CN108048378B - 一种产dna酶的菌株hl28-6及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种产DNA酶的菌株HL28‑6及其应用，可有效解决DNA酶的生产制备问题；解决的技术方案是，一种产DNA酶的菌株HL28‑6，分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，于2014年9月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9639；制备DNA酶的方法包括：制备LB斜面培养基、制备发酵培养基、制备斜面菌种、发酵、酶液的制备；本发明菌株性状优良、制备出的DNA酶活性高，制备工艺简单、高效，节能环保，菌株在发酵培养基中生长分泌的DNA酶表现出很高的活性，在洗衣液、医药等应用中具有极高的应用潜力，经济和社会效益显著。

Description

一种产DNA酶的菌株HL28-6及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种产DNA酶的菌株HL28-6及其应用。
背景技术
DNA酶(Deoxyribonuclease，脱氧核糖核酸酶，简称DNase)是一种催化DNA分子骨架上磷酸二酯键的水解断裂，从而降解DNA的一种酶。
关于DNA酶，主要有以下三个方面的用途：
1、在生物学研究方面。当从细菌体中提取蛋白时，当细胞壁破裂，胞内的DNA就和目的蛋白结合到一起，这种结合使得目的蛋白变得非常粘稠而给提纯带来非常大的难度，为了解决这个问题，需向其中加入DNA酶降解其中的DNA，从而降低粘度，以利于后续的蛋白提纯。在常规的蛋白质组实验中，需先将实验对象的所有的蛋白质都提取出来，然后将这些蛋白进行双向电泳，即先根据蛋白质的等电点的不同在电场中将蛋白质分开，然后根据蛋白质的分子量的不同进一步将蛋白质分离到丙烯酰胺凝胶上，形成一个一个的蛋白质点，这样就达到分离所有蛋白质的目的，然后后续对感兴趣的蛋白质点进行质谱分析。然而，在提取蛋白的时候，细胞中的DNA就和蛋白质结合到一起，一方面干扰蛋白质的等电点，使蛋白质聚焦在凝胶的酸性区域，另一方面增加蛋白质的粘度，使蛋白质在双向电泳凝胶上的蛋白点特别异常，没法分析，因此，在处理样品的时候，需要在其中加入DNA酶，使DNA降解。
2、在医药方面：比如，DNA酶可用于治疗肺炎(pneumonia)和囊性纤维化(cysticfibrosis)等疾病，因为这类疾病都会引起肺部分泌黏弹性分泌物，而DNA酶主要作用是降解分泌物中高浓度的DNA，从而降低分泌物的粘弹性。临床实验表明，用组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,tPA)和DNA酶两者结合对胸腔膜感染疾病的治疗有效果，能增加胸腔引流，降低肺炎旁胸腔积液，而单独用组织型纤溶酶原激活剂没有这个效果。实验表明，DNA酶在治疗系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)也有效果。到目前为止，用DNA酶对一些疾病的治疗只是一种尝试，但随着对相关疾病的机理的全面揭示，用DNA酶对疾病的治疗就水到渠成了，相信DNA酶对越来越多的疾病有治疗作用，DNA酶会在疾病的治疗中发挥越来越大的作用。
3、在洗涤剂方面。提到酶制剂在洗涤剂中的应用，通常认为最基本、最重要和使用最为广泛的洗涤用酶的品种包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶和果胶酶等。随着人们的生活品质的提高，人们越来越关注之前没有关注而对洗涤效果影响非常大的污渍，如当使用衣物时，它们暴露于来自使用者的身体和来自它们使用的环境中，这些环境中包含有大量的细菌，这其中的一些细菌会粘附于衣物上并形成生物膜(biofilm)。生物膜使衣物变得粘稠，并且因此污垢粘附在粘稠区域上。这种污垢难以用商购的洗涤剂来去除。此外，当非常脏的衣物物品与不太脏的衣物物品一起洗涤时，洗涤溶液中存在的污物倾向于附着于生物膜上。其结果是，该衣物物品在洗涤后比洗涤前更“脏”。此外，这些细菌是难闻的气味的来源，使衣物产生难闻的气味。难闻的气味难以去除，并且即使在洗涤后仍可存在。在衣物上形成生物膜的细菌很多是人体的机会病原菌，如绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)，不有效去除的话可能会使人感染而致病，因此，开发对衣物上的生物膜的有效洗涤剂就显得非常必要和重要。衣物上能形成生物膜主要原因是衣物上的细菌向胞外分泌很多大分子物质形成基质，然后它们附着在基质上。生物膜的基质主要由细菌胞外多糖、蛋白质和DNA组成。研究表明，基质上的DNA含量非常大并且对生物膜的形成至关重要。因此，降解生物膜上的DNA可以去除生物膜。这就需要开发出含有DNA酶的洗涤剂。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种产DNA酶的菌株HL28-6及其应用，可有效解决DNA酶的生产制备问题。
本发明解决的技术方案是，一种产DNA酶的菌株HL28-6，分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，于2014年9月4日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.9639。
所述的产DNA酶的菌株HL28-6用于制备DNA酶的方法，包括以下步骤：
(1)制备LB斜面培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300mL水溶解，调pH至6-9，加琼脂粉20g，加水定容至1000mL，将琼脂加热溶解，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得LB斜面培养基；
(2)制备发酵培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300mL水溶解，调pH至6-8，加水定容至1000mL，混匀，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，得发酵培养基；
(3)制备斜面菌种：用接种环将芽孢杆菌HL28-6菌株接种于步骤(1)制备的斜面培养基上，25-35℃恒温培养，直到斜面上长满菌苔，得斜面菌种；
(4)发酵：用接种环将步骤(3)制备的斜面菌种接种于发酵培养基中，摇床发酵，发酵温度为25-37℃，转速为120-200转/分钟，发酵时间为24-36h；
(5)酶液的制备：发酵完成后，将发酵液在4℃、8000-12000转/分钟的条件下离心10-15min，弃去沉淀，上清液为粗酶液，即DNA酶液。
本发明菌株性状优良、制备出的DNA酶活性高，制备工艺简单、高效，节能环保，菌株在发酵培养基中生长分泌的DNA酶表现出很高的活性，在洗衣液、医药等应用中具有极高的应用潜力，经济和社会效益显著。
附图说明
图1为本发明菌株所产DNA酶液对细菌基因组(昆明假单胞菌HL22-2菌株)DNA、昆明假单胞菌HL22-2菌株淀粉酶基因和16SrRNA基因的降解情况。
图2为温度对DNA酶酶切效果的影响。
图3为不同条件处理粗酶发酵液对酶活力的影响。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，是由以下实施例实现。
本发明一种产DNA酶的菌株HL28-6，分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，于2014年9月4日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9639。
实施例1
所述的产DNA酶的菌株HL28-6用于制备DNA酶的方法，包括以下步骤：
(1)制备LB斜面培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300mL水溶解，调pH至6，加琼脂粉20g，加水定容至1000mL，将琼脂加热溶解，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得LB斜面培养基；
(2)制备发酵培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300mL水溶解，调pH至6-8，加水定容至1000mL，混匀，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，得发酵培养基；
(3)制备斜面菌种：用接种环将芽孢杆菌HL28-6菌株接种于步骤(1)制备的斜面培养基上，25℃恒温培养，直到斜面上长满菌苔，得斜面菌种；
(4)发酵：用接种环将步骤(3)制备的斜面菌种接种于发酵培养基中，摇床发酵，发酵温度为25℃，转速为200转/分钟，发酵时间为36h；
(5)酶液的制备：发酵完成后，将发酵液在4℃、8000转/分钟的条件下离心10min，弃去沉淀，上清液为粗酶液，即DNA酶液。
实施例2
本发明所述的产DNA酶的菌株HL28-6用于制备DNA酶的方法，包括以下步骤：
(1)制备LB斜面培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300mL水溶解，调pH至7.2，加琼脂粉20g，加水定容至1000mL，将琼脂加热溶解，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得LB斜面培养基；
(2)制备发酵培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300mL水溶解，调pH至6-8，加水定容至1000mL，混匀，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，得发酵培养基；
(3)制备斜面菌种：用接种环将芽孢杆菌HL28-6菌株接种于步骤(1)制备的斜面培养基上，30℃恒温培养，直到斜面上长满菌苔，得斜面菌种；
(4)发酵：用接种环将步骤(3)制备的斜面菌种接种于发酵培养基中，摇床发酵，发酵温度为30℃，转速为150转/分钟，发酵时间为30h；
(5)酶液的制备：发酵完成后，将发酵液在4℃、10000转/分钟的条件下离心12min，弃去沉淀，上清液为粗酶液，即DNA酶液。
实施例3
本发明所述的产DNA酶的菌株HL28-6用于制备DNA酶的方法，包括以下步骤：
(1)制备LB斜面培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300mL水溶解，调pH至9，加琼脂粉20g，加水定容至1000mL，将琼脂加热溶解，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得LB斜面培养基；
(2)制备发酵培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300mL水溶解，调pH至6-8，加水定容至1000mL，混匀，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，得发酵培养基；
(3)制备斜面菌种：用接种环将芽孢杆菌HL28-6菌株接种于步骤(1)制备的斜面培养基上，35℃恒温培养，直到斜面上长满菌苔，得斜面菌种；
(4)发酵：用接种环将步骤(3)制备的斜面菌种接种于发酵培养基中，摇床发酵，发酵温度为37℃，转速为120转/分钟，发酵时间为24h；
(5)酶液的制备：发酵完成后，将发酵液在4℃、12000转/分钟的条件下离心10min，弃去沉淀，上清液为粗酶液，即DNA酶液。
本发明经多次反复实验，均取得了一致的结果，相关实验资料如下：
实验1：菌株的筛选及鉴定
用DNA筛选平板，从本实验室保藏的细菌菌株中，分离到一株高活性的DNA生产菌株——Bacillus sp.HL28-6菌株。将Bacillus sp.HL28-6菌株接种于液体发酵培养基上，于25-37℃摇瓶培养24-36h，在4℃，10000r/min条件下离心15min，取上清液，测定其降解DNA分子的活力。最终，发现Bacillus sp.HL28-6菌株发酵液上清液对DNA分子有很强的降解活性。参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，依据其生理生化特征对HL28-6菌株进行分类鉴定。
对HL28-6菌株进行生理生化鉴定试验，结果如表1所示。
表1HL28-6菌株生理生化鉴定结果
注：“+”表示反应为阳性，“-”表示反应为阴性。
并对HL28-6菌株进行16S rDNA序列分析，具体步骤如下：
(1)基因组的DNA提取
用细菌基因组DNA提取试剂盒，按说明书所说步骤提取制备基因组DNA。
(2)引物序列：
27F 5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’
(3)PCR反应体系建立(50μL)：
(4)PCR程序设定
预变性94℃4min；循环94℃30s，59℃30s，72℃1min，30个循环；修复延伸72℃10min；
(5)DNA测序
将PCR出来的基因送交华大基因测序公司进行测序。
测序出的HL28-6菌株的16S rDNA基因序列见序列表。
(6)系统进化树的构建及分析
将测序出来HL28-6菌株的16S rDNA基因在NCBI的基因数据库中进行BLAST比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)，寻找与HL28-6菌株的16S rDNA相关的序列，用相关性最高的菌株和HL28-6菌株的16S rDNA基因构建系统进化树，进行同源性比较，确定HL28-6菌株的分类地位。在进化树中，HL28-6菌株和芽孢杆菌属(Bacillus)形成一个分枝，因此确定HL28-6菌株属于芽孢杆菌属菌株。
根据生理生化和分子生物学特征，HL28-6菌株与芽孢杆菌属中苏云金芽孢杆菌ATCC10792(Bacillus thuringiensis ATCC 10792)菌株，亲缘关系最近，在进化树中二者在同一个分枝上，但两者在生理生化特征上有一些差别，因此，二者不属于同一种细菌菌种，我们将HL28-6菌株命名为Bacillus sp.HL28-6。
实验2DNA酶活力的测定方法
1、用细菌基因组(昆明假单胞菌HL22-2菌株)DNA、16SrRNA基因和淀粉酶基因作为底物，检测DNA酶的活性。反应体系如下：总的反应体系是50μL，其中包含DNA 1μg，发酵酶液2μL。然后将反应体系置于37℃水浴中保温30min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子降解情况。如果没有相应的DNA分子条带，就说明DNA分子已经被降解。
2、PCR方法。将细菌基因组DNA分子用DNA酶液处理以后，以被处理的细菌基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA基因的引物对(27F/1492R)作为引物，用实验1中的PCR体系和方法对细菌16S rRNA基因进行克隆。同时用没有被处理的细菌基因组做模板，对16S rRNA基因进行对照克隆。然后将PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳，观察16S rRNA基因的克隆情况。
实验3粗酶液对DNA分子的降解
1、发酵：将HL28-6菌株接种到发酵培养基中，按发明内容所述的条件摇床发酵，然后离心，得上清液为粗酶液，即DNA酶液，用DNA酶液进行DNA分子降解实验。
2、制备待降解的DNA分子
(1)细菌基因组DNA分子的制备
将昆明假单胞菌HL22-2菌株(Pseudomonas kunmingensis HL22-2)接种到100mLLB培养基中(1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母粉，pH7.2)，30℃摇床培养过夜。4℃、12000转/分钟离心收集菌体，加入10mL TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0)重悬菌体。加入1mL TE缓冲液溶解的10mg/mL溶菌酶，混匀，置于37℃保温1小时。加入1mL10％SDS，60℃水浴保温10分钟，加入30μL 20mg/mL蛋白酶K，55℃水浴保温1小时。加入10mLTris饱和酚，颠倒混匀多次，离心，取上清液。在上清液中加入0.1倍体积的3M乙酸钠，然后加入2倍体积的95％的乙醇。用玻璃棒卷出DNA，重新溶解到10mL TE缓冲液中，加入20μL10mg/mL的RNA酶A，37℃保温30分钟。加入等体积的氯仿混匀多次，离心，取上层液。在上清液中加入0.1倍体积的3M乙酸钠，然后加入2倍体积的95％的乙醇。用玻璃棒卷出DNA，重新溶解到3mL TE缓冲液中，所得溶液即为HL22-2菌株基因组DNA。
(2)细菌基因DNA分子的制备
a.昆明假单胞菌HL22-2菌株16S rRNA基因DNA分子的制备：用昆明假单胞菌HL22-2菌株基因组DNA分子为模板，用细菌16S rRNA基因的引物对(27F/1492R)作为引物，用实施例1的PCR体系和方法对HL22-2菌株16S rRNA基因DNA分子进行克隆。
b.昆明假单胞菌HL22-2菌株淀粉酶基因DNA分子HLAM的制备：用昆明假单胞菌HL22-2菌株基因组DNA分子为模板，用菌株淀粉酶基因的引物对(HLAM_F：
ACTGAATTCGGCTCCCGAGCTGAGCGTTCGCCT；HLAM_R：
CCCAAGCTTTCGGGCCTGCACCACGATGA)作为引物，用实施例1的PCR体系和方法对HL22-2菌株淀粉酶基因DNA分子进行克隆。
3、DNA酶液对DNA分子的降解
总的反应体系是50μL，其中包含DNA分子1μg，发酵酶液2μL。然后将反应体系置于37℃水浴中保温30min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子降解情况。如果没有相应的DNA分子条带，就说明DNA分子已经被降解。结果如图1所示。图1：粗酶液对细菌基因组(昆明假单胞菌HL22-2菌株)DNA、昆明假单胞菌HL22-2菌株淀粉酶基因和16SrRNA基因的降解情况。泳道1、昆明假单胞菌HL22-2菌株基因组DNA+发酵培养基(LB培养基，未培养，下同)；泳道2、昆明假单胞菌HL22-2菌株基因组DNA+粗酶液；泳道M、DNA Marker；泳道3、昆明假单胞菌HL22-2菌株淀粉酶基因DNA(HLAM)+发酵培养基；泳道4、昆明假单胞菌HL22-2菌株淀粉酶基因DNA(HLAM)+粗酶液；泳道5、昆明假单胞菌HL22-2菌株16SrRNA基因DNA+发酵培养基；泳道6、昆明假单胞菌HL22-2菌株16SrRNA基因DNA+粗酶液。从图1可以看出，酶液对细菌基因组DNA、淀粉酶基因DNA分子HLAM和16S rRNA基因DNA分子完全降解。说明HL28-6菌株产生的DNA酶对不同的DNA分子能有效降解，有很大的应用潜力。
实验4菌株粗酶液的性质研究
1、温度对酶切效果的影响
将HL28-6菌株接种到LB培养基，发酵24h后，离心，制取粗酶液。然后取少量的粗酶液于小的离心管中，盖紧，置于沸水中保温10min，然后离心，取上清液。将原粗酶液和沸水处理后的粗酶液进行降解反应。总的反应体系是50μL，其中包含DNA分子1μg，粗酶液2μL。然后将反应体系分别置于37℃和60℃水浴中保温30min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子降解情况。结果如图2所示。图2：温度对酶切效果的影响。泳道1、HLAM+发酵培养基；泳道2、HLAM基因+粗酶液，37℃保温；泳道3、HLAM+粗酶液，60℃保温；泳道4、HLAM基因+沸水浴保温10min的粗酶液，37℃保温；泳道5、HLAM基因+沸水浴保温10min的粗酶液，60℃保温。结果显示，37℃条件下，原粗酶液和沸水处理过的粗酶液对DNA分子都有降解活性，而在60℃条件下，原粗酶液对DNA分子只具有部分降解活性，不能完全降解，沸水处理后的粗酶液对DNA分子只具有极少降解活性。HL28-6菌株所产的DNA酶在不同的温度下对DNA分子的不同降解效果这一特性可以用于分子生物学中，因为有时候我们需要将某基因组部分酶切，用于建库或其他方面，这时候我们就需要一种限制性内切酶对基因组DNA部分酶切，一方面限制性内切酶成本比较贵，另一方面用限制性内切酶害怕将基因组DNA切过了。而用HL28-6菌株所产DNA酶对待切基因组DNA在不同温度下酶切，就能达到我们想要的不同的酶切效果。
2、不同条件处理粗酶发酵液对酶活力的影响
考虑到HL28-6菌株在发酵的过程中会产生色素到培养基中，发酵完成后离心上清液有颜色，这在使用的时候不太好，因此，我们将发酵上清液用活性炭吸附1小时。然后离心，取上清液。将发酵液置于沸水中保温10min，然后离心，取上清液。取1mL原发酵清液，在其中加入200μg蛋白酶K，在55℃水浴中保温1h，离心，取上清液。将不同方式处理后的粗酶上清液进行降解反应。总的反应体系是50μL，其中包含DNA分子1μg，粗酶液2μL。然后将反应体系分别置于37℃水浴中保温30min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子降解情况。结果如图3所示。图3：不同条件处理粗酶发酵液对酶活力的影响。泳道1、昆明假单胞菌HL22-2菌株16SrRNA基因DNA+活性炭处理的粗酶液；泳道2、昆明假单胞菌HL22-2菌株16SrRNA基因DNA+沸水浴保温10min的粗酶液；泳道3、昆明假单胞菌HL22-2菌株16SrRNA基因DNA+蛋白酶K处理后的粗酶液。从图3可以看出，粗酶液经活性炭吸附色素后，粗酶液中的色素被清除，粗酶液变得澄清透明，并且澄清透明的粗酶液能对DNA分子有效降解，说明粗酶液经活性炭处理并没有影响其中的DNA酶，因此，用活性炭是一种非常好的去除粗酶液中色素的方法。将粗酶液在沸水中保温10min，离心上清液不仅对昆明假单胞菌HL22-2菌株的淀粉酶基因HLAM进行讲解，还能对昆明假单胞菌HL22-2菌株16SrRNA基因进行有效降解，说明在保温的时候，DNA酶并没有损失，这种特性在酶的后期处理中非常有用。可以用将发酵清液通过煮沸的方式将其中大部分蛋白变性，然后用离心的方式除去，而需要的DNA酶还保留在上清液中，这样就大大去除了粗酶液中的杂质蛋白。在图3中还可以看出，用蛋白酶K处理粗酶液后，其DNA酶活性完全丧失，说明虽然煮沸的方式不能使粗酶液中的DNA酶变性，似乎不符合酶的一般特征，但蛋白酶K能使粗酶液中DNA酶活性完全丧失这一现象说明粗酶液中起DNA酶作用的组分还是蛋白质成分，还是一种酶，只是能经受住100℃的处理。
到目前为止，作为可应用于医药、洗涤等行业的新型生物酶，关于可降解DNA分子的DNA酶的文献和专利很少，尤其是关于该酶的专利申请就更少。本发明分离到一株产DNA酶的芽孢杆菌(Bacillus sp.)HL28-6菌株，这个菌株与已有的芽孢杆菌在生理生化和分子生物学等方面都有区别，是一种新的产DNA酶的芽孢杆菌菌株，本发明所用到的发酵培养基成分和发酵条件简单，易于操作，另外菌株性状稳定、所产DNA酶活力高，对DNA分子降解彻底，发酵周期短，因此成本低廉，便于大规模发酵生产。在本发明中，生产菌株所生产的DNA酶的性状优良，具体表现在，用活性炭吸附菌株所产色素对DNA酶活力没有影响，沸水保温10min对酶活力没有影响，这些性质大大方便了酶的提纯，使酶在更适合在医药上的应用，因为医药应用的酶需要更高的纯度。总之，HL28-6菌株所产DNA酶可以应用于很多领域，比如在洗衣液、洗涤剂和医药等工业应用中具有极高的应用潜力。
序列表
<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司
<120> 一种产DNA酶的菌株HL28-6及其应用
<130> 2018
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1450
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌(Bacillus sp.)
<400> 1
gtatgcggca gctatacatg cagtcgagcg aatggattga gagcttgctc tcaagaagtt 60
agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat aagactggga taactccggg 120
aaaccggggc taataccgga taacattttg aactgcatgg ttcgaaattg aaaggcggct 180
tcggctgtca cttatggatg gacccgcgtc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240
ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300
ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360
ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt gttagggaag 420
aacaagtgct agttgaataa gctggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480
actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc 540
gtaaagcgcg cgcaggtggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga 600
gggtcattgg aaactgggag acttgagtgc agaagaggaa agtggaattc catgtgtagc 660
ggtgaaatgc gtagagatat ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactttc tggtctgtaa 720
ctgacactga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg aagttaacgc 840
attaagcact ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa actcaaagga attgacgggg 900
gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960
tcttgacatc ctctgaaaac cctagagata gggcttctcc ttcgggagca gagtgacagg 1020
tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080
caacccttga tcttagttgc catcattaag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1140
aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1200
cgtgctacaa tggacggtac aaagagctgc aagaccgcga ggtggagcta atctcataaa 1260
accgttctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca tgaagctgga atcgctagta 1320
atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380
accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tggggtaacc ttttggagcc agccgctaag 1440
ggacaagaga 1450

Claims (5)

1.一种产DNA酶的菌株HL28-6，分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，于2014 年9 月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9639。
2.权利要求1所述产DNA酶的菌株HL28-6用于制备DNA酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备LB斜面培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300 mL 水溶解，调pH至6-9，加琼脂粉20g，加水定容至1000mL，将琼脂加热溶解，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得LB斜面培养基；
（2）制备发酵培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300 mL 水溶解，调pH至6-8，加水定容至1000mL，混匀，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，得发酵培养基；
（3）制备斜面菌种：用接种环将芽孢杆菌HL28-6菌株接种于步骤（1）制备的斜面培养基上，25-35℃恒温培养，直到斜面上长满菌苔，得斜面菌种；
（4）发酵：用接种环将步骤（3）制备的斜面菌种接种于发酵培养基中，摇床发酵，发酵温度为25-37℃，转速为120-200转/分钟，发酵时间为24-36h；
（5）酶液的制备：发酵完成后，将发酵液在4℃、8000-12000转/分钟的条件下离心10-15min，弃去沉淀，上清液为粗酶液，即DNA酶液。
3.根据权利要求书2所述的产DNA酶的菌株HL28-6用于制备DNA酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备LB斜面培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300 mL 水溶解，调pH至6，加琼脂粉20g，加水定容至1000mL，将琼脂加热溶解，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得LB斜面培养基；
（2）制备发酵培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300 mL 水溶解，调pH至6-8，加水定容至1000mL，混匀，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，得发酵培养基；
（3）制备斜面菌种：用接种环将芽孢杆菌HL28-6菌株接种于步骤（1）制备的斜面培养基上，25℃恒温培养，直到斜面上长满菌苔，得斜面菌种；
（4）发酵：用接种环将步骤（3）制备的斜面菌种接种于发酵培养基中，摇床发酵，发酵温度为25℃，转速为200转/分钟，发酵时间为36h；
（5）酶液的制备：发酵完成后，将发酵液在4℃、8000转/分钟的条件下离心10min，弃去沉淀，上清液为粗酶液，即DNA酶液。
4.根据权利要求书2所述的产DNA酶的菌株HL28-6用于制备DNA酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备LB斜面培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300 mL 水溶解，调pH至7.2，加琼脂粉20g，加水定容至1000mL，将琼脂加热溶解，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得LB斜面培养基；
（2）制备发酵培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300 mL 水溶解，调pH至6-8，加水定容至1000mL，混匀，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，得发酵培养基；
（3）制备斜面菌种：用接种环将芽孢杆菌HL28-6菌株接种于步骤（1）制备的斜面培养基上，30℃恒温培养，直到斜面上长满菌苔，得斜面菌种；
（4）发酵：用接种环将步骤（3）制备的斜面菌种接种于发酵培养基中，摇床发酵，发酵温度为30℃，转速为150转/分钟，发酵时间为30h；
（5）酶液的制备：发酵完成后，将发酵液在4℃、10000转/分钟的条件下离心12min，弃去沉淀，上清液为粗酶液，即DNA酶液。
5.根据权利要求书2所述的产DNA酶的菌株HL28-6用于制备DNA酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备LB斜面培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300 mL 水溶解，调pH至9，加琼脂粉20g，加水定容至1000mL，将琼脂加热溶解，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得LB斜面培养基；
（2）制备发酵培养基：将蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、加300 mL 水溶解，调pH至6-8，加水定容至1000mL，混匀，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，得发酵培养基；
（3）制备斜面菌种：用接种环将芽孢杆菌HL28-6菌株接种于步骤（1）制备的斜面培养基上， 35℃恒温培养，直到斜面上长满菌苔，得斜面菌种；
（4）发酵：用接种环将步骤（3）制备的斜面菌种接种于发酵培养基中，摇床发酵，发酵温度为37℃，转速为120转/分钟，发酵时间为24h；
（5）酶液的制备：发酵完成后，将发酵液在4℃、12000转/分钟的条件下离心10min，弃去沉淀，上清液为粗酶液，即DNA酶液。
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