KR102368506B1 - 결핵균과 비결핵 항산균 검출을 위한 객담의 전처리 조성물과 그 방법 및 프라이머와 프로브, 이를 이용한 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 결핵균과 비결핵 항산균 검출을 위한 객담의 전처리 조성물과 그 방법 및 프라이머와 프로브, 이를 이용한 장치에 관한 것으로, 인간 신체로부터 채취한 객담을 전처리하는 과정을 포함하는 결핵 진단 방법에 있어서, 상기 전처리하는 과정은 전처리 용액을 상기 채취한 객담에 투여하는 것을 포함하며, 상기 전처리 용액은 상기 채취한 객담 대비 2배 내지 3배의 비로 혼합하며, 수산화나트륨; 및 2-프로판올을 포함하는 것으로, 상기 수산화나트륨과 상기 2-프로판올은 전체 용액 대비 각각 0 내지 2%, 0 내지40%인 것을 특징으로 하는 결핵 진단 방법, 그리고 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 구성된 프라이머 그룹과 서열번호 7 내지 9의 염기서열로 구성된 프로브 그룹에서 적어도 어느 하나를 이용하는 것을 특징으로 하는 결핵 진단 방법과 이를 수행하는 것을 포함하는 결핵 진단 장치를 제공한다.
Description
본 발명은 결핵균과 비결핵 항산균 검출을 위한 객담의 전처리(액화, liquefaction)를 위한 전처리 조성물과 그 방법 및 프라이머와 프로브, 이를 이용한 장치에 관한 것으로, 상세하게는 상기 객담의 전처리 과정, 진단 카트리지에 장착되는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC) 및 비결핵 항산균(Non-Tuberculous Mycobacteria, NTM)의 진단 시약으로 객담 전처리 용액의 조성 및 전처리 방법, 결핵균 및 비결핵 항산균을 특이적으로 증폭하고 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 및 이를 이용한 장치에 관한 것이다.
결핵(TB, tuberculosis)은 결핵균(MTB, mycobacterium tuberculosis)에 의한 호흡기전파 질환으로, 밀접접촉자의 약 30%가 감염되고, 감염자의 약 10%에서 발병하는 감염력이 매우 높은 질환으로 발병은 감염자의 50%가 2년 이내에, 나머지 50%는 평생에 걸쳐 나타나고 있다.
그러나 결핵의 표준진단방법인 도말검사법은 간단하고 경제적이지만 민감도가 낮고 비결핵 항산균 (NTM, nontuberculous mycobacteria)을 구별하지 못해 오진의 가능성이 있다.
또 다른 표준진단방법인 배양검사법은 도말검사에 비해 정확하지만 결핵균이 매우 느리게 증식하기 때문에 균의 존재 여부를 확인하는데 최소 2주에서 최장 8주 정도의 시간이 걸리고 비용이 많이 드는 단점이 있다.
표준진단법 이외의 검사법으로 검체에서 결핵균의 유전자를 검출하는 분자진단법인 결핵균핵산증폭검사(2018 국가결핵관리지침, 질병관리본부)가 있다.
도말검사법에 비해 민감도와 특이도가 우수하고, 배양법에 비해 결과보고가 빠르다는 장점이 있어서 다수의 진단검사 전문기관에서 결핵균핵산증폭검사법의 하나인 real-time PCR법을 사용하고 있으나 분자진단 전문가가 없는 중소병원, 개인병원/의원, 보건소 등에서 이 기술을 사용하는데 어려움이 존재하고 예산문제 또한 현실적인 장벽이 되고 있다.
따라서 비전문가도 쉽게 사용할 수 있도록 현재의 real-time PCR법보다 간편하고 결과분석이 용이한 새로운 분자진단 시스템의 필요성이 있다.
Nicolas Radomski, Adelaide Roguet, Franηoise Lucas, Frederic Veyrier, Emmanuelle Cambau, et al.. atpE gene as a new useful specific molecular target to quantify Mycobacterium in environmental samples. BMC Microbiology, BioMed Central, 2013, 13 (1), pp.277. 10.1186/1471-2180-13-277. pasteur-00919416.
결핵의 표준진단방법인 도말검사법과 배양검사법은 민감도와 특이도가 떨어지거나 결과를 알기까지 시일이 오래 걸리고 비용이 많이 드는 단점이 있다.
결핵균 유전자를 검출하는 핵산증폭검사법이 우수한 민감도와 특이도의 결과를 빠르게 확인할 수 있다는 장점으로 기존의 표준진단방법의 단점을 보완할 수 있지만, 임상검체로부터 핵산을 추출하고 핵산을 증폭하는 과정은 전문가를 필요로 하고, 게다가 연구실 내 오염 문제를 피할 수 없다.
무엇보다 핵산증폭검사법이 결핵 표준진단법보다 빠르게 진단결과를 확인할 수 있다고 하지만, 시료를 준비하고 결과를 확인하기까지 여전히 시간이 오래 걸리는 방법이다.
소형자동화 분자진단시스템에 장착하는 카트리지에 동결건조한 결핵 진단 시약을 장착하여 신속하고 정확하게 객담 내의 결핵균 및 비결핵 항산균의 존재유무를 진단하는 키트(Kit)를 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
상기 서술한 과제를 해결하기 위한, 본 발명에 따른 일 수단은 다음과 같다.
본 발명에 따른 일 수단은, 인간 신체로부터 채취한 객담을 전처리하는 과정을 포함하는 결핵 진단 방법에 있어서, 상기 전처리하는 과정은 전처리 용액을 상기 채취한 객담에 투여하는 것을 포함하며, 상기 전처리 용액은 상기 객담 대비 2배 내지 3배이되, 수산화나트륨; 및 2-프로판올을 포함하는 것으로, 상기 수산화나트륨과 상기 2-프로판올은 전체 용액 대비 각각 0 내지 2%, 0 내지 40%인 것을 특징으로 하는 결핵 진단 방법을 일 수단으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 일 수단으로서는, 서열번호 1 내지 6의 염기서열의 프라미어 그룹과 서열번호 7 내지 9의 염기서열의 프로브 그룹 중 적어도 어느 하나를 이용하는 것을 특징으로 하는 결핵 진단 방법 및 동 방법을 수행하는 것을 포함하는 결핵 진단 장치를 일 수단으로 할 수 있다.
본 발명의 키트를 이용하면 비전문가도 쉽게 객담 내의 결핵균과 비결핵 항산균의 존재여부를 진단할 수 있고, 신속한 진단으로 알맞은 결핵관리가 용이한 효과가 있다. 또한, 결핵균과 비결핵 항산균을 동시에 진단하여 적절한 치료를 가능하게 하고, 그에 따른 치료 비용의 절감 및 치료 기간의 단축으로 인한 경제적 효과도 기대할 수 있다.
구체적으로는, 본 발명에 따른 일 수단으로서 결핵 진단을 위한 전처리용액에 의해, 보다 증폭 효율이 개선된 결핵 진단 방법을 제공할 수 있고, 종래 기술 대비 증폭 효율이 개선된 프라이머 및 프로브를 제공하여 보다 신속하고 정확하게 결핵을 진단하게끔 할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 전처리 방법의 모식도이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 전처리에 있어서 객담과 전처리 용액의 비율 및 시간 테스트 결과를 도시한 것이다.
도 2는 전처리용액의 수산화나트륨과 2-프로판올의 농도를 달리 하여 수득한 Cycle-RFU 그래프이다.
도 3는 서열번호 1 내지 6의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 결핵균, 마이코박테리아 및 바실러스균의 프라미어 세트의 PCR 증폭 결과를 도시한 것이다.
도 4는 비특허문헌 1에 개시된 프라이머와 본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 M. avium과 M. kansasii 종을 PCR 증폭한 것을 도시한 것이다.
도 5은 비특허문헌 1에 개시된 프로브와 본 발명에 따른 프로브를 이용하여 M. avium, M. kansasii, M. abscessus 종을 PCR 증폭한 것을 도시한 것이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 전처리에 있어서 객담과 전처리 용액의 비율 및 시간 테스트 결과를 도시한 것이다.
도 2는 전처리용액의 수산화나트륨과 2-프로판올의 농도를 달리 하여 수득한 Cycle-RFU 그래프이다.
도 3는 서열번호 1 내지 6의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 결핵균, 마이코박테리아 및 바실러스균의 프라미어 세트의 PCR 증폭 결과를 도시한 것이다.
도 4는 비특허문헌 1에 개시된 프라이머와 본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 M. avium과 M. kansasii 종을 PCR 증폭한 것을 도시한 것이다.
도 5은 비특허문헌 1에 개시된 프로브와 본 발명에 따른 프로브를 이용하여 M. avium, M. kansasii, M. abscessus 종을 PCR 증폭한 것을 도시한 것이다.
첨부한 도면들을 참조하여 본 발명인 결핵균과 비결핵 항산균 검출을 위한 객담의 전처리 조성물과 그 방법 및 프라이머와 프로브, 이를 이용한 장치를 상세히 설명한다. 다음에 소개되는 도면들은 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 이하 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다.
이 때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시예 등을 통하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예를 통한 결핵 진단 방법은, (1) 인간의 신체로부터 객담(가래)를 채취하여 냉장보관하는 단계("채취단계"); (2) 채취한 객담을 전처리하는 단계("전처리단계"); (3) 전처리된 객담에서 DNA를 추출하는 단계("추출단계"), (4) 추출물에서 표적 유전자(Target Gene)을 real-time PCR의 방법으로 증폭하는 단계("증폭단계");를 포함하여, 결핵균 및 비결핵 항산균을 진단하는 방법이다.
상기 표적 유전자는 바람직하게 채취된 객담 내에 존재하는 DNA 추출물로서, 결핵균의 IS6110 유전자, 마이코박테리아의 atpE 유전자 중 적어도 하나 이상일 수 있으나, 이는 일 예에 불과하며, 결핵 진단을 하기에 적절한 유전자라면 이에 한하지 아니한다.
구체적으로 본 발명은 "증폭단계" 에 앞서 보다 양질의 검사 결과를 도출해내기 위해 "전처리단계"에서 어떠한 시약을 어떠한 조건으로 사용하는 지에 따라 그 검사 결과가 달라진다고 할 것이며, 이러한 전처리단계에서 사용하는 시약 및 그 사용 조건이 본 발명의 일 실시예가 될 수 있다.
또한, 본 발명은 "증폭단계"에서 표적 유전자의 증폭을 보다 효율적으로 달성하기 위한 프라이머/프로브 세트를 제공하고자 하며, 그 프라미어/프로브 세트가 일 실시예가 될 수 있다.
또 다른 한편, 상기 "증폭단계" 이후, "증폭여부 판정단계"를 더 포함할 수 있는데, 이는 뒤에서 설명하기로 한다.
이하, "전처리 단계"와 "증폭단계"로 크게 구분하여 본 발명을 보다 자세히 설명하되, "증폭여부 판정단계"는 그 다음에 부연하기로 한다.
전처리 단계
도 1a를 참조하여 전처리 과정을 설명하면, "채취단계"를 통해 수득한 객담을 용기에 첨가하되, 여기서 첨가되는 양은 0.5 내지 4ml가 될 수 있다.
다음, 첨가된 객담의 양 대비 1배 내지 3배 용량으로 전처리 용액(Sample Procsssing Reagent, SPR)을 첨가하되, 상기 첨가되는 전처리 용액의 양은 첨가된 객담 대비 바람직하게는 2배 내지 3배이다. 만약 2배 미만인 경우에는 전처리 용액에 의한 전처리 효과가 미흡하고, 3배를 초과하는 경우에는 전처리 용액이 상대적으로 많아져 전처리 효과가 과해질 우려가 있다.
객담과 전처리 용액을 하나의 용기에 넣은 뒤, 강하게 혼합하여 고온에서 가열해주되, 가열 온도는 바람직하게 85도 내지 95도, 더 바람직하게 90도이며, 가열 시간은 5분 내지 15분이 좋다.
도 1b를 참조하여 부연하면, 전처리 후 동일한 방법으로 추출하여 CFX96 Real-time PCR을 통해 증폭한 결과를 Cq 값으로 나타낸 바, 객담과 전처리 용액의 비는 1:2 내지 1:3이 적합한 것을 보여주면서, 전처리 가열 시간은 10분으로 함이 적절하였다.
강하게 혼합하는 것은 손으로 직접 흔들 수도 있되, 10회 정도로 할 수 있고, 기계/기구를 이용할 수 있으며, 상기 가열은 항온수조기를 활용할 수 있으나, 이에 한하지 아니하며, 가열수단이면 어느 것이든 충족될 수 있다.
그리고 다시금 가볍게 혼합하되, 이 때 교반기 등 기계를 이용하여 혼합하거나, 손으로 가볍게 5회 정도 흔들어서 혼합할 수 있다.
상기 전처리용액은 수산화물과 알코올이 포함된 것을 특징으로 하되, 상기 수산화물은 수산화나트륨(NaOH), 상기 알코올은 2-프로판올(2-Propanol)일 수 있다.
본 발명자들은 객담의 전처리 효율을 측정하기 위해 각각의 농도를 달리하여 마이코박테리아(Mycobacteria)의 atpE 유전자 증폭의 정도 및 상피세포에서 GAPDH 유전자 증폭 정도를, 각 조성의 전처리 시약들로 전처리 후에 동일하게 DNA를 추출한 후 추출물의 증폭을 확인하였는데, 그 결과는 아래 [표 1] 및 도 2에서 정리하였다.
[표 1]
증폭단계 - real-time PCR에 사용되는 프라이머 및 프로브
앞서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 일 실시예는 "전처리 단계" 와 "추출 단계" 이후 "증폭단계"를 거치게 되며, 이 때 real-time PCR 기법을 사용할 수 있으나, 표적 유전자(target gene)을 증폭케 하는 기법이라면 이에 한하지 않는다.
이 때, 증폭을 위한 Taq 중합효소, Taq Buffer, 반응을 위해 필요한 부수적인 물질은 직접 제조하거나 상업적으로 판매하는 구성물질을 사용할 수 있다. 이때, 증폭을 위한 구성물질들은 증폭용 프라이머/프로브 세트와 혼합하여 카트리지의 증폭이 일어나는 챔버에 첨가한 후, 동결건조하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명자들은 동결건조한 바실러스균(Bacillus atrophaeus)을 포함하는 카트리지를 이용하여 상기 전처리한 객담시료로부터 게놈 DNA를 추출하고 결핵균의 IS6110 유전자, 마이코박테리아의 atpE 유전자, B. atrophaeus균의 gyrA 유전자를 증폭시켰다.
여기서 위와 같은 유전자를 증폭케 하는 데에 프라이머와 프로브가 필요하며, 본발명자들은 하기 [표 2]에 나열된 서열번호 1 내지 6의 각 염기서열을 갖는 프라이머 또는 [표 3]에 나열된 서열번호 7 내지 9의 각 염기서열을 갖는 프로브를 갖는 결핵균 진단 프라이머와 프로브를 이용하였다.
하기 서열번호 1번, 5번, 6번 프라이머와 7번 및 9번 프로브는 본 발명자들이 인공적으로 만든 것이고, 3번 및 4번 프라이머와 8번 프로브는 상기 비특허문헌1에 공지된 것을 다소 변형한 것이다. 그 변형의 정도에 대해서는 후술하기로 한다.
[표 2]
[표 3]
상기 서열번호 1 내지 6의 염기서열을 갖는 프라이머는 결핵균 및 마이코박테리어 검출용으로 활용될 수 있으며, 상기 결핵균 및 마이코박테리아의 특정 유전자가 증폭되는 것을 확인하기 위해 형광물질을 부착케 하는 프로브, 즉 형광물질 부착 프로브(Dye-labeled probe)세트를 더 포함할 수 있다.
상기 형광물질 부착 프로브로서, 상기 서열번호 7 내지 9의 형광물질 결합 프로브일 수 있는데, 상기 형광물질 부착 프로브의 형광세기가 실시간으로 측정되어상기 유전자들의 증폭 여부를 보여주게 되는 것이다.
상세히 설명하면, 위 서열번호 1, 2에 해당하는 염기서열은 결핵균의 IS6110 유전자를 특이적으로 증폭하도록 한 프라이머이고, 서열번호 7에 해당하는 염기서열은 IS6110 유전자의 증폭여부를 실시간으로 검출하도록 형광물질(Excitation 515-535nm, Emission 560-580nm)이 부착된 프로브이다.
서열번호 5, 6에 해당하는 염기서열은 핵산 추출 및 증폭에 대한 컨트롤(internal control로서의 목적)로 사용하는 B. atrophaeus균의 gyrA 유전자를 특이적으로 증폭하도록 한 프라이머이고, 서열번호 9에 해당하는 염기서열은 gyrA 유전자의 증폭여부를 실시간으로 검출하도록 형광물질(Excitation 620-650nm, Emission 675-690nm)이 부착된 프로브이다.
서열번호 3번, 4번 및 8번에 해당하는 염기서열은 마이코박테리아의 atpE 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머와 형광물질(Excitation 450-490nm, Emission 515-530nm)이 부착된 프로브인데, 표적 DNA (Target이 되는 유전자: atpE 유전자)에 대한 프라이머 및 프로브의 친화력(affinity)을 상기 비특허문헌 1. 대비 향상되게끔 만든 것이다.
본 발명자들은 상기 [표 2] 및 [표 3]에서 나열한 프라이머와 프로브의 효과를 알아보기 위해 다양한 조건 하에서 증폭 실험을 실시하였다.
도면 3 및 하기 [표 4]를 참조하여 설명하면, 본 발명자들은 서열번호 1 내지 6의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 결핵균, 마이코박테리아 및 B. atrophaeus균의 검출용 프라이머 세트를 사용하여 결핵균의 IS6110 유전자, 마이코박테리아의 atpE 유전자, B. atrophaeus균의 gyrA 유전자를 증폭케 하였고, 상기 프라이머 세트에 포함되는 서열번호 7 내지 9의 형광물질 결합 프로브 세트를 사용하여 형광세기를 실시간으로 측정하여 상기 유전자들의 증폭 정도를 살펴보았다(상기 증폭시약에서 프라이머 및 프로브 외에 부수적으로 사용되는 성분들은 널리 알려져 있기 때문에 이에 대한 구체적인 기재는 생략하기로 한다).
[표 4]
또한, 아래 [표 5]를 참조하여, 본 발명자들은 임의 개발된 프라이머 및 프로브에 대한 분석적 민감도를 살펴보았다. 비결핵 항산균 4종에 대해서 구간반복은 적게는 24회, 많게는 34회까지 이뤄졌으며, 95% 확률의 검출 한계치는 적게는 2.25, 많게는 14.07까지 기록했다. 반면, MTC(IS6110)의 경우 24회의 구간반복, 95% 확률의 검출한계치는 3.72을 기록했다.
[표 5]
또한, 아래 [표6] 및 [표7]을 참조하여 설명하면, 본 발명자들은 임의 개발된 프라이머 및 프로브의 분석적 특이도를 확인하였다.
[표 6]와 관련하여, 비결핵 항산균 6종에 대한 특이도 실험 결과, 결핵균 검출을 위한 형광은 검출되지 않고, internal control과 비결핵 항산균 검출을 위한 형광이 검출되었음을 알 수 있다.
[표 6]
[표 7]과 관련하여, 비결핵균 6종에 대한 특이도 실험 결과, internal control의 형광만 검출되고 결핵균 및 비결핵 항산균의 검출을 위한 형광은 검출되지 않았음을 알 수 있다.
[표 7]
한편, 앞서 말한 바, 본 발명자들은 상기 비특허문헌 1의 Nicolas Radomski et al.(2013)의 프라이머 및 프로브를 참조하여 서열 번호 3, 4 및 8의 프라이머/프로브를 만들었는데, 상기 비특허논문 1과 비교하여 다음 [표 8]에서 보는 바와 같은 염기서열의 차이가 있다.
[표 8]
도4와 아래 [표 9]을 참조하여 설명하면, 본 발명자들에 의해 개발된 프라이머를 사용한 증폭 결과 Cq 값이 적고, RFU(상대적 형광세기) 값이 크다. 이는 상기 비특허문헌 1의 프라이머와 비교하여 볼 때, 본 발명자가 개발한 프라이머의 증폭 성능이 우수하다고 판단되며, 10배 정도 우수한 감수성이 나타난 것으로 보인다.
[표 9]
도5과 아래 [표 10]을 참조하여, 상기 비특허문헌 1의 프로브와 본 발명자들이 개발한 8번 프로브의 성능을 설명한다(위 [표8]의 8번 염기서열 참조).
본 발명자들은 리버스 프라이머(Reverse Primer)와 프로브를 이용하여 결핵균의 게놈 DNA를 증폭한 뒤, 프로브의 결합력을 간접적으로 확인하였다. 그 결과, 본 발명자들이 개발한 프로브를 사용한 경우, 논문 대비 Cq 값이 상대적으로 적고, 10배 정도 우수한 감수성을 나타내어, 그 결합력이 보다 우수한 것으로 보인다.
[표 10]
더 나아가, 본 발명자들은 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브와 타사의 제품을이용하여 결핵균 게놈 DNA의 증폭(CFX96 Real-time system)결과를 비교하였다.
그 결과 다음 [표 11]에서 보는 바와 같이, 본 출원인의 프라이머 및 프로브는 타사 대비 10배 정도 우수한 감수성을 갖는 것으로 확인되었다.
[표 11]
증폭여부 판정단계
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 "증폭단계" 이후에, 표적 유전자가 결핵 진단에 적절한 수준으로 증폭되었는지 확인하는 "증폭여부 판정단계"를 더 포함할 수 있다.
본 발명자들은 형광물질 (Excitation 620 - 650nm, Emission 675 - 690nm)의 형광세기를 측정하여 인터널 컨트롤(internal control)로 사용하는 B. atrophaeus균의 gyrA 유전자의 증폭 여부를 판정하여 추출과 증폭 과정에 문제가 없음을 확인하고, 형광물질(Excitation 450 - 490nm, Emission 515 - 530nm)의 형광세기를 측정하여 결핵균과 비결핵 항산균를 포함하는 마이코박테리아의 atpE 유전자의 증폭여부를 판정, 형광물질(Excitation 515 - 535nm, Emission 560 - 580nm)의 형광세기를 측정하여 결핵균 특이적인 IS6110 유전자의 증폭여부를 판정하는 것이며, 아래 [표 12]은 모든 가능한 결과에 대한 판정기준표이다.
[표 12]
상기 발명의 상세한 설명 및 실시예는 단지 본 발명의 예시적인 것으로, 이는 단지 본 발명을 설명하기 위한 목적에서 사용된 것이지, 의미한정이나 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하기 위하여 사용된 것은 아니다. 그러므로 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.
<110> Advanced BioVision Inc.
<120> Pre-processing solution, primer and probe for detecting
Mycobacterium tuberculosis and Non-tuberculosis mycobacterium in
sputum, and apparatus using the same
<130> DP2019-00131
<160> 9
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mycobacterium tuberculosis complex
<400> 1
tcggaccacc agcacctaac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mycobacterium tuberculosis complex
<400> 2
cgtaggcgtc ggtgacaaag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mycobacterium tuberculosis complex
<400> 3
tcggaccacc agcacctaac 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mycobacteria
<400> 4
ygccggtatc ggtgacgg 18
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Bacillus atrophaeus
<400> 5
cgacttccac ccacgatacg at 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Balansia gaduae
<400> 6
atccattcgc ccttctccac tt 22
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mycobacterium tuberculosis complex
<400> 7
acctcaccta tgtgtcgacc tggg 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mycobacteria
<400> 8
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<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Bacteriophage SPO1
<400> 9
aggggaaagt ctatcgctca aaagg 25
Claims (3)
- 인체로부터 분리된 객담을 전처리하는 과정을 포함하는 결핵 진단 방법에 있어서,
상기 전처리하는 과정은 수산화나트륨 및 2-프로판올을 포함하는 전처리 용액을 상기 객담에 투여하는 것을 포함하며,
상기 수산화나트륨은 전체 용액 대비 2% 농도이며, 상기 2-프로판올은 전체 용액 대비 40%의 농도인 것을 특징으로 하고,
상기 전처리 용액은 상기 객담에, 객담 대비 2배 내지 3배의 비로 투여되며,
전처리 용액과 객담이 혼합된 용액을 섭씨 90도에서 5분 내지 15분 동안 가열하되,
서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 결핵균의 IS6110 유전자를 증폭시키고, 서열번호 7의 프로브를 이용하여 상기 유전자가 증폭되는 것을 검출하는 것을 특징으로 하는 결핵 진단을 위한 정보제공 방법. - 제1항에 있어서,
서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 마이코 박테리아의 atpE 유전자를 증폭시키고, 서열번호 8의 프로브를 이용하여 검출하고,
서열번호 5 및 서열번호 6의 프라미어를 이용하여 B. atrophaeus 균의 gyrA 유전자를 증폭시키고, 서열번호 9의 프로브를 이용하여 검출하는 것을 더 포함하는 결핵 진단을 위한 정보제공 방법. - 삭제
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020190144592A KR102368506B1 (ko) | 2019-11-12 | 2019-11-12 | 결핵균과 비결핵 항산균 검출을 위한 객담의 전처리 조성물과 그 방법 및 프라이머와 프로브, 이를 이용한 장치 |
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| JP2017521086A (ja) * | 2014-07-24 | 2017-08-03 | アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド | マイコバクテリウム・ツベルクロシスの検出および分析のための組成物および方法 |
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| KR100950495B1 (ko) | 2008-04-23 | 2010-03-31 | 단국대학교 산학협력단 | 특정 프라이머 세트를 포함하는 결핵균을 검출하기 위한등온증폭반응용 프라이머 조성물, 키트 및 상기 프라이머세트를 이용하여 결핵균을 검출하는 방법 |
| KR20170138732A (ko) | 2016-06-08 | 2017-12-18 | 한국과학기술원 | 객담도말검사 기반의 결핵 진단 시스템 |
| KR101865898B1 (ko) | 2016-08-25 | 2018-06-08 | 솔젠트 (주) | 결핵균 및 비결핵균 동시 검출용 진단키트 |
-
2019
- 2019-11-12 KR KR1020190144592A patent/KR102368506B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017521086A (ja) * | 2014-07-24 | 2017-08-03 | アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド | マイコバクテリウム・ツベルクロシスの検出および分析のための組成物および方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20210057893A (ko) | 2021-05-24 |
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