JP2008278800A - Ｒｎａウイルスの検出法 - Google Patents

Abstract

【課題】簡便な操作で、迅速多検体処理可能なＲＮＡウイルスの検出法を提供すること。
【解決手段】表面にリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有するとともに、少なくとも一つ以上の反応空間が設けられ、当該反応空間には固定された固定核酸プライマーを含む担体を用いて、ＲＮＡウイルスを含む標的サンプルからＲＮＡウイルスの特異的標的ＲＮＡ鎖を検出することを特徴とするＲＮＡウイルスの検出法。
【選択図】 図２

Description

本発明はＲＮＡウイルスの検出法に関する。

ＲＮＡウイルスの一種であるノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）はヒトカリシウイルス科に属するウイルスであり、人に対し急性胃腸炎を起こすことが知られている。カキなどの貝類による食中毒の原因になるほか、感染したヒトの糞便や嘔吐物、あるいはそれらが乾燥したものから出る塵埃を介して経口感染する。ノロウイルスによる集団感染は世界各地の学校や養護施設などで散発的に発生している。

また、ノロウイルスは実験室的に増殖させる方法が未だ見つかっていないため、検査や治療に対する研究が他のウイルスと比べて格段に遅れている。このためノロウイルスの検査は、公衆衛生上および食品の品質管理上大きな課題となっている。現状では一般的に糞便を検体に用いたＥＬＩＳＡ法よる検出及びＲＴ−ＰＣＲ法による検出が多く用いられている（非特許文献１参照）。特に、高感度かつ迅速な検査方法としてＲＴ−ＰＣＲ法は注目されており、感染拡大するノロウイルスの遺伝子型の判定に用いることができる利点がある。

しかしＲＴ−ＰＣＲは細胞収集、生体サンプルからRNA抽出と精製、逆転写反応、PCR及び遺伝子検出など操作が非常に煩雑で、各工程におけるサンプルロスやコンタミネーションなどの問題点を有し、安定した遺伝子検出を行うには研究者の技術の熟練を要するのが現状である。とくに、完全なRNA分子の精製はRT-PCRの成功を決定する第一のステップであり、これには細胞及び組織中のリボヌクレアーゼを除去または不活性化するための作業が要求される。

これらの問題を解決するため、自動RNA抽出装置、mRNA精製キット等の製品開発が盛んに行なわれている。例えば、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズあるいはタンパク凝集作用を有する試薬等が使用されている。しかし、いかなる製品を用いても時間の懸かる困難な処理操作ステップが要求されるため、多検体の処理に対して困難を強いられる。
食品衛生検査指針 微生物編 (日本食品衛生協会編)

本発明の目的は、簡便な操作で、迅速多検体処理可能なＲＮＡウイルスの検出法を提供することである。
本発明者らは、RNA抽出及びRT-PCRを行う際に非特異的吸着性の表面を有する表面をもつ担体を用いることで本発明の完成に至った。

本発明は以下の通りである。
（１）表面にリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有するとともに、少なくとも一つ以上の反応空間が設けられ、当該反応空間には固定された固定核酸プライマーを含む担体を用いて、ＲＮＡウイルスを含む標的サンプルからＲＮＡウイルスの特異的標的ＲＮＡ鎖を検出することを特徴とするＲＮＡウイルスの検出法。
（２）ＲＮＡウイルスを含む標的サンプルからサンプル溶解物を調製する工程、前記溶解物を前記反応空間に移す工程、ＲＮＡウイルスの特異的標的ＲＮＡ鎖を前記固定核酸プライマーによってハイブリダイズする工程、適切な緩衝液をもちいて逆転写反応―ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を前記反応空間で行う工程、目的ＰＣＲ産物を検出する工程、を含む（１）記載のＲＮＡウイルスの検出法。
（３）目的ＰＣＲ産物を検出する工程において、ＰＣＲ産物を核酸染色を用いて蛍光測定的にまたは蛍光若しくは化学ルミネセンスを発生させることによって定量する（２）記載のＲＮＡウイルスの検出法。
（４）前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザ、又はＨＣＶである（１）〜（３）いずれか記載のＲＮＡウイルスの検出法。
（５）前記担体が、ＰＣＲ用チューブ又はＰＣＲ用マイクロプレートである（１）〜（４）いずれか記載のＲＮＡウイルスの検出法。
（６）前記固相核酸プライマーがオリゴｄＴである（１）〜（５）いずれか記載のＲＮＡウイルスの検出法。
（７）前記固相核酸プライマーがＲＮＡウイルス特異的な配列と相補的な配列をもつ核酸である（１）〜（５）いずれか記載のＲＮＡウイルスの検出法。
（８）ＲＮＡウイルス特異的な配列がノロウイルス特異的な配列である（７）記載のＲＮＡウイルスの検出法。
（９）ＲＮＡウイルスを含む標的サンプルからサンプル溶解物を調製する工程において、ＲＮａｓｅ活性を阻害するまたはＲＮａｓｅを不活性化するための試薬を含み、ハイブリダイゼーションのためのｐＨ及び塩濃度を調整する溶解用緩衝液を用いてサンプル溶解物を調製する（２）〜（８）いずれか記載のＲＮＡウイルスの検出法。
（１０）前記サンプル溶解物の組成において、グアニジン、プロテアーゼ又はフェノールを含む（２）〜（９）いずれか記載のＲＮＡウイルスの検出法。
（１１） 適切な緩衝液をもちいて逆転写反応―ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を反応空間で行う工程において、試料に含まれるヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものである（２）〜（１０）いずれか記載のＲＮＡウイルスの検出法。
（１２） 前記担体が、プラスチック材料からなるものである（１）〜（１１）いずれか記載のＲＮＡウイルスの検出法。

本発明によれば、迅速に多検体処理可能なＲＮＡウイルスの検出が可能となる。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
ここで使用される担体の表面には、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。

このリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基は鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、この高分子物質からなるコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該の表面に固定化される。

第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。

また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、表面における鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。

カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。

活性化されたカルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；
等の基を有することができる。

また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。

（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）

上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。

（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ¹およびＲ²は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ¹はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ²はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）

上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。

上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。

カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。

また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。

実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。

ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。

表面にプライマーが固定化される担体の場合、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、ホスホリルコリン基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。

また、本実施形態の担体のコーティング層に使用される高分子物質は、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の担体表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。

具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。

ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。

上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、鋳型ＲＮＡ断片の非特異吸着を抑制する性質と、プライマーを固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、担体表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた担体上への鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制しつつ、プライマーをさらに確実に共有結合により固定化して担体上に導入することができる。

なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。

溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。

また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。

さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。

なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有する例を説明したが、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。

なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。

このような第二の高分子物質は、鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。

なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。

以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む担体は、所定の形状に加工された担体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に担体を浸漬し、乾燥してもよい。

また、担体として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス担体のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。

熱可塑性樹脂としては、ある程度耐熱性があれば特に制限はない、耐熱性のある樹脂としてたとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；環状ポリオレフィン；含フッ素樹脂；
等を用いることができる。

次に、担体の表面へのプライマーの固定化方法について説明する。
例えば、（ｉ）担体上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とプライマーとを反応させて共有結合を形成させることにより、担体表面でプライマーを固定化し、続いて（ｉｉ）プライマーを固定化した以外の担体表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、プライマーを担体の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。

上記工程（ｉ）において、鋳型ＲＮＡ断片とアニールするプライマーを担体上に固定化する際には、プライマーを溶解または分散した液体を接触させることにより、高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がプライマーと反応して、プライマーの間で共有結合が形成される。

このプライマーを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。

また、接触後、担体表面に固定化されなかったプライマーを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。

また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はプライマーを固定化した以外のプラスチック担体表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。

アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。

一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。

また、担体に固定化するプライマーには、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたプライマーを用いることにより、効率よくかつ強固に担体の表面上にプライマーを固定化することができる。アミノ基の導入位置はプライマーの分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的な鋳型ＲＮＡ断片とのアニーリングをより一層効率よく行うことができるという観点からは、好ましい。

以上により、表面上にプライマーが固定化された担体が得られる。この担体は図１に示したように、担体１２の表面上にプライマー１４が固定化されている。また、担体１２の表面に設けられる反応空間としては、チューブ、ウェル、液体流路などＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことができる反応空間を提供できれば、どのような形状であってもよい。定量的ＰＣＲによって検出するためには、リアルタイムＰＣＲ装置用のチューブ形状が望ましい。

また、プライマー１４の長さは、目的や用途に応じて任意に決定することができ、例えば５〜５０塩基とすることができる。

ＲＮＡウイルスが含まれる試料からサンプル溶解物を作製し、上記により得られる反応空間に導入を行うことで、試料に含まれるＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ鎖を固相プライマーもしくはオリゴｄTプライマーにより捕捉し、洗浄を行うことで目的とするＲＮＡ鎖の回収と、精製を行うことができる。このＲＮＡ鎖に対し、逆転写反応及びＰＣＲを行い、得られる目的ＰＣＲ産物を検出することでＲＮＡウイルスの検出を行うことができる。

本発明において、標的となる試料は糞便、吐しゃ物、貝類、下水道水等が含まれるがこれらに限定されるものではない。

使用されるサンプル溶解物は、試料に含まれるＲＮＡウイルスのＲＮＡ分解酵素の阻害を行う性質を持つ組成が含まれる。一般的に界面活性剤およびグアニジン等のタンパク質変性剤の組成からなる溶解液が選ばれるが、タンパク質変性剤の代わりにタンパク質分解酵素およびフェノールなどを用いても良い。

固相プライマーはオリゴｄＴプライマーやＲＮＡウイルスの特異的な配列と相補的な配列をもつプライマーが選ばれる。後者を用いることにより、ＲＮＡ鎖の捕捉時にノロウイルス特異なＲＮＡ分子のみを捕捉することができる。

逆転写反応液は、ｐＨ緩衝液ならびにＭｇＣｌ２、ＫＣｌなどの塩類、プライマー、デオキシボヌクレオチド類、ＲＮａｓｅ阻害剤ならびに逆転写酵素を含むものである。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用される。また、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク質や、界面活性剤等の物質が添加される場合がある。

ＰＣＲ反応液は、ｐＨ緩衝液ならびにＭｇＣｌ２、ＫＣｌなどの塩類、プライマー、デオキシボヌクレオチド類、ＲＮａｓｅ阻害剤ならびに耐熱性ポリメラーゼを含むものである。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用される。また、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク質や、界面活性剤等の物質が添加される場合がある。

ＲＴ−ＰＣＲはＲＴ反応の産物の一部をＰＣＲ反応液に添加して実行すること、またはＲＴ反応の産物にＰＣＲ反応用試薬を添加して実行すること、または予めＲＴ−ＰＣＲ反応に必要なすべての試薬を準備しておき、ＲＴ反応とＰＣＲ反応を連続して実行することも可能である。

上記ＰＣＲ反応時にＰＣＲ産物量を測定することのできる試薬を用いることにより、鋳型ＲＮＡの定量的な評価を行うことができる。

上記により得られるプライマーが固定化された担体は、一般的なプラスチック表面に比べ、ポリマーの親水性基の効果により担体表面への非特異的吸着が抑制されている。このため生体由来成分が混在するサンプルから表面に固定化されたプライマーに相補的なＲＮＡ及びＤＮＡのみが捕捉され、上清を取り除き、洗浄を行うことで捕捉されたＲＮＡ及びＤＮＡの精製を行うことができる。一般的なプラスチック表面では非特異的吸着があるために、捕捉されたＲＮＡ及びＤＮＡ以外にも表面への吸着がおこり、十分に精製することができない。ゆえに、ＲＮＡウイルスの検出法において非特異的な吸着が検出に悪影響を与える。

上記ポリマーを構成する親水性基は細胞表面をモチーフとするホスホリルコリン基を有しているため、固層表面において酵素反応を阻害しない。この効果により、捕捉したＲＮＡを鋳型として逆転写反応を効率よく行うことができ、固相ｃＤＮＡを作製することができる。さらに、固相ｃＤＮＡを鋳型として定量的ＰＣＲ反応を行うことにより標的サンプルに含まれるＲＮＡウイルス特異的なＲＮＡ鎖を定量することができる。

表面に固定化されたプライマーに相補的なＲＮＡ及びＤＮＡのみが捕捉された反応空間に対して、ランダムプライマーを含む逆転写反応液を添加することにより、固相に捕捉されたＲＮＡを鋳型として液相ｃＤＮＡを作製することができる。さらに、この液相ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、ノロウイルス特異的なＲＮＡ鎖を定量検出することができる。

以下、この担体を用いたＲＮＡウイルス検出方法の具体的な態様について説明する。ただし、いかなる意味においても本発明を限定的に解釈するための意味を有するものではない。

（第一の実施態様）
図２は、第一の実施態様としてのＲＮＡウイルス検出方法の手順を示すフローチャートである。
図３および図４は、図２のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を
模式的に示す図である。

このＲＮＡウイルス検出方法は、担体１２に設けられた反応空間２０にサンプル溶解物を含む試料２２導入し（ステップＳ１０）、ハイブリダイゼーションを行う（ステップＳ２０）第１段階と、洗浄を行う（ステップＳ３０）第２段階と、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料２３を導入し（ステップＳ４０）、サンプル溶解物に含まれるＲＮＡ鎖１６を鋳型にして、固定ＤＮＡプライマー（プライマー１４）のＤＮＡ鎖伸長反応を行って、ｃＤＮＡ鎖を形成する（ステップＳ５０）第３段階と、ｃＤＮＡ鎖１８を含む反応系に伸長用ＤＮＡプライマー、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料２４を導入し（ステップＳ６０）、ｃＤＮＡ鎖１８を鋳型にして、ＰＣＲ反応を行い、二重鎖ＤＮＡ２１を増幅する（ステップＳ７０）第４段階と、増幅された２重鎖ＤＮＡ２１を検出する（ステップＳ８０）第５段階とを含むものである。

ステップＳ１０において導入されるサンプル溶解物中にＤＮＡ鎖伸長用酵素系による酵素反応を阻害しない場合、また酵素反応への阻害を低減させる工夫がある場合、サンプル細胞溶解物を含む試料２２にＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびオリゴヌクレオチドモノマーを加え、ステップＳ３０の洗浄工程を省略することができる。

ステップＳ２０では、ハイブリダイゼーションを行い、鋳型のＲＮＡ鎖１６の一部と相補的な配列を有するプライマー１４と、このＲＮＡ鎖１６とを二本鎖にする（図３Ｂ、図４Ｂ）ＲＮＡ鎖１６の配列のどの部分とも相補的な関係の配列をも有さないプライマー１４は二本鎖にならない。プライマー１４にオリゴｄＴプライマーを用いることにより、ＲＮＡがもつポリＡを捕捉することができる。また、プライマー１４に特異的な配列をもつＤＮＡプライマーを用いることにより、特異的なＲＮＡ鎖およびＤＮＡ鎖を捕捉することができる。

ステップＳ３０では、反応空間２０を洗浄することで、プライマー１４とＲＮＡ鎖１６との二本鎖を残し反応空間内の試料２２を取り除くことができる。洗浄において上記ポリマーをコートした表面は親水性基に細胞溶解液中に含まれる生体分子を無吸着効果があるために、純粋なＲＮＡとして精製することができる。ポリスチレン、ポリプロピレンなどの上記ポリマーをコートしていないプラスチック表面を用いた場合、後工程の酵素反応阻害物質を取り除くことができず検出において悪影響を与える。

ステップＳ５０では、プライマー１４の３'末端において、ＲＮＡ鎖１６を鋳型としてＤＮＡ鎖伸長用酵素系の作用により逆転写反応が起こり、ＤＮＡ鎖の伸長反応が起こり、ＲＮＡ鎖１６に相補的なｃＤＮＡ鎖１８が基板１２の上に形成される（図３Ｃ、図４Ｃ）

ステップＳ６０では、ｃＤＮＡ鎖１８を鋳型ＤＮＡ鎖としてのｃＤＮＡ鎖１８の一部と相補的な配列を有するプライマー（不図示）、ＤＮＡ鎖伸長酵素系、およびヌクレオチドモノマーを含むＰＣＲ反応液を導入する。ＤＮＡ鎖伸長酵素系としては、例えばＰＣＲで代表的に使用されるTaqポリメラーゼなどの耐熱性酵素が挙げられる。ステップＳ８０において、定量的ＰＣＲ反応による蛍光色素による定量を行う場合、該反応液にＴａｑＭａｎプローブなどの検出用蛍光プローブやＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなどの蛍光分子を導入する必要がある。また、ＤＮＡマイクロアレイなどのハイブリダイゼーションによる検出を行う場合、ヌクレオチドモノマーの少なくとも一種類をラベル化する必要がある。

ステップＳ７０では、ｃＤＮＡ鎖１８とｃＤＮＡ鎖１８の一部と相補的な配列を有するプライマーとＤＮＡ鎖伸長酵素系の作用によりＤＮＡ増幅反応が起こり、二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ２１が増幅される（図３Ｄ、図４Ｄ）。

ステップＳ４０〜ステップＳ７０において、ｃＤＮＡ作製を行う逆転写酵素等とＰＣＲ反応を行うＤＮＡポリメラーゼ等を同一反応溶液で行うことができる１ステップタイプのＲＴ−ＰＣＲ反応液を用いることにより、ステップＳ６０を省略することができる。

ステップＳ５０で形成されたｃＤＮＡ鎖１８は担体１２表面にＤＮＡ鎖として安定に存在するため、固相ｃＤＮＡとして反応空間２０を保存することができる。

以下、この担体を用いた細胞溶解液からRNA鎖を検出する方法の例を説明する。下記の実施例のチューブを使用することにより、糞便サンプル等からＲＮＡウイルス特異的なＲＮＡ鎖の検出を行うことができる。

（ＰＭＢＮコートチューブの作製）
市販ＰＣＲ用8連チューブ（ポリプロピレン製）に対し各チューブを２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンーブチルメタクリレートーｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ―ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）、各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、チューブ表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、ＰＭＢＮコ−トチューブを得た。以下ＰＭＢＮチューブと称す。

（プライマーの固定）
プライマーとして、下記表１に示したように、５’末端がアミノ基で修飾された配列１に示すオリゴDNAを各々０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。各オリゴＤＮＡ溶液を上記ＰＭＢＮコートチューブに１０μｌ分注し、チューブを８０℃で１時間放置した。超純水により洗浄を行った後、各チューブのブロッキング処理をおこなった。

このブロッキング処理とは、担体表面にオリゴＤＮＡを固定化させて、固定化プライマーとした後に、担体の表面に存在する未反応の活性エステルまたはアルデヒド基部分を不活性化して、試料中のＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖、その他たんぱく質などの生体由来物質などが非特異的に結合することを防止するための処理をいう。

具体的には、ＰＭＢＮコートチューブについては、ブロッキング溶液として、１ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨ溶液を各チューブに４００μｌ分注し、５分間室温で放置した後、ブロッキング液を除き、超純水により洗浄をおこなった。

ブロッキング処理後、ＰＢＳ（−）に１％ＢＳＡを各チューブに４００μｌを分注し、室温で２時間放置し、ＰＢＳ（−）に０．０５％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含有する洗浄溶液を４００μｌ分注し吸引除去を３回で洗浄を行った後、チューブを乾燥させた。

本発明の実施形態で用いる担体の一部を模式的に示す図である。 本発明の第一の実施形態に係るＲＮＡウイルス検出法を示すフローチャートである。 図２のフローチャートにしたがって担体の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。 図２のフローチャートにしたがって担体の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。

符号の説明

１２ 担体
１４ プライマー
１６ ＲＮＡ鎖
１８ ｃＤＮＡ鎖
２０ 反応空間
２１ 二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ
２２ サンプル溶解物を含む試料

Claims (12)

1. 表面にリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有するとともに、少なくとも一つ以上の反応空間が設けられ、当該反応空間には固定された固定核酸プライマーを含む担体を用いて、ＲＮＡウイルスを含む標的サンプルからＲＮＡウイルスの特異的標的ＲＮＡ鎖を検出することを特徴とするＲＮＡウイルスの検出法。
2. ＲＮＡウイルスを含む標的サンプルからサンプル溶解物を調製する工程、前記溶解物を前記反応空間に移す工程、ＲＮＡウイルスの特異的標的ＲＮＡ鎖を前記固定核酸プライマーによってハイブリダイズする工程、適切な緩衝液をもちいて逆転写反応―ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を前記反応空間で行う工程、目的ＰＣＲ産物を検出する工程、を含む請求項１記載のＲＮＡウイルスの検出法。
3. 目的ＰＣＲ産物を検出する工程において、ＰＣＲ産物を核酸染色を用いて蛍光測定的にまたは蛍光若しくは化学ルミネセンスを発生させることによって定量する請求項２記載のＲＮＡウイルスの検出法。
4. 前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザ、又はＨＣＶである請求項１〜３いずれか記載のＲＮＡウイルスの検出法。
5. 前記担体が、ＰＣＲ用チューブ又はＰＣＲ用マイクロプレートである請求項１〜４いずれか記載のＲＮＡウイルスの検出法。
6. 前記固相核酸プライマーがオリゴｄＴである請求項１〜５いずれか記載のＲＮＡウイルスの検出法。
7. 前記固相核酸プライマーがＲＮＡウイルス特異的な配列と相補的な配列をもつ核酸である請求項１〜５いずれか記載のＲＮＡウイルスの検出法。
8. ＲＮＡウイルス特異的な配列がノロウイルス特異的な配列である請求項７記載のＲＮＡウイルスの検出法。
9. ＲＮＡウイルスを含む標的サンプルからサンプル溶解物を調製する工程において、ＲＮａｓｅ活性を阻害するまたはＲＮａｓｅを不活性化するための試薬を含み、ハイブリダイゼーションのためのｐＨ及び塩濃度を調整する溶解用緩衝液を用いてサンプル溶解物を調製する請求項２〜８いずれか記載のＲＮＡウイルスの検出法。
10. 前記サンプル溶解物の組成において、グアニジン、プロテアーゼ又はフェノールを含む請求項２〜９いずれか記載のＲＮＡウイルスの検出法。
11. 適切な緩衝液をもちいて逆転写反応―ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を反応空間で行う工程において、試料に含まれるヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものである請求項２〜１０いずれか記載のＲＮＡウイルスの検出法。
12. 前記担体が、プラスチック材料からなるものであるＲＮＡウイルスの検出法。