CN110804648A - 检测黑茶发酵过程中微生物结构变化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测黑茶发酵过程中微生物结构变化的方法，其包括：将黑茶进行细胞固定，得到固定后的黑茶；将固定后的黑茶进行超声、过滤，加入琼脂糖，封膜后得到第一滤膜；杂交缓冲液和寡核苷酸探针混合，得到第一混合液，将第一混合液和第一滤膜混合并离心，得到第二滤膜；酪胺标记的荧光染料、信号增强缓冲液和双氧水混合，得到第二混合液，将第二混合液和第二滤膜进行处理，计算得到黑茶中微生物的数量；本发明使用辣根过氧化物酶标记寡核苷酸分子，通过酶活反应将荧光分子大量结合到目标DNA周围，大幅度提高了检测灵敏度，对一些丰度很低且存在风险的微生物，能够快速检出，保证了黑茶生产过程中的安全性，并降低了背景荧光。

Description

检测黑茶发酵过程中微生物结构变化的方法
技术领域
本发明属于食品科学与工程技术领域，涉及一种检测黑茶发酵过程中微生物结构变化的方法，更具体涉及到黑茶发酵过程中微生物群落结构和数量的分析检测，是一种基于酶联荧光原位杂交的检测发酵样品中霉菌、酵母、细菌等丰度的方法。
背景技术
黑茶属于六大茶类之一，属后发酵茶；因成品茶的外观呈黑色，故得名。按照原料和制作工艺的不同，可分为紧压茶、花卷和散装茶3类。紧压茶主要有茯砖茶、青砖茶、六堡茶等；散装茶有黑毛茶、普洱茶等；花卷主要是千两茶等。
黑茶发酵与微生物存在密切的联系，快速检测发酵过程中微生物的数量和结构，对于茶叶品质的提升以及安全性的评估至关重要。一方面，渥堆处理是黑茶品质形成的关键步骤，其实质是茶原料在一系列微生物的作用下，经过酶促反应和发酵过程，形成叶色黑润、香气纯正的品质特征过程。酵母菌、霉菌和细菌是黑茶发酵过程中的主要微生物群落。另一方面，发酵茶中严格限制各种真菌毒素的检出，所以发酵过程中各种有可能存在的有害微生物的检测也非常必要。
现有茶样品中的微生物检测手段仅见菌落培养法、变性梯度凝胶电泳(DGGE)相关报道。培养法是指根据每一种微生物的特性及其所需要的营养环境，来进行增菌，生化鉴定和分离培养等。通过选择合适的培养基，可以对菌落总数、大肠菌群、部分霉菌和致病菌等进行检测；但是此方法存在培养周期长、检出率低等问题，无法检测到丰度极低和不可培养的微生物。DGGE分析是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。应用这种特性可以分离微生物的特异性分子标记，比如细菌的16s rDNA、真菌的18s rDNA等；但此方法存在灵敏度和准确性不好的问题，无法检测到丰度极低的微生物，也难以区分序列一致性很高的不同菌种。
酶联荧光原位杂交是一种灵敏度高、荧光背景低、高效快速、对样品前处理要求低的方法。该方法通过在寡核苷酸探针长标记辣根过氧化物酶HRP，使大量的荧光标记的酪胺沉淀至特异性结合了DNA的探针周围，从而在不影响检测特异性的前提下，大幅度提高荧光信号强度，使检测灵敏度大幅度提高。因此，该方法非常适用于茶叶发酵过程这样的复杂环境中微生物的快速检测，且此应用报到较少，未见相关专利申请。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种检测黑茶发酵过程中微生物结构变化的方法。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种检测黑茶发酵过程中微生物结构变化的方法，其包括如下步骤：
(1)将黑茶进行细胞固定，得到固定后的黑茶样品；
(2)将固定后的黑茶样品进行分散处理、过滤，加入琼脂糖保护，封膜后得到第一滤膜；
(3)杂交缓冲液和合成HRP的寡核苷酸探针以300:1混合，得到第一混合液，将第一混合液和第一滤膜混合后孵育，离心后得到第二滤膜；
(4)酪胺标记的荧光染料、信号增强缓冲液和双氧水混合，得到第二混合液，将第二混合液和第二滤膜混合进行信号放大，冲洗后制成玻片标本。
(5)使用荧光显微镜检测、拍照并统计，计算得到黑茶中微生物的数量。
进一步地，步骤(1)中，细胞固定的过程为：将黑茶离心，加入甲醛溶液振荡后，在4℃下冷却4h，离心；之后加入1:1磷酸缓冲盐溶液和乙醇的混合液，振荡混匀。
进一步地，步骤(2)中，第一滤膜的制备过程为：将固定后的黑茶加入1:1的磷酸缓冲盐溶液和乙醇的混合液，进行分散处理，稀释于10mL的去离子水中，用0.2um的滤膜进行过滤，标记好滤膜有微生物的一面，加入0.1％的琼脂糖到滤膜有微生物的一面进行封膜，之后在37-46℃下，干燥15min；破壁处理后，37℃下孵育60min；之后进行冲洗。
进一步地，步骤(3)中，第二滤膜的制备过程为：将之前处理好的滤膜剪切成小块。杂交缓冲液与HRP标记的寡核苷酸探针以300:1比例充分混合。将剪碎的滤膜放入1.5mL离心管中，然后加入杂交缓冲液和探针的混合液300uL。在46℃条件下，10rpm摇床条件下孵育一定时间。杂交完成，在48℃条件下，在50mL离心管中使用冲洗缓冲液冲洗15min。
进一步地，步骤(4)的具体过程为：将第二滤膜放入磷酸缓冲盐溶液中冲洗，将1份酪胺标记的荧光染料、500-2000份信号增强缓冲液和0.0015％双氧水混合，得到第二混合液，将冲洗后的第二滤膜放入第二混合液中，46℃黑暗条件下处理20-60min，进行信号放大，之后用乙醇进行冲洗；滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚染料溶液，之后采用乙醇进行冲洗。
进一步地，步骤(5)的具体过程为：使用倒置荧光显微镜观测样品，随机挑取10个视野拍照。使用图像处理软件或人工计数对拍摄的照片进行微生物计数，最后换算成每克茶样中所含微生物的数量。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
第一、本发明使用辣根过氧化物酶标记寡核苷酸分子，通过酶活反应将荧光分子大量结合到目标DNA周围，大幅度提高了检测灵敏度，对一些丰度很低且存在风险的微生物，能够快速检出，保证了黑茶生产过程中的安全性，并降低了背景荧光。同时，该方法样品处理简便，不需要分离杂质，省去了相关前处理仪器的购置和使用。
第二、本发明探索、优化并实现了酶联荧光原位杂交法检测黑茶发酵过程中微生物结构变化，开发了一套高精密度、方便快捷的检测流程，一天之内能够得到微生物结构计数分析结果，为工业化生产过程中微生物的发酵调控及安全评估提供了依据，也可以适用于其他发酵茶中微生物的检测，具有很好的应用价值。
附图说明
图1为本发明的实施例1中超声处理对黑茶的分散作用效果示意图(A为涡旋振荡处理，B为超声处理)。
图2为本发明的实施例2中黑茶的破壁处理效果示意图(A为溶菌酶处理的黑茶(细菌探针)；B为蛋白酶K处理的黑茶(细菌探针)；C为溶菌酶处理的黑茶(真菌探针)；D为蛋白酶K处理的黑茶(真菌探针))。
图3为本发明的实施例3中寡核苷酸杂交的效果示意图(A：杂交时间为1.5h；B：杂交时间为2.0h；C：杂交时间为2.5h；D：杂交时间为3.0h)。
图4为本发明的实施例4中黑茶酶联荧光原位杂交效果示意图(左上图，DAPI，染色所有微生物；右上图，18-1探针，染色霉菌；左下图，PF-2探针，染色酵母；右下图，EUB338探针，细菌)。
图5为本发明的实施例4中黑茶发酵过程中免培养微生物数量的变化示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明技术方案做进一步说明和再现。
基础实施例
本发明实施例的检测黑茶发酵过程中微生物结构变化的方法包括如下步骤：
步骤1、细胞固定
研磨茶叶样品，取500mg置于2mL的离心管内。加入1500uL 4％的甲醛溶液并充分振荡，置于4℃冰箱中约4小时。充分振荡后在4℃条件下，10000rpm离心10min。弃去上清液，加入1500uL PBS溶液，振荡混匀，清洗2次。之后使用1500uL 1:1的PBS/乙醇混合液重悬沉淀，振荡混匀(如需保存，使用-20℃冰箱)。
步骤2、样品制备
取100uL固定后的样品，再加入900uL 1:1的PBS/乙醇，充分分散样品。取20uL超声处理的样品(根据微生物含量，做相应调整)，稀释于10mL去离子水中，用0.2umol/L滤膜过滤，并标记好滤膜有微生物的一面。用微波炉融化0.1％琼脂糖，冷却到35-40℃，小心的滴加到滤膜的有微生物一面进行封膜。之后在37-46℃条件下，干燥15min。随后进行细胞膜通透处理，之后在培养皿中用10mL的去离子水冲洗1min。将膜放入10mL 0.01mol/L的HCl中处理l0min，灭活内源酶。在培养皿中用10mL的去离子水冲洗1min，室温干燥。
步骤3、寡核苷酸杂交
将之前处理好的滤膜剪切成小块。杂交缓冲液与HRP标记的寡核苷酸探针以300:1比例充分混合。将剪碎的滤膜放入1.5mL离心管中，然后加入杂交缓冲液和探针的混合液300uL。在46℃条件下，10rpm摇床上孵育合适的时间。杂交完成，在48℃条件下，在50mL离心管中使用冲洗缓冲液冲洗15min。
其中，寡核苷酸探针为
细菌通用探针EUB338混合物：
EUB338 I：GCTGCCTCCCGTAGGAGT；
EUB338 II：GCAGCCACCCGTAGGTGT；
EUB338 III：GCTGCCACCCGTAGGTGT；
霉菌通用探针18S-1：GCGGGTCATCATAGAAACACCGC；
酵母通用探针PF-2：CTCTGGCTTCACCCTATTC。
上述杂交缓冲液组分为
添加顺序 试剂 20mL
1 5mol/L NaCl 3600μL
2 1mol/L Tris-HCl 400μL
3 Dextran Sulfate 2g
4 Formamide 7000μL
5 MQ water 7000μL
6 Blocking reagent 2000μL
7 SDS(10％) 20μL
步骤4、酪胺信号放大
将膜从冲洗缓冲液中取出，用吸水纸吸去多余的溶液，但不要让膜干燥。放入10mLPBS中冲洗10min。轻拍滤膜，将溶液甩去。1份酪胺标记的染料、500-2000份信号增强缓冲液和0.0015％双氧水混合。将膜放入上述的混合液中，46℃处理20-60min，黑暗条件进行信号放大。用50mL去离子水冲洗10min，室温黑暗条件下处理。用50mL 95％乙醇冲洗10min。取出，室温晾干。DAPI微生物计数。滴加数滴DAPI染料溶液(1-5ug/mL)，3min，黑暗条件，用50mL超纯水冲洗15s，50mL 80％乙醇处理1min。将处理好的滤膜制成玻片标本，并在制作过程中加入抗荧光衰退封片剂Citifluor，防止荧光淬灭。
其中，信号增强缓冲液为
Figure BDA0002243623350000051
步骤5、显微镜观测与图像处理
使用倒置荧光显微镜观测样品。由于高能量的紫外光会破坏较弱的荧光信号，因此在用紫外光之前，先采用蓝色激发光源。随机挑取10个视野拍照，使用软件ImageJ或人工计数对拍摄的照片进行微生物计数，最后换算成每克茶样中所含微生物的数量。
以下进一步给出优选实施例
实施例1
本实施例在基础实施例基础上，进一步优化技术措施：推荐以超声作为黑茶样品微生物的分散方法。
发酵样品中，微生物紧密依附于黑茶表面，所以在步骤2中需要合适的分散处理方法。按照本发明所述完成全部实验流程，并在步骤2中使用超声和涡旋振荡作为分散步骤，相应的最终步骤5中所得的荧光显微镜拍照结果如图1所示。从图1A中可以很直观地看出，黑茶样品仅使用涡旋振荡处理会导致大量的黑茶颗粒难以分散，形成巨大亮斑，即使细胞成功标记也难以计数。与之相比较，图1B中黑茶样品采用超声处理的微生物，分散度好，染色效率高，计数方便。经多次实验比较，使用低频度超声对黑茶样品进行分散处理，每次超声5s，停止5s，总时长10min(在冰上进行)，可以取得非常好的效果。超声处理后会明显提升对环境微生物的检测效率。酶联荧光原位杂交平均阳性检测效率从48.8％提高到93.2％。
实施例2
本实施例在基础实施例基础上，进一步优化技术措施：推荐蛋白酶K作为微生物破壁处理方法。
酶联荧光原位杂交试验中，与寡核苷酸探针结合的HRP属于生物大分子蛋白，难以直接进入到细胞壁中，所以需要对微生物进行破壁处理。按照本发明所述完成全部实验流程，并在步骤2中使用蛋白酶K和溶菌酶对微生物进行破壁处理黑茶样品，并用细菌和真菌探针分别杂交样品中的微生物，相应的最终步骤5中所得的荧光显微镜拍照结果如图2所示。用上述两种酶处理的样品与细菌探针杂交(图2A、图2B)并无明显差异，而对于真菌来说(图2C、图2D)，差异则非常明显。蛋白酶K处理的微生物信号强度更高，效果更好，酶联荧光原位杂交结果较理想，细菌及真菌的染色效率可以达到DAPI染色数量的80％以上。
实施例3
本实施例在基础实施例基础上，进一步优化技术措施：推荐2.5小时作为步骤3中的探针杂交时间。
杂交时间可对探针与靶序列的结合率及荧光信号强度产生较大影响。杂交时间过短，探针还未与靶序列结合就会被洗掉，而杂交时间过长，则会导致探针与其它碱基对结合，降低探针的特异性。为了确定探针最适宜杂交时间，按照本发明所述完成全部实验流程，并在步骤3中探针杂交时间选择1.5h、2.0h、2.5h和3.0h四个时间点，相应的步骤5中所得的荧光显微镜拍照结果如图3所示。结果发现，在杂交2.5h和3.0h的情况下，探针与靶序列杂交并在荧光素衍生物FluoX作用下在488nm下激发出绿色的荧光，而1.5h和2.0h的杂交则没有信号发出。因此选取2.5h作为优化杂交时间。
实施例4
本实施例在基础实施例基础上，使用最优参数，完成动态监测沱茶渥堆发酵过成中的微生物结构变化。
选择9个不同时间点的黑茶发酵过程样品，按照本发明所述完成全部实验流程，并在步骤2、步骤3中使用实施例1-3中推荐的最优参数，相应的最终步骤5中所得的荧光显微镜拍照结果如图4所示，计数统计之后结果如图5所示。在不同发酵时期，微生物的数量有极大的变化。在最初的晒青茶茶胚中，微生物总量大约730个/克，发酵末期达到7.3×108个/克。整个发酵过程中，真菌始终占据主体地位，细菌只占很小一部分。
发酵过程中黑茶茶群落多样性的变化遵循一定的规律。在发酵前期(0-35天)，霉菌占绝对优势(每克0.8×102-2.8×106个)，在发酵后期(35-56天)，酵母占绝对优势(每克0.6×102-3.6×106个)。发酵初期，由于潮水工艺造成茶叶湿度较高，霉菌最先繁殖起来；但是随着发酵的进行，含水量不断的减少，霉菌的生长状况变差。在发酵末期，原料基质干燥不适于霉菌生长，酵母开始繁殖，慢慢占据主导。通过微生物群落结构的鉴定，一旦发现微生物群落结构演变趋势与图5所示差异过大，则说明发酵过程可能出现温度、湿度控制不稳、外界杂菌污染等问题，此时需要即使调整发酵车间的温度、湿度等参数，以保证发酵成品的品质。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种检测黑茶发酵过程中微生物结构变化的方法，其特征在于：其包括如下步骤：
(1)将黑茶进行细胞固定，得到固定后的黑茶样品；
(2)将固定后的黑茶样品进行分散处理、过滤，加入琼脂糖保护，封膜后得到第一滤膜；
(3)杂交缓冲液和合成HRP的寡核苷酸探针以300:1混合，得到第一混合液，将所述第一混合液和第一滤膜混合后孵育，离心得到第二滤膜；
(4)酪胺标记的荧光染料、信号增强缓冲液和双氧水混合，得到第二混合液，将所述第二混合液和第二滤膜混合进行信号放大，冲洗后制成玻片标本；
(5)使用荧光显微镜检测、拍照并统计，计算得到黑茶中微生物的数量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述细胞固定的过程为：将黑茶离心，加入甲醛溶液振荡后，在4℃下冷却4h，离心；之后加入1:1磷酸缓冲盐溶液和乙醇的混合液，振荡混匀。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述第一滤膜的制备过程为：将固定后的黑茶加入1:1的磷酸缓冲盐溶液和乙醇的混合液，进行分散处理，稀释于10mL的去离子水中，用0.2um的滤膜进行过滤，标记好滤膜有微生物的一面，加入0.1％的琼脂糖到滤膜有微生物的一面进行封膜，之后在37-46℃下，干燥15min；破壁处理后使用HCl灭火内源酶；之后进行冲洗。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，第二滤膜的制备过程为：将之前处理好的滤膜剪切成小块。杂交缓冲液与HRP标记的寡核苷酸探针以300:1比例充分混合。将剪碎的滤膜放入1.5mL离心管中，然后加入杂交缓冲液和探针的混合液300uL。在46℃条件下，10rpm摇床条件下孵育一定时间。杂交完成，在48℃条件下，在50mL离心管中使用冲洗缓冲液冲洗15min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)的具体过程为：将第二滤膜放入磷酸缓冲盐溶液中冲洗，将1份酪胺标记的荧光染料、500-2000份信号增强缓冲液和0.0015％双氧水混合，得到第二混合液，将冲洗后的第二滤膜放入第二混合液中，46℃黑暗条件下处理20-60min，进行信号放大，之后用乙醇进行冲洗；滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚染料溶液，之后采用乙醇进行冲洗。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)的具体过程为：使用倒置荧光显微镜观测样品，随机挑取10个视野拍照；使用图像处理软件或人工计数对拍摄的照片进行微生物计数，最后换算成每克茶样中所含微生物的数量。
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