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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von lebenden Mikroorganismen und/oder zur Differenzierung von lebenden und toten Mikroorganismen in einer Probe mittels in-situ-Hybridisierung, insbesondere einer Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, und einer optischen Analyse der nachzuweisenden Mikroorganismen, wobei der Probe vor der Hybridisierung wenigstens eine Substanz beigegeben wird, die eine unterschiedliche Veränderung der Nukleinsäure-Konzentration, insbesondere RNA-Konzentration und/oder DNA-Konzentration, in toten Zellen und in lebenden Zellen begünstigt.
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Zum Nachweis von Nukleinsäuren in einzelnen Zellen sind beispielsweise Verfahren wie In-Situ-Hybridisierung (ISH) sowie die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH) bekannt. Dabei werden kurze synthetische Nukleinsäuresonden eingesetzt, welche über Basenpaarungen an die nachzuweisende Zielsequenz binden. Die In-Situ-Hybridisierung und die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung, bei welcher die Nukleinsäuresonden fluoreszent markiert sind, können zur spezifischen Detektion von Nukleinsäuren (DNA und/oder RNA Molekülen) verwendet werden.
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Die spezifische Detektion von Nukleinsäuren kommt beispielsweise bei einer Produktions- und/oder Qualitätskontrolle zur Anwendung. Für eine Vielzahl von Substanzen, Rohstoffen und Produkten aus den unterschiedlichen Bereichen der Industrie, Gesundheit oder Gastronomie ist es wichtig, dass die mikrobiologische Sicherheit gewährleistet werden kann. Beispielsweise kann bei einem Reinigungsverfahren einer Oberfläche auf diese Weise geprüft werden, ob die Reinigung/Desinfektion erfolgreich war.
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Mit molekularbiologischen Verfahren, beispielsweise PCR, kann die Nukleinsäure eines Mikroorganismus in wenigen Stunden nachgewiesen werden. Dabei wird jedoch die gesamte DNA/RNA aller Keime von lebenden und toten Mikroorganismen ermittelt. Für hygienische Bewertungen sind jedoch nur die Mikroorganismen von Belang, die eine Infektion auslösen können, und nicht bereits abgestorbenen Mikroorganismen, die nicht mehr zu einer Erkrankung führen können. Daher ist es für ein Nachweisverfahren wichtig, dass eine Differenzierung zwischen lebenden und toten Mikroorganismen stattfindet.
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Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein einfaches und schnelles Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe bereitzustellen, das eine Unterscheidung lebender Mikroorganismen von toten Mikroorganismen ermöglicht und außerdem außerhalb von Laborumgebungen durchführbar ist.
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Merkmale von Anspruch 1 gelöst. Insbesondere wird somit erfindungsgemäß zur Lösung der genannten Aufgabe bei einem Verfahren der eingangs beschriebenen Art vorgeschlagen, dass der zu untersuchenden Probe vor der Hybridisierung wenigstens eine Substanz beigegeben wird, die eine unterschiedliche Veränderung der Nukleinsäure-Konzentration, insbesondere RNA-Konzentration und/oder DNA-Konzentration, in toten Zellen und in lebenden Zellen begünstigt.
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Hierzu macht sich die Erfindung zunutze, dass eine Differenzierung zwischen lebenden und toten Mikroorganismen ermöglicht werden kann, indem der Probe vor der Hybridisierung wenigstens eine Substanz beigegeben wird, die eine unterschiedliche Veränderung der Nukleinsäure-Konzentration in toten Zellen und in lebenden Zellen begünstigt. Beispielsweise kann die RNA-Konzentration und/oder DNA-Konzentration in toten Zellen vermindert und/oder in lebenden Zellen erhöht werden. Alternativ oder zusätzlich kann die RNA-Konzentration und/oder DNA-Konzentration in toten und lebenden Zellen unterschiedlich schnell vermindert werden.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die beigegebene Substanz wenigstens einen chemischen Stoff enthält, der RNA und/oder DNA abbaut. Der chemische Stoff, der RNA und/oder DNA abbaut, kann ein Enzym sein. Beispielsweise ist das eine DNAse. Die beigegebene Substanz kann auch eine RNAse sein. Von Vorteil ist es dabei, dass eine RNAse in die toten Zellen, die viel permeabler sind als die lebenden Zellen, d.h. sich oft durch eine erhöhte Durchlässigkeit auszeichnen, eindringen und im Zellraum enzymatisch aktiv werden kann. Dadurch können tote Partikel entfernt werden, was eine Lebend/Tod-Differenzierung erheblich verbessern kann. Die beigegebene Substanz kann auch einen chemischen Stoff enthalten, der einen RNA-Abbau und/oder einen DNA-Abbau begünstigt. Beispielsweise ist dieser Stoff Ethylendiamintetraacetat (EDTA), der auch als Schutzstoff vor Metalloenzymen verwendet werden kann. In einer vorteilhaften Ausführungsform beträgt die Konzentration von EDTA 0,1-2 M, bevorzugt 0,1-1 M, besonders bevorzugt 0,5 M. Es können auch weitere Stoffe wie beispielsweise Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), Triethylentetraminhexaessigsäure (TTHA), RNA-Helikase, Polymerase, Chaperon oder siRNA verwendet werden. Die beigegebene Substanz kann aber auch alternativ oder zusätzlich einen chemischen Stoff enthalten, der die Durchlässigkeit bei toten Zellen erhöht. Insbesondere ist es Murein-Hydrolase, Lysozym, Mutanolysin, Glukosaminidase, Peptidase oder Amidase. Als Peptidasen, d.h. Enzymen, die Proteine oder Peptide spalten, können Exopeptidasen und/oder Endopeptidasen verwendet werden, in Abhängigkeit von der Lokalisierung innerhalb der zu spaltenden Polypeptidkette. Alternativ oder zusätzlich kann in der beigegebenen Substanz auch ein selektives oder nicht selektives Nährmedium enthalten sein, das einen RNA-Aufbau und/oder DNA-Aufbau in lebenden Zellen begünstigt. Beispielsweise ist das ein Peptonwasser, CASO-Bouillon, DEV Lactose-Bouillon, MRS Medium, Thioglycolat Bouillon, Hirn-Herz-Infusion-Bouillon, Caseinpepton-Sojamehlpepton-Bouillon, GN-(gramnegativ) Anreicherungsbouillon n. Hajna und/oder LB-Medium.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht weiterhin vor, dass die Mikroorganismen zumindest mit Beigabe der Substanzen inkubiert werden. Insbesondere erfolgt die Inkubation der Mikroorganismen vor der Hybridisierung. Die Inkubationszeit kann dabei so bemessen werden, dass noch keine Zellteilung stattfindet. Dadurch kann die Wahrscheinlichkeit, dass tote Zellen als falsch-positives Signal erfasst werden, um mehrere Größenordnungen gesenkt werden, da diese tote Partikel durch die Inkubation der Mikroorganismen vor der Hybridisierung stark reduziert werden.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die Hybridisierung mindestens zwei der Schritte einer Fixierung, einer Permeabilisierung und einer Denaturierung umfasst. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass die Fixierung durch eine Denaturierungssubstanz erfolgt. Dies ermöglicht eine vorteilhafte Zusammensetzung des Hybridisierungspuffers, bei dem dasselbe Mittel zur Fixierung und Denaturierung verwendet werden kann.
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Es kann auch vorgesehen sein, dass in der Hybridisierung alle der Schritte einer Fixierung, einer Permeabilisierung und einer Denaturierung umfasst sind. Bevorzugt findet die Hybridisierung in einem Hybridisierungspuffer statt. Der Hybridisierungspuffer enthält als Denaturierungssubstanz beispielsweise eine ungiftige Substanz, insbesondere Guanidiniumchlorid und/oder Harnstoff. Als Denaturierungssubstanzen können alternativ oder zusätzlich auch Guanidiniumthiocyanat und/oder Formamid verwendet werden. Die Verwendung von Harnstoff ist jedoch bevorzugt.
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Hierdurch wird sichergestellt, dass der Einsatz von Guanidiniumchlorid und/oder Harnstoff anstelle von wassergefährdeten Stoffen oder anstelle vom toxischen Formamid die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ohne Labor ermöglicht. Von Vorteil ist dabei, dass die Reagenzien in trockenform vorgelagert und anschließend im Hausmüll entsorgt werden können. In einer vorteilhaften Ausführungsform beträgt die Konzentration des Guanidiniumchlorid 0,1-2 M, bevorzugt 0,1-1 M, besonders bevorzugt 0,5 M. Vorteilhaft ist dabei, dass Guanidiniumchlorid in einer Konzentration von über 0,25 M einen mit der Erhöhung der Konzentration zunehmenden Schutz vor RNAsen bieten kann. Alternativ kann eine Mischung aus Guanidiniumchlorid und Harnstoff in einer bevorzugten Konzentration von 5,3 M Harnstoff mit 0,5 M Guanidiniumchlorid verwendet werden. Dies ermöglicht einen verbesserten Schutz gegenüber RNAsen.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass der Probe ein Detergens zugegeben wird, bevor die Hybridisierung, insbesondere ein Fixierungsschritt, abgeschlossen ist. Von Vorteil ist es dabei, dass ein effektives Eindringen von Nachweissonden in die Zelle ermöglicht werden kann, indem der Probe ein Detergens zugegeben wird. Beispielsweise ist das Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS). In einer vorteilhaften Ausführungsform beträgt die Konzentration des SDS 0,003%-0,05%. Durch die Zugabe des Detergens bevor der Fixierungsschritt abgeschlossen ist, kann erreichbar sein, dass anschließend nicht-lysierte, individuelle Mikroorganismen nachgewiesen werden können. Insbesondere wird das Detergens nicht vor Beginn der Fixierung zugegeben. Die Zugabe des Detergens vor Beginn der Fixierung, bei der eine weitere Veränderung des Aufbaus der Mikroorganismen verhindert wird, würde den Nachweis der in den einzelnen Mikroorganismen durch die Hybridisierung erzeugten Reaktionsprodukte erschweren.
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Alternativ oder zusätzlich kann vorgesehen sein, dass vor der Hybridisierung eine Lebend/Tot-Differenzierung der in der Probe enthaltenden Mikroorganismen erfolgt. Somit kann der Nachweis von ausschließlich lebenden Mikroorganismen ermöglicht werden.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass der Hybridisierungspuffer mindestens ein Denaturierungsmittel und eine RNAse-inhibierende Substanz enthält. Dadurch können die Nukleinsäurehybride stabilisiert und auch Schutz vor RNAsen gewährleistet werden.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die RNAse-inhibierende Substanz aus Guanidiniumchlorid, Guanidiniumthiocyanat, Formamid, Dithiothreitol (DTT), Diethylpyrocarbonat (DEPC), Oligovinylsulfonsäure, Polyvinylsulfonsäure, Ethansulfonsäure, Heparin, Gluthation, natürlichen Nukleosiden und Nukleotiden ausgewählt ist.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass der Hybridisierungspuffer mindestens ein Salz, vorzugsweise Natriumchlorid enthält. Durch die Verwendung von Salzen im Hybridisierungspuffer kann die Renaturierungsrate der doppelsträngigen Nukleinsäurehybriden und somit auch die Hybridisierungseffizienz erhöht werden. Zusätzlich können auch andere Salze wie beispielsweise Magnesiumchlorid und/oder Kaliumchlorid enthalten sein. Der Zusatz von Magnesiumchlorid kann eine Förderung der Hybridbildung ermöglichen. In einer vorteilhaften Ausführungsform beträgt die Konzentration von Natriumchlorid 25-1100 mM, bevorzugt 750-1000 mM, besonders bevorzugt 800-900 mM. Die bevorzugte Konzentration von Magnesiumchlorid beträgt 0,01-50 mM.
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Es kann vorgesehen sein, dass der Hybridisierungspuffer als Puffersubstanz Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (TRIS-HCl) enthält. Vorteilhaft ist dabei, dass die Puffersubstanz den pH-Wert des Puffers zwischen 5,5 und 8,7 stabilisiert. In einer vorteilhaften Ausführungsform beträgt die Konzentration der Puffersubstanz 10-100 mM.
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Zusätzlich können RNA-Oligonukleotide als „Opfer-Substrat“ in dem Hybridisierungspuffer enthalten sein. Dadurch ist ein verbesserter initialer Schutz vor RNAse Aktivität erreichbar. In einer vorteilhaften Ausführungsform beträgt die Konzentration von RNA-Oligonukleotiden 0,1-100 µM.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die optische Analyse einen Schritt der Detektion, vorzugsweise des Quantifizierens der Mikroorganismen mit hybridisierten Nukleinsäuresonden umfasst. Alternativ oder zusätzlich kann die optische Analyse mittels Einzeldetektion der Mikroorganismen erfolgen. Somit kann eine absolute Quantifizierung der nachzuweisenden Organismen auf Basis einer Partikelmessung ermöglicht werden.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die Nukleinsäuresonde komplementär zu einer RNA eines nachzuweisenden Mikroorganismus ist. Vorzugsweise kann die Nukleinsäuresonde aus linearen Oligonukleotidsonden ausgewählt werden. Beispielsweise sind das monoProbes, dopeProbes, tetraProbes und multiProbes. Die Nukleinsäuresonde kann auch aus Nukleinsäuresonden mit Sekundärstruktur ausgewählt werden. Beispielsweise sind das Molecular Beacons und Scorpions Sonden. Dadurch sind eine höhere Fluoreszenzintensität sowie ein besseres Signal-RauschVerhältnis erreichbar, was insbesondere für eine automatisierte Anwendung vorteilhaft ist.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass die Nukleinsäuresonde mit einem detektierbaren Marker verbunden ist. Der detektierbare Marker kann beispielsweise ein Fluoreszenzmarker, ein Chemolumineszenzmarker, ein Affinitätsmarker oder eine enzymatisch aktive Gruppe sein. Somit ist eine optische Detektion erreichbar. Der Affinitätsmarker kann beispielsweise Affinitätsbindungspaare Biotin-Streptavidin oder Antigen-Antikörper umfassen. Der enzymatische Marker kann beispielsweise Peroxidase, vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase, oder Phosphatase, vorzugsweise alkalischer Phosphatase, sein.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform gemäß der Erfindung sieht vor, dass das Verfahren mit einem fluidischen Kanalsystem ausgeführt wird. Beispielsweise kann ein fluidisches Kanalsystem einen scheibenförmigen Probenträger umfassen. Von Vorteil ist dabei, dass ein spezifischer Nachweis von Mikroorganismen in unterschiedlichen Applikationsfeldern ermöglicht werden kann. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren zur mikrobiologischen Lebensmittelanalyse, Hygienekontrolle, klinischen und biotechnologischen Anwendungen sowie Umweltanalyse zum Einsatz kommen.
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Eine bevorzugte Anwendung sieht ein fluidisches Kanalsystem vor, mit Mitteln zum Durchführen des Verfahrens, insbesondere wie zuvor beschrieben und/oder nach einem der auf ein Verfahren gerichteten Ansprüche. Beispielsweise können in dem fluidischen Kanalsystem zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Detektionsbereich und ein Vorbereitungsbereich ausgebildet sein. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass die Querschnitte der Kanäle des fluidischen Kanalsystems auf Abmessungen der Mikroorganismen angepasst sein können.
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Das fluidische Kanalsystem kann beispielsweise in Form eines Probenträgers ausgebildet sein. Der Probenträger kann insbesondere mindestens eine Kavität mit mindestens einer Nukleinsäuresonde und mindestens einer Substanz umfassen, die eine unterschiedliche Veränderung der Nukleinsäure-Konzentration, insbesondere RNA-Konzentration und/oder DNA-Konzentration, in toten Zellen und in lebenden Zellen begünstigt. Alternativ oder zusätzlich kann der Probenträger mit Mitteln zur optischen Zählung von markierten Mikroorganismen vorgesehen sein.
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Der Probenträger kann als ein scheibenförmiger Probenträger ausgebildet sein. Beispielsweise kann der Probenträger als ein flacher Probenträger ausgebildet sein. Von Vorteil ist dabei, dass durch die Scheibenform des Probenträgers die Zentrifugalkraft für die Fluidförderung ausgenutzt werden kann. Die Fluidförderung ist auch über Druck oder auf eine andere Weise erreichbar. Alternativ kann der Probenträger eine dreidimensionale Erstreckung, beispielsweise in Form eines Zylinders oder küvettenartig, aufweisen.
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Beispielsweise kann die Scheibenförmigkeit rotationssymmetrisch ausgebildet sein. Dies kann für ein Zentrifugieren von Vorteil sein. Es sind auch alternativ rechteckförmige Probenträger wie bei einer Chipkarte oder segmentförmige Probenträger wie bei einem Pizzastück bildbar.
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Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben, ist aber nicht auf diese Ausführungsbeispiele beschränkt. Weitere Ausführungsbeispiele ergeben sich durch Kombination der Merkmale einzelner oder mehrerer Schutzansprüche untereinander und/oder mit einzelnen oder mehreren Merkmalen der Ausführungsbeispiele.
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Es zeigt:
- 1 ein herkömmliches, Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH)-basiertes Verfahren in einer schematischen Darstellung,
- 2 ein erfindungsgemäßes FISH-Verfahren in einer schematischen Darstellung,
- 3 das Verfahren gemäß 2 in einer detaillierten Darstellung.
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In den 1 bis 3 ist ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in verschiedenen Ausführungen gezeigt.
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1 zeigt ein herkömmliches FISH-Verfahren zum spezifischen Nachweis von Nukleinsäuren in einzelnen Mikroorganismen 1, umfassend die folgenden Schritte: Fixierung und Permeabilisierung 2 der in einer Probe enthaltenen Mikroorganismen 1; Waschen 3, um die zur Permeabilisierung verwendeten Reagenzien zu entfernen; Inkubation der fixierten und permeabilisierten Mikroorganismen 1 mit Nukleinsäuresonden, um eine Hybridisierung 4 herbeizuführen; Entfernen bzw. Abwaschen 5 der nicht hybridisierten Nukleinsäuresonden; und anschließende Analyse 6 der mit den Nukleinsäuresonden hybridisierten Mikroorganismen 1.
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2 zeigt ein erfindungsgemäßes Verfahren 7 zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen 1, welches die Schritte der Permeabilisierung, Fixierung und Hybridisierung in einen einzigen Verfahrensschritt 8 zusammenfasst. Es werden keine zusätzlichen Waschschritte oder Pufferaustausche benötigt. Vor der Hybridisierung wird die Mikroorganismen-haltige Probe 9 beispielsweise mit Enzymen 10 inkubiert 11.
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3 zeigt ein erfindungsgemäßes Verfahren 7 zum Nachweis von lebenden Mikroorganismen 1 und/oder zur Differenzierung von lebenden 12 und toten 13 Mikroorganismen in einer Probe 9 mittels in-situ-Hybridisierung 14, insbesondere einer Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, und einer optischen Analyse 26 der nachzuweisenden Mikroorganismen 1, wobei der Probe 9 vor der Hybridisierung 14 wenigstens eine Substanz 15 beigegeben wird, die eine unterschiedliche Veränderung der Nukleinsäure-Konzentration, insbesondere RNA-Konzentration und/oder DNA-Konzentration, in toten Zellen 13 und in lebenden Zellen 12 begünstigt.
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Durch die Inkubation 11 der Mikroorganismen 1 vor der Hybridisierung 14 mit Enzymen 10, die eine unterschiedliche Veränderung der RNA-Konzentration in toten Zellen und in lebenden Zellen begünstigt, können tote Partikel stark reduziert werden. Beispielsweise kann die rRNA des toten Mikroorganismus 13, der viel permeabler als ein lebender Mikroorganismus ist, durch die Einwirkung von RNAsen 15 enzymatisch abgebaut 16 werden, wobei gleicher Effekt bei den lebenden 12 Mikroorganismen ausbleibt 17. Der tote Mikroorganismus 13, bei dem der Schutz durch die äußere Membran als Diffusionsbarriere für große Moleküle, wie beispielsweise Enzyme, nicht mehr vorhanden ist, kann durch die Inkubation 11 mit Lysozymen 18 als Partikel komplett aufgelöst werden 19. Die Ribosomen 20 bestehend aus RNAs und Proteinen können aus dem komplett oder teilweise aufgelösten Mikroorganismus diffundieren und können anschließend optisch nicht mehr nachgewiesen werden. Somit kann eine Differenzierung zwischen lebenden 12 und toten 13 Mikroorganismen und der Nachweis von ausschließlich lebenden Mikroorganismen ermöglicht werden.
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Bei einer bevorzugten Anwendung wurde zum spezifischen Nachweis von lebenden Mikroorganismen eine Mikroorganismen-haltige Probe mit einem Hybridisierungspuffer (zum Beispiel aus einzelnen oder alle Bestandteilen aus der Liste: 900 mM NaCI, 20 mM Tris/HCl, 0,01 % SDS, 6 M Harnstoff, 1 mM EDTA, 0,25 µM Hybridisierungssonde und pH 8,0) versetzt und für einen Zeitraum von 15 bis 90 Minuten bei einer Temperatur von 52°C inkubiert. Nach Ende dieser Inkubationszeit wurden die fertig hybridisierten Proben durchflusszytometrisch oder Fluoreszenz-mikroskopisch analysiert.
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Vor der Hybridisierung wird die Probe mit Lysozym und DNAse oder RNAse und/oder einer Protease in einer Konzentration von jeweils unter 5 mg/L in einem mit Mikroorganismen kombinierbaren Puffer (beispielsweise PBS-Puffer, Peptonwasser oder Tris-HCl-Puffer) inkubiert, um Leben/Tot-Differenzierung zu verbessern.
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Erfindungsgemäß wird somit vorgeschlagen, ein Verfahren 7 zum Nachweis von lebenden Mikroorganismen 1 und/oder zur Differenzierung von lebenden 12 und toten 13 Mikroorganismen in einer Probe 9 mittels in-situ-Hybridisierung 14, insbesondere einer Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, und einer optischen Analyse 26 der nachzuweisenden Mikroorganismen 1 bereitzustellen, wobei der Probe 9 vor der Hybridisierung 14 wenigstens eine Substanz 10 beigegeben wird, die eine unterschiedliche Veränderung der RNA-Konzentration in toten Zellen und in lebenden Zellen begünstigt.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- nachzuweisende Mikroorganismen
- 2
- Fixierung und Permeabilisierung gemäß herkömmlichem FISH-Verfahren
- 3
- Waschen gemäß herkömmlichem FISH-Verfahren
- 4
- Hybridisierung gemäß herkömmlichem FISH-Verfahren
- 5
- Waschen gemäß herkömmlichem FISH-Verfahren
- 6
- Analyse
- 7
- erfindungsgemäßes Verfahren
- 8
- Permeabilisierung, Fixierung und Hybridisierung, bevorzugt umfasst in einem Verfahrensschritt
- 9
- Probe mit Mikroorganismen
- 10
- Enzyme
- 11
- Inkubation der Probe mit Enzymen
- 12
- lebende Mikroorganismen
- 13
- tote Mikroorganismen
- 14
- Hybridisierung
- 15
- RNAse
- 16
- RNA-Abbau bei toten Mikroorganismen
- 17
- kein Effekt von RNAsen in lebenden Mikroorganismen
- 18
- Lysozym
- 19
- Auflösung des toten Mikroorganismus als Partikel durch Inkubation mit Lysozymen
- 20
- Ribosom bestehend aus RNAs und Proteinen
- 21
- Detergens
- 22
- Einschleusen spezifischer Nukleinsäuresonden
- 23
- Nukleinsäuresonde
- 24
- Fixierung der Mikroorganismen
- 25
- Marker
- 26
- optische Analyse
- 27
- weitere Mikroorganismen, die nicht nachzuweisen sind
- 28
- Ribosom mit abgebauten RNAs
