CN104561354B - 一种基于fish技术的活细菌定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物检测领域，涉及一种基于FISH技术的活细菌定量检测方法。该方法在常规荧光原位杂交方法的实施过程前，增加PMA核酸染料的预处理步骤；在PMA处理过程中，死菌细胞内的核酸与PMA共价结合，在荧光显微镜的蓝光激发下发出橙色荧光，从而可知橙色荧光的细菌为原体系中的死菌，活菌细胞内的rRNA在杂交步骤与荧光探针结合，荧光探针在荧光显微镜的蓝光激发下发出绿色荧光，从而可知绿色荧光的细菌为原体系中的活菌。本发明通过对荧光原位杂交技术的改进，即增加PMA染料处理的步骤，实现了样品体系中死活菌的有效区分，构建出一套可快速定量样品中活性细菌的方法。本方法对细菌定量具有较强的普适性。

Description

一种基于FISH技术的活细菌定量检测方法

技术领域

本发明属于微生物检测领域，涉及一种基于FISH技术的活细菌定量检测方法。

背景技术

培养法是目前应用最广泛的活性微生物特异性检测手段，但培养法存在明显的缺点：一方面，该法耗时长、工作量大，检测结果具有较大的滞后性；另一方面，对于粪便样品中不可培养的或处于活的非可培养状态(Viable but Non-culturable, VBNC)的细菌，无法应用培养法来进行检测。

荧光原位杂交（FISH）技术是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位，由于FISH技术通过设计探针来对细菌检测，故对VBNC状态的菌同样也可以进行检测。近年来，FISH技术广泛应用于水体、土壤、粪便等样品中的细菌检测。结合计算机图像分析，可对细菌进行准确的定量检测。随着特异性探针种类的不断丰富，可检测的细菌种类也越来越多。且FISH技术可在3h内完成对细菌的定量检测，较传统培养法更加快速简便。

FISH技术能实现对细菌的特异性检测，然而在实际的微生物生态体系中，有活细菌也存在着死细菌；死细菌虽然已经死亡，但其rRNA会在一段时间内存在，因此采用FISH定量反映的是总菌的结果。对于微生物体系的解析尤其涉及生态功能的分析，活细菌的数目更加能反映该种菌在生态体系中发挥的实际影响和作用，因此如何排除死细菌的干扰准确定量活细菌变得十分重要，需对该技术进行升级使其能够特异性检测活细菌。

叠氮溴化丙锭（PMA）是一类叠氮类核酸染料，能够结合胞外游离的核酸，并能穿过膜受损细胞的细胞膜进入细胞内，进而结合其胞内的核酸。而活性微生物具有完整的细胞膜，叠氮类染料被阻隔在细胞之外。结合核酸的PMA在强光诱导下能够与核酸形成牢固的共价键。这部分核酸则不能够参与后续的核酸反应，这样便在后续反应中消除了非活性微生物对检测结果的影响。PMA已与qPCR技术结合形成PMA-qPCR技术，它是一种细菌活细胞定量检测的有效的分子手段，现在被广泛应用于致病菌或有害菌活菌的定量检测等领域中。

而PMA这一有效区分死活菌的染料还未与FISH技术结合，具有良好的开发前景。

发明内容

基于上述背景，本发明提供了一种基于荧光原位杂交技术的活细菌定量检测方法：PMA-FISH技术，构建一种可以快速定量活细菌的PMA-FISH技术。

本发明的技术方案是在常规荧光原位杂交方法的实施过程前，增加PMA核酸染料的预处理步骤，在PMA处理过程中，死菌细胞内的核酸与PMA共价结合，在荧光显微镜的蓝光激发下发出橙色荧光，从而可知橙色荧光的细菌为原体系中的死菌；而PMA无法穿透活菌完整的细胞膜，从而被隔绝在活菌细胞外，游离在体系中的PMA在PMA处理最后的清洗步骤中被洗去，故在PMA处理中和PMA处理之后，PMA都不会影响活菌，活菌细胞内的rRNA在杂交步骤与荧光探针结合，荧光探针在荧光显微镜的蓝光激发下发出绿色荧光，从而可知绿色荧光的细菌为原体系中的活菌。

本发明的技术方案包括以下步骤：

（1）用PMA对样品进行前处理，使PMA与死菌核酸结合。

（2）去除样品中游离的PMA，使之不对活菌造成影响。

（3）进行FISH操作，包括细菌固定、溶菌酶处理、探针杂交。

（4）将细菌过滤在聚碳酸酯滤膜上，并制片。

（5）荧光显微镜观察并计数。

具体按如下步骤进行：

（1）按照常规方法制备细菌悬液和进行PMA预处理；

（2）离心，去上清，用无菌生理盐水冲洗后，再用生理盐水重悬；

（3）将步骤2）得到的菌液离心，去上清，1×PBS缓冲液重悬；

（4）用4%多聚甲醛在4℃下固定1-2h，储存于-20℃ 50%乙醇中；

（5）取2-10μL菌液，加20-50μL 1mg/ml溶菌酶，37℃水浴加热15min；

（6）加入20μL 5×杂交液和5μL EUB338探针，用无菌水补足至100μL，轻轻重悬，45-50℃水浴加热1-2h；

（7）取杂交后的菌液用真空抽滤装置过滤到0.2μm聚碳酸酯滤膜上，滴加抗荧光猝灭剂，封片，常温保存于暗盒中；

（8）用荧光显微镜蓝光激发，拍摄所得到的荧光影像；

（9）镜检后菌体细胞计数：随机选取荧光显微镜内观察的视野10个，取其平均数，按照下列公式计算：

菌体细胞数目=视野平均细菌数×（过滤面积/视野面积）×稀释倍数。

本发明的显著优点：

本发明通过对荧光原位杂交技术的改进，即增加PMA染料处理的步骤，实现了样品体系中死活菌的有效区分，构建出一套可准确定量样品中活性细菌的方法。由于这种定量方法建立在荧光原位杂交技术上，荧光原位杂交在微生物定量领域已广泛应用，而PMA对细菌的活性选择也具有普适性，故本方法对细菌定量具有较强的普适性。另外，本方法在检测活性细菌的同时，也可同时对非活性菌进行定量，可快速分析环境体系对细菌活性的影响。

附图说明

图1为活菌比例为50%时的FISH荧光图；其中a为E. coli的活菌比例为50%时的FISH荧光图，b为P. pentosaceus的活菌比例为50%时的FISH荧光图，c为S. enterica的活菌比例为50%时的FISH荧光图，d为L. monocytogenes的活菌比例为50%时的FISH荧光图。

图2为活菌比例为50%时的PMA-FISH荧光图；其中a为E. coli的活菌比例为50%时的PMA-FISH荧光图，b为P. pentosaceus的活菌比例为50%时的PMA-FISH荧光图，c为S. enterica的活菌比例为50%时的PMA-FISH荧光图，d为L. monocytogenes的活菌比例为50%时的PMA-FISH荧光图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于此。

本实施例以三株革兰氏阴性菌——大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella enterica）和单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）以及一株革兰氏阳性菌——戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）为研究对象，利用PMA-FISH对活菌进行定量检测。

（1）四株菌株分别接种于营养肉汤中，分别在37℃-43℃恒温培养箱中培养12h-24h。

（2）细菌活菌菌悬液：取30 mL细菌悬液于50 mL灭菌离心管中，10 000 rpm 离心5 min，弃上清，沉淀用灭菌生理盐水悬浮并混匀，静置1min后10 000 rpm 离心5 min，弃上清收集菌体加入30 mL灭菌生理盐水悬浮。细菌死细胞悬浮液：采用热处理与超声波处理相结合的方法制备细菌死细胞，其处理方法为：取30 mL菌悬液于50 mL灭菌离心管中，放入80℃ 的水浴锅，水浴15min。水浴后，放入超声波清洗器进行15min的超声波处理，使细胞膜通透。然后 10 000 rpm 离心5 min，弃上清，沉淀用灭菌生理盐水悬浮并混匀，静置1min后10 000 rpm 离心5 min，弃上清收集菌体加入30 mL灭菌生理盐水悬浮。

（5）配比死活菌，设置三个活菌比例梯度：100%、50%和10%，每个梯度各100μL。

（6）在避光条件下向样品菌液中加入适量PMA，使PMA终浓度为50μM。避光混匀5min，每隔20s在振荡器上震荡2s。光照结束后用卤素灯强光照射8min，光源距离样品20cm，每隔两分钟振荡一次，光照时样品需要进行冰水浴；

（7）离心，去上清，无菌生理盐水冲洗两次，最后用生理盐水重悬。

（8）将得到的菌液离心，10μL 1×PBS缓冲液重悬，加30μL 4%多聚甲醛固定1h；

（9）细菌固定后储存于50%乙醇中，于-20℃保存；

（10）取5μL（9）中的菌液，加50μL 1mg/ml溶菌酶对菌体进行去壁，37℃水浴加热15min；

（11）加入20μL 5×杂交液和5μL EUB338荧光探针(5’端用Alexa Flour 488标记，由上海生工生物工程有限公司合成并标记)，并用无菌水补足至100μL，轻轻重悬后46℃水浴加热1h；

（12）取适量杂交后的菌液用真空抽滤装置过滤到0.2μm聚碳酸酯滤膜上，滴加抗荧光猝灭剂，用盖玻片封片，常温保存于暗盒中；

（13）用荧光显微镜蓝光激发，拍摄所得到的荧光影像。

（14）镜检后菌体细胞计数：随机选取荧光显微镜内观察的视野10个，取其平均数，并计算原始样品死活菌数。视野中绿色代表活菌，橙色代表死菌。

镜检后菌体细胞计数：随机选取荧光显微镜内观察的视野10个，取其平均数，按照下列公式计算：

菌体细胞数目=视野平均细菌数×（过滤面积/视野面积）×稀释倍数

其中：使用过滤半径为8.4mm的抽滤装置，其过滤面积S：

S=π×8400²≈2.22×10⁸ μm²；

观察的视野面积为118×89.2=1.05×10⁴ μm²。

表1 FISH和PMA-FISH记得预混菌液中活菌比例统计表

从表1的FISH计数结果及图1中可以看出，由于FISH没有区分死活菌的功能，故全部细菌不论死活都被认为是活菌，呈现荧光探针所发出的绿色荧光，而从表1的PMA-FISH计数结果和图2中可知，PMA-FISH具有良好的区分死活菌的能力，橙色为死菌，绿色为活菌，且计数结果的比例值接近于预设比例值，说明定量结果准确可靠。

Claims (1)

1.一种基于FISH技术的活细菌定量检测方法，其特征在于：在常规荧光原位杂交方法的实施过程前，增加PMA核酸染料的预处理步骤；在PMA处理过程中，死菌细胞内的核酸与PMA共价结合，在荧光显微镜的蓝光激发下发出橙色荧光，从而可知橙色荧光的细菌为原体系中的死菌，活菌细胞内的rRNA在杂交步骤与荧光探针结合，荧光探针在荧光显微镜的蓝光激发下发出绿色荧光，从而可知绿色荧光的细菌为原体系中的活菌；

按如下步骤进行：

（1）按照常规方法制备细菌悬液和进行PMA预处理；

（2）离心，去上清，用无菌生理盐水冲洗后，再用生理盐水重悬；

（3）将步骤2）得到的菌液离心，去上清，1×PBS缓冲液重悬；

（4）用4%多聚甲醛在4℃下固定1-2h，储存于-20℃ 50%乙醇中；

（5）取2-10μL菌液，加20-50μL 1mg/ml溶菌酶，37℃水浴加热15min；

（6）加入20μL 5×杂交液和5μL EUB338探针，用无菌水补足至100μL，轻轻重悬，45-50℃水浴加热1-2h；

（7）取杂交后的菌液用真空抽滤装置过滤到0.2μm聚碳酸酯滤膜上，滴加抗荧光猝灭剂，封片，常温保存于暗盒中；

（8）用荧光显微镜蓝光激发，拍摄所得到的荧光影像；

（9）镜检后菌体细胞计数。