CN102146480A - 军团菌的活菌检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了军团菌活菌的检测方法，该方法利用EMA降解待检样品中死菌胞内DNA，再提取待检样品DNA，通过荧光定量PCR检测样品中军团菌的活菌数。本发明方法可以只检测出军团菌活菌并进行计数。本发明还提供了用于该方法的检测试剂盒。将此技术运用到环境水样军团菌的检测中，并与传统的细菌培养计数方法、普通PCR法、普通荧光定量PCR法进行比较，结果证明本发明灵敏快速、污染率低、成本低，能准确地对军团菌活菌进行定性和定量检测，可用于对环境水源军团菌污染的监测。

Description

军团菌的活菌检测方法及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及军团菌活菌的检测方法，本发明还涉及用于该方法的检测试剂盒。

背景技术

准确地对环境中细菌进行定性定量检测，对于有效监测病原细菌的繁殖和传播，预防疾病的发生，保障食品安全和维护公共卫生利益具有重要意义。由军团菌(Legionella)引起的军团菌病是非典型肺炎的重要组成部分，该菌是水环境中一种常见的微生物，它广泛存在于各种自然水体中，人工环境中的中央空调冷却塔水和冷凝水、冷热水管道、温泉水、游泳池以及养鱼池水都是军团菌滋生繁殖的场所。军团菌的菌体微小，人在正常呼吸时，会将空气中含有军团菌的气溶胶吸入呼吸道内，致使军团菌有机会侵染肺泡巨噬细胞，导致军团菌病的发生。由于军团菌营养要求较高以及标本中杂菌较多等因素，分离培养较为困难，因此提高空调冷却水中军团菌的检出率，对于预防军团病的发生非常重要。

目前，国内外军团菌活菌定量的检测方法主要有平板分离培养法，实时荧光定量PCR方法。前者操作繁琐，耗时较长，花费高，对培养基的要求高，条件不同的实验室之间检测的灵敏度存在较大的差异性，不易评价和质量控制。荧光定量PCR技术与细菌分离培养法相比具有特异性强、灵敏度高和操作简单、快速等优点，有利于细菌的早期检测。但其检测针对样品中核酸的存在与否以及拷贝数，并不能真正的反映样品中死菌和活菌的数量，导致假阳性率高，对于环境标本的检测其重复性和稳定性并不理想。传统金标准的军团菌检测法是当今国际上主流的军团菌检测方法。该方法被公认主要存在以下几方面不足：。(1)传统方法的检测结果误差大。条件不同的实验室之间检测的灵敏度存在较大的差异性，不易评价和质量控制。由于各个现场提供的监测数据无法直接进行比较，因此导致对各现场军团菌发生状况无法精确调查和统计，对大范围的疾病检测控制工作造成困难。(2)传统方法检测步骤繁琐，检测周期较长，花费较高，无法第一时间对军团菌的发生状况进行掌控。(刘文华，谢风，何成彦.军团菌的实验诊断方法及其研究进展[J].中国实验诊断学，2006，10(4)：427-429)。普通PCR技术与其它检测方法相比具有特异性强、灵敏度高和操作简单、快速等优点，更有利于军团菌的早期诊断。但其假阳性出现率较高，重复性和稳定性有待进一步的研究。荧光PCR已经展现出独特的优点被应用于环境中军团菌的分离和数量的检测。尽管荧光PCR的检测灵敏度比较高，但其检测结果针对样品中核酸的存在与否以及拷贝数，并不能真正的反应样品中死菌和活菌的数量。在水质检测方面，死菌DNA长期存在使基因水平的检测方法高估了样品中活菌的水平。如何快速准确的鉴定出环境水中军团菌活菌的数量，并把其和死亡菌做出正确的对比是长期以来困扰我们的一大难题。

溴乙锭类化合物是一种荧光核酸插入染料，同时也是一种抗寄生虫活性药物。单叠氮溴乙啶(ethidium monoazidem EMA)是为了光学标记DNA而合成的一种叠氮乙锭衍生物。近年来，利用其对活菌和死亡菌细胞壁的穿透作用的不同，能迅速区别活菌和死菌的技术在国外已有报道(Rueckert，A.，Rominus，R.S.，and Morgan，H.W.2005.Rapid differentiation and enum eration of the total，viable vegetative celland spore content of thermophilic bacilli in milk powders with referenceto Anoxybacillus flavithermus.J.Appl.Microbiol.99：1246-1255.)。EMA单纯只能进入那些损害细胞内的细胞壁和细胞膜，随后共价结合在细菌的DNA上。随后，通过可视光的光解作用，EMA所产生的氮烯共价链接到染色体DNA上，通过光活化反应将DNA裂解成小碎段。与此相比，未结合EMA的完整细胞仍然能在水溶液中保持一种自由的状态。也就是说，活菌细胞因具有完整的细胞壁和细胞膜，使其得到保护不受EMA共价反应的影响。EMA能选择性进入死菌的细胞质，通过光活化反应裂解染色体DNA，从而使其在荧光定量PCR反应中不能发生扩增。因此，EMA结合荧光定量PCR的方法将能区别活菌DNA和死菌DNA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种军团菌的活菌检测方法，用以克服现有技术中无法准确快速鉴定出环境中军团菌活菌数量的问题；

本发明还在于提供一种用于军团菌活菌检测的试剂盒。

本发明提供了一种军团菌的活菌检测方法，该方法首先利用EMA降解待检样品中死菌胞内DNA，再提取待检样品DNA，通过荧光定量PCR检测样品中军团菌的活菌数。

具体地，本发明方法包括如下步骤：

1)水样品离心浓缩处理；

2)向待检样品中加入EMA至终浓度为1～5μg/ml，暗处孵育8～12min，可视光光照处理1～5min；

3)提取步骤2)处理后的样品DNA；

4)以步骤3)提取的样品DNA为模板进行荧光定量PCR检测目标菌的活菌数；

当待检样品不是水溶液时，先将待检样品制成菌液。

其中，步骤1)对样品离心浓缩处理的目的是为了获得较高浓度的菌体，以便后续进一步操作。对于某些样本由于浓度菌体含量较低，通过浓缩后可以增加其检出率。水样品的浓缩处理可以通过离心实现，例如在5000～7000g下离心10～15分钟。

其中，步骤2)宜在4℃下进行相关操作，优选向待检样品中加入EMA至终浓度为5μg/ml，4℃下暗处孵育10min；4℃下可视光离样本15厘米处，光照处理5min。然后离心收集菌体，用于后续的DNA提取。光照处理可以使用卤素灯，例如在本发明实施例中优选使用500W的卤素灯作为光源。

其中，步骤3)提取军团菌DNA的方法可以是本领域所知的任何方法，包括但不限于CTAB法、酚/氯仿法、chelex100等等。

其中，步骤4)荧光定量PCR所用的引物可以是5s rRNA引物，优选引物序列为，

上游：5’-ACTATAGCGATTTGGAACCA-3’，

下游：5’-GCGATGACCTACTTTCGCAT-3’；

所用探针为：HEX-CCGCGCCAATGATAGTGTGAGGC-BHQ。

此外，本发明还提供检测军团菌活菌的实时荧光定量PCR扩增反应体系，其中20μl反应液的具体配置为：

优选20μl反应体系为：

实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃变性5s，60℃退火20s，50个循环。

本发明可应用于水环境中军团菌活菌的快速检测和定量。

进一步，本发明还提供用于上述检测方法的检测试剂盒，其包括EMA、军团菌(Legionella)特异性PCR引物及荧光探针。此外，还可进一步包括荧光定量PCR中涉及的各种试剂。

本发明以军团菌(Legionella)为目标菌，建立了可检测军团菌活菌的方法，只要通过1对特定的引物和1个探针进行实时荧光定量PCR扩增，即可检测样品中是否有活菌存在，展现出快速、灵敏，污染率低，容易定量和成本低的特点。(1)本发明可排除死菌的干扰，仅对有致病性的军团菌活体进行检测，可避免假阳性的产生，具有较高的检测精度。(2)本发明检测灵敏度高、误差小、检测结果稳定可靠，可对不同现场数据进行直接比较和统计，能较大的降低疫情统计及掌控的难度。此外，通过对高精度数据的比较、分析以及备份，可以对军团菌引起的疾病进行系统性的预防与控制。(3)本发明确定了EMA对军团菌活菌无杀菌作用的最佳浓度，孵育时间和光照时间。并对EMA的使用浓度，暗孵育时间和光照时间等实验条件做了详细的优化，还优化了整个荧光定量PCR的体系，包括对引物和探针浓度的优化。(4)本发明操作简单、检测周期短，可以减少操作人员的工作量，及时获取精确的检测信息。

此方法的建立和运用，将简化军团菌检测的程序、缩短检测周期，可作为敏感的初筛手段，提高军团菌菌培养检测的阳性率。可为我国今后制定环境水样中军团菌卫生学指标提供有力的技术支撑。

附图说明

图1.不同浓度EMA对军团菌活菌数量的影响。A图使用菌株为嗜肺军团菌(L.pneumophila，ATCC33152)，B图为环境分离军团菌株SH116。1×10⁷cfu/ml菌液中加入终浓度为0，1，5，10，20μg/ml的EMA，4℃暗处孵育10min，500瓦卤素灯(约7万LUX)离样本15厘米处光照5min。菌液梯度稀释接种于BCYE培养基。(△)表示样品经500瓦(约为7万LUX)卤素灯可视光光照5min，(□).表示样品未经过可视光光照处理；

图2.孵育时间对军团菌活菌数量的影响。A图使用菌株为L.pneumophila菌株ATCC33152，B图为环境分离菌株SH116。1×10⁷cfu/ml菌液中加入终浓度为0(◇)，1(□)，5(△)，or10(○)μg/ml的EMA，4℃暗处孵育，孵育时间分别为0，5，10，20，40min时取出样品，用500瓦(约为7万LUX)卤素灯离样本15厘米处光照5min。菌液梯度稀释接种于BCYE培养基；

图3.可视光光照时间对军团菌活菌数量的影响。A图使用菌株为L.pneumophila菌株ATCC33152，B图为环境分离菌株SH116。1×10⁷cfu/ml菌液中加入终浓度为0(△)和5(□)μg/ml的EMA，4℃暗处孵育至10min，500瓦(约为7万LUX)卤素灯离样本15厘米光照0，1，2，5，10，20min时分别取出样品。菌液梯度稀释接种于BCYE培养基；

图4.不同浓度的EMA对军团菌染色体DNA的切断作用。军团菌菌液加入终浓度为0，1，5，10，20μg/ml EMA，4℃暗处孵育至10min，500瓦(约为7万LUX)卤素灯离样本15厘米光照5min。各浓度处理后的菌液提取染色体DNA，通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。当EMA浓度为10和20μg/ml时，染色体DNA的条带变弱，第2泳道：EMA终浓度为0μg/ml，光照时间为0min，第3-7泳道：EMA终浓度分别为0，1，5，10和20μg/ml，光照时间均为5min，第1和第8泳道：λ/HindIII DNA marker；

图5.EMA分别作用军团菌活菌和死亡菌后染色体DNA的琼脂糖凝胶电泳分布图。提取EMA处理前和处理后的L.pneunmophilaATCC33152菌株(2.1×10⁸cfu/ml)染色体DNA。每个泳道加入的DNA量为5μg，第2泳道：活菌未经EMA处理，第3泳道：活菌经过EMA处理(EMA浓度为5μg/ml；4℃暗处孵育10min；500瓦(约为7万LUX)卤素灯离样本15厘米光照5min)，第4泳道：热处理后的死菌未经EMA处理，第5泳道：热处理后的死菌经过EMA处理(EMA浓度为5μg/ml；4℃暗处孵育10min；光照5min)，第1和第6泳道：λ/HindIII DNA marker；

图6.使用军团菌活菌和热处理后的死菌经过EMA处理或不处理，对军团菌16s rRNA的普通定性PCR扩增结果。50μl的PCR反映体系中加入67ng的DNA模板。第2泳道：活菌未经EMA处理的PCR扩增结果，第3泳道：活菌经过EMA处理的PCR扩增结果(EMA浓度为5μg/ml；4℃暗处孵育10min；500瓦(约为7万LUX)卤素灯离样本15厘米光照5min)，第4泳道：热处理后的死菌未经EMA处理，第5泳道：热处理后的死菌经过EMA处理(EMA浓度为5μg/ml；4℃暗处孵育10min；500瓦(约为7万LUX)卤素灯离样本15厘米光照5min)，第1和第6泳道：100bp DNA marker；

图7.实时荧光定量PCR技术对军团菌的特异性检测结果。图中纵坐标为荧光值，横坐标为循环数(Ct值)。1：军团菌；2：非军团菌；

图8.普通PCR检测军团菌敏感性结果。第1和11泳道为100bpladder marker；第2至10泳道为从10⁸～10⁰cfu/ml菌量中提取染色体DNA进行普通PCR的检测结果；

图9.实时荧光定量PCR技术对军团菌的敏感性试验结果；

图10.实时荧光定量PCR的敏感性验证标准曲线。

具体实施方式

采集环境水样标本，采用离心法对水样进行浓缩，加入EMA处理、光照，于4℃1300r/min离心15min，按常规步骤提取DNA，用EMA-荧光定量PCR方法进行军团菌活菌的检测。整个检测过程需要4～5个小时。实时荧光定量PCR阳性结果判定：以Ct值＜37并且扩增曲线呈S型为阳性判定原则。其中以Ct值＜35且扩增曲线良好可直接判定为阳性。Ct值35-37之间需要重复实验，2次实验能得到良好S型扩增曲线方可判定为阳性。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

运用模拟水样采用平板菌落计数和染色体DNA琼脂糖凝胶电泳的方法对EMA的浓度，孵育时间和可视光光照时间进行了优化。设计了四个EMA的参考浓度分别为0，1，5，10，20μg/ml，发现在500瓦(约为7万LUX)卤素灯离样本15厘米光照5min的条件下，当EMA的浓度大于5μg/ml时，EMA对军团菌活菌具有杀菌作用，染色体DNA也被降解(见图1，4)。当EMA浓度不超过5μg/ml时，孵育时间不会影响军团菌活菌数量。当EMA浓度为10μg/ml时，孵育时间大于5min，EMA即会杀灭军团菌活菌(见图2)。对于光照时间的优化，我们发现当EMA的浓度为5μg/ml，孵育时间为10min时，光照时间大于5min也会使EMA杀灭军团菌的部分活菌(见图3)。综上所述，得出EMA处理样品的优化结果：EMA的浓度为5μg/ml；4度暗处孵育时间为10min；4度环境下500瓦(约为7万LUX)卤素灯可视光离样本15厘米处光照5min。根据这个条件，本发明将军团菌活菌和用热处理人为造成的死菌经过上述条件EMA的处理，死菌染色体DNA完全被降解，在琼脂糖凝胶电泳中看不到条带。而活菌DNA则不受影响(见图5)。同时，在对军团菌16s rRNA的PCR扩增中，经过EMA处理的死菌DNA由于受到EMA的切断作用，在PCR的反应中没有得到扩增(见图6)。

实施例2

方法特性验证

1、特异性检验：取17株军团菌及9株其他菌株(3株大肠杆菌，2株肺炎克雷伯菌，3株沙门氏杆菌，1株金黄色葡萄球菌)菌种编号见表1。根据上述方法，EMA处理后，提取细菌DNA，用建立的EMA-实时荧光定量PCR反应系统进行检测，验证方法的特异性。

表1特异性检验选用菌种编号

结果表明，本方法对军团菌表现良好的特异性，17株军团菌株的Ct值在12-16之间，对其他非军团菌株及所设置的阴性对照Ct值均在37以上或扩增曲线成一平滑直线，表现为阴性结果(见图7)。

2、敏感性检验：将已经过EMA处理的嗜肺军团菌(ATCC33153)菌液不同稀释度进行方法敏感性评价。将菌量10倍系列稀释，取最终浓度为10⁸～10¹cfu/ml的8个样品，用普通PCR方法和本发明方法进行敏感性检测，并绘制标准曲线。

普通PCR的引物序列为上游：5’-AAGATTAGCCTGCGTCCGAT-3；下游：5’-GTCAACTTATCGCGTTTGCT-3’。预期扩增片断长度为654bp，反应体系为20μl，0.2mM dNTP、0.2μM引物、1U Taq酶(Takara)、1×PCR缓冲液。扩增条件为预变性95℃1min，1个循环；95℃1min，52℃1min，72℃1min进行35个循环。终末延伸温度为72℃5min。PCR产物电泳在1.5％的琼脂糖凝胶，0.5×TBE缓冲液中电泳PCR产物。

结果表明，不同稀释度提取模板经普通PCR检测，其灵敏度为10³cfu/ml(见图8)，而实时荧光定量PCR检测灵敏度则为10cfu/ml(见图9)。可见实时荧光定量PCR检测灵敏度比常规PCR高100倍左右，且Ct值与模板浓度具有很好的对应关系(R²＝0.9998，见图10)。说明本发明建立的方法具有很好的敏感性。

3、重复性检验：取1株标准嗜肺军团菌，2株嗜肺军团菌分离株和1株大肠杆菌做6次重复性试验，通过计算Ct值间的变异系数验证方法的稳定性。变异(CV)＝标准偏差(S)/平均数(X)×100％。

反应结果如表所示。由表2可见，4种细菌均能够正确判定，Ct值的变异系数均＜5％，表明军团菌EMA-实时荧光定量PCR检测方法具有良好的稳定性。

表2实时荧光定量PCR检测的重复性检测结果

注：Ct 1-6为6次实验的Ct值。Ct(x)为6次实验的平均值。S为标准偏差。

实施例3

环境水样检测

1.样本选择

济南市公共卫生场所集中空调冷却塔水：包括宾馆、饭店、大型写字楼、超市、地铁等使用一年以上的集中空调冷却塔，每冷却塔按照不同位置，分左中右三个点采水样标本。采样选点要求离壁5cm，水面下10cm，无菌容器瓶采水样200mL。水样标本总量216份。上海市出入境口岸中央空调冷却塔水和卫生间管道水，水样标本总量132份。样品最好2天内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下贮存不得超过15天。

2.样本处理和DNA的提取

提取的水样经氯或臭氧等消毒，采样容器灭菌前加入硫代硫酸钠溶液以中和样品中的氧化物。将200mL±5mL样品倒入容积为500mL的无菌离心瓶中。6000g离心10min，控制离心温度在15℃～25℃之间。无菌操作去除上层液体，用20mL溶液或无菌蒸馏水将沉淀重悬。记录所用稀释液的体积，这样的浓缩物即为处理好的标本。浓缩以后的水样经8000r/min离心15min，弃上清，用1ml重蒸水洗细菌沉淀；

向浓缩后的样品中加入EMA至终浓度为5μg/ml，4度环境下(放置于冰盒)暗处理10min，500瓦(约为7万LUX)卤素灯离样本15厘米处，照射5min，于4℃1300r/min离心15min；

采用QiAmp DNA Mini kit(Qiagen，Hilden，Germany)试剂盒，按照操作说明提取处理后的样品DNA。

3.EMA-荧光定量PCR方法进行军团菌活菌的检测

总反应体系为20ul，包括premix EX Taq 10μl，上游引物5’-ACTATAGCGATTTGGAACCA-3’2μl，下游引物5’-GCGATGACCTACTTTCGCAT-3’，2μl，探针HEX-CCGCGCCAATGATAGTGTGAGGC-BHQ 2μl，模板DNA 2μl，ROX Reference Dye II 0.4μl，用ddH₂O补足至20μl。反应条件为95℃2min，1个循环；95℃5s，60℃20s，50个循环。实时荧光定量PCR阳性结果判定：以Ct值＜37并且扩增曲线呈S型为阳性判定原则。其中以Ct值＜35且扩增曲线良好可直接判定为阳性。Ct值35～37之间需要重复实验，2次实验能得到良好S型扩增曲线方可判定为阳性。

在定量分析上，将L.pneumophila ATCC33152菌株做为内参，菌量由10⁸cfu/ml稀释到10¹cfu/ml，不同稀释度的菌液运用上述方法提取DNA模板，用我们优化好的军团菌荧光定量PCR反映体系进行标准曲线的测定。Ct值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。各模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品(本方法中的L.pneumophila ATCC33152菌株10⁸cfu/ml～10¹cfu/ml菌液)可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

4.用EMA-荧光定量PCR方法与军团菌检测常用的GVPC平板培养和计数法、普通PCR和普通荧光定量PCR共四种方法同时进行检测，评价EMA-荧光定量PCR方法用于实际样本的检测能力。

运用上述方法在离心浓缩以后的1ml水样中取100ul涂布于军团菌选择性GVPC培养基上，置36℃±1℃，CO₂培养箱培养10天。从每个GVPC平板上至少选择3个可疑军团菌菌落分别接种到BCYE和BCYE-CYS平板上进行二次培养，36℃±1℃培养至少2天。在BCYE上生长而在BCYE-CYS上不生长的为疑似军团菌。并对平板上的菌落数进行计数。

同时，分别取两份1ml浓缩的水样。按建立的EMA处理方法进行处理后，用QiAmp DNA Mini kit(Qiagen，Hilden，Germany)试剂盒，按照操作说明提取制备DNA模板，进行定性普通PCR，普通荧光定量PCR和EMA-荧光定量PCR的检测。军团菌定性普通PCR扩增体系、反应条件如实施例2中所述，荧光定量PCR的反应条件，体系和计算方法如前所述。

结果与分析

1、四种方法定性检测结果见表3。上海132份水样检测结果说明，普通细菌培养计数法检测结果为阳性的样品，EMA-荧光定量PCR法全部检测为阳性。EMA-荧光定量PCR法较细菌培养计数法检测精度提高5.3％。济南216份水样检测结果说明，普通细菌培养计数法检测结果为阳性的样品，EMA-荧光定量PCR法全部检测为阳性。EMA-荧光定量PCR法较细菌培养计数法检测精度提高4.63％。对比传统的细菌培养计数法，EMA-荧光定量PCR法能够快速准确地对水体中军团菌活菌数量进行计数和分析。由表3可以看出，建立的EMA-荧光定量PCR方法在对样本的阳性检出率(定性)上与普通荧光定量PCR的结果是一样的，二者比普通PCR和传统的平板培养方法的阳性检出率都要高。

表3两个现场水环境中四种方法对军团菌检测阳性率的比较

2、四种方法定量检测结果见表4，EMA-荧光定量PCR法较传统细菌培养法检测精度高，且计数结果与培养法相匹配，还因为样本经EMA处理后，可以去处死菌DNA的影响，在检出的菌量上少于普通荧光定量PCR，与传统的平板培养方法相符合。能快速准确的鉴定出环境水中军团菌活菌的数量，并把其和死亡菌做出正确的对比。简化了军团菌检测的程序、且大幅缩短了检测周期，可作为敏感的初筛手段，提高军团菌培养阳性率。可为我国今后制定环境水样中军团菌卫生学指标提供有力的技术支撑，也为军团菌和其他细菌的检测提供一种新的思路。

表4四种方法的定量检测结果比较

Claims (9)

1.一种军团菌(Legionella)的活菌检测方法，该方法首先利用EMA降解待检样品中死菌胞内DNA，再提取待检样品DNA，通过荧光定量PCR检测样品中军团菌的活菌数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)水样品离心浓缩处理；

2)向待检样品中加入EMA至终浓度为1～5μg/ml，暗处孵育8～12min，然后光照处理1～5min；

3)提取步骤2)处理后的样品DNA；

4)以步骤3)提取的样品DNA为模板进行荧光定量PCR检测目标菌的活菌数；

当待检样品不是水溶液时，还包括在步骤1)前将待检样品制成菌液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中步骤2)向待检样品中加入EMA至终浓度为5μg/ml，4℃下暗处孵育10min；4℃下500瓦卤素灯离样本15厘米处，光照处理5min。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR所用引物序列为，

上游：5’-ACTATAGCGATTTGGAACCA-3’，

下游：5’-GCGATGACCTACTTTCGCAT-3’；

所用探针为：HEX-CCGCGCCAATGATAGTGTGAGGC-BHQ。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增反应体系，其中20μl反应液的具体配置为：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述20μl反应液的具体配置为：

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃变性5s，60℃退火20s，50个循环。

8.用于军团菌(Legionella)活菌检测的试剂盒，其包括：EMA、军团菌荧光定量检测引物和探针。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述引物为：

上游：5’-ACTATAGCGATTTGGAACCA-3’，

下游：5’-GCGATGACCTACTTTCGCAT-3’；

所述探针为：HEX-CCGCGCCAATGATAGTGTGAGGC-BHQ。

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