DE102004061664A1 - Nukleinsäure-bindende Chips zur Detektion von Phosphatmangelzuständen im Rahmen der Bioprozesskontrolle - Google Patents

Nukleinsäure-bindende Chips zur Detektion von Phosphatmangelzuständen im Rahmen der Bioprozesskontrolle Download PDF

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Abstract

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind Nukleinsäure-bindende Chips zur Überwachung von Bioprozessen unter spezieller Ausrichtung auf die Detektion von Phosphatmangelzuständen. Sie tragen Sonden für mindestens drei der folgenden 47 Gene: htpG, cypX, catC, nasE, yrbE, yfkN, yhcR, yurl, Homolog zu dhaS, dhaS, phoB, phoD, tatCD, alsD, alsS, ghd, phy, spollAA, spollAB, cotE, spollGA, spollQ, spoVID, pstS, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein, yvmA, Gen für eine vermutliche Acetoin-Reductase, Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase, Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase, Gen für ein konserviertes hypothetisches Protein, Gen für eine vermutliche Phosphatase, Gen für ein hypothetisches Protein, Gen für ein hypothetisches Protein, yfkH, yfmQ, yhbD, yhbE, yvmC, yvnA, spolllAF, spolllAG, spolllAH, pstA, pstBA, pstBB, pstC, Gen für eine vermutliche Ribunuclease, wobei die Gesamtzahl aller Phosphatstoffwechsel-spezifischen unterschiedlichen Sonden auf den Nukleinsäure-bindenden Chips nicht über 100 liegt. Ferner betrifft diese Anmeldung die Verwendung entsprechender Gensonden, insbesondere auf solchen Chips, beziehungsweise entsprechende Verfahren und Verwendungsmöglichkeiten.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäure-bindende Chips zur Überwachung von Bioprozessen unter spezieller Ausrichtung auf die Detektion von Phosphatmangelzuständen sowie die Verwendung entsprechender Gensonden, insbesondere auf solchen Chips, beziehungsweise Verfahren und Verwendungsmöglichkeiten, die auf derartigen Sonden und Chips beruhen.
  • Bei der technischen Nutzung biologischer Prozesse stellt sich das sehr grundlegende Problem, deren Verlauf zu überwachen, um zum gewünschten Ergebnis zu gelangen, um Ressourcen zu schonen und/oder um in einer gegebenen Zeit ein optimales Ergebnis zu erzielen. Unter biologischen Prozessen sind beispielsweise die Kultur von Mikroorganismen auf einer Agarplatte oder in Schüttelkultur zu verstehen, insbesondere aber deren Fermentation, beziehungsweise die Gewinnung von Rohstoffen über die Fermentation von Mikroorganismen. Hierzu gibt es einen reichhaltigen Stand der Technik, sowohl was einzellige Eukaryonten wie Hefen oder Streptomyceten, als auch was gramnegative oder grampositive Bakterien angeht.
  • Die Überwachung derartiger Prozesse (Monitoring) geschieht einerseits durch die Beobachtung der sich im Laufe des Prozesses wandelnden Eigenschaften und Anforderungen der betrachteten Organismen, was sich beispielsweise in der optischen Dichte und Viskosität des Mediums, in aufgenommenen oder abgegebenen Gasen, in Änderungen des pH-Werts oder sich wandelnden Nährstoffbedürfnissen niederschlägt. Hierzu kann man auch die Messung enzymatischer Aktivitäten über geeignete Assays rechnen, beispielsweise den Nachweis interessierender Aktivitäten im Kulturüberstand.
  • Andererseits sind in den letzten Jahren verschiedene Techniken entwickelt worden, um die Stoffwechselprozesse der betreffenden Organismen auf der Ebene der Genexpression zu verfolgen. Eine gängige Methode hierfür ist die Verwendung von Genen für leicht nachzuweisende Proteine als Indikatoren für die Aktivität der Promotoren für die eigentlich interessierenden Gene (Promotor-Analyse, Genexpressions-Analyse). Hierfür sind auch entsprechende Apparaturen (sogenannte (Bio-)Sensoren) entwickelt worden.
  • Andere Techniken befassen sich mit dem Nachweis der interessierenden Proteine beziehungsweise der für diese Proteine codierenden mRNA. Hierzu gehören (1.) die Proteom-Analyse, das heißt die Betrachtung der Veränderung der Ausstattung der betreffenden Zellen mit Proteinen, welche zumeist über 2-dimensionale Gelelektrophorese der Zellysate erfolgt, (2.) die Analyse der gebildeten mRNA (Transkriptom) über ein in analoger Weise erstelltes „genomisches DNA-Array" und (3.) die Chip-Technologie.
  • Letztere befindet sich in einem vergleichsweise frühen Entwicklungsstadium. Während die beiden zuerst genannten Methoden letzlich auf quantitativen Isolierungen und zeitaufwendingen Analysen der betreffenden Makromoleküle beruhen, liegt der Chip-Technologie das Prinzip zugrunde, auf physikalisch auslesbaren Trägern (Chips) Sonden für Proteine oder für Nukleinsäuren anzubringen, die unmittelbar auf das Vorhandensein der betreffenden Proteine, beziehungsweise Nukleinsäuren ansprechen. Gegenüber den beiden zuerst genannten Technologien verspricht man sich von derartigen Chips eine zum betrachteten Prozeß zeitnahe Analyse (At line-Analyse). Ein weiterer Vorteil ist der Bedarf an vergleichsweise kleinen Probenmengen.
  • Das Prinzip von Chip-basierten Messungen wird beispielsweise in dem Artikel „Real-time electrochemical monitoring: toward green analytical chemistry" von J. Wang (Acc. Chem. Res.; ISSN 0001-4842; Rec. Sept. 12, 2001, Seiten A-F) schematisch in 2 vorgestellt. Demnach wird die zu analysierende Probe mit einer Erkennungsschicht (biorecognition layer) in Kontakt gebracht, bei der es sich beispielsweise um Enzym, Antikörper, Rezeptor oder DNA handeln kann; das hierüber empfangene Signal wird über einen Umwandler (Transducer), beispielsweise eine amperometrische oder potentiometrische Elektrode, über einen Verstärker (amplification/processing) als elektrische Spannung oder als elektrisches Potential ausgegeben. In der betreffenden Arbeit werden auch optische Systeme angesprochen, denen gegenüber die elektronisch auswertbaren Systeme hinsichtlich der Miniaturisierbarkeit und anderer Vorteile dem Autor günstiger erschienen.
  • Aufgrund der vorliegenden Erfindung können die Protein-spezifischen Chips außer Betracht bleiben. mRNA erkennende Chips sind in der Regel mit komplementären DNA- Molekülen dotiert. Deren Herstellung und Nutzung zu sehr detaillierten Fragestellungen wie beispielsweise der Differenzierung von Punktmutationen wird beispielsweise in der Anmeldung WO 95/11995 A1 beschrieben. Unter den DNA-Chip-Analysen gibt es solche mit einer PCR-Amplifikation der Zielsequenz und solche ohne Amplifikation. Ferner gibt es solche mit optischer Auswertung der auf die Erkennung zurückzuführenden Signale und solche mit elektrischer Auswertung.
  • Die optischen Detektionsmethoden erfordern zum Teil einen Verstärkungsmechanismus der Signale. Hierfür werden zum Beispiel Fluorophore, Acridiniumester oder eine indirekte Detektion über sekundäre Bindungsvorgänge, zum Beispiel über Biotin, Avidin/Streptavidin oder Digoxigenin beschrieben. Im letzteren Falle werden zum optischen Nachweis Digoxigenin-spezifische Antikörper eingesetzt, die mit einem Enzym markiert werden. Dabei wird die Enzymaktivität entweder kolorimetrisch oder über Lumineszenz nachgewiesen. Nach Westin et al. (2000), Nature Biotechnol., 18, S. 199-204, kann die Hybridisierung mit einer PCR auf dem DNA-Chip gekoppelt werden, um so die gesamte Nachweisreaktion auf einem Chip durchführen zu können („Lab-on-a-Chip-Konzept").
  • Weitere Arbeiten beschreiben die Entwicklung von DNA-Chips, die das Prinzip der Kapillarelektrophorese zur DNA-Sequenzierung, beziehungsweise Trennung miniaturisieren (Woolley und Mathies (1994), Proc. Natl. Acad. Sci., 91, S. 11348-11352; Liu et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci., 97, S. 5369-5374).
  • Elektrisch auslesbare DNA-Chips sind in einigen Publikationen prinzipiell bereits vorgestellt worden (Hoheisel (1999), DECHEMA Jahresbericht 1999., S. 8-11; Hintsche et al. (1997), EXS, 80, S. 267-283). Wright et al. (2000; Anal. Biochem., 282, S. 70-79) nutzten einen „Ion-Channel-Sensor" (ICS) zur DNA-Detektion, wie er erstmalig von Cornell et al. (1997; Nature, 387, S. 580-583) beschrieben wurde. Dabei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem die Leitfähigkeit molekularer Ionenkanäle durch eine Bindungsreaktion detektiert wird. Im wesentlichen stellt der Sensor ein Impedanz-Element dar. Cheng et al. (1998; Nat. Biotechnol., 16, S. 541-546) zufolge können elektrische Impulse zu einer Verstärkung der Hybridisierungsreaktion auf optischen DNA-Chips genutzt werden. Fritsche et al. (2002; Laborwelt II) schlugen ein elektrisches Chip-System vor, das mit metallischen Nanopartikeln arbeitet, die zum Beispiel an Oligonukleotide gebunden sind. Bei diesem System wird durch eine sogenannte „metallische Verstärkung" während der Hybridisierungsreaktion ein Abfall des elektrischen Widerstandes an der Elektrode ausgelöst, der dann als Signal meßbar ist.
  • Ein weiterer Ansatz basiert auf einem elektrischen Detektionsprinzip, in dem DNA-Sonden verwendet werden, die durch die Markierung mit einem geeigneten Enzym (zum Beispiel alkalische Phosphatase) nach der Hybridisierung zu einem elektrisch aktiven Substrat führen, das dann durch eine Redox-Reaktion an der Elektrode detektierbar ist (Hintsche et al. (1997), EXS, 80, S. 267-283).
  • Wenn man sich hinsichtlich des prinzipiellen Aufbaus und des Auswertungssystems für einen bestimmten Nukleinsäure-erkennenden Chip-Typus entschieden hat, stellt sich das konkretere Problem, welche Genaktivitäten beobachtet werden sollen. Dabei ist zu bedenken, daß in der Zahl der mit einem Nukleinsäure-Chip-Typ gleichzeitig analysierbaren Gene technisch bedingte Grenzen bestehen. So sind optisch auslesbare Chips, was die Zahl der Sonden, die auf dem Chip aufgebracht werden können, den elektrisch auswertbaren derzeit überlegen. Deren Grenzen werden durch die Miniaturisierbarkeit der elektronischen Meßeinheiten gesetzt.
  • Es stellt sich somit das biologische Problem, welche Auswahl von Genaktivitäten den betrachteten Prozeß in geeigneter Weise abbilden. Hierzu gehört auch die Überwachung der Produktbildung, wenn es sich beispielsweise um eine fermentative Produktherstellung handelt. Gleichzeitig sollten auch Kontrollgene eingeschlossen werden, die anzeigen, wenn der Prozeß sich in eine Richtung entwickelt, die nicht beabsichtigt ist. Im Zuge dieses Monitoring sollte aus Praktikabilitätsgründen eine nicht zu hohe Zahl an verschiedenen Genen beobachtet werden.
  • Von besonderem technischen Interesse sind biotechnologische Prozesse mit grampositiven Bakterien. Denn diese werden besonders aufgrund ihrer Fähigkeit zur Sekretion zur industriellen Herstellung von Wertstoffen eingesetzt. Hierunter haben solche der Gattung Bacillus und hierunter wiederum die Spezies B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. licheniformis, B. lentus und B. globigii derzeit die wirtschaftlich größte Bedeutung.
  • Mit der simultanen Beobachtung der Aktivität mehrerer Gene in Bakterien (multiparametrische Erfassung) befassen sich beispielsweise die im folgenden vorgestellten Arbeiten.
  • In dem Artikel „Monitoring of genes that respond to process-related stress in large-scale bioprocesses" von Schweder et al. (1999), Biotech. Bioeng., 65, S. 151-159, wird die Veränderung der mRNA-Spiegel verschiedener durch Streß-Faktoren induzierbarer Gene, nämlich clpB, dnaK (induziert bei Hitzeschock), uspA (Glucose-Mangel), proU (osmotischer Streß), pfl und frd (O2-Mangel) und ackA (Glucose-Überschuß) im Verlauf einer Fermentation von E. coli und in der nachfolgenden Konzentrierungsphase beschrieben. Sie wurden über eine PCR-basierte, auf herkömmliche Weise durchgeführte Methode erfaßt. Hierbei wurden unterschiedliche Expressionsraten bereits an verschiedenen Stellen des Reaktors und sekundenschnelle Reaktionen auf veränderte Bedingungen festgestellt.
  • Eine weitere Fermentation von E. coli wird in der Arbeit „Monitoring of genes that respond to overproduction of an insoluble recombinant protein in Escherichia coli glucose-limited fed-batch fermentations" von Jürgen et al. (2000), Biotech. Bioeng., 70, S. 217-224, beschrieben. Hierin wird die Expression der Gene Ion, dnaK, ibpB, htrA, ppiB, groEL, tig, s6, 19 und dps, teilweise auf mRNA-, teilweise auf Proteinebene, teilweise auf beiden Ebenen betrachtet. Dabei erfolgte die Untersuchung über 2D-PAGE, beziehungsweise die DNA-array-Technik. Angesichts der Ergebnisse wird vorgeschlagen, rekombinante Bioprozesse wie die heterologe Protein-Herstellung über (unmittelbar) Prozeß-relevante Proteine und Reporter-Gene wie ibpB zu verfolgen.
  • Mit einer weiteren Beobachtung des Fermentationsverlaufs bei Expression eines rekombinanten Proteins durch E. coli befaßt sich die Arbeit „Genomic analysis of high-cell-density recombinant Escherichia coli fermentation and "cell conditioning" for improved recombinant protein yield" von R.T.Gill et al. (2001; Biotech. Bioeng., 72, S. 85-95). Hierin wird beschrieben, daß die Streß-Gene degP, uvrB, alpA, mltB, recA, ftsH, ibpA, aceA und groEL unter den genannten Bedingungen bei hoher Zelldichte gegenüber niedriger Zelldichte verstärkt exprimiert werden. Der Stärke der Reaktion nach gruppierten sie sich untereinander zu gewissen Clustern. Dies wurde über einen auf RT-PCR und DNA-Microarray beruhenden und durch Dot-blot-Analyse ergänzten Ansatz ermittelt, der auf Proben von zwei Zeitpunkten der Fermentation angewendet wurde, eben zu Beginn bei niedriger Zelldichte und gegen Ende bei hoher Zelldichte. Hieraus wurden „Cell Conditioning"-Ansätze entwickelt, um die Streß-Antwort der Zellen herabzusetzen.
  • Grundsätzliche Unterschiede in den Expressionsmustern grampositiver Organismen gegenüber denen von gramnegativen Bakterien werden mit der Arbeit „Proteome and transcriptome based analysis of Bacillus subtilis cells overproducing an insoluble heterologous protein" von Jürgen et al. (2001), Appl. Microbiol. Biotechnol., 55, S. 326-332 aufgedeckt. Darin wird die Expression unter anderem der Gene dnaK, groEL, grpE, clpP, clpC, clpX, rpsB und rplJ in B. subtilis beschrieben, wie sie über die DNA-macroarray-Technik, beziehungsweise über zweidimensionale Polyacrylgelelektrophorese ermittelt werden können. Hiernach werden in grampositiven zur Überexpression eingesetzten Bakterien die Gene für die Purin- und die Pyrimidin-Synthese sowie die bestimmter ribosomaler Proteine stärker exprimiert, als aufgrund der Erkenntnisse an gramnegativen Bakterien zu erwarten war. Ein weiterer Unterschied betrifft die Proteasen Lon und Clp.
  • Einzelne dieser Gene oder sogar Nukleinsäure-bindende Chips mit einzelnen dieser Gene werden inzwischen in mehreren Publikationen offenbart oder zumindest die Möglichkeit ihrer Herstellung aufgezeigt. So offenbaren beispielsweise die beiden Patentanmeldungen DE 10136987 A1 und DE 10108841 A1 jeweils ein Gen aus Corynebacterium glutamicum, nämlich clpC beziehungsweise citB. Beide Gene werden als relevant für den Aminosäure-Stoffwechsel beschrieben, weshalb eine kommerziell interessante Nutzung dieser Gene darin bestehen soll, sie zu inaktivieren oder zumindest abzuschwächen, um die fermentative Herstellung von Aminosäuren durch diesen Mikroorganismus zu optimieren. Weitere Anwendungsmöglichkeiten können nach diesen Anmeldungen darin bestehen, Sonden für die betreffenden Gen-Produkte auf Nukleinsäure-bindenden Chips vorzulegen.
  • Auf der anderen Seite werden zunehmend mehr Genomdaten verschiedener Organismen publiziert, die eine solche Fülle von Sequenzdaten enthalten, daß hieraus eine repräsentative Auswahl wünschenswert erscheint. So offenbart die Patentanmeldung WO 02/055655 A2 mehr als 1.800 DNA-Sequenzen, die durch die vollständige Sequenzierung des Genoms des Mikroorganismus Methylococcus capsulatus ermittelt worden sind.
  • Inzwischen ist beispielsweise auch das komplette Genom des grampositiven Bacillus licheniformis sequenziert worden. Es wird in der Publikation „The Complete Genome Sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an Organism with Great Industrial Potential" (2004) von B. Veith et al. in J. Mol. Microbiol. Biotechnol., Band 7 (4), Seiten 204 bis 211, beschrieben und ist zusätzlich unter dem Eintrag AE017333 (Basen 1 bis 4.222.645) in der Datenbank GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; Stand 2.12.2004) zugänglich.
  • Unter Verwendung der Technik optisch auswertbarer Chips ist es inzwischen sogar möglich, Nukleinsäure-bindende Chips herzustellen, die ein nahezu vollständiges Genom beziehungsweise das zugehörige Transkriptom abdecken (genomische DNA-Chips).
  • Mit der Anmeldung WO 2004/027092 A2 wird ein repräsentativer Querschnitt mit einer überschaubaren Anzahl von Genen zur Verfügung gestellt, um verschiedene physiologische Zustände, die ein beobachteter Mikroorganismus im Laufe der Kultivierung durchlaufen kann, zu identifizieren. Hierzu gehörten beispielsweise Hungerzustände gegenüber verschiedenen Nährstoffen oder Streßsituationen wie beispielsweise Hitze- oder Kälteschock, Scherstreß, oxidativer Streß oder Sauerstofflimitierung. Es handelt sich dabei um die folgenden Gene: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, IctP, Idh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF. Aus dieser Anmeldung gehen auch die zugehörigen DNA-Sequenzen aus B. subtilis, E. coli und/oder B. licheniformis hervor. Dadurch ist es möglich geworden, auch entsprechende Nukleinsäure-bindende Chips herzustellen, die bei der Überwachung eines auf Mikroorganismen, insbesondere grampositiven oder gramnegativen Bakterien beruhenden Bioprozesses Änderungen der diesen Prozeß kennzeichnenden Stoffwechselaktivitäten anzeigen.
  • Nukleinsäure-bindende Chips, die auf dieser Auswahl von Genen beruhen, liefern einen gewissen, insgesamt aber eher nur groben Überblick über die jeweilige Stoffwechselsituation. Sie vermögen in der Regel nicht, ein einzelnes Teilproblem besonders zu beleuchten; allerdings kann sich ein einzelnes positives Signal aus verschiedenen Situationen heraus ergeben oder auch nur falsch-positiv sein, weshalb es oft – und insbesondere in einer solchen unklaren Situation – sinnvoll ist, einen ausgewählten Stoffwechselaspekt separat zu analysieren. Andererseits ist gerade bei elektrisch auslesbaren Nukleinsäure-bindenden Chips, welche den Vorteil einer zeitnahen Analyse besitzen, die Zahl der gleichzeitig belegbaren Plätze begrenzt, so daß zur Erfassung zusätzlicher, spezieller Stoffwechselsituationen nicht einfach zusätzliche Gensonden aufgebracht werden können.
  • Eine Stoffwechselsituation, die für Mikroorganismen kritisch und somit für einen entsprechenden Bioprozeß limitierend sein kann, ist die des Phosphatmangels. Somit besteht ein besonderer Bedarf, diesbezüglich eine Chip-basierte, zeitnahe Analyse durchzuführen und aufgrund des hierdurch rasch zu erhaltenden Ergebnisses punktuell und damit noch zielgerichteter in den laufenden Bioprozeß eingreifen zu können. Dadurch wird einem Verlust an Ausbeute vorgesorgt, der sich durch einen nicht oder zu spät erkannten Phosphat-Engpaß ergeben würde.
  • Es stellte sich somit die Aufgabe, Gene zu identifizieren, die bei Organismen, insbesondere Mikroorganismen möglichst eindeutig mit dem Streß-Signal des Phosphatmangels in Verbindung gebracht werden können. Ziel war es, Sonden für diese Gene zu entwickeln, um sie für die Überwachung entsprechender Bioprozesse einsetzen zu können.
  • Damit sollte es möglich sein, Nukleinsäure-bindende Chips mit Gensonden für einzelne oder mehrere dieser Gene zu belegen und hierdurch zu Nukleinsäure-bindenden Chips zu gelangen, die im Verlaufe eines überwachten Bioprozesses zuverlässig das Signal „Phosphatmangel" anzeigen (Phosphatmagel-Sensoren). Diese Aufgabe stellte sich insbesondere für solche Nukleinsäure-bindenden Chips, deren Anzahl an belegbaren Plätzen aufgrund ihrer Bauart vergleichsweise gering ist, insbesondere die elektrisch auswertbaren. Denn diese weisen andererseits die Vorteile einer raschen Auslesbarkeit auf und ermöglichen damit eine At-line-Analyse. Dies gewährleistet ein gegebenenfalls frühzeitiges Eingreifen, um den betreffenden Bioprozeß hinsichtlich der Phosphatversorgung zu optimieren.
  • Solch ein DNA-bindender Chip sollte für mehrere miteinander vergleichbare Prozesse einsetzbar und mit vergleichsweise geringfügigen Variationen an spezifische Einsatzmöglichkeiten anzupassen sein. Vorzugsweise sollte er auf Bioprozesse auf der Grundlage von Bacillus-Spezies, insbesondere B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. globigii, und ganz besonders auf B. licheniformis ausgerichtet sein. Unter Bioprozessen standen Fermentationen, insbesondere die technische Herstellung von Produkten, ganz besonders von überexprimierten Proteinen im Vordergrund.
  • Ferner sollte solch ein Phosphatmagel-Sensor entsprechende Verfahren zur Messung des physiologischen Zustands der betrachteten Zellen sowie entsprechende Verwendungsmöglichkeiten zur Überwachung der betrachteten biologischen Prozesse ermöglichen.
  • Zur Lösung dieser Aufgabe wurde eine Vielzahl von Genen aus dem biotechnologisch wichtigen Bakterium B. licheniformis hinsichtlich ihrer Aktivierbarkeit durch den Übergang der betreffenden Kultur in einen Phosphatmangelzustand untersucht (Beispiel 1). Dabei wurde überraschenderweise festgestellt, daß bei weitem nicht alle Gene, die am Phosphatstoffwechsel beteiligt sind, ein diesbezüglich eindeutiges Signal liefern. Zusätzlich wurde – ebenso überraschend – eine Aktivierung von solchen Genen beobachtet, die zuvor nicht ohne weiteres mit dem Phophsphatstoffwechsel in Verbindung gebracht worden sind, beispielsweise Sporulationsgenen; diese sollen nun unabhängig von ihrer bislang bekannten Funktion erfindungsgemäß ebenfalls als Phosphatstoffwechselgene angesehen werden. Beides belegt Beispiel 2 der vorliegenden Anmeldung. Dabei wurden sehr unterschiedlich starke Induktionen beobachtet. Der Lehre der vorliegenden Erfindung zufolge sollen Gene umso mehr als Indikatoren geeignet sein, je stärker diese Antwort ausfällt. Erfindungsgemäß werden deshalb solche Gene als Phosphatmangel-Indikatoren ausgewählt, die ein deutliches, signifikant über einem bestimmten Schwellenwert liegendes Signal ergeben. Je weiter das Ergebnis darüber liegt, desto mehr sind sie erfindungsgemäß bevorzugt, womit sich eine entsprechende Staffelung hinsichtlich bevorzugter Erfindungsapekte erklärt.
  • Eine Lösung der gestellten Aufgabe besteht in einem Nukleinsäure-bindenden Chip, dotiert mit Sonden für mindestens drei der folgenden 47 Gene: htpG, cypX, ctaC, nasE, yrbE, yfkN, yhcR, yurI, Homolog zu dhaS (Homolog zu SEQ ID NO. 17), dhaS, phoB, phoD, tatCD, alsD, alsS, gdh, phy, spoIIAA, spoIIAB, cotE, spoIIGA, spoIIQ, spoVID, pstS, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), yvmA, Gen für eine vermutliche Acetoin-Reductase (Homolog zu SEQ ID NO. 53), Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), Gen für ein konserviertes hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yfkH, yfmQ, yhbD, yhbE, yvmC, yvnA, spoIIIAF, spoIIIAG, spoIIIAH, pstA, pstBA, pstBB, pstC, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93), wobei die Gesamtzahl aller Phosphatstoffwechsel-spezifischen unterschiedlichen Sonden nicht über 100 liegt.
  • Unter einem Nukleinsäure-bindenden Chip sind erfindungsgemäß alle Gegenstände zu verstehen, die mit Nukleinsäure-spezifischen Sonden versehen sind und bei Bindung einer oder mehrerer spezifisch erkannter Nukleinsäuren jeweils ein auswertbares Signal liefern.
  • Aus dem einleitend dargestellten Stand der Technik ist die Gestaltung von Chips bekannt, die mit Nukleinsäuren als Sonden dotiert sind. Prinzipiell können sie alle für Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung genutzt werden. Sie basieren auf dem Prinzip der Nukleinsäure-Hybridisierung der zu detektierenden mRNA (oder einem hiervon abgeleiteten Molekül) mit der auf dem Chip vorgelegten Sonde. Je nach System zur Auswertung des durch die Hybridisierung ausgelösten Signals wird zwischen Chips mit einem optischen und mit einem elektrischen Analysesystems unterschieden. Erfindungsgemäß sind prinzipiell beide Systeme anwendbar.
  • Solche Chips werden folgendermaßen zur Kontrolle (Monitoring) des jeweils betrachteten Bioprozesses eingesetzt: Aus dem Prozeß wird zu einem bestimmten Zeitpunkt eine Probe mit dem zu analysierenden biologischem Material entnommen. Aus diesem wird, nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise unter Zellaufschluß und Verwendung einen denaturierenden Puffers RNA, insbesondere mRNA isoliert. Diese wird selbst markiert oder als Ausgangsmolekül für ein in die Messung eingebrachtes Molekül eingesezt (zum Beispiel durch reverse Transkription erhaltene cDNA) und die erhaltenen Moleküle vorteilhafterweise in einem Puffer über/durch den Chip geleitet. Bei Hybridisierung (Sandwich-Markierung) einer präparierten RNA beziehungsweise deren Derivat mit der homologen (das heißt hinsichtlich ihrer Sequenz kongruenten) auf dem Chip bereitgestellten Sonde (Target-Nukleinsäure, beispielsweise Target-DNA oder Target-Nukleinsäureanalog) ergibt sich ein entsprechendes optisch oder elektronisch auswertbares Signal. Dieses beruht beispielsweise auf der Markierung der bindenden mRNA oder einem Transkript davon mit einem Farb- oder Fluoreszenzmarker, einer Hybridisierung mit einer zweiten Sonde oder auf einer sekundären Nachweisreaktion, etwa über eine RT-PCR.
  • Da von derselben Sonde in der Regel jeweils mehrere Moleküle an den Chip gebunden sind, ist die Stärke des Hybridisierungssignal über einen gewissen – im Einzelfall gegebenenfalls zu optimierenden – Bereich proportional zur Zahl der zum Zeitpunkt der Probennahme in der Probe vorhandenen spezifischen mRNA. Auf diese Weise ist die Stärke des Signals ein direktes Maß für die Aktivität des betreffenden Gens zu dem Zeitpunkt der Probennahme.
  • Die Zeitspanne zwischen Probennahme und Messung sollte dabei so kurz wie möglich gehalten werden, beispielsweise über eine weitgehend automatisierte Probennahme, deren Aufarbeitung und Leitung über/durch den Sensor.
  • Als mithilfe eines erfindungsgemäßen Chips betrachtete (monitorierte) Organismen kommen prinzipiell alle Pflanzen, Tiere und Mikroorganismen in Frage, insbesondere solche, die kommerziell genutzt werden. So geht beispielsweise aus der Anmeldung DE 19860313 A1 mit dem Titel „Verfahren zur Erkennung und Charakterisierung von Wirkstoffen gegen Pflanzen-Pathogene" hervor, daß es in Pflanzen, insbesondere Nutzpflanzen Stoffwechselsituationen gibt, die beobachtet werden müssen. Ebenso können beispielsweise Nutztiere oder Labortiere beobachtet weden. Von nicht geringem kommerziellen Interesse sind eukaryontische Zellkulturen, etwa bei der Herstellung monoklonaler Antikörper, und insbesondere die fermentative Herstellung von Lebensmitteln, etwa über die von Hefen betriebene alkoholische Gärung. Bakterien werden insbesondere zur technischen Herstellung von Proteinen oder niedermolekularen Wertstoffen (Biotransformation), etwa von Vitaminen oder Antibiotika genutzt.
  • Unter Sonden sind erfindungsgemäß alle Moleküle zu verstehen, die in der Lage sind, mit Nukleinsäuren eine jeweils weitgehend spezifische Wechselwirkung einzugehen (sie zu binden). Diese Wechselwirkung wird erfindungsgemäß ausgenutzt, um im Rahmen einer entsprechenden Anordnung (Chip) ein weitgehend eindeutig zuzuordnendes, auswertbares Signal zu erhalten.
  • Chemisch gesehen handelt es sich bei einer erfindungsgemäßen Sonde zumeist um eine Verbindung, die in der Lage ist, über Wasserstoffbrückenbindungen mRNA-Moleküle oder hiervon abgeleitete Nukleinsäuren zu binden, so wie dies beispielsweise auch bei der Wechselwirkung der beiden Stränge einer DNA oder der DNA-RNA-Wechselwirkung erfolgt. Dies kann beispielsweise eine DNA sein, welche gegenüber Hydrolyse stabiler ist als RNA.
  • Im Stand der Technik sind darüber hinaus weitere Moleküle bekannt, insbesondere chemisch synthetisierte, die biomimetisch dieselbe Wechselwirkung ermöglichen, aber stabiler als DNA sind, beispielsweise dadurch, daß die Phophatester-Bindungen des Rückgrats gegen weniger hydrolyseempfindliche Bindungen ausgetauscht worden sind. Solche Nukleinsäure-Analogon-Sonden kennzeichnen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Anmeldung (siehe unten). Die betreffenden spezifischen Sonden wären, etwa nach dem Vorbild des mit dieser Anmeldung verbundenen Sequenzprotokolls entsprechend zu synthetisieren. Dies kommt dem Aspekt entgegen, daß erfindungsgemäße Chips vorteilhafterweise mehrmals verwendbar sein sollten, insbesondere während eines einzelnen beobachteten Prozesses, in dessen Verlauf eine ständige Überwachung erstrebenswert ist.
  • Limitierend für die Brauchbarkeit einer Sonde ist jeweils das Maß der Homologie zwischen der bereitgestellten Sonde und der mRNA oder der davon abgeleiteten Nukleinsäure, die über Hybridisierung erkannt werden soll. Letztlich entscheidet das Maß an Hybridisierung der Sonde mit der zu detektierenden mRNA (siehe oben) über deren Brauchbarkeit als Sonde und muß im Einzelfall experimentell optimiert und/oder über Anpassung der Signalauswertung berücksichtigt werden. Es muß unter den durch den Aufbau der Meßapparatur, und sonstigen Einflüssen vorgegebenen Bedingungen eine Hybridisierung erfolgen, die spezifisch nur auf das interessierende Gen zurückgeführt werden kann, ausreichend stark ist, um ein positives Signal zu ergeben, und andererseits nicht zu stark ist, als daß das erkannte Molekül nach Erzeugung des Signals wieder abdiffundiert, um die Bindungsstelle für das nächste Molekül freizumachen, beziehungsweise ein Abklingen des Signals zu ermöglichen; letzteres gegebenenfalls über einen entsprechenden Waschschritt.
  • Allerdings ist es nötig, vor Verwendung erfindungsgemäßer Chips für einen interessierenden Organismus das Maß der Homologie zwischen den betreffenden Genen abzuschätzen, bei nicht ausreichender Affinität der zu detektierenden mRNAs zu den voregelegten Sonden solche über dieselben erfindungsgemäßen Gene aus näher verwandten Spezies auf dem Chip zu verankern und Kalibrierungsmessungen durchzuführen, um verläßliche Aussagen darüber zu erhalten, welche Signalstärke welcher Konzentration an spezieller mRNA entspricht.
  • Die Identifizierung der für die vorliegende Erfindung wesentlichen 47 Gene ist in den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung beschrieben. Deren aus Bacillus licheniformis erhältlichen Sequenzen sind im Sequenzprotokoll der vorliegenden Anmeldung angegeben (SEQ ID NO. 1 bis 94), wobei es sich bei den Sequenzen mit ungeradzahligen Nummern um DNA-Sequenzen und bei den jeweils um einen Zahlwert höheren Sequenzen um die jeweils davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen handelt. Während die DNA-Sequenzen unmittelbar für die Herstellung von Sonden genutzt werden können (siehe oben), dienen die Aminosäuresequenzen beispielsweise über Sequenzdatenbank-Vergleiche der Überprüfung der Genfunktion und können ferner dazu dienen, um etwa über Rück-Übersetzung des genetischen Codes ähnliche Nukleinsäuren-erkennende Sonden zu generieren.
  • Wie in Beispiel 1 dargestellt ist, wurden zahlreiche verschiedene Gentranskripte, das heißt mRNA-Moleküle untersucht, insbesondere solche, von denen eine Beteiligung am Phosphatstoffwechsel allgemein bekannt war. Diese mRNA-Moleküle wurden zu verschiedenen Zeitpunkten während des Übergangs von B. licheniformis DSM 13 in einen Phosphatmangelzustand isoliert. In Beispiel 1 wird ebenfalls beschrieben, wie der Konzentrationsanstieg dieser mRNA im Zellinneren von B. licheniformis experimentell ermittelt wurde. Alternative Bestimmungsmöglichkeiten hierzu mögen im Stand der Technik etabliert sein; entscheidend für das Verständis der vorliegenden Erfindung ist die Zusammenstellung in Tabelle 1 (Beispiel 2). Sie zeigt die mit dem Übergang verbundenen Konzentrationsänderungen für insgesamt 235 mRNAs. Dabei wurden folgende Schwellenwerte für das Verhältnis der RNA Menge des jeweiligen Gens gegenüber dem Kontrollwert als signifikant angesehen: Als induziert gelten erfindungsgemäß die Gene, deren RNA ein Verhältnis > 3 (das heißt mindestens eine Verdreifachung) aufweist; eine deutliche Induktion liegt bei ein Verhältnis von > 10 vor; deutlich reprimiert sind Gene mit einem RNA-Verhältnis < 0,3 (das heißt einem Absenken auf weniger als 30%). Bei den in Tabelle 1 aufgeführten 235 Genen wurde zu irgendeinem der betrachteten Zeitpunkte mindestens eine Verdreifachung beobachtet.
  • Unter diesen 235 Genen befinden sich, wie Tabelle 2 belegt, überraschenderweise lediglich 47 Gene mit einer mindestens 10fachen Induktion zu irgendeinem der beobachteten Zeitpunkte unter den Bedingungen des in Beispiel 1 beschriebenen Phosphatmangels. Diese 47 Gene werden erfindungsgemäß als repräsentative Indikatoren eines Phosphatmangelzustands angesehen. Weitere Angaben zu diesen Genen, beispielsweise über deren Funktion oder abweichende Start-Codons sind den Tabellen 1 und 2 sowie dem Sequenzprotokoll zu entnehmen.
  • All diese Gene sind jeweils für sich im Stand der Technik beschrieben. Sie können für die verschiedenen Organismen aus allgemein zugänglichen Datenbanken entnommen werden. Wie oben erwähnt sind die im Sequenzprotokoll für B. licheniformis DSM 13 angegebenen Sequenzen aus diesem Mikroorganismus ermittelt worden und stimmen praktisch mit den in der Publikation „The Complete Genome Sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an Organism with Great Industrial Potential" (2004) von B. Veith et al. in J. Mol. Microbiol. Biotechnol., Band 7 (4), Seiten 204 bis 211, beschriebenen und zusätzlich unter dem Eintrag AE017333 (Basen 1 bis 4.222.645) in der Datenbank GenBank (siehe oben) zugänglichen Angaben überein. Der Stamm B. licheniformis DSM 13 ist über die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) allgemein erhältlich. Er trägt bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (http://www.atcc.org) die Hinterlegungsnummer ATCC 14580.
  • Die zu den genannten 47 Genen entsprechenden Gene aus anderen Organismen sind zu einem Großteil ebenfalls in allgemein zugänglichen Datenbanken hinterlegt, beispielsweise für die gut charakterisierten Spezies B. subtilis und E. coli, die allgemein als Modellorganismen der grampositiven, beziehungsweise gramnegativen Bakterien angesehen werden. Die entsprechenden Sequenzen können beispielsweise den Datenbanken des Institut Pasteur, 25,28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, Frankreich, entnommen werden, welche über die Internet-Adressen http://genolist.pasteur.fr/Colibn/ (für E. coli), beziehungsweise http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/ (für B. subtilis) zugänglich sind (Stand: 2.12.2004) zugänglich sind. Weitere hierfür geeignete Datenbanken sind die des EMBL-European Bioinformatics Institute (EBI) in Cambridge, Großbritannien (http://www.ebi.ac.uk), Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Genf, Schweiz; http://www.genebio.com/sprot.html) oder GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
  • Unter diesen „entsprechenden Genen" sind diejenigen zu verstehen, die jeweils für die Proteine codieren, die im betrachteten Organismus dieselbe chemische Reaktion katalysieren oder an demselben physiologischen Vorgang wie die genannten 47 Proteine in B. licheniformis DSM 13 beteiligt sind. Die meisten davon tragen für andere Organismen ähnliche Namen und Abkürzungen wie die, die in den Tabellen 1 und 2 für B. licheniformis angegeben sind, weil diese Namen für die jeweilige Funktion stehen. In der Regel geben sie sich über ihre Sequenz zu erkennen, welche aus dem betreffenden Organismus die zu den hier genannten jeweils nächstähnliche (am stärksten homologe) ist. Bei der Funktionszuordnung kommt es vor allem auf die Ähnlichkeit der Aminosäuresequenzen zueinander an, weil die Aminosäuren die Funktionsträger des Proteins darstellen und aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes verschiedene Nukleotidsequenzen für dieselbe Aminosäuresequenz codieren können.
  • Besonders hohe Verwandtschaftsgrade bestehen zwischen nahe verwandten Spezies. So kann prinzipiell davon ausgegangen werden, daß sich zu den meisten der genannten 47 Gene Homologe in allen Spezies finden lassen, auch in Cyanobakterien, in eukaryontischen Zellen wie etwa Pilzen, oder gramnegativen Spezies wie E. coli oder Klebsiella. Noch höher ist diese Wahrscheinlichkeit für grampositive Bakterien, insbesondere der Gattung Bacillus, weil es sich bei B. licheniformis DSM 13, von dem die im Sequenzprotokoll aufgeführten Sequenzen stammen, um ein solches grampositives Bakterium handelt. Zudem ist davon auszugehen, daß in zunehmend verwandten Organismen die homologen Gene auch zunehmend denselben oder gleichwirkenden Regulationsmechanismen unterworfen sind; somit sollten diese Homologen auch dieselbe Stoffwechselsituation, insbesondere einen Phosphatmangel anzeigen. Insofern ist B. licheniformis ein glücklich gewählter Beispielorganismus, weil die kommerziell ebenfalls besonders wichtigen Spezies B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. globigii ebenfalls Bacilli und damit grampositiv sind. Damit wird dem diesbezüglichen Aspekt der gestellten Aufgabe entsprochen.
  • Es sei angemerkt, daß zum Nacharbeiten der Erfindung für eine bestimmte Spezies nicht alle genannten 47 Gene bekannt sein müssen sondern lediglich einige davon (siehe unten) ausreichen, um den Phosphatstoffwechsel abzubilden und insbesondere den Übergang in einen Phosphatmangelzustand detektieren zu können. Gleichwohl steigt mit zunehmender Zahl von Sonden die Verläßlichkeit der Aussage über den Phosphat-Versorgungsszustand. Sind mehrere prinzipiell aufgrund der vorliegenden Offenbarung geeignet erscheinende Gene bekannt, empfiehlt es sich, vor Herstellung eines entsprechenden Chips eine Expressionsstudie durchzuführen, um ähnlich der Darstellung in Beispiel 1 oder auch über eine Northern-Analyse zu überprüfen, ob die betreffenden Gene tatsächlich signifikante Aussagen erlauben. Je weniger die betrachtete Spezies mit B. licheniformis verwandt ist, desto eher mögen sich Verschiebungen hinsichtlich des durch Phosphatmangels hervorgerufenen Expressionsnieaus ergeben, so daß sich (gegebenenfalls andere als die unten zusammengestellten) Unterguppen dieser 47 Gene als besonders geeignet und damit als bevorzugt herausstellen.
  • Bei der Herstellung eines erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden Chips für einen hier nicht genannten Organismus müssen also zu zumindest einzelnen der für B. licheniformis genannten Gene die zugehörigen homologen Gene identifiziert werden, beispielsweise durch einen Vergleich der für den betreffenden Organismus bekannten DNA-Sequenzen mit den hier angegebenen Sequenzen. Diese oder Teile davon (siehe unten) können sodann an sich als Sonden oder als Vorlage zur Synthese entsprechender Sonden dienen, welche nach an sich bekannten Methoden auf einen Nukleinsäurebindenden Chip aufgebracht werden.
  • Sollten einzelne homologe Sequenzen nicht in Datenbanken hinterlegt sein, ist es dem Fachmann möglich, anhand der im Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung offenbarten Sequenzen jeweilige Sonden zu synthetisieren, um mit deren Hilfe eine für den gewünschten Organismus erstellte Genbank (genomisch oder vorzugsweise auf der Basis der cDNA) nach allgemein üblichen Methoden nach dem betreffenden Homolog zu durchsuchen. Alternativ hierzu ist es auch möglich, anhand der im Sequenzprotokoll angegebenen DNA-Sequenzen Oligonukleotide zu synthetisieren, die als PCR-Primer dienen, um die betreffenden Gene oder als Sonden brauchbare Teile davon aus einer gesamtgenomischen DNA-Präparation oder einer cDNA-Präparation des interessierenden Organismus herauszuamplifizieren. Diese oder Teile davon (siehe unten) können als Sonden auf erfindungsgemäßen Nukleinsäure-spezifischen Chips eingesetzt werden.
  • Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Gesamtzahl aller Phosphatstoffwechsel-spezifischen unterschiedlichen Sonden nicht über 100 liegt. Dieses Merkmal korreliert mit der gestellten Aufgabe, wonach sie schwerpunktmäßig auf solche Nukleinsäure-bindenden Chips ausgerichtet sein sollte, deren Anzahl an belegbaren Plätzen aufgrund ihrer Bauart vergleichsweise gering ist. Dies sind insbesondere die elektrisch auswertbaren Chips.
  • Unter den weiteren Phosphatstoffwechsel-spezifischen Sonden können beispielsweise solche sein, die durch einen Phosphatüberschuß induziert werden, evtl. auch weitere, die mit dem Phosphatstoffwechsel scheinbar in keinem direkten Zusammenhang stehen, aufgrund dieser Induzierbarkeit aber als solche definiert werden können. Damit ergibt solch ein Chip auch eine auswertbare und im betrachteten Prozeß brauchbare Information, wenn der Phosphatmagel, beispielsweise durch Ergreifen entsprechender Gegenmaßnahmen überwunden worden ist.
  • Ferner handelt es sich bei Nukleinsäure-spezifischen Sonden in der Regel jeweils nur um Fragmente der kompletten Gene (siehe unten). In Einzelfällen, beispielsweise bei einer Regulation über Spleißen oder großen, mehrfachfunktionellen Polypeptiden kann es deshalb sinnvoll sein, ein und dasselbe Gen mit zwei oder mehr verschiedenen Sonden zu detektieren. Somit sind entsprechende Ausführungsformen gegebenenfalls durch mehr als 47 Sonden gekennzeichnet, die jedoch auf nicht mehr als diese 47 Gene ansprechen.
  • Je nach zu beobachtendem Prozeß können auf erfindungsgemäßen Chips auch Sonden für weitere Gene beziehungsweise Genprodukte enthalten sein (siehe unten).
  • Zum anderen besteht der Kern der Erfindung gerade in der Spezifität des betreffenden Chips, mit dem eine spezielle Stoffwechselsituation erfaßt werden sollte. Die Herstellung eines Chips mit mehr als 100 auf verschiedene Gene ansprechenden Sonden oder sogar eines Chips, der einen Großteil des Genoms eines Organismus abbildet, ist bei einer solch spezifischen Fragestellung wegen des damit verbundenen Aufwands nicht Teil der hier beschriebenen Erfindung. Vielmer können beide Arten von Chips in einem beobachteten Bioprozeß sinnvoll nebeneinander eingesetzt werden: So können die Chips mit zahlreichen verschiedenen Gensonden oder mit einem repräsentativen Querschnitt verschiedener möglicherweise relevanter Situationen, wie sie mit der Anmeldung WO 2004/027092 A2 zur Verfügung gestellt werden, einen groben Überblick über den Zustand des betreffenden Organismus liefern, während ein erfindungsgemäßer Chip zur Kontrolle hinzugezogen wird, wenn Anlaß zur Sorge besteht, die betreffenden Zellen könnten in einen Phosphatmangelzustand eintreten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um einen erfindungsgemäßen Nukleinsäure-bindenden Chip, der mit Sonden für mindestens drei der folgenden 39 Gene: cypX, ctaC, nasE, yrbE, yfkN, yhcR, yurI, Homolog zu dhaS (Homolog zu SEQ ID NO. 17), dhaS, phoB, phoD, tatCD, alsD, alsS, gdh, phy, spoIIAA, spoIIAB, cotE, spoIIGA, spoIIQ, spoVID, pstS, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), yvmA, Gen für eine vermutliche Acetoin-Reductase (Homolog zu SEQ ID NO. 53), Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), Gen für ein konserviertes hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yfkH, yfmQ, yhbD, yhbE, yvmC, yvnA, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93) dotiert ist.
  • Diese Zusammenstellung orientiert sich an den Werten, die als Stärke der Induktion in den Tabellen 1 und 2 angegeben sind. Von den dort zusammengestellten 235 beziehungsweise 47 Genen zeigen die hier aufgeführten und entsprechend bevorzugten Gene eine mindestens zehnfache Induktion zwei Stunden nach Eintritt des Phosphatmangels.
  • Hierunter sind weiterhin bevorzugte Chips durch eine Auswahl von mindestens zwei der folgenden 14 Gene gekennzeichnet: cypX, yfkN, Homolog zu dhaS (Homolog zu SEQ ID NO. 17), phoB, phoD, alsD, alsS, gdh, phy, spoIIAB, Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), yfmQ, yvmC, yvnA. Denn diese zeigten zwei Stunden nach Eintritt des Phosphatmangels eine mindestens zwanzigfache Induktion.
  • Hierunter sind besonders bevorzugte Chips durch eine Auswahl von mindestens zwei der folgenden 6 Gene gekennzeichnet: cypX, phoB, phoD, alsS, yvmC, yvnA. Denn diese zeigten zwei Stunden nach Eintritt des Phosphatmangels eine mindestens vierzigfache Induktion.
  • Hierunter sind ganz besonders bevorzugte Chips durch eine Auswahl von mindestens einem der folgenden 3 Gene gekennzeichnet: phoB, yvmC, yvnA. Denn diese zeigten zwei Stunden nach Eintritt des Phosphatmangels eine mindestens einhundertfache Induktion.
  • In bevorzugten Ausführungsformen sind erfindungsgemäße Nukleinsäure-bindende Chips mit mindestens 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26 28, 30, 35, 40, 45 oder 47 der in der für die vorliegende Erfindung namentlich genannten Sonden dotiert.
  • Denn je mehr dieser Sonden auf ein entsprechendes Signal ansprechen, desto zuverlässiger ist die hiermit verbundene Aussage über die augenblickliche Phosphatversorgung beziehungsweise -Unterversorgung. So ist es auch sinnvoll, die besonders aussagekräftigen und somit bevorzugte Ausführungsformen kennzeichnenden Sonden mit scheinbar weniger aussagekräftigen zu kombinieren, um falsch-positive Signale ausschließen zu können. Ferner ist es vorteilhaft, entsprechend den Angaben in Tabelle 2 solche Sonden miteinander zu kombinieren, die zu unterschiedlichen der dort angegebenen Zeitpunkte unterschiedlich starke Signale ergeben. So kann man zu einer Abschätzung darüber gelangen, wie lange vor Probennahme der Eintritt des Phosphatmangels zurückliegt und ob er – unter Protokollierung der Kultivierungsbedingugen – möglicherweise auf einen bestimmten Umwelteinfluß zurückzuführen ist.
  • In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips liegt die Gesamtzahl aller unterschiedlichen Sonden zunehmend bevorzugt nicht über 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 oder 50.
  • Dies entspricht dem oben ausgeführten Erfindungsgedanken, wonach mit den hier beschriebenen Chips ein spezieller Stoffwechselaspekt monitoriert werden soll, so daß eine größere Zahl von Sonden als zum Erfassen dieser Situation notwending nicht auf den betreffenden Chips aufgebracht zu werden braucht. Davon bleibt die Situation unberührt, daß es in Einzelfällen sinnvoll sein kann, mehr als eine Sonde zur Detektion derselben mRNA einzusetzen und/oder einzelne Sonden aufzubringen, die mit der Herstellung eines interessierenden Wertstoffs in Verbindung stehen. Insgesamt bewegt sich die vorliegende Erfindung in dem genannten Rahmen, um Chips mit technisch bedingt nur wenigen Bindungsstellen in den Schutzbereich einschließen zu können.
  • In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips handelt es sich bei den namentlich genannten Sonden um solche, die auf die betreffenden Gene aus dem für den Bioprozeß gewählten Organismus ansprechen, vorzugsweise solche, die von Genen dieses Organismus abgeleitet sind.
  • Hierzu ist bereits oben ausgeführt worden, daß die in der vorliegenden Anmeldung offenbarten Sequenzen aus B. licheniformis erhalten worden sind und sich aufgrund der allgemein bekannten Verwandtschaftsverhältnisse insbesondere zum Überwachen von verwandten Spezies, insbesondere solchen der Gattung Bacillus eignen sollten.
  • Statistisch gesehen sollte solch ein Chip jedoch umso erfolgreicher einsetzbar sein, je besser die gewählten Sonden mit den zu messenden Nukleinsäuren interagieren. Somit steigt vor allem bei abnehmendem Verwandtschaftsgrad zu B. licheniformis die Notwendigkeit, sich bei dieser Hybridisierung nicht auf die angegebenen Sequenzen zu verlassen sondern – sofern Sequenzunterschiede bestehen – die für die homologen Gene aus den betreffenden Spezies einzusetzen. Wie erläutert können diese über an sich bekannte Verfahren, insbesondere Genbank-Screening oder PCR mit Primern, die an den hier offenbarten Sequenzen orientiert sind (gegebenenfalls in Form sogenannter Mismatch-Primer mit gewissen, statistischen Sequenzvariationen), erhalten werden.
  • In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips handelt es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien.
  • Denn in diese Gruppen fallen die kommerziell am stärksten eingesetzen Organismen, insbesondere wenn es sich bei dem zu beobachteten Bioprozeß um eine Fermentation handelt. Hierzu zählen beispielsweise Gärprozesse, etwa zur Herstellung von Wein oder Bier, oder die biotechnologische Herstellung von Wertstoffen wie Proteinen oder niedermolekularen Verbindungen.
  • Abhängig von der Art des gewünschten Produkts werden für ein biotechnologisches Verfahren verschiedene Organismen gewählt. Hierunter sind im Sinne der Erfindung nicht allein die Produktionsstämme zu verstehen sondern auch alle dem Produktionsprozeß vorgeschalteten Organismen, beispielsweise zur Klonierung entsprechender Gene oder zur Auswahl geeigneter Expressionsvektoren. Der Bedarf, die Phosphatlimitation zu erfassen, besteht dabei prinzipell während jedes Teilprozesses.
  • In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips handelt es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
  • Denn diese werden neben der Herstellung alkoholischer Getränke und weiterer durch Gärung erhaltener Lebensmittel intensiv als Wirtszellen insbesondere für die Genprodukte von Eukaryonten eingesetzt. Letzteres ist dann besonders vorteilhaft, wenn diese Genprodukte spezielle, nur durch diese Stämme durchführbare Modifikationen erfahren sollen, wie beispielsweise Glykosylierungen von Proteinen.
  • Unter diesen Gegenstand fallen auch erfindungsgemäße Chips, die auf die Überwachung des Verlaufs, insbesondere des Wachstums von Zellkulturen höherer Eukaryonten, etwa von Nagetieren oder von Menschen ausgerichtet sind. Sie können in gewisser Hinsicht ebenfalls als, zumindest weitgehend einzellige Eukaryonten verstanden werden, die insbesondere in der Immunologie eine erhebliche kommerzielle Bedeutung besitzen, beispielsweise für die Herstellung monoklonaler Antikörper.
  • In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips handelt es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii oder B. lentus, und ganz besonders um B. licheniformis.
  • Denn dies sind technisch besonders wichtige Produktionsstämme. Sie werden insbesondere zur Produktion niedermolekularer chemischer Verbindungen, etwa von Vitaminen oder von Antibiotika oder zur Produktion von Proteinen, insbesondere Enzymen eingesetzt. Hierbei sind besonders Amylasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen und Proteanen besonders hervorzuheben. Die besondere Ausrichtung auf B. licheniformis erklärt sich daraus, daß die im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen aus dieser Spezies erhalten worden sind und wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben nachweislich mit dem Übergang in einen Phosphatmangel in Verbindung gebracht werden konnten.
  • In nicht minder bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips handelt es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E. coli oder Klebsiella, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
  • Denn diese dienen sowohl im Labormaßstab beispielsweise der Klonierung und Expressionsanalyse als auch im großtechnischen Maßstab der Herstellung biologischer Wertstoffe.
  • In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips ist/sind mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere der im Zusammenhang mit der hier beschriebenen Erfindung namentlich genannten Sonden von den Sequenzen abgeleitet, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 und 93 aufgeführt sind.
  • Denn diese Gene konnten bei B. licheniformis wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben nachweislich mit dem Übergang in einen Phosphatmangel in Verbindung gebracht werden. Insbesondere wenn B. licheniformis oder andere, vor allem verwandte Bacillus-Spezies überwacht werden sollen, sollte deshalb auf diese Sequenzen zurückgegriffen werden.
  • In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips handelt es sich um solche, die zusätzlich mit mindestens einer Sonde für ein zusätzliches Gen dotiert sind, insbesonderen einem solchen, das in einem Stoffwechsel-bedingten Zusammenhang zu dem oder den prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Genen) steht, ganz besonders für eines von diesen oder dieses selbst.
  • Wie oben ausgeführt dienen die beobachteten Prozesse einem technischen Interesse, das oft mit weiteren spezifischen Genen verbunden ist. Hierbei handelt es sich beispielsweise in dem Fall, daß ein Protein hergestellt werden soll, um das Gen für dieses Protein und in dem Fall, daß eine niedermolekulare Verbindung hergestellt werden soll, um ein oder mehrere Genprodukte, die auf dem Syntheseweg der betreffenden Verbindung liegen oder diesen regulieren. Es können auch andere zelleigene Gene betroffen sein, etwa Stoffwechselgene, die im Zuge der Produktherstellung verstärkt gebildet werden müssen, beispielsweise eine zelleigene Oxidoreduktase, wenn das Produkt aus einem Edukt oder einem Zwischenprodukt über Oxidation oder Reduktion erhalten werden soll.
  • Zudem werden für bestimmte biologische Prozesse, insbesondere die Bildung gewerblich relevanter Verbindungen durch Mikroorganismen in der Regel nicht die Wildtyp-Stämme eingesetzt, sondern solche, die auf den betreffenden Prozeß ausgerichtet sind. Hierzu gehört neben der Transformation mit den für die eigentliche Produktherstellung verantwortlichen Genen das Versehen mit Selektionsmarkern oder weitere Anpassungen des Stoffwechsels, bis hin zu Auxotrophien. Derartige Stämme besitzen ein besonderes Anforderungsprofil an die Wachstumsbedingungen und besitzen zum Teil Stoffwechselgene, die gegenüber den Wildtypgenen mutiert sind. Da erfindungsgemäße Chips vorteilhafterweise auf eben diese Stämme, ganz besonders den betrachteten Bioprozeß ausgerichtet sein sollen, sollten diese Stamm-spezifischen Eigenheiten berücksichtigt werden und können sich in der Wahl der betreffenden Sonden widerspiegeln.
  • In bevorzugten Ausführungsformen derartiger erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips handelt es sich bei dem prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Gen um das für ein gewerblich einsetzbares Protein, insbesondere um eine Amylase, Cellulase, Lipase, Oxidoreduktase, eine Hemicellulase oder Protease, oder um eines, das auf einem Syntheseweg für eine niedermolekulare chemische Verbindung liegt oder diesen wenigstens zum Teil reguliert.
  • Diese sind dann besonders auf diejenigen Bioprozesse, vor allem Fermentationen ausgerichtet, in denen die genannten Proteine hergestellt werden. Bei diesen handelt es sich um kommerziell besonders wichtige Enzyme, die beispielsweise in der Lebensmittelindustrie oder der Waschmittelindustrie Verwendung finden. Im zuletztgenannten Fall insbesondere zur Entfernung von Anschmutzungen, die von Amylasen, Cellulasen, Lipasen, Hemicellulasen und/oder Proteasen hydrolysierbar sind, zur Behandlung der betreffenden Materialien, insbesondere durch Cellulasen beziehungsweise zur Bereitstellung eines auf einer Oxidoreduktase beruhenden enzymatischen Bleichsystems.
  • Die zuletzt genannte Variante fällt in den Bereich der Biotransformation, wonach bestimmte, gegebenenfalls zusätzlich eingeführte Stoffwechselaktivitäten von Mikroorganismen zur Synthese chemischer Verbindungen ausgenutzt werden.
  • In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips wird/werden eine, bevorzugt mehrere der im Zusammenhang mit der hier beschriebenen Erfindung namentlich genannten Sonden einzelsträngig, in Form des codogenen Strangs bereitgestellt.
  • Diese Ausführungsform verfolgt das Ziel, die Hybridisierung zwischen der Sonde und der zu detektierenden Probe zu verbessern. Dies gilt insbesondere für den Fall, daß aus der Probe tatsächlich der Gehalt an der relevanten mRNA bestimmt wird. Da diese einzelsträngig ist und in ihrer Sequenz mit dem codierenden Strang der DNA übereinstimmt, sollte eine optimale Hybridisierung mit dem komplementären, das heißt dem codogenen Strang erfolgen.
  • In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips wird/werden eine, bevorzugt mehrere der namentlich genannten Sonden in Form einer DNA, vorzugsweise eines Nukleinsäureanalogs zur Verfügung gestellt.
  • Diese Ausführungsform verfolgt das Ziel, die Haltbarkeit und mehrmalige Verwendbarkeit der erfindungsgemäßen Chips zu verbessern. Dieses Bedürfnis ergibt sich insbesondere während eines einzelnen beobachteten Prozesses, in dessen Verlauf eine ständige Überwachung erstrebenswert ist. Die Haltbarkeit erfindungsgemäßer Chips, insbesondere gegenüber Nukleinsäure-hydrolysierenden Enzymen wird bereits durch die Bereitstellung der Sonden in Form einer DNA erhöht, da diese an sich weniger hydrolyseempfindlich als etwa eine RNA ist. Noch haltbarer sind Nukleinsäureanaloga, in denen beispielsweise das Phosphat des Zucker-Phosphatsrückgrats gegen einen chemisch anderen Baustein ersetzt ist, welcher beispielsweise durch natürliche Nukleasen nicht hydrolysierbar ist. Derartige Verbindungen sind prinzipiell im Stand der Technik bekannt und werden für gewünschte, jeweils anzugebende Sequenzen von hierauf spezialisierten Firmen auf Wunsch kommerziell synthetisiert. Die betreffenden Sonden sind etwa nach dem Vorbild der im Sequenzprotokoll angegebenen Segzenzen zu synthetisieren.
  • In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips umfaßt/umfassen eine, bevorzugt mehrere der namentlich genannten Sonden Genbereiche, die von dem zu untersuchenden Organismus in mRNA umgeschrieben werden, insbesondere die Genbereiche, die nahe dem 5'-Ende der mRNA liegen.
  • Hiermit wird dem Aspekt Rechnung getragen, daß vielfach auch die regulatorischen DNA-Abschnitte einem speziellen Gen zugeordnet werden. In der Tat soll der erfindungsgemäße Chip jedoch dem Nachweis der in den beobachteten Zellen tatsächlich vorhandenen mRNA eingesetzt werden, so daß für den hier betrachteten Zweck erst der Genabschnitt von Bedeutung ist, der tatsächlich in mRNA übersetzt wird. Zum anderen ist zu berücksichtigen, daß insbesondere bei Eukaryonten Introns auftreten, das heißt der codierende Bereich von Abschnitten unterbrochen ist, die nicht in mRNA übersetzt werden. Sonden, die Introns enthalten, dürften deshalb nicht oder nur schlecht auf die betreffenden mRNA ansprechen. Zur Realisierung dieses Aspekts ist es ratsam, nicht auf genomische DNA-Sequenzen zurückzugreifen sondern auf cDNA-Segenzen, das heißt auf solche, die anhand der tatsächlichen mRNA erhalten worden sind.
  • Des weiteren ist zum Nachweis einer mRNA oft keine Hybridisierung über die ganze Seqzuenzlänge erforderlich. Die spezifischen Sonden brauchen deshalb in der Regel nur einen kleineren des in mRNA umgeschriebenen Gens zu umfassen. Vorteilhaft ist hierfür eine Auswahl eines Bereichs, der nahe dem 5'-Ende der mRNA liegt, da dieser zuerst in mRNA transkribiert wird und somit nach Aktivitierung des Gens als erstes nachweisbar ist. Dies kommt einem zeitnahen Nachweis entgegen.
  • In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips spricht/sprechen eine, bevorzugt mehrere der namentlich genannten Sonden auf Fragmente der betreffenden Nukleinsäuren an, insbesondere auf solche, die in der betreffenden mRNA, bezogen auf die jeweilige Gesamt-mRNA ein geringes Maß an Sekundärfaltung aufweisen.
  • Dies ist ein weiterer Aspekt, um die Hybridisierung zwischen den Sonden und den zu detektierenden mRNA zu optimieren. Denn mRNA-Moleküle liegen oft in einer Sekundärstruktur vor, die auf Hybridisierung einzelner mRNA-Bereiche mit eigenen, anderen Bereichen beruht. So kommt es beispielsweise zu Loop- oder Stem-loop-Strukturen. Solche Bereiche hybridisieren in der Regel jedoch weniger leicht mit anderen Nukleinsäuremolekülen, auch wenn diese homolog sind. Derartige Bereiche können recht genau von hierauf ausgerichteten Computerprogrammen (siehe unten) errechnet werden. Zur Realisierung dieses Aspekts sollte man also das Gen, dessen Aktivität man für einem interessierenden Organismus bestimmen möchte, von solch einem Programm analysieren lassen und zur Gewinnung einer geeigneten – in der Regel nur einen Teilbereich umfassenden (siehe unten) – Sonde auf Abschnitte zurückgreifen, für die ein nur geringes Maß an mRNA-Sekundärstrukturen vorhergesagt wird.
  • In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips weist/weisen eine, bevorzugt mehrere der namentlich genannten Sonden eine Länge von zunehmend bevorzugt weniger als 200, 150, 125 oder 100 Nukleotiden, vorzugsweise von 20 bis 60 Nukleotiden, besonders bevorzugt von 45 bis 55 Nukleotiden auf.
  • Denn die für die Nachweisreaktion eingesetzten Sonden brauchen nur Teile der zu detektierenden mRNA zu umfassen, sofern das über sie erhältliche Signal noch spezifisch genug ist. Diese Spezifität, die Unterscheidbarkeit verschiedener mRNA setzt die untere Grenze für die Länge der betreffenden Sonden und muß gegebenenfalls in Vorversuchen experimentell ermittelt werden.
  • Die Identifizierung von geeigneten Sonden ist dem Fachmann an sich bekannt und wird normalerweise unter Zuhilfenahme spezialisierter Software durchgeführt. Beispiele für solche Software sind die Programme Array Designer der Fa. Premier Biosoft International, USA, und Vector NTI® Suite, V. 7, erhältlich von der Firma InforMax, Inc., Bethesda, USA. Neben den schon erwähnten Sekundärstrukturen berücksichtigen diese Softwareprogramme beispielsweise auch vorgegebene Sondenlängen sowie Schmelztemperaturen.
  • In bevorzugten Ausführungsformen erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips wird durch die Bindung der mRNA an die betreffende namentlich genannte Sonde ein elektrisches Signal ausgelöst.
  • In dem bereits erwähnten Artikel J. Wang (Acc. Chem. Res.; ISSN 0001-4842; Rec. Sept. 12, 2001, S. A-F) werden die Vorteile eines elektrisch auswertbaren Systems gegenüber einem optischen System diskutiert. Ferner wird auf verschiedene im Stand der Technik entwickelte Ausführungsformen solcher Sensoren verwiesen.
  • So beträgt zum gegenwärtigen Zeitpunkt die Zeitspanne von der Probennahme bis zum Messen des Signals für optisch auswertbare Chips ungefähr 24 h. Mithilfe eines elektrischen Systems liegt der Zeitbedarf momentan bei weniger als 2 h (vergleiche 1). Demgegenüber liegt die Zahl der gleichzeitig analysierbaren Proben bei elektrisch auswertbaren Chips derzeit im zweistelligen Bereich, wobei jedoch eine rasche Entwicklung dafür spricht, daß diese Größenordnung in Kürze überschritten werden kann. Limitierend hierfür sind die elektronischen Auswerte-Einheiten für die verschiedenen Signale.
  • Eine im Stand der Technik etablierte Methode zur mRNA-Quantifizierung stellt beispielsweise die RT-PCT dar. Diese wird in dem Artikel „Quantification of Bacterial mRNA by One-Step RT-PCR Using the LightCycler System" (2003) von S.Tobisch, T.Koburger, B.Jürgen, S.Leja, M.Hecker und T.Schweder in BIOCHEMICA, Band 3, Seiten 5 bis 8 beschrieben. Demgegenüber besitzt die Detektion über Elektro-Chips einen weiteren Vorteil, nämlich die höhere Zuverlässigkeit der Daten, da diese gegenüber der RT-PCR deutlich geringere Schwankungsbreiten aufweisen.
  • Die Herstellung entsprechender elektronisch auswertbarer Chips wird beispielsweise in den Patentanmeldungen WO 00/62048 A2, WO 00/67026 A1 und WO 02/41992 beschrieben, deren Offenbarungsgehalt vollständig in die vorliegende Anmeldung einbezogen wird.
  • Die Funktionsweise elektrisch auslesbarer Chips einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann wie folgt beschrieben werden: Die genspezifischen Sonden sind auf an sich bekannte Weise kovalent an magnetische Beads gebunden, die sich in hierfür vorgesehenen Kammern der Chips befinden. Die spezifische Hybridisierung der entsprechenden mRNA an die jeweiligen Beads erfolgt in dieser Hybridisierungskammer, die temperierbar ist und von den betreffenden Lösungen durchspült werden kann. Die Beads werden in dieser Kammer durch einen Magneten festgehalten. Nach der Hybridisierung der RNA-Proben an die Beads-gebundenen DNA-Sonden erfolgt ein Waschschritt zur Beseitigung der nicht-gebundenen RNA, so daß in der Inkubationskammer nur noch spezifische Hybride vorhanden sind, und zwar gebunden an den magetischen Beads.
  • Nach dem Waschen wird eine Detektionssonde in die Inkubationskammer eingeleitet, die über eine Biotin-Extravidin-gebundene alkalische Phosphatase markiert ist. Diese Sonde bindet an eine zweite freie Region der hybridisierten mRNA. Dieses Hybrid wird anschließend erneut gewaschen und mit dem Substrat der alkalischen Phosphatase Para-Aminophenolphosphat (pAPP) inkubiert. Die enzymatische Reaktion in der Inkubationskammer führt zur Freisetzung des redoxaktiven Produkts para-Aminophenol (pAP). Dieses wird nun über den Red/Ox-Elektrode auf dem elektrischen Chip geleitet und das Signal zu einem Potentiostaten gesendet.
  • Eine System-spezifische Software (zum Beispiel MCDDE32) liest die erhaltenen Daten und die Ergebnisse können mit Hilfe eines weiteren Programms (zum Beispiel Origin) auf einem Computer ausgewertet und dargestellt werden.
  • Selbstverständlich ist dieser Prozeß sowohl hinsichtlich der technischen Gestaltung der Chips als auch der Auswertung variierbar. So kann beispielsweise die Nachweisreaktion auch durch eine andere, wegen des elektrischen Meßprinzips vorzugsweise jedoch eine Redoxreaktion erfolgen.
  • Eine Leistung der vorliegenden Erfindung besteht darin, Phosphatstoffwechsel-spezifische und insofern prozeßkritische Gene identifiziert und der Analyse über entsprechend gestaltete Biochips zugänglich gemacht zu haben. Der Vorteil von Chips gegenüber konventionellen Nachweismethoden besteht neben dem Zeitgewinn und der höheren Genauigkeit darin, daß mit der Bereitstellung mehrerer Sonden auf einem Träger gleichzeitig in derselben Probe die Aktivitäten von mehreren verschiedenen Genen nachgewiesen werden können und bei der hier beschriebenen Anwendung auf ein spezielles Problem ein solideres und detaillierteres Bild ergeben können, beispielsweise hisichtlich des Zeitpunkts, zu dem ein Phosphatmangel eingetreten ist.
  • Ein eigener Erfindungsgegenstand ist die Verwendung von Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden für mindestens drei der folgenden 47 Gene: htpG, cypX, ctaC, nasE, yrbE, yfkN, yhcR, yurI, Homolog zu dhaS (Homolog zu SEQ ID NO. 17), dhaS, phoB, phoD, tatCD, alsD, alsS, gdh, phy, spoIIAA, spoIIAB, cotE, spoIIGA, spoIIQ, spoVID, pstS, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), yvmA, Gen für eine vermutliche Acetoin-Reductase (Homolog zu SEQ ID NO. 53), Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), Gen für ein konserviertes hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yfkH, yfmQ, yhbD, yhbE, yvmC, yvnA, spoIIIAF, spoIIIAG, spoIIIAH, pstA, pstBA, pstBB, pstC, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93), gebunden an einen Nukleinsäure-bindenden Chip, zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus.
  • Wie oben erläutert sind diese 47 Gene so ausgewählt, daß sie ein Bild über die Situation des Phosphatstoffwechels des betrachteten Organismus liefern, weil sie wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben bei dem Übergang des grampositiven Bakteriums B. licheniformis in den Phosphatmangelzustand signifikant induziert werden. Eine vergleichbare Aussage ist auch für andere Organismen zu erwarten, die über die homologen Gene beziehungsweise Proteine mit im wesentlichen denselben stoffwechelrelevanten Eigenschaften verfügen.
  • Wie ebenfalls bereits ausführlich beschrieben, können derartige Genaktivitäten prinzipiell auf verschiedene Arten bestimmt werden, beispielsweise durch Northern-Hybridisierung. Die Analyse mithilfe eines Nukleinsäure-bindenden Chip, insbesondere eines oben beschriebenen, eröffnet jedoch die Möglichkeit, auf sehr effiziente Weise gleichzeitig mehrere Genaktivitäten zu bestimmen und dies zudem sehr zeitnah. Dadurch können die Stoffwechselveränderungen eines Organismus, der einen biologischen Prozeß durchläuft, zeitnah beobachtet und gegebenenfalls regulatorisch eingegriffen werden.
  • Die oben gemachten Ausführungen zu Nukleinsäure-bindenden Chips gelten für die hier bezeichneten Verwendungen der betreffenden Sonden entsprechend.
  • Entsprechend den oben gemachten Ausführungen sind folgende der soeben bezeichneten Verwendungen von Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden zunehmend bevorzugt:
    • – Verwendung von Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden, gebunden an einen Nukleinsäure-bindenden Chip, zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus, wobei es sich um Sonden für mindestens drei der folgenden 39 Gene handelt: cypX, ctaC, nasE, yrbE, yfkN, yhcR, yurI, Homolog zu dhaS (Homolog zu SEQ ID NO. 17), dhaS, phoB, phoD, tatCD, alsD, alsS, gdh, phy, spoIIAA, spoIIAB, cotE, spoIIGA, spoIIQ, spoVID, pstS, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), yvmA, Gen für eine vermutliche Acetoin-Reductase (Homolog zu SEQ ID NO. 53), Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), Gen für ein konserviertes hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yfkH, yfmQ, yhbD, yhbE, yvmC, yvnA, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93);
    • – entsprechende Verwendung, vorzugsweise für mindestens zwei der folgenden 14 Gene: cypX, yfkN, Homolog zu dhaS (Homolog zu SEQ ID NO. 17), phoB, phoD, alsD, alsS, gdh, phy, spoIIAB, Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), yfmQ, yvmC, yvnA;
    • – entsprechende Verwendung, besonders bevorzugt für mindestens eins der folgenden 6 Gene: cypX, phoB, phoD, alsS, yvmC, yvnA;
    • – entsprechende Verwendung, ganz besonders bevorzugt für eines der folgenden 3 Gene: phoB, yvmC, yvnA.
  • Entsprechend dem oben Gesagten handelt es sich vorzugsweise um erfindungsgemäße Verwendungen von mindestens 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26 28, 30, 35, 40, 45 oder 47 der namentlich genannten Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden Sonden.
  • Entsprechend dem oben Gesagten handelt es sich vorzugsweise um erfindungsgemäße Verwendungen von Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden zur Bestimmung einer Änderung im Phosphatstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus, vorzugsweise zur Detektion eines Phosphatmangelzustands.
  • Entsprechend dem oben Gesagten handelt es sich vorzugsweise um erfindungsgemäße Verwendungen von Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere der namentlich genannten Sonden von den Sequenzen abgeleitet sind, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 und 93 aufgeführt sind.
  • Einen eigenen Erfindungsgegenstand bilden Verfahren der Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus durch Einsatz eines erfindungsgemäßen, oben beschriebenen Nukleinsäure-bindenden Chips.
  • Diese Verfahren sehen prinzipiell so aus, daß während des Prozesses und ohne ihn zu unterbrechen, Proben des betrachteten Organismus entnommen und daraus die mRNA isoliert werden. Diese oder gegebenenfalls hiervon abgleitete Verbindungen wie beispielsweise cDNA werden über einen oben beschriebenen Nukleinsäure-bindenden Chip geleitet, welcher unter Berücksichtigung der oben angegebenen Verfahrensschritte – wie etwa ausreichende Inkubationszeit oder Abwaschen unspezifisch bindender Nukleinsäuren – behandelt und schließlich dem Detektionsgerät zugeführt wird. Solch ein Verfahrensprotokoll ist anhand des Beispiels elektrisch auswertbarer Chips prinzipiell in 1 dargestellt.
  • Die oben gemachten Ausführungen zu Nukleinsäure-bindenden Chips gelten für die hier bezeichneten Verfahren der Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus entsprechend.
  • Vorzugsweise handelt es sich um erfindungsgemäße Verfahren, wobei eine Änderung im Phosphatstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus bestimmt wird, vorzugsweise ein Phosphatmangelzustand.
  • Denn bezüglich dieses Einsatzgebiets sind die in den Beispielen beschriebenen und oben aufgeführten Gene ausgewählt worden. Ihre signifikante Induktion geht zumindest bei B. licheniformis mit dem Eintreten eines Phosphatmangelzustands einher, so daß diese mit den genannten Verfahren besonders zuverlässig detektiert werden können, und zwar nicht nur bei B. licheniformis sondern mit zunehmend besseren Erfolgsaussichten auch bei zunehmend verwandten Spezies (siehe oben). Zudem stellt diese Stoffwechselsituation im Lebenszyklus vieler Mikroorganismen einen kritischen Zeitpunkt dar. So war wie in den Beispielen erläutert mit dem jeweiligen Eintritt des Phosphatmangels immer auch ein Übergang in die stationäre Wachstumsphase verbunden. Verfahren, die diesen Zeitpunkt frühzeitig zu erkennen helfen, dienen dazu, diesen Übergang zu verzögern und insbesondere bei großtechnisch genutzten Fermentationen die Phase der Produktion eines Wertstoffs zu verlängern.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii oder B. lentus, und ganz besonders um B. licheniformis.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verfahren nicht minder bevorzugt, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E. coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei solche der namentlich genannten Sonden zum Einsatz kommen, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51, 53, 55, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 81, 83, 85, 87, 89, 91 oder 93 abgeleitet sind.
  • Hierunter sind wiederum diejenigen Verfahren bevorzugt, bei denen die hier genannten Sonden für die zuvor aufgeführten grampositiven Bakterien, insbesondere B. licheniformis eingesetzt werden, da diese Sequenzen aus ebendiesem Organismus isoliert worden sind und somit am erfolgreichsten auf diese Spezies angewendet werden können.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, vorzugsweise unter Einsatz mehrerer baugleicher Nukleinsäure-bindender Chips, besonders bevorzugt desselben Nukleinsäure-bindenden Chips.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind hierunter solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei der niedermolekularen chemischen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind alternativ auch solche erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
  • Einen eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen auch die Verwendungsmöglichkeiten erfindungsgemäßer Nukleinsäure-bindender Chips, wie sie oben eingehend beschrieben sind, zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus dar.
  • Die oben gemachten Ausführungen zu Nukleinsäure-bindenden Chips gelten für die hier bezeichneten Verwendungen der Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus entsprechend.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei eine Änderung im Phosphatstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus bestimmt wird, vorzugsweise ein Phosphatmangelzustand.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind hierunter solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind alternativ hierzu solche erfindungsgemäßen Verwendungen nicht minder bevorzugt, wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii oder B. lentus, und ganz besonders um B. licheniformis.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen nicht minder bevorzugt, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E. coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei solche der namentlich genannten Sonden zum Einsatz kommen, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51, 53, 55, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 81, 83, 85, 87, 89, 91 oder 93 abgeleitet sind.
  • Hierunter sind wiederum aus dem bereits genannten Grund diejenigen Verwendungen bevorzugt, bei denen die hier genannten Sonden für die zuvor aufgeführten grampositiven Bakterien, insbesondere B. licheniformis eingesetzt werden.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, vorzugsweise unter Einsatz mehrerer baugleicher Nukleinsäure-bindender Chips, besonders bevorzugt desselben Nukleinsäure-bindenden Chips.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind hierunter solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei es sich bei der niedermolekularen chemischen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.
  • Entsprechend dem oben Gesagten sind alternativ dazu solche erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
  • Der vorliegenden Erfindung wird zusätzlich durch die nachfolgenden Beispiele erläutert.
  • Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) werden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
  • Beispiel 1
  • Identifizierung der Gensonden durch Chipanalysen
  • Kultivierung von Bakterien und Probengewinnung
  • Zellen des Stamms Bacillus licheniformis DSM13 (erhältlich von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig; http://www.dsmz.de) wurden in Phosphat-limitiertem, synthetischem Belitsky-Minimalmedium (0,28 mM Endkonzentration) bei 37°C unter konstantem Schütteln bei 270 rpm kultiviert. Dieses Medium weist folgende Zusammensetzung auf: (1.) Grundmedium (pH 7,5): 0,015 M (NH4)2SO4, 0,008 M MgSO4 × 7H2O, 0,027 M KCl, 0,007 M Na3Citrat × 2H2O, 0,050 M Tris-HCl und 0,009 M Glutaminsäure; (2.) Supplemente: 0,2 M KH2PO4, 0,039 M L-Tryptophan-HCL, 1 M CaCl2 × 2H2O, 0,0005 M FeSO4 × 7H2O, 0,025 M MnSO4 × 4H2O und 20% (w/v) Glukose; und als (3.) Mediumsupplementierungsschema: 0,14 ml KH2PO4, 0,2 ml CaCl2, 0,2 ml FeSO4, 0,04 ml MnSO4, 1 ml Glukose. Alle Werte sind beziehen sich auf 100 ml Grundmedium.
  • Im Verlauf der Wachstumskurve wurden bei einer optischen Dichte bei 500 nm (OD500) von 0,4 die Kontrollprobe und in der transienten Wachstumsphase bei einer OD500 von ca. 0,8 eine weitere Probe („Übergang") entnommen. Das oben angegebene Supplementierungsschema für das BelitzkyMM ist so eingestellt, daß ab einer OD500 von 0,8 bis 1,0 Phosphatmangel eintritt und somit die stationäre Phase eingeleitet wird. Weitere Probennahmen erfolgten nach weiteren 30, 60 und 120 min. Die Proben wurden nach Entnahme sofort mit demselben Volumen, auf 0°C gekühlten Killing Puffer (20 mM NaN3; 20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 5 mM MgCl2) versetzt. Nach sofortigem Abzentrifugieren des Zellpellets für 5 min bei 4°C und 15.000 rpm wurde der Überstand verworfen und das Pellet entweder bei –80°C eingefroren oder sofort weiter aufgearbeitet.
  • Zellaufschluß
  • Der Zellaufschluß erfolgte mit dem „Hybaid RiboLyserTM Cell Disruptor" (Fa. Thermo Electron Corporation, Dreieich, Deutschland). Diese Methode basiert auf der mechanischen Zerstörung der Zellwand und der Zellmembran mit Hilfe von ca. 0,1 mm kleinen Glasperlen (Fa. Sartorius BBI, Melsungen, Deutschland). Die aufzuschließenden Zellen, die zuvor in Lysis-Puffer II (3 mM EDTA; 200 mM NaCl) resuspendiert worden waren, wurden zusammen mit den Glasperlen in ein Glasröhrchen gegeben. Zusätzlich wurde saures Phenol dazugegeben, um die Degradation der RNA durch RNasen zu vermeiden. Dieses Röhrchen wurde daraufhin in den RiboLyser eingespannt, wobei unter starkem Schütteln die Glassperlen mit den Zellen kollidierten, was den Zellaufschluß bewirkte.
  • Gesamt-RNA-Isolierung
  • Nach dem Zellaufschluß wird die RNA-haltige wäßrige Phase durch Zentrifugation von den Protein- und Zellfragmenten, der chromosomalen DNA und den Glassperlen getrennt und daraus die RNA mit Hilfe des Geräts KingFisher mL (Fa. Thermo Electron Corporation, Dreieich, Deutschland) unter Verwendung des MagNA Pure LC RNA Isolation Kit I (Fa. Roche Diagnostics, Penzberg, Germany) isoliert. Diese Aufreinigung basiert auf der Bindung der RNA an magnetische Glaspartikel in der Gegenwart von chaotropen Salzen, welche auch die Inaktivierung von RNasen bewirken. Dabei dienen die magnetischen Partikel als Transportmittel der RNA zwischen verschiedenen Reaktionsgefäßen, die mit Bindungs-, Wasch- und Elutionspuffern befüllt sind. Der hierfür genutzte KingFisher mL ist eine Art Pipettierroboter, der mit Hilfe von Magneten die Partikel mit der gebundenen RNA zwischen den Gefäßen hin- und hertransportiert und auch zum Mischen der Proben genutzt wird. Abschließend wird die RNA von den magnetischen Partikeln gelöst und liegt gereinigt vor.
  • RNA-Qualitäts- und -Quantitätskontrolle
  • An die Aufreinigung der RNA schließt sich die Qualitäts- und Quantitätskontrolle an. Der hierfür genutzte Apparat Agilent Bioanalyzer 2100 (Fa. Agilent Technologies, Berlin, Deutschland) ermöglicht die Analyse von RNA im Lab-on-a-Chip-Maßstab. Zusammen mit dem „RNA 6000 Nano Kit" von Agilent wird die Gesamt-RNA gelelektrophoretisch aufgetrennt und bietet somit die Möglichkeit der Untersuchung der Qualität in Hinblick auf Teilabbau und Verunreinigungen. Hierbei wird ribosomale RNA (16 S- und 23 S-rRNA) detektiert. Stellen diese sich als klare Banden dar, kann man davon ausgehen, daß die RNA im Verlauf der Bearbeitung nicht abgebaut wurde und somit intakt ist und in die nachfolgenden Untrsuchungen eingebracht werden kann. Zusätzlich wird dabei auch die genaue Konzentration bestimmt.
  • Transkriptomanalysen
  • Die Transkriptomanalysen wurden mit gesamtgenomischen B. licheniformis DSM13-DNA-Microarrays durchgeführt, die auf herkömmliche Weise (beispielsweise gemäß WO 95/11995 A1) hergestellt worden waren und über ein optisches System auswertbar sind. Auf diesen DNA Microarrays lag nahezu jedes Gen aus B. licheniformis in doppelter Ausführung vor, so daß zwei Proben parallel auf demselben Chip analysiert und die erhaltenen Werte gemittelt werden konnten.
  • Das Prinzip der vorgenommenen Messung besteht darin, daß die jeweiligen mRNA-Moleküle aus der entnommenen Probe in vitro über eine reverse Transkription in DNA umgeschrieben werden, wobei eines der zugesetzten Desoxyribonukleotide einen Farbmarker trägt. Diese markierten Moleküle werden dann mit den bekannten, auf bekannten Stellen des Chip liegenden Sonden hybridisiert und die jeweilige Stärke des an den betreffenden Stellen auf den Fluoreszenzmarker zurückzuführenden Signals optisch erfaßt. Bei Verwendung zweier verschiedener Fluoreszenzmarker für eine Kontrolle und für eine eigentlich zu untersuchende Probe, die gleichzeitig zur Hybridisierung gebracht werden und somit um die Bindung an die vorgelegte Sonde konkurrieren, gelangt man zu unterschiedlichen Farbwerten, die ein Maß für das Verhältnis der Konzentration der Kontrolle zur Konzentration der Probe liefern.
  • Für diese Markierung wurde dUTP gewählt, welches mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cyanin 3 oder mit Cyanin 5 markiert war. So wurden jeweils 25 μg Gesamt-RNA der Kontrolle (OD500 0,4) mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cyanin 3 (Fa. Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Deutschland) und 25 μg Gesamt-RNA der jeweiligen Streßprobe (transiente Phase, 30, 60 und 120 min) mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cyanin 5 (Fa. GE Healthcare, Freiburg, Deutschland) markiert. Die kompetitive Hybridisierung der beiden Proben auf dem herkömmlichen, gesamtgenomischen B. licheniformis-DSM13-DNA-Microarray erfolgte für mindestens 16 Stunden bei 42°C.
  • Nach dem Waschen der Arrays zur Entfernung unspezifischer Bindungen erfolgte die optische Auslesung der Arrays mit Hilfe des ScanArray® Express Laser Scanners (Fa. PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Rodgau-Jügesheim, Germany). Alle Hybridisierungen wurden wiederholt, wobei die Proben mit dem jeweiligen anderen Farbstoff markiert wurden (Dye-Swap-Verfahren). Die quantitative Auswertung der Arrays wurde unter Verwendung der Software ScanArray® Express (erhältlich von der Fa. PerkinElmer Life and Analytical Sciences Rodgau-Jügesheim, Deutschland) nach Herstellerangaben und unter Standard-Parametern durchgeführt.
  • Unter Zuhilfenahme der Kontrollen der Lucidea Score Card (Fa. GE Healthcare, Freiburg, Deutschland) wurden die Arrays normalisiert und evaluiert. Mit Hilfe dieser „Score Card", welche zur Kontrolle der Effizienz und Qualität der Hybridisierung dient, waren entsprechend den Herstellerangaben bekannte Kontroll-DNA und sogenannte Spikes in Form von Oligos auf das Array aufgebracht und in der Hybridisierung mit komplementären Sequenzen versetzt worden. Somit konnte man nach dem Scannen den Erfolg der Hybridisierung und des Einbaus der Farbstoffe kontrollieren. Die Kontrollen sollten in beiden Proben in gleicher Menge vorhanden sein und somit nach dem Scannen gelb erscheinen beziehungsweise eine Ratio zwischen beiden Kanälen von 1 aufweisen. Die Spikes sind für die jeweilige Probe spezifisch, und werden in verschiedenen Verdünnungen aufgebracht, das heißt sie erscheinen nach dem Scannen für die jeweilige Probe rot oder grün.
  • Für die Expression der Gene wurden Mittelwerte aus den zwei Hybridisierungen sowie die jeweiligen Standardabweichungen errechnet. Für eine signifikante Induktion oder eine signifikante Repression werden folgende Schwellenwerte für das Verhältnis der RNA Menge des jeweiligen Gens gegenüber dem Kontrollwert betrachtet: Als induziert gelten die Gene, deren RNA ein Verhältnis > 3 (das heißt mindestens eine Verdreifachung) aufweist; deutlich reprimiert sind Gene mit einem RNA-Verhältnis < 0,3 (das heißt einem Absenken auf weniger als 30%). Diese Resultate werden in Beispiel 2 aufgelistet.
  • Beispiel 2
  • In folgender Tabelle 1 sind alle in Beispiel 1 ermittelten 235 Gene von Bacillus licheniformis DSM13 aufgeführt, deren (mindestens den Faktor 3 betragende) Induzierung unter den Bedingungen des in Beispiel 1 beschriebenen Phosphatmangels beobachtet wurde. In den ersten beiden Spalten sind der jeweilige Name des abgeleiteten Proteins beziehungsweise (soweit vorhanden) dessen Abkürzung abgegeben; die „Bli-Nummer" entspricht dem „locus_tag" des unter dem Eintrag AE017333 (Basen 1 bis 4.222.645) in der Datenbank GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; httpa/www.ncbi.nlm.nih.gov; Stand 2.12.2004) zugänglichen Gesamtgenoms von B. licheniformis; anschließend folgen die zu den oben angegebenen Zeitpunkten beobachteten Faktoren zur Steigerung der Konzentration der jeweils zugehörigen mRNAs.
  • Tabelle 1: Die in Beispiel 1 ermittelten 235 Gene von Bacillus licheniformis DSM13, deren (mindestens den Faktor 3 betragende) Induzierung unter Phosphatmangel beobachtet wurde (Erläuterungen: siehe Text).
    Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Beispiel 3
  • In folgender Tabelle 2 sind alle in Beispiel 1 ermittelten Gene von Bacillus licheniformis DSM13 aufgeführt, deren Induzierung unter den Bedingungen des in Beispiel 1 beschriebenen Phosphatmangels zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte mindestens den Faktor 10 betragen hat. Dies sind insgesamt 47. Die Spaltenbezeichnungen sind dieselben wie im vorangegangenen Beispiel. Zusätzlich sind in der ersten Spalte die Sequenznummern angegeben, die die jeweiligen DNA-beziehungsweise Aminosäuresequenzen in dem zur vorliegenden Anmeldung gehörenden Sequenzprotokoll tragen. Besonderheiten der jeweiligen Sequenzen, die im Sequenzprotokoll als freier Text auftauchen, sind unter der Rubrik Genname/Genfunktion ergänzt.
  • Tabelle 2: Die in Beispiel 1 ermittelten 47 Gene von Bacillus licheniformis DSM13, deren Induzierung durch Phosphatmangel zu irgendeinem der gemessenen Zeitpunkte mindestens den Faktor 10 betragen hat (Erläuterungen: siehe Text).
    Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Beispiel 4
  • Real-Time-RT-PCR-Quantifizierung ausgewählter Gene
  • Mit Hilfe der Real-Time-RT-PCR ist es möglich, die absoluten Molekülzahlen von spezifischen Transkripten in einer Probe zu ermitteln. Es wurde der LightCycler (Fa. Roche Diagnostics, Penzberg, Deutschland) in Verbindung mit dem "SYBR Green I" Kit (Fa. Roche Diagnostics) genutzt. Diese Methode basiert auf der Detektion der Bindung des fluoreszierenden Farbstoffs an doppelsträngige DNA. Die Quantifizierung der spezifischen mRNA-Moleküle erfolgte wie in Tobisch et al. (2003; Quantification of Bacterial mRNA by One-Step RT-PCR Using the LightCycler System; BIOCHEMICA, Band 3, Seiten 5 bis 8) beschrieben, wobei für jede zu untersuchende mRNA eine externe Standardkurve erstellt wurde.
  • Dazu wurden Verdünnungen bekannter Konzentrationen von In-vitro-Transkripten der in Beispiel 1 ermittelten und Beispiel 2 aufgelisteten mRNA mit Hilfe des LightCyclers gemessen und dann unter Verwendung der gerätespezifischen Software die Standardkurve erstellt. Dazu mußten im Vorfeld für jede zu untersuchende mRNA spezifische Primer ausgewählt werden (mit Hilfe der Software „Array Designer"; erhältlich von der Firma PREMIER Biosoft International, Palo Alto, USA), die eine Synthese von In-vitro-Transkripten sowie die PCR-Amplifikation im LightCycler ermöglichen.
  • Nach Herstellung der externen Standardkurve konnte mit der Messung im LightCycler begonnen werden. Für die Messungen wurden zwei unterschiedliche Verdünnungen für jede zu analysierende Probe eingesetzt. Im LightCycler-Lauf wurde dann mit den jeweiligen Primern das spezifische Transcript amplifiziert und die Einlagerung des Farbstoffs gemessen.
  • Unter Verwendung der LightCycler-Software sowie des auf der Webseite http://molbiol.ru/ger/scripts/01_07.html zugänglichen Skripts (2.12.2004) konnte die genaue Molekülzahl für ausgewählte Transkripte ermittelt werden. Mit den auf diese Weise erhaltenen Werten und deren Relationen zueinander wurden für die ausgewählten Transkripte die in den Tabellen 1 und 2 angegebenen Induktionswerte bestätigt.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1: Schematische Darstellung des at line-Monitoring eines Bioprozesses mit erfindungsgemäßen elektrischen DNA-Chips
  • Die zeitnahe Überwachung des Bioprozesses geschieht vorteilhafterweise über folgende Arbeitsschritte:
  • 1
    Probennahme, beispielsweise aus der Fermentation eines Mikroorganismus;
    2
    Zellaufschluß über Routine-Methoden;
    3
    RNA-Isolierung über Routine-Methoden;
    4
    Hybridisierung auf einem erfindungsgemäß mit Nukleinsäuren (beispielsweise DNA) oder Nukleinsäure-Analoga (beispielsweise schwer hydrolysierbaren, analog aufgebauten Verbindungen) beladenen Chip;
    5
    Erfassung der elektrischen Signale eines entsprechend konstruierten Elektro-Chips; alternativ wäre auch die Aufnahme optischer Signale von einem optischen DNA-Chip möglich;
    6
    Vorzugsweise Rechner-gestützte Datenauswertung.
  • Bei Einsatz elektrischer Chips ergibt sich nach derzeitigem Entwicklungsstand eine ungefähre Gesamtanalysenzeit von weniger als 2 h, bei Einsatz konventioneller optischer DNA-Chips von ca. 12 h.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (45)

  1. Nukleinsäure-bindender Chip, dotiert mit Sonden für mindestens drei der folgenden 47 Gene: htpG, cypX, ctaC, nasE, yrbE, yfkN, yhcR, yurI, Homolog zu dhaS (Homolog zu SEQ ID NO. 17), dhaS, phoB, phoD, tatCD, alsD, alsS, gdh, phy, spoIIAA, spoIIAB, cotE, spoIIGA, spoIIQ, spoVID, pstS, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), yvmA, Gen für eine vermutliche Acetoin-Reductase (Homolog zu SEQ ID NO. 53), Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), Gen für ein konserviertes hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yfkH, yfmQ, yhbD, yhbE, yvmC, yvnA, spoIIIAF, spoIIIAG, spoIIIAH, pstA, pstBA, pstBB, pstC, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93), wobei die Gesamtzahl aller Phosphatmangel-spezifischen unterschiedlichen Sonden nicht über 100 liegt.
  2. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 1, dotiert mit Sonden für mindestens drei der folgenden 39 Gene: cypX, ctaC, nasE, yrbE, yfkN, yhcR, yurI, Homolog zu dhaS (Homolog zu SEQ ID NO. 17), dhaS, phoB, phoD, tatCD, alsD, alsS, gdh, phy, spoIIAA, spoIIAB, cotE, spoIIGA, spoIIQ, spoVID, pstS, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), yvmA, Gen für eine vermutliche Acetoin-Reductase (Homolog zu SEQ ID NO. 53), Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), Gen für ein konserviertes hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yfkH, yfmQ, yhbD, yhbE, yvmC, yvnA, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93), vorzugsweise für mindestens zwei der folgenden 14 Gene: cypX, yfkN, Homolog zu dhaS (Homolog zu SEQ ID NO. 17), phoB, phoD, alsD, alsS, gdh, phy, spoIIAB, Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), yfmQ, yvmC, yvnA, besonders bevorzugt für mindestens zwei der folgenden 6 Gene: cypX, phoB, phoD, alsS, yvmC, yvnA, ganz besonders bevorzugt für eines der folgenden 3 Gene: phoB, yvmC, yvnA.
  3. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 1 oder 2, dotiert mit mindestens 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 28, 30, 35, 40, 45 oder 47 der namentlich genannten Sonden.
  4. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Gesamtzahl aller unterschiedlichen Sonden zunehmend bevorzugt nicht über 100, 90, 80, 70, 60 oder 50 liegt.
  5. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei den namentlich genannten Sonden um solche handelt, die auf die betreffenden Gene aus dem für den Bioprozeß gewählten Organismus ansprechen, vorzugsweise solche, die von Genen dieses Organismus abgeleitet sind.
  6. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
  7. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 6, wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
  8. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 6, wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii oder B. lentus, und ganz besonders um B. licheniformis.
  9. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 6, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E. coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5a, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
  10. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere der namentlich genannten Sonden von den Sequenzen abgeleitet sind, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 und 93 aufgeführt sind.
  11. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 10, zusätzlich dotiert mit mindestens einer Sonde für ein zusätzliches Gen, insbesonderen einem solchen, das in einem Stoffwechsel-bedingten Zusammenhang zu dem oder den prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Genen) steht, ganz besonders für eines von diesen oder dieses selbst.
  12. Nukleinsäure-bindender Chip nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Gen um das für ein gewerblich einsetzbares Protein handelt, insbesondere um eine Amylase, Cellulase, Lipase, Oxidoreduktase, eine Hemicellulase oder Protease, oder um eines, das auf einem Syntheseweg für eine niedermolekulare chemische Verbindung liegt oder diesen wenigstens zum Teil reguliert.
  13. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei eine, bevorzugt mehrere der namentlich genannten Sonden einzelsträngig, in Form des codogenen Strangs bereitgestellt werden.
  14. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei eine, bevorzugt mehrere der namentlich genannten Sonden in Form einer DNA, vorzugsweise eines Nukleinsäureanalogs zur Verfügung gestellt werden.
  15. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei eine, bevorzugt mehrere der namentlich genannten Sonden Genbereiche umfassen, die von dem zu untersuchenden Organismus in mRNA umgeschrieben werden, insbesondere die Genbereiche, die nahe dem 5'-Ende der mRNA liegen.
  16. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei eine, bevorzugt mehrere der namentlich genannten Sonden auf Fragmente der betreffenden Nukleinsäuren ansprechen, insbesondere auf solche, die in der betreffenden mRNA, bezogen auf die jeweilige Gesamt-mRNA ein geringes Maß an Sekundärfaltung aufweisen.
  17. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei eine, bevorzugt mehrere der namentlich genannten Sonden eine Länge von weniger als 200 Nukleotiden, vorzugsweise von weniger als 100 Nukleotiden, besonders bevorzugt von 20 bis 60 Nukleotiden, ganz besonders bevorzugt von 45 bis 55 Nukleotiden aufweisen.
  18. Nukleinsäure-bindender Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei durch die Bindung der mRNA an die betreffende namentlich genannte Sonde ein elektrisches Signal ausgelöst wird.
  19. Verwendung von Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden für mindestens drei der folgenden 47 Gene: htpG, cypX, ctaC, nasE, yrbE, yfkN, yhcR, yurI, Homolog zu dhaS (Homolog zu SEQ ID NO. 17), dhaS, phoB, phoD, tatCD, alsD, alsS, gdh, phy, spoIIAA, spoIIAB, cotE, spoIIGA, spoIIQ, spoVID, pstS, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), yvmA, Gen für eine vermutliche Acetoin-Reductase (Homolog zu SEQ ID NO. 53), Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), Gen für ein konserviertes hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yfkN, yfmQ, yhbD, yhbE, yvmC, yvnA, spoIIIAF, spoIIIAG, spoIIIAH, pstA, pstBA, pstBB, pstC, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93), gebunden an einen Nukleinsäure-bindenden Chip, zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei es sich um Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Analogon-Sonden für mindestens drei der folgenden 39 Gene handelt: cypX, ctaC, nasE, yrbE, yfkN, yhcR, yurI, Homolog zu dhaS (Homolog zu SEQ ID NO. 17), dhaS, phoB, phoD, tatCD, alsD, alsS, gdh, phy, spoIIAA, spoIIAB, cotE, spoIIGA, spoIIQ, spoVID, pstS, Gen für ein vermutliches Benzoat-Transportprotein (Homolog zu SEQ ID NO. 49), yvmA, Gen für eine vermutliche Acetoin-Reductase (Homolog zu SEQ ID NO. 53), Gen für eine vermutliche Aromaten-spezifische Dioxygenase (Homolog zu SEQ ID NO. 55), Gen für eine vermutliche Decarboxylase/Dehydratase (Homolog zu SEQ ID NO. 57), Gen für ein konserviertes hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 59), Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 63), Gen für ein hypothetisches Protein (Homolog zu SEQ ID NO. 65), yfkN, yfmQ, yhbD, yhbE, yvmC, yvnA, Gen für eine vermutliche Ribonuclease (Homolog zu SEQ ID NO. 93), vorzugsweise für mindestens zwei der folgenden 14 Gene: cypX, yfkN, Homolog zu dhaS (Homolog zu SEQ ID NO. 17), phoB, phoD, alsD, alsS, gdh, phy, spoIIAB, Gen für eine vermutliche Phosphatase (Homolog zu SEQ ID NO. 61), yfmQ, yvmC, yvnA, besonders bevorzugt für mindestens eins der folgenden 6 Gene: cypX, phoB, phoD, alsS, yvmC, yvnA, ganz besonders bevorzugt für eines der folgenden 3 Gene: phoB, yvmC, yvnA.
  21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20 von mindestens 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 28, 30, 35, 40, 45 oder 47 der namentlich genannten Sonden.
  22. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 21 zur Bestimmung einer Änderung im Phosphatstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus, vorzugsweise zur Detektion eines Phosphatmangelzustands.
  23. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere der namentlich genannten Sonden von den Sequenzen abgeleitet sind, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 und 93 aufgeführt sind.
  24. Verfahren der Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus durch Einsatz eines Nukleinsäure-bindenden Chips nach einem der Ansprüche 1 bis 18.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei eine Änderung im Phosphatstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus bestimmt wird, vorzugsweise ein Phosphatmangelzustand.
  26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
  28. Verfahren nach Anspruch 26, wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii oder B. lentus, und ganz besonders um B. licheniformis.
  29. Verfahren nach Anspruch 26, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E. coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
  30. Verfahren nach Anspruch 29 oder vorzugsweise 28, wobei solche der namentlich genannten Sonden zum Einsatz kommen, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51, 53, 55, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 81, 83, 85, 87, 89, 91 oder 93 abgeleitet sind.
  31. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 30, wobei die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, vorzugsweise unter Einsatz mehrerer baugleicher Nukleinsäure-bindender Chips, besonders bevorzugt desselben Nukleinsäure-bindenden Chips.
  32. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 31, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei es sich bei der niedermolekularen chemischen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.
  34. Verfahren nach Anspruch 32, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
  35. Verwendung eines Nukleinsäure-bindenden Chips nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus.
  36. Verwendung nach Anspruch 35, wobei eine Änderung im Phosphatstoffwechsel des den biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus bestimmt wird, vorzugsweise ein Phosphatmangelzustand.
  37. Verwendung nach Anspruch 35 oder 36, wobei es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
  38. Verwendung nach Anspruch 37, wobei es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
  39. Verwendung nach Anspruch 37, wobei es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. globigii oder B. lentus, und ganz besonders um B. licheniformis.
  40. Verwendung nach Anspruch 37, wobei es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen E. coli oder Klebsiella handelt, insbesondere um Derivate von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
  41. Verwendung nach Anspruch 40 oder vorzugsweise 39, wobei solche der namentlich genannten Sonden zum Einsatz kommen, die von den im Sequenzprotokoll angegebenen SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 43, 45, 49, 51, 53, 55, 59, 61, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 81, 83, 85, 87, 89, 91 oder 93 abgeleitet sind.
  42. Verwendung nach einem der Ansprüche 35 bis 41, wobei die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, vorzugsweise unter Einsatz mehrerer baugleicher Nukleinsäure-bindender Chips, besonders bevorzugt desselben Nukleinsäure-bindenden Chips.
  43. Verwendung nach einem der Ansprüche 35 bis 42, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
  44. Verwendung nach Anspruch 43, wobei es sich bei der niedermolekularen chemischen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.
  45. Verwendung nach Anspruch 43, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
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