsが開発したMetaCyte走査システムを用いた自動走査により同定した。スライドは、サイトケラチン染色細胞の検出用に独自に開発及び最適化したクラシファイアを用いて10倍で走査した。走査後、スキャナにより同定した細胞を、自動リロケーションにより視覚検査した。
(男児)胎児細胞のFISHによる同定/検証
男児妊娠のケースについて、抗体染色の特異性を、XY FISHにより確認した。ハイブリダイゼーション前に、カバースリップを取り外し、スライドをPBS中で5分間リンスし、60%、80%及び99.9%エタノール中でそれぞれ3分間脱水した。スペクトラムアクアで標識した染色体特異的反復DXZ1プローブCEP XアルファサテライトDNAと、スペクトラムオレンジで標識したDYZ1プローブCEP YサテライトIII(Abbott Molecular)を、この解析に使用した。両プローブを含むハイブリダイゼーション混合液は、Xプローブを1、Yプローブを1、蒸留水を1、ハイブリダイゼーション緩衝液を7の割合で混合することにより調製した。15μlのハイブリダイゼーション混合液を加え、24×24mmカバースリップにより覆った。カバースリップをラバーセメントにより密封し、DNAをホットプレート上にて83.5℃で7分間変性させ、加湿空気中にて42℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたスライドを、0.3%のTween 20を含む0.4×SSC中において73℃で2分間、0.1%のTween 20を含む2×SSC中において室温で1分間洗浄した。スライドは、その後、Vectashield with DAPIでマウントした。
21トリソミの解析
高リスク妊娠(1:50以上)のケースについて、サイトケラチン染色された胎児細胞を、21トリソミ(ダウン症候群)の有無に関して、スペクトラムオレンジで標識された21番染色体特異的LSI 21プローブ(Abbott Molecular)を用いて解析した。スペクトラムアクアで標識されたCEP Xプローブを、内部対照としてLSI 21プローブと共に用いた。両プローブを含むハイブリダイゼーション混合液は、Xプローブを1、LSI 21プローブを1、蒸留水を1、ハイブリダイゼーション緩衝液を7の割合で混合することにより調製した。
FISH前に、2%のパラホルムアルデヒド(PFA)を含むPBS中で10分間スライドを洗浄してカバースリップを取り外した。4%PFAにおいて10分間インキュベートすることによりスライドを後固定し、PBS中で2分間洗浄後、60%、80%及び99.9%EtOH中でそれぞれ3分間脱水した。空気乾燥後、プローブを含まないハイブリダイゼーション混合液により、スライドを以下の方法で事前に変性させた。18μlのハイブリダイゼーション混合液を添加し、24×24mmカバースリップにより覆った。次に、スライドをホットプレート上に90℃で10分間載置した。カバースリップを取り外し、スライドをPBS中で5分間、氷温の99.9%EtOH中で10分間洗浄した。空気乾燥後、LSI 21プローブ及びCEP Xプローブを含む18μlのハイブリダイゼーション混合液を添加し、24×24mmカバースリップで覆った。カバースリップをラバーセメントで密封し、DNAをホットプレート上にて90℃で10分間変性させ、加湿空気中にて42℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたスライドを、0.3%のTween 20を含む0.4×SSC中において73℃で2分間、0.1%のTween 20を含む2×SSC中において室温で1分間洗浄した。スライドは、その後、Vectashield with DAPIでマウントした。染色胎児細胞内の21番染色体FISHシグナルの計数は、オリジナルの走査ファイルを用いたリロケーションにより行った。図6は、21トリソミ(ダウン症候群)の非侵襲的出生前診断の場合を示している。

Claims (13)

  1. 母体血液試料中の胎児細胞を単離する方法であって、
    a. 内皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも15個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は内皮細胞マーカに対するリガンドに、 前記母体血液試料又はその画分を接触させるステップと、
    b. 前記内皮細胞マーカに特異的な細胞を選択し、これにより、内皮表現型を有する細胞に関して前記試料又はその画分を濃縮するステップと、
    c. 上皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも15個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は上皮細胞マーカに対するリガンドに、内皮表現型を示すb)において選択された前記細胞を接触させるステップと、
    d. ステップc)の前記上皮細胞マーカにも結合する、内皮表現型を有する細胞を検出するステップと、を備える方法。
  2. 母体血液試料中の胎児細胞を単離する方法であって、
    a. 内皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも15個の隣接ヌクレ オチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は内皮細胞マーカに対するリガンドに、 前記母体血液試料又はその画分を接触させるステップと、
    b. 上皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも15個の隣接ヌクレ オチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は上皮細胞マーカに対するリガンドに、 前記母体血液試料又はその画分を接触させるステップと、
    c. 前記内皮細胞マーカに特異的な細胞を選択し、これにより、内皮表現型を有する細 胞に関して前記試料又はその画分を濃縮するステップと、
    d. ステップb)の前記上皮細胞マーカにも結合する、内皮表現型を有する細胞を検出す るステップと、を備える方法。
  3. 前記内皮細胞マーカの標的は、同定対象となる細胞の表面に位置する、請求項1又は2記載の方法。
  4. 前記上皮細胞マーカの標的は、同定対象となる細胞の細胞内に位置する、請求項1又は2記載の方法。
  5. a.母体血液試料又はその画分を、
    i. 内皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも15個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は
    ii. 内皮細胞マーカに対するリガンドに、接触させるステップと、
    b. 先行ステップの前記ハイブリダイゼーションプローブ又は前記リガンドに結合した細胞を選択し、これにより、先行ステップの前記ハイブリダイゼーションプローブ又は前記リガンドに結合した細胞に関して、前記試料又はその画分を濃縮するステップと、
    c. 前記試料又はその画分を、
    i. 上皮細胞マーカをコードする遺伝子に対して相補的な少なくとも15個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ又は
    ii. 上皮細胞マーカに対するリガンドに、接触させるステップと、を備える方法
  6. 更に、前記試料又はその画分の胎児細胞を同定するステップを備える、請求項5記載の方法。
  7. 同定は、胎児細胞上又は細胞内の前記リガンド又は前記ハイブリダイゼーションプローブの存在を検出することを含む、請求項5及び6の何れかに記載の方法。
  8. 前記母体血液試料は、全血である、請求項1乃至7の何れかに記載の方法。
  9. 前記試料又はその画分中の細胞は、前記選択/濃縮ステップ後に固定ステップを施される、請求項1乃至8の何れかに記載の方法。
  10. 前記試料又はその画分中の細胞は、前記固定ステップ後に透過化される、請求項1乃至9の何れかに記載の方法。
  11. 前記内皮細胞マーカは、CD105、CD146、又はCD141からなる群から選択される、請求項1乃至10の何れかに記載の方法。
  12. 前記内皮細胞マーカは、CD105である、請求項1乃至11の何れかに記載の方法。
  13. 前記上皮細胞マーカは、CK8、CK18、CK19、又はCK7からなる群から選択される、請求項1乃至12の何れかに記載の方法。
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