NO332049B1 - Fremgangsmate for isolasjon og pavisning av celler ved binding til en fast baerer med en uspesifikk polysakkaridligand, samt et sett for isolering av mikroorganismer fra en prove. - Google Patents

Fremgangsmate for isolasjon og pavisning av celler ved binding til en fast baerer med en uspesifikk polysakkaridligand, samt et sett for isolering av mikroorganismer fra en prove. Download PDF

Info

Publication number
NO332049B1
NO332049B1 NO20023474A NO20023474A NO332049B1 NO 332049 B1 NO332049 B1 NO 332049B1 NO 20023474 A NO20023474 A NO 20023474A NO 20023474 A NO20023474 A NO 20023474A NO 332049 B1 NO332049 B1 NO 332049B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
well
added
dilution
cells
coated
Prior art date
Application number
NO20023474A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20023474D0 (no
NO20023474L (no
Inventor
Unn Hilde Refseth
Tone Elise Kolpus
Original Assignee
Genpoint As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genpoint As filed Critical Genpoint As
Publication of NO20023474D0 publication Critical patent/NO20023474D0/no
Publication of NO20023474L publication Critical patent/NO20023474L/no
Publication of NO332049B1 publication Critical patent/NO332049B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Abstract

Det beskrives en fremgangsmåte for å isolere celler fra en prøve, hvilken fremgangsmåte omfatter å binde cellene til en fast bærer ved hjelp av en ikke- spesifikk ligand som er immobilisert på den faste bærer, spesielt en fremgangsmåte ved isolasjon av mikroorganismer fra en prøve. Foretrukne ligander for bruk i slike fremgangsmåter omfatter karbohydrater og derivater derav. Dessuten beskrives et sett for å isolere mikroorganismer.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for isolasjon av mikroorganismer som foreligger en prøve hvor fremgangsmåten utføres som angitt i krav 1, spesielt en fremgangsmåte for å isolere bakterier som foreligger en prøve, som angitt i krav 3.
Hovedparten av dagens teknikker som forsøker å analysere prøver kvalitativt og kvantitativt for nærværet av mikroorganismer, er rettet mot identifikasjon av en bestemt mikroorganisme, for eksempel et patogen. En immunomagnetisk atskillelse av stammer av Listeria og Salmonella fra mat og kliniske prøver er blitt beskrevet (se for eksempel Skjerve et al. Appl. Environ. Microbiol. 1990, 3478-3481). Slike teknikker baserer seg på anvendelse av ligander, generelt antistoffer, som er spesifikke for den aktuelle mikroorganisme. Ettersom den baserer seg på anvendelse av spesifikke ligander, kan en immunomagnetisk atskillelse kun an-vendes i situasjoner hvor man søker å identifisere en bestemt mikroorganisme, og ikke hvor man ønsker en generell test for mikroorganisme som eventuelt foreligger. En immunomagnetisk atskillelse vil ikke uten videre plukke opp uante mikroorganismer.
Det finnes situasjoner, for eksempel når man analyserer miljøprøver, så som vannprøver, hvor det kan være ønskelig å erholde et fullstendig bilde av de forskjellige arter av mikroorganismer som foreligger, eller en bedømmelse av den samlede konsentrasjon av mikroorganismer. Det kan settes grenser for den samlede mengde bakterier som får foreligge i vanntilførselen, som er uavhengig av tanker om nærværet av bestemte bakterier. En identifikasjon av brede klasser av mikroorganismer i for eksempel en elv eller et vann, kan gi nyttig informasjon om tilstanden av dette vann, mengden av næringsstoffer, utsildrede jordbruk-kjemikalier osv.
Hvis det tilveiebringes en generell metode for å isolere mikroorganismer fra en prøve, kan det deretter bekvemt ut-føres en identifikasjon av de bestemte mikroorganismer som forligger i et påfølgende trinn. Nukleinsyrebaserte assayer kunne bekvemt brukes for å identifisere bestemte mikroorganismer.
Det er fra WO 91/06007 Al kjent en metode for å isolere mikroorganismer fra en prøve ved å binde disse til en fast bærer ved hjelp av en karbohydratreseptor immobilisert på bæreren samt et diagnostisk kit for å utføre metoden.
Det er videre fra US 4.935.147 A kjent en metode for å separere ikke-magnetiske partikler, som celler og mikroorganismer, fra en flytende prøve ved å binde disse til magnetiske partikler. Bindingene av cellene og mikroorganismene er en ikke-spesifikk, kjemisk binding som skjer ved hjelp av for eksempel kitosan eller heparin.
I US 5.696.000 A er det beskrevet en metode for å detektere og fjerne mikroorganismer i en prøve ved å binde disse til et uløselig eller løselig substrat ved hjelp av en reseptor omfattende karbohydratelementer.
Fra US 4.543.328 A er det kjent en metode for deteksjon og fjerning av patogener som bakterier, sopp og virus i blod.
Fremgangsmåter som brukes i dag for å bedømme den samlede mengde mikroorganismer som foreligger i en prøve, eller for å isolere mikroorganismer fra prøven for nærmere analyse, baserer seg på nokså grove separasjonsteknikker omfattende filtrering og/eller sentrifugering og dyrkning på agarpla-ter. En bestemmelse av den samlede bakteriekonsentrasjon kan utføres ved strømningscytometri eller filtrering og dyrkning på et generelt medium i en petriskål for eksempel. Disse fremgangsmåter kan ta flere dager, og er nokså komplekse og unøyaktige. Spesielle problemer har blitt observert med konvensjonelle metoder som brukes for å analysere matprøver ettersom disse inneholder mye fastmateriale (klumper og fettpartikler) som har en tendens til å blokkere filtre, og som etter sentrifugering danner en pellet hvor bakteriene er stuet sammen og ikke er tilgjengelig for spaltning eller binding til antistoff.
Det finnes derfor et behov for en fremgangsmåte som kan isolere et antall forskjellige typer av mikroorganismer fra en prøve, fortrinnsvis i et enkelt trinn, som kan utføres raskt og bekvemt.
Foreliggende oppfinnelse tar for seg disse krav, og dermed tilveiebringes i en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for isolasjon av mikroorganismer fra en prøve, hvilken fremgangsmåte omfatter å binde mikroorganismene til en fast bærer ved hjelp av en ikke-spesifikk ligand som er immobilisert på den faste bærer, hvor nevnte ligand er et polysakkarid omfattende mannose og/eller galaktose og/eller et derivat derav og hvor nevnte polysakkarid omfatter 13 eller flere kovalent bundne monosakkaridenheter.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dermed, ved utnyt-telse av vekselvirkingene mellom ikke-spesifikke ligander som er festet på faste bærere og bindingspartnere for ligandene (reseptorer) som finnes på overflaten av mikroorganismer, en generell atskillelsesmetode som muliggjør innfanging av brede klasser av mikroorganismer. Ettersom kjernepunktet av foreliggende oppfinnelse er den ikke-spesifikke vekselvirkning mellom den immobiliserte ligand og mikroorganismene, er det når det heri vises til å "isolere mikroorganismer" ment å beskrive en isolasjon av mikroorganismer på en ikke-typespesifikk og ikke-genus spesifikk måte. Med andre ord kan den immobiliserte ligand binde flere genera av mikroorganismer, minst 2 forskjellige genera, fortrinnsvis 3 eller flere, mer foretrukket minst 5 eller 7 forskjellige genera, mest foretrukket minst 10 eller til og med 14 eller flere forskjellige genera.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en generell fremgangsmåte for å isolere mikroorganismer, spesielt bak terier, fra de andre bestanddeler i en prøve. Fremgangsmåten er "generell" i den forstand at ingen bestemt bakteriell art er tilsiktet, men at det oppnås et grovt atskillelsessystem for å få informasjon om den samlede mikroorganismepopulasjon eller for å forenkle et andre trinn hvor artsspesifikk informasjon erholdes, for eksempel på nukleinsyrenivå ved bruk av artsspesifikke prober.
Mikroorganismene "isoleres" i og med at de bindes til den faste bærer og deretter kan atskilles fra resten av prøven ved å fjerne den faste bærer med mikroorganismene bundet på seg eller ved å fjerne, for eksempel ved avrenning, resten av prøven. Når den faste bærer er magnetisk, er en manuipulasjon av bærer/mikroorgansime-komplekset spesielt bekvemt.
Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes til å isolere et bredt utvalg av mikroorganismer omfattende alle slike mikroorganismer som kan bindes til eukaryotiske celler, omfattende protister, alger, protozoer og sopp samt også mycoplasmaer og alle bakterier og viruser. Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan brukes ved isolasjon av eukaryotiske parasitter, spesielt slike som har evnen til å binde de komplekse polysakkarider som finnes på humane celler (eller andre vertsorganismer). Slike eukaryotiske parasitter omfatter Kryptosporidium, Entamoeba histolytika og malariaparasitten. Derfor skal henvisningene heri til "mikroorgansimer" forstås å omfatte slike parasitter.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er spesielt egnet for å isolere bakterier. Klassifikasjon av bakterier er en kompleks og stadig skiftende vitenskap, men "sanne" bakterier (eubakterier) kan deles opp i et antall deler (Bergey's Manual of Determinative Biology), for eksempel fototrofiske bakterier, glidende bakterier, bemantelede bakterier og Gram-positive kokker. Hver del kan i sin tur deles opp i en eller flere ordner med familier og genera innen disse ordnene. Bakterier er flere enn ett genus, en familie eller en orden eller til og med en del, kan isoleres ved bruk av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. En virksom atskillelse fra en prøve av bakterier fra noen av eller alle de følgende familier og genera av bakterier kan oppnås ved bruk av foreliggende fremgangsmåte: Aeromonas, Bacillus, Campylobacter, Citrobacter, Clostridium, Enterobakter, Escherichia (patogene og ikke-patogene), Hafnia, Klebsiella, Listeria, Proteus, Salmonella, Shewanella, Serratia, Shigella, Vibrio, Yersinia, Morganella, Photobacterium, Streptococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus, Brochothrix.
Fremgangsmåten kan brukes til å samtidig isolere bakterier og andre typer mikroorganismer, for eksempel alger, protozoer, sopp eller viruser.
Under visse omstendigheter kan prøven eventuelt kun inne-holde et begrenset antall bakterietyper, og fremgangsmåten kan eventuelt føre til at kun noen få bakteriearter, eller til og med bare en eller to arter, finnes og dermed isoleres fra prøven. En slik fremgangsmåte er allikevel ikke noen spesifikk isolasjonsmetode, ettersom den immobiliserte ligand har evnen til å bindes til et bredt utvalg av bakterier, selv om den tilgjengelige bakteriellpopula-sjon er nokså begrenset.
Det faktum at man ikke trenger å velge noe bestemt fast bærer-ligand-kompleks for å utføre en gitt isolasjonsmetode, gir en betydelig fordel med hensyn til fleksibilitet og kostnader, ettersom en og samme faste bærer med påfestet ligand kan brukes i et bredt utvalg av isolasjons/separa-sjonsmetoder. Det er derfor de generelle bindingsevner av den faste bærer som er spesielt fordelaktige.
Fortrinnsvis vil fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen føre til at en stor andel av mikroorganismene (for eksempel bakterier) som foreligger i prøven, isoleres, både hva angår andelen av alle bakterieceller som foreligger, og andelen av bakterietyper. Dermed vil fortrinnsvis minst 30%, mer foretrukket minst 50%, mest foretrukket minst 70 eller 80% av mikroorganismene i prøven bindes til den faste bærer. Så klart vil prosentdelen mikroorganismer i prøven som bindes, avhenge av hvilken mengde fast bærer som til-føres til prøven samt forholdet mellom ligand og mikroorganisme. For de ovennevnte prosentdeler antas at det foreligger et overskudd fast bærer og ligand i blandingen.
Sett fra et annet synspunkt, vil representanter fra minst 20% av de forskjellige (for eksempel bakterielle) typer som foreligger, fortrinnsvis isoleres, mer foretrukket representanter fra minst 30 eller 40%, mest foretrukket minst 50%, spesielt minst 60 eller 70% eller til og med minst 80% av de forskjellige (for eksempel bakterielle) materialer som foreligger, bindes til den faste bærer.
Den "ikke-spesifikke" ligand vil være en ligand, som, slik det ble nevnt overfor, har evnen til å bindes til flere enn en mikroorganismetype og/eller bakteriell genus, fortrinnsvis til flere enn 2 eller 3, mer foretrukket til flere enn 5 eller 7, for eksempel flere enn 10 eller 14 forskjellige genera. Det forefinnes en vekselvirkning mellom liganden og dennes bindingspartner(e) på overflaten av mikroorganismen som er ansvarlig for bindingen, og det er ikke slik at det helt enkelt foreligger en generell tiltrekning eller forbindelse mellom cellene og den faste bærer, slik som kan være tilfellet når celler bindes ved felling. Den ikke-spesifikke karakter av liganden viser ikke til det faktum at den har evnen til å bindes eller forbindes vilkårlig med enheter på overflaten av mikroorganismer, men det at dens bindingspartner(e) ikke er spesifikke for noen bestemt type eller art av mikroorganisme. Liganden kan derfor anses å være en generell bindingsligand.
Ettersom det finnes et relativt bredt utvalg av egnede bindingspartnere blant forskjellige mikroorganismer, spesielt blant forskjellige genera av bakterier, tilveiebrin ges en nokså generell og dermed ikke-spesifikk isolasjonsmetode. Selv om liganden kan ha en eller flere spesifikke bindingspartnere, er den allikevel "ikke-spesifikk" i den forstand at den har evnen til å bindes til et bredt utvalg av forskjellige bakterier, som alle bærer en egnet bindingspartner. Selv om man ikke ønsker å binde seg til noe bestemt teori, virker det som om et bredt utvalg av forskjellige bindingspartnere, som i og for seg vanligvis er typespesifikke, har evnen til å bindes til samme ligand, hvorved det tilveiebringes en atskillelsesmetode som ikke er typespesifikk. Typespesifikke lektiner har evnen til å tilveiebringe et ikke-typespesifikt atskillelsessystem med karbohydratbaserte ligander.
Bindingspartnerne er vanligvis proteiner på overflaten av mikroorganismene og kan variere fra art til art. Man vet ikke så mye om bindingspartnerne. Men oppfinnerne har allikevel kunnet identifisere egnede ligander for bruk i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen.
Liganden er et polysakkarid omfattende mannose og/eller galaktose og/eller et derivat derav, og dermed er antistoffer og derivater og fragmenter derav utelukket. I mot-setning til de ikke-spesifikke ligander benyttet ifølge foreliggende fremgangsmåte, har slike proteinholdige ligander evnen til meget spesifikke (det vil si familie-, spesielt artsspesifikke) vekselvirkninger med for eksempel proteiner på celleoverflater.
Foretrukne ligander er karbohydrater som nevnt ovenfor omfattende monosakkarider, oligosakkarider (omfattende disakkarider og trisakkarider) og polysakkarider.
Spesielt foretrukne er oligosakkarider og polysakkarider som er polymerer av monosakkaridmonomerer, for eksempel polymerer som innlemmer de ovennevnte monosakkaridmonomerer, omfattende 13 eller flere kovalent bundne monosakkaridenheter.
Polysakkarider omfatter 13 eller flere kovalent bundne monosakkaridenheter som kan være like eller forskjellige, og som kan være rettkjedet eller forgrenet, fortrinnsvis forgrenet. Egnede polysakkarider vil være rike på mannose, galaktose, glukose, fruktose eller uronsyre, for eksempel galaktomannan-polysakkarid (heri benevnt GUM eller GUM 1)
(Sigma G-0753) som antas å være en rettkjedet polymer av mannose med en galaktosegren på hver fjerde mannose.
Polysakkarider som utgjøres av mannose- og galaktose-del-enheter, er en foretrukket type ligand, og et ytterligere
eksempel er guar som har en (3-1, 4-bundet rettkjedet mannose grunnstrukturkjede med en galaktose side-enhet på cirka annen hver enhet i en 1,6-a-binding. Forholdet mellom mannose og galaktose er fra cirka 1,8:1 til cirka 2:1; og guaren
som brukes i eksperimentene beskrives heri, er fra Sigma, katalogreferansenummer G1429.
Andre polysakkarider omfatter gummi arabikum (Sigma G 9752) som antas å være en forgrenet polymer av galaktose, rhamnose, arabionse og glukuronsyre, og Karayagummi (Sigma G 0503) som antas å være en delvis acetylert polymer av galaktose, rhamnose og glukuronsyre, samt homo-polysakkaridet mannan, som består av mannose enheter.
Sukkerderivater som er egnede ligander, omfatter heparin, heparansulfat, dekstransulfat og "carrageenan" (forskjellige former). Sulfaterte sukkere er en foretrukket klasse sukkerderivater.
Oppfinnerne har funnet at ligander som er basert på molekyler som er næringsstoffer for mikroorganismer, såsom karbohydrater, er egnet for atskillelse. Det var et mål for foreliggende fremgangsmåte å tilveiebringe isolasjonssystem som i tilegg til å benytte seg av reseptor/ligand-veksel-virkinger, dro nytte av den proaktive respons av bakterier på nærværet av næringsstoffer i mediene for å forsterke innfangingen av mikroorganismer. Andre næringsstoffer for mikroorganismer som dermed kan brukes som ikke-spesifikke ligander i henhold til fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter vitaminer såsom nikotinsyre, ribo-flavin, tiamin, pyridoksin, pantotensyre, folinsyre, biotin og kobamid og jern-chelaterende molekyler/forbindelser såsom hemin, laktoferrin, transferrin, hemoglobin og sidero-forer såsom aerobaktin, ferrikrom (Sigma F8014), ferrien-terochelin, enterobaktin og ferriksanin.
En fast bærer som har en ligand immobilisert på seg, hvilken ligand har evnen til å bindes til celler (for eksempel mikroorganismer) på en ikke-spesifikk måte, utgjør dermed et ytterligere trekk av foreliggende oppfinnelse. "Ikke-spesifikk" har den ovennevnte betydning (det vil si ikke celletype- eller artsspesifikt, men fortsatt avhenger av vekselvirkninger med en bindingspartner), og egnede ligander beskrives heri under henvisning til fremgangsmåten.
I sammenheng med undersøkelsen av den fukose-følsomme og mannose-følsomme hemagglutinasjon av bakterie Vibrio cho-lera, ble L-fukose og D-mannose kovalent bundet til agaroseperler (Sanchez et al. APMIS (1990) 98 353-357) og dermed er disse faste bærer-ligand-komplekser ikke omfattet innen rammen for foreliggende oppfinnelse. Dette tidligere arbeid undersøkte en meget spesifikk vekselvirkning omfattende kun en bakterieart, og er ikke noe generell bakteriell isolasjonsmetode. Dermed utgjør anvendelsen av disse perle/ligand-komplekser i sammenheng med fremgangsmåtene som defineres heri, ikke ett trekk av foreliggende oppfinnelse.
Den immobiliserte ligand vil fortrinnsvis være et oligo-eller polysakkarid, en vitamin (for eksempel en som er nød-vendig som næringsmiddel for mikroorganismer) eller en jern-chelaterende forbindelse, og polysakkarider er spesielt foretrukne. Eksempler på spesielt foretrukne ligander beskrives i diskusjonen i sammenheng med fremgangsmåten. Selv om det, slik det ble nevnt, tilveiebringes en generell atskillelsesmetode, har oppfinnerne funnet at ligander som innlemmer visse sukkertyper, er spesielt godt egnet for å atskille visse meget brede klasser av mikroorganisme. Dermed kan for eksempel bakterieart som foreligger i tarmen, isoleres meget virksomt når man bruker en mannoseholdig ligand (liganden kan være en mannosemonomer eller en mannoseinnlemmende polymer), bakterier som inntrer via lungen, kan isoleres meget virksomt ved bruk av sulfaterte sukkere som ligander, og bakterier som smitter urinveiene, bindes til immobilisert glukose (igjen som en monomer eller innlemmet i en polymer). Anvendelsen av slike ligander i fremgangsmåter for å atskille bakterier fra en prøve tatt fra tarm eller lunge, utgjør derfor ytterligere foretrukne trekk av foreliggende oppfinnelse.
Prøven som mikroorganismer kan isoleres fra, omfatter mil-jøprøver såsom vannprøver, for eksempel fra innsjø, elver, kloakkanlegg og andre vannbehandlingssentre eller jordprø-ver. Fremgangsmåten er spesielt nyttig ved analyse av matprøver og generelt innen helse- og hygiene anvendelser hvor det er ønskelig å overvåke bakterienivåer, for eksempel i områder hvor det lagres mat. Melkeprodukter kan for eksempel analyseres for listeri. Konvensjonelle teknikker for bakterieisolasjon ved bruk av immobiliserte antistoffer har vist seg å være meget mindre virksomme enn våre metoder for å isolere listeri ved bruk av ikke-spesifikke ligander, eventuelt på grunn av den hydrofobe natur av det immobiliserte antistoff. Når prøven er en vannprøve, er liganden fortrinnsvis et næringsstoff for de aktuelle mikroorganismer .
Matprøver kan analyseres ved å først homogenisere etter behov (hvis det er en fast prøve) og deretter blande med et egnet inkubasjonsmedium (for eksempel peptonvann) og inku-bere ved 37°C over natten. Matvare såsom ost, iskrem, egg, margarin, fisk, reker, kylling, biff, svineribber, hvete-mel, havregryn, kokt ris, pepper, grønnsaker såsom tomat, brokkoli, bønner, jordnøtter og marsipan kan analyseres på denne måte. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er spesielt fordelaktig for analyse av matprøver, ettersom disse inneholder mye fastmateriale (klumper og fettpartikler) som har en tendens til å blokkere filtre og å etter sentrifugering danne en pellet hvor bakteriene er sammenklumpet og ikke er tilgjengelig for spaltning eller binding til antistoffer.
Prøver som det kan isoleres mikroorganismer fra ifølge foreliggende fremgangsmåte, kan være kliniske prøver tatt fra et menneskes eller dyrs kropp. Egnede prøver omfatter fullblod og blodavledede produkter, urin, avføring, cere-brospinal væske eller hvilken som helst kroppsvæske samt vevprøver og prøver erholdt ved for eksempel en utskrapning av et kroppshulrom.
Prøven kan også omfatte relativt rene eller delvise rensede utgangsstoffer, så som halvrene preparater erholdt ved andre celleseparasjonsprosesser.
Man har også funnet at de faste bærere og fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan brukes ved ikke-selektiv isolasjon av eukaryotiske celler fra en prøve. Fremgangsmåten er "ik-ke-selektiv" ved at det ikke siktes til å isolere en enkel celletype. Minst 2, fortrinnsvis 3 eller flere, 4 eller flere eller til og med 6 eller flere eukaryotiske celletyper vil isoleres i henhold til disse fremgangsmåter.
I et annet trekk tilveiebringer foreliggende oppfinnelse dermed en fremgangsmåte ved isolasjon av eukaryotiske celler fra en prøve, hvilken fremgangsmåte omfatter å binde de eukaryotiske celler til en fast bærer ved hjelp av en ikke-spesif ikk ligand som er immobilisert på den faste bærer. Egnede eukaryotiske celler som kan atskilles, er slike som har lektiner på sin overflate som bindes til polysakkarider. En slik fremgangsmåte kan være spesielt nyttig når det er ønskelig å innfange alle typer hvite blodceller fra en blodprøve eller blodavledet prøve, fra benmarg eller fak- tisk fra hvilket som helst vev eller hvilken som helst væske som inneholder hvite blodceller. For denne anvendelse omfatter spesielt egnede ligander kruskarrageen og derivater derav, sulfaterte polysakkarider (glykosaminogly-kaner) så som dekstransulfat, heparin og heparansulfat.
I henhold til en slik fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, kan i det minste B-celler og monocytter, fortrinnsvis de fleste, hvis ikke alle, typer hvite blodceller isoleres ved binding til de samme perler. Røde blodceller innfanges fortrinnsvis ikke. Denne fremgangsmåte er vanligvis et preliminært trinn i en fremgangsmåte for å isolere DNA fra en prøve. Isolasjon av DNA fra blod i henhold til kjente metoder oppnås ved direkte spaltning av prøven og isolering av DNA. En slik teknikk vil spalte alle cellene som foreligger, mens de hvite blodceller i henhold til fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, bindes, hvilket muliggjør en første konsentrasjon av de aktuelle celler. Et antistoff basert seperasjonssystem ville ikke tillate noen isolering av hvite blodceller generelt. Analogt kan andre cellegrupper isoleres fra en eukaryotisk prøve.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor en celleiso-lasjonsmetode hvor "cellen" kan være eukaryotisk eller pro-karyotisk, hvor begrepet "celle" omfatter alle de ovenfor definerte mikroorganismer.
Egnede faste bærerer for anvendelse i foreliggende oppfinnelse kan være hvilken som helst av de velkjente bærere eller matriser som i dag finner omfattende bruk eller som er foreslått for immobilisering, separasjon osv. Disse kan ha formen av partikler, ark, geler, filtre, membraner, fibrer, kapillærer, eller mikrotitrestrimler, rør, plater eller brønner osv.
Med fordel kan bæreren være av glass, silika, lateks eller et polymert materiale. Foretrukne er materialer som pre-senterer et stort overflateareal for binding av cellene, og dermed av nukleinsyren. Slike bærere vil generelt ha en uregelmessig overflate og kan for eksempel være porøse eller partikkelformede partikler, fibrer, nett, sinterer eller siler. Parikkelformede materialer, for eksempel perler, er generelt foretrukket på grunn av deres større bindingskapasitet, spesielt polymere perler.
Med fordel vil en partikkelformet fast bærer som brukes i henhold til oppfinnelsen, omfatte sfæriske perler. Stør-relsen av perlene er ikke vesentlig, men de kan for eksempel ha en diamter i størrelsesorden på minst 1 og fortrinnsvis minst 2 ym, og har en maksimal diameter på fortrinnsvis ikke mer enn 10 og mer foretrukket ikke mer enn 6 ym. For eksempel har perler med diameter 2,8 ym og 4,5 ym vist seg å være godt egnet.
Ikke-magnetiske polymerperler som er egnet for anvendelse i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er tilgjengelig fra Dyno Particles AS (Lillestrøm, Norge) samt fra Qiagen, Pharmacia og Serotec.
For å fremme manipulasjon og atskillelse, foretrekkes imidlertid magnetiske perler. Begrepet "magnetisk" slik det brukes heri, betyr at bæreren har evnen til å få formidlet et magnetisk moment når den plasseres i et magnetisk felt, og dermed kan forskyves av dette felts virkning. Med andre ord kan en bærer som omfatter magnetiske partikler, lett fjernes ved magnetisk aggregasjon, hvilket utgjør en rask, enkel og virksom måte å atskille partiklene etter celle- og nukleinsyrebindingstrinnene, og dette utgjør en meget mindre voldsom metode enn tradisjonelle teknikker såsom sentrifugering som genererer skjærkrefter som kan sprenge celler eller degradere nukleinsyrer.
Ved bruk av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan dermed de magnetiske partikler med celler bundet på seg fjernes på en egnet flate ved anvendelse av et magnetisk felt, for eksempel ved bruk av en permanent magnet. Det er vanligvis nok å påføre en magnet på siden av beholderen som inneholder prøveblandingen, for å aggregere partiklene på veggen av beholderen, og å helle bort resten av prøven.
Spesielt foretrukne er superparamagnetiske partikler, for eksempel de som beskrives av Sintef i EP-A-106873, ettersom man da kan unngå en magnetisk aggregasjon og klumping av partiklene under omsetningen, og dermed kan sikre en enhet-lig nukleinsyre-ekstrahering. De velkjente magnetiske partikler som selges av Dynal AS (Oslo, Norge) med navnet DYNABEADS, er egnet for bruk ifølge foreliggende oppfinnelse .
Funksjonaliserte bestrøkne partikler for bruk ifølge foreliggende oppfinnelse kan prepareres ved modifikasjon av perlene i henhold til US-patentene 4.336.173, 4.459.378 og 4.654.267. Dermed kan man fremstille perler, eller andre bærere, som har forskjellige typer funksjonalisert overflate, for eksempel positivt eller negativt ladet, hydrofil eller hydrofob.
Partiklene vil fortrinnsvis stille til rådighet et stort overflateareal for binding, og vil derfor ha en tendens til å være små og etter mulighet ikke glatte. Overflaten av den faste bærer vil fortrinnvis (enten før eller etter ligand immobiliseringen) ikke være hydrofob.
Spesielt foretrukne partikler for anvendelse som fast bærer i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, er sfærisk formede polymerpartikler (perler) basert på PVA (polyvinylalkohol) hvori man har innkapslet en magnetisk kolloid. Disse perler kan fremstilles ved suspensjon av en polymerfase som inneholder magnetiske kolloider i en vegetabilsk oljefase som inneholder et emulgeringsmiddel slik det beskrives i CA 2.227.608. Partiklene, hvis størrelse kan variere fra 1-8 ym, er fortrinnsvis tilgjengelig fra Chemagen AG, Tyskland. Egnede buffere kan også videre brukes som medium for isolasjon for å oppnå betingelser som er egnet for binding. Med fordel kan en buffer med egnet ladning, osmolaritet osv. tilsettes til prøven før, samtidig med eller etter berøring med den faste bærer. PBS er en egnet celle-bindingsbuffer.
Fremgangsmåter for å binde en ligand til en fast bærer er velkjent innen faget. Vanligvis vil den faste bærer først aktiveres og deretter omsettes med liganden, og liganden kan i og for seg har blitt modifisert noe for å oppnå en kovalent binding til den faste bærer. I tilfellet av de ovennevnte superparamagnetiske perler fra Chemagen, kan polyvinylalkoholmatrisen aktiveres ved innføring av iso-cyanatfunksjonaliteter via en 8 atomer lang avstandsholder. Disse aktiverte perler (M-PVA A k2x) kan deretter brukes for en direkte kobling av molekyler som inneholder amino-eller hydroksyfunksjonaliteter. En typisk koblingsreaksjon vil være som følger:
aktiverte karbohydrat karbamat av perler med hydrok- karbohydrat
sylgruppe
Chemagen har patenter som vedrører modifikasjon av deres perler ved kobling.
For å undersøke cellebindingen og når det er ønsket med en kvalitativ eller kvantitativ informasjon om bestemte mikroorganismer, kan det utføres et ytterligere identifikasjons-trinn. Kombinasjonen av en generell celleseparajonsmetode som beskrevet ovenfor med en artsspesifikk påvisnings-metode, representerer en spesielt foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse.
Identiteten av de bundne mikroorganismer kan undersøkes ved analyse av nukleinsyren av mikroorganismene eller ved andre teknikker som er kjent innen faget, så som ved anvendelse av merkede antistoffer som er spesifikke for visse typer mikroorganismer. Etter at cellene har bundet seg til den faste bærer, kan med fordel nukleinsyre fra mikroorganis-me/perle-komplekset isoleres og analyseres, for eksempel ved PCR. Etter at mikroorganismene har bundet seg til den faste bærer, følger derfor et cellespaltningstrinn for å frigi nukleinsyren fra mikroorganismene for en påfølgende analyse. Den frigitte nukleinsyre kan analyseres i opp-løsning, men analyseres bekvemere etter at den er blitt bundet til en fast bærer, og denne faste bærer kan være den samme eller en annen, men er fortrinnsvis den samme som den faste bærer som mikroorganismene selv ble bundet til. I et ytterligere trekk tilveiebringer derfor foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte ved analysering av en mikro-organismeholdig prøve, hvilken fremgangsmåte omfatter å: (a) binde mikroorgansimene til en fast bærer ved hjelp av en ikke-spesifikk ligand som er immobilisert på den faste bærer; og (b) identifisere mikroorganismene som bundet til den faste bærer, slik som angitt i krav 11.
Trinn (b) utføres bekvemt ved å
(c) spalte mikroorganismene; og valgfritt
(d) binde nukleinsyren som ble frigjort fra de spaltede mikroorganismer, til en fast bærer.
Sett fra et annet synspunkt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte ved påvisning av en celletype eller mikroorganisme i en prøve, hvilken fremgangsmåte omfatter de ovennevnte trinn (a) og (b).
Egnede fremgangsmåter for å spalte mikroorganismene, binde nukleinsyren som dermed blir frigitt, og analysere nuklein syren, beskrives i WO 98/51693. Dermed er et ytterligere trekk av foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte ved isolasjon av nukleinsyre fra en prøve av celler, hvilken fremgangsmåte omfatter å: (a) binde cellene i prøven til en fast bærer ved hjelp av en ikke-spesifikk ligand som er immobilisert på den faste bærer;
(b) lysere de bundne celler; og
(c) binde nukleinsyren som ble frigitt fra de spaltede celler, til en fast bærer.
Enda et ytterligere trekk er en fremgangsmåte for påvisning av nærvær eller fravær av en bestemt celletype i en prøve, hvilken fremgangsmåte omfatter å: (a) binde cellene i prøven til en fast bærer ved hjelp av en ikke-spesifikk ligand som er immobilisert på den faste bærer; (b) lysere de bundne celler; (c) binde nukleinsyre som ble frigitt fra de lyserte celler, til en fast bærer; og (d) påvise nærvær eller fravær av nukleinsyre som er karakteristisk for de tilsiktede celler, i den bundne nukleinsyre. Foretrukne celler, ligander og faste bærere er som nevnt ovenfor.
Nukleinsyren kan være DNA, RNA eller hvilken som helst naturlig forekommende eller syntetisk modikasjon derav, og kombinasjon derav. Fortrinnsvis vil nukleinsyren imidlertid være DNA, som kan være enkelt- eller dobbeltkjedet eller kan foreligge i hvilken som helst annen form, for eksempel rettkjedet eller sirkulær.
Etter bindingen, lyseres de isolerte eller bærerbundne mikroorganismer for å frigi deres nukleinsyre. Fremgangsmåter ved cellelysering er velkjent innen faget og omfattende beskrevet i litteraturen og hvilken som helst av de kjente metoder kan brukes. Forskjellige metoder kan være bedre egnet for bestemte mikroorganismer, men hvilken som helst av de følgende metoder kan for eksempel brukes: rensemiddelspaltning ved bruk av for eksempel SDS, LiDS eller sarkosyl i egnede buffere; anvendelse av kaotroper så som Guanidiumhydroklorid (GHC1), Guanidiumtiocyanat (GTC), natriumjodid (Nal), perklorat osv.; mekanisk sprengning så som ved bruk av en French press, ultralydbehandling, maling med glassperler, alumina eller i flytende nitrogen; enzymatisk spaltning, for eksempel ved bruk av lysozym, proteinaser, pronaser eller cellulaser eller hvilken som helst av de andre handelstilgjengelige spaltningsenzymer; spaltning av celler ved bakteriofag- eller virusinfeksjon; frysetørking; osomotisk sjokk; mikrobølgebehandling; temperaturbehandling; for eksempel ved oppvarming eller koking, eller frysing, for eksempel i tørr is eller flytende nitrogen, og tining; eller alkalinsk spaltning. Slik det ble nevnt ovenfor, er alle slike metoder standard spaltningsteknikker og er velkjent innen faget, og hvilken som helst slik metode eller kombinasjon av metoder kan brukes.
Med fordel kan lyseringen oppnås i henhold til foreliggende oppfinnelse ved bruk av kaotroper og/eller rensemidler. For eksempel i tilfellet av bakterielle celler, har en kombinasjon av en kaotrop med et rensemiddel vist seg å være spesielt virksom. Et eksempel på et egnet lyserings-middel omfatter dermed en kaotrop så som GTC eller GHC1 og et rensemiddel så som SDS eller Sarkosyl. Lyseringsmidlene kan tilveiebringes i en enkel vandig oppløsning, eller de kan innlemmes i en bufferoppløsning, for å danne en såkalt "lyseringsbuffer". Hvilken som helst egnet buffer kan brukes, omfattende for eksempel Tris, Bicin, Tricin og fosfat-buffere. Alternativt kan spaltningsmidlene tilsettes at-skilt. Egnede konsentrasjoner og mengder av spaltningsmid-ler vil variere i henhold til det nøyaktige system, naturen av cellene osv., og kan bestemmes på egnet måte, men konsentrasjoner fra for eksempel 2M til 7M kaotroper så som GTC GHC1, Nal eller perklorat kan brukes, 0,1M til IM alka-linske midler så som NaOH, og 0,1 til 50% (vekt/vol), for eksempel 0,5 til 15%, rensemiddel. Dermed omfatter et eksempel på en egnet representativ lyseringsbuffer en vandig oppløsning av 4M GTC, 1% (vekt/vol) sarkosyl.
De isolerte, bærerbundne mikroorganismer kan bekvemt fjernes eller adskilles fra resten av prøven, hvorved cellene konsentreres eller anrikes. Således tjener cellebindingstrinnet til å anrike cellene eller konsentrere dem i et mindre volum enn den opprinnelige prøven. Lysering kan deretter bekvemt oppnås ved å tilsette en egnet lyseringsbuffer som inneholder de ønskede lyseringsmidler, eller ved å utsette de isolerte celler for de ønskede lyserings-betingelser. For eksempel i tilfelle av å helt enkelt tilsette en lyseringsbuffer som inneholder egnede lyseringsmidler, kan de isolerte celler helt enkelt inkuberes i nærvær av lyseringsbufferen over et egnet tidsrom for å mu-liggjøre lyser. Forskjellige inkubasjonsbetingelser kan være egnet for forskjellige lyseringssystemer, og disse er kjent innen faget. For eksempel for en rensemiddel-og/eller kaotropholdig lyseringsbuffer, kan inkubasjon finne sted ved romtemperatur eller ved høyere temperaturer, for eksempel 37°C eller 65°C. Likeledes kan inkuba-sjonsvarigheten varieres fra noen få minutter, for eksempel 5 eller 10 minutter til flere timer, for eksempel 1 til 2 timer. I tilfelle av GTC/sarkosyol-lysisbuffere og bakterieceller, har en inkubasjon ved for eksempel 65°C i 10 til 20 minutter vist seg å være egnet, men dette kan så klart varieres etter behov. For en enzymatisk lyser, for eksempel ved bruk av proteinase K osv., kan det være nødven-dig med lengre behandlingsvarighet, for eksempel over natten .
Etter lyser bindes den frigitte nukleinsyre med fordel til en fast bærer, fortrinnsvis samme bærer som de spaltede mikroorganismer er bundet til. På den andre side kan det for eksempel tilveiebringes en blandet populasjon av perler, noen med en ikke-spesifikk ligand for binding til mikroorganismer og andre som er tilpasset til å binde nukleinsyre.
Denne binding av nukleinsyre kan oppnås på hvilken som helst måte som er kjent innen faget for binding av nukleinsyre til en fast bærer. Med fordel bindes nukleinsyren ikke-spesifikt til bæreren, dvs. uavhengig av sekvensen. Således kan den frigitte nukleinsyre for eksempel felles på bæreren ved bruk av hvilket som helst kjent felningsmiddel for nukleinsyre, for eksempel alkoholer, alkohol/saltkom-binasjoner, polyetylenglykoler (PEG'er), osv. Felning av nukleinsyrer på perler på denne måte beskrives for eksempel i WO 91/12079. Dermed kan salt tilsettes til bæreren og den frigitte nukleinsyre i oppløsning, fulgt av en tilsetning av alkohol, hvilket vil forårsake at nukleinsyren felles. Alternativt kan saltet og alkoholen tilsettes sammen, eller saltet kan unnværes. Slik det ble beskrevet ovenfor i sammenheng med cellebindingstrinnet, kan hvilken som helst alkohol eller salt brukes, og egnede mengder eller konsentrasjoner kan lett bestemmes.
Alternative ikke-spesifikke nukleinsyrebindingsteknikker omfatter anvendelse av rensemidler som beskrevet i WO 96/18731 til Dynal AS (den såkalte "DNA Direct"-prosedyre), og anvendelse av kaotroper og en nukleinsyrebindende fast fase så som silikapartikler, slik det beskrives av Akzo N.V. i EP-A-0389063.
En ionisk binding av nukleinsyren til bæreren kan oppnås ved bruk av en fast bærer som har en ladet overflate, for eksempel en bærer som er bestrøket med polyaminer.
Bæreren som brukes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan også bære funksjonelle grupper som fremmer den spesifikke eller ikke-spesifikke binding av nukleinsyrer, for eksempel DNA-bindende proteiner, for eksempel leucin-glide-låser eller histoner eller interkalaterende fargestoffer
(for eksempel etidiumbromid eller Hoechst 42945) som kan bestrykes på bæreren.
Likeledes kan bæreren utstyres med bindingspartnere for å fremme den selektive innfanging av nukleinsyrer. For eksempel kan komplementære DNA- eller RNA-sekvenser, eller DNA-bindende proteiner brukes, eller virale proteiner som bindes til virale nukleinsyrer. Bindingen av slike proteiner til den faste bærer kan oppnås ved bruk av teknikker som er velkjent innen faget.
En bekvem måte å felle nukleinsyrer ifølge foreliggende oppfinnelse utføres ved å tilsette et felningsmiddel, for eksempel alkohol, til blandingen som inneholder bæreren og de spaltede celler. Således kan et egnet volum av alkohol, for eksempel 100% eller 96% etanol, helt enkelt tilsettes til blandingen, og det hele inkuberes over et tilstrekkelig langt tidsrom for å muliggjøre en binding av de frigitte nukleinsyrer på bæreren. Inkubasjonsbetingelsene for dette trinn er ikke vesentlige, og kan helt enkelt omfatte en inkubasjon i 5 til 10 minutter ved romtemperatur. Imidlertid kan tidsrommet varieres og temperaturen heves etter valg.
Selv om det ikke er nødvendig, kan det være fordelaktig å innføre ett eller flere vasketrinn i isolasjonsmetoden ifølge oppfinnelsen, for eksempel etter nukleinsyrebin-dingstrinnet. Hvilke som helst konvensjonelle vaskebuffere eller andre medier kan brukes. Generelt foretrekkes buffere med lav til moderat ionisk styrke, for eksempel 10 mM Tris-HCl ved pH 8,0/10 mM NaCl. Andre standard vaskeme-dier, for eksempel inneholdende alkoholer, kan også brukes om ønsket, for eksempel vasking med 70% etanol.
Bruken av magnetiske partikler tillater enkle vasketrinn helt enkelt ved å aggregere partiklene, fjerne nukleinsyre-bindingsmediet, tilsette vaskemediet og reaggregere partiklene så mange ganger som nødvendig.
Etter nukleinsyreisolasjonsprosessen og eventuelle valgfrie vasketrinn som kan være ønskelig, kan bæreren som bærer den bundne nukleinsyre overføres, for eksempel resuspenderes eller nedsenkes i hvilket som helst egnet medium, for eksempel vann eller buffer med lav ionisk styrke. Avhengig av bæreren og naturen av den påfølgende prosessering som er ønsket, kan det eventuelt være ønskelig å frigi nukleinsyren fra bæreren. I tilfelle av en partikkelformet fast bærer så som magnetiske eller ikke-magnetiske perler, kan ma-terialet i mange tilfeller brukes direkte, for eksempel i PCR eller andre amplifikasjoner, uten å eluere nukleinsyren fra bæreren. I tillegg er det for mange DNA-påvisnings-eller identifikasjonsmetoder ikke nødvendig med eluering, ettersom det selv om DNA kan være i vilkårlig berøring med perleoverflaten og kan være bundet på forskjellige punkter ved hydrogenbinding eller ionisk binding eller andre kref-ter, generelt vil være tilgjengelig tilstrekkelige lengder av DNA for en hybridisering til oligonukleotider og for amplifikasjon.
Hvis ønsket kan imidlertid en eluering av nukleinsyren lett oppnås på kjent måte, for eksempel ved oppvarming, for eksempel til 70 - 90°C i 5 til 10 minutter, hvoretter bæreren kan fjernes fra mediet og etterlate seg nukleinsyre. En slik oppvarming oppnås automatisk i PCR ved DNA-denature-ringstrinnet forut for cykliseringprogrammet.
Hvis det er ønskelig å adskille RNA fra DNA, kan dette oppnås ved å ødelegge RNA før DNA-separasjonstrinnet, for eksempel ved tilsetning av et RNAase eller et alkali så som NaOH.
En fordel med foreliggende oppfinnelse er at den er rask og enkel å utføre, og enkeltheten av fremgangsmåten tillater et høyt gjennomløp av prøver.
Oppfinnelsen er på fordelaktig måte tilpasningsdyktig for automatisering, spesielt hvis det brukes partikler, og spesielt magnetiske partikler, som bærer.
Slik det ble nevnt ovenfor har fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen spesiell anvendelse som et preliminært første trinn for å preparere nukleinsyre for anvendelse i nukleinsyrebaserte påvisningsprosedyrer.
Slik det ble nevnt ovenfor, er det fordelaktig at bundne nukleinsyrer ikke trenger å elueres eller fjernes fra bæreren før påvisningstrinnet utføres, selv om dette kan utfø-res om ønsket. Om nukleinsyren skal elueres eller ikke kan avhenge av den bestemte fremgangsmåte som ble brukt i nuk-leinsyrebindingstrinnet. Dermed vil disse nukleinsyrebin-dingsprosedyrer binde nukleinsyren sterkere enn andre. For eksempel i tilfelle av DNA-binding ved bruk av rensemidler (for eksempel ved "DNA-Direct"), vil nukleinsyren elueres fra den faste bærer når det tilsettes en elueringsbuffer eller et annet egnet medium. Nukleinsyre som bindes ved hjelp av et felningsmiddel så som alkohol eller en kaotrop, vil holdes sterkere bundet, og vil eventuelt ikke elueres når den plasseres i et buffermedium, og kan kreve oppvarming for å elueres.
Således kan den bærerbundne nukleinsyre brukes direkte i en nukleinsyrebasert påvisningsprosedyre, spesielt hvis bæreren er partikkelformet, helt enkelt ved å resuspendere bæreren i, eller tilsette til bæreren, et medium som er egnet for påvirkningstrinnet. Enten kan nukleinsyren elueres inn i mediet, eller en eluering er, slik det ble nevnt ovenfor, ikke nødvendig. Når sulfaterte sukre blir brukt som ligand, foretrekkes eluering.
Et antall forskjellige teknikker for å påvise nukleinsyrer er kjent og beskrives i litteraturen, og hvilke som helst av disse kan brukes i henhold til foreliggende oppfinnelse. I den enkleste utførelse kan nukleinsyren påvises ved hyb ridisering til en probe, og veldig mange slike hybridise-ringsprotokoller er blitt beskrevet (se for eksempel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Vanligvis vil påvisningen omfatte et in situ-hybridi-seringstrinn og/eller et in vitro-amplifikasjonstrinn ved bruk av hvilken som helst metode som beskrives for dette formål i litteraturen. Som nevnt kan således teknikker så som LAR, 3SR og Q-beta-replikase-systemet brukes. Imidlertid vil PCR og dens forskjellige modifikasjoner, for eksempel anvendelse av nestede primere, generelt være den mest fordelaktige metode (se for eksempel Abramson and Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4: 41-47 for en oversikt over nukleinsyreamplifikasjonsteknologier).
Andre påvisningsmetoder kan basere seg på en sekvensie-ringsfremgangsmåte, for eksempel minisekvensieringsfrem-gangsmåten som beskrives av Syvånen og Soderlund, 1990, Genomics, 8: 684-692.
I amplifikasjonsteknikker så som PCR, kan oppvarmingen som er påkrevd i det første trinn for å åpne DNA-dupleksen, frigi det bundne DNA fra bæreren. I tilfelle av et påføl-gende påvisningstrinn, så som PCR, kan derfor den bærerbundne nukleinsyre tilsettes direkte til reaksjonsblan-dingen, og nukleinsyren vil elueres i det første trinn av påvisningsprosessen. Den fullstendige isolerte bærerbundne nukleinsyreprøve som erholdes ifølge oppfinnelsen, kan brukes i påvisningstrinnet, eller det brukes en alikvot.
Resultatene av PCR eller et annet påvisningstrinn kan påvises eller visualiseres på mange måter som beskrives innen faget. For eksempel kan produktene av PCR eller en annen amplifikasjon få trekke på en elektroforesegel, for eksempel en etidiumbromidflekket agarosegel, ved bruk av kjente teknikker. Alternativt kan DIANA-systernet brukes, som er en modifikasjon av den nestede primerteknikk. I DIANA-systemet (Detection of Immobilised Amplified Nucleic Acids)
(se Wahlberg et al., Mol.Cell Probes 4: 285(1990)), det indre, andre par av primere, henholdsvis et hjelpemiddel for immobilisering for å muliggjøre innfanging av amplifisert DNA, og en markør eller et hjelpemiddel for å feste en markør for å muliggjøre gjenkjenning. Dette gir de to for-deler med nedsatt bakgrunnssignal og en rask og lett måte å påvise det amplifiserte DNA. Samtids-PCR-metoder kan brukes ved DNA-påvisning, for eksempel 5'nuklease-PCR eller teknikker som benytter seg av fluoreserende prober.
Den amplifiserte nukleinsyre kan også påvises, eller resultatet kan bekreftes, ved sekvensiering ved bruk av hvilken som helst av de mange forskjellige sekvensieringsteknolo-gier som nå er tilgjengelige, for eksempel standardsekven-siering, fastfasesekvensiering, cyklisk sekvensiering, automatisk sekvensiering og minisekvensiering.
De forskjellige reagensmidler og bestanddeler som er nød-vendige for å utføre fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse kan med fordel tilbys i form av et sett. Slike sett representerer et ytterligere trekk av oppfinnelsen.
På sitt enkleste tilveiebringer dette trekk av oppfinnelsen et sett for å isolere mikroorganismer fra en prøve, omfattende : (a) en fast bærer som har en ligand immobilisert på seg
som har evnen til ikke-spesifikk til mikroorganismer;
(b) en anordning for å binde mikroorganismer til den faste
bærer; valgfritt
(c) anordning for å spalte cellene; og valgfritt
(d) anordning for å binde nukleinsyre som er frigitt fra de spaltede celler, til en fast bærer, som angitt i krav 21.
De forskjellige anordninger (b), (c) og (d) kan være som beskrevet og diskutert ovenfor i sammenheng med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Et typisk sett kan omfatte en fast bærer, for eksempel partikler bestrøket med et polysakkarid så som GUM1, en bindingsbuffer, for eksempel PBS, og en lysisbuffer.
En ytterligere valgfri bestanddel er (e), nemlig en anordning for påvisning av nærvær eller fravær av nukleinsyre som er karakteristisk for en bestemt tilsiktet mikroorganisme. Slik det ble diskutert ovenfor, kan en slik anordning omfatte egnede probe- eller primeroligonukleotidsek-venser for anvendelse i hybridiserings- og/eller amplifika-sjonsbaserte påvisningsteknikker.
Valgfritt kan det i et slikt sett dessuten innlemmes buffere, salter, polymerer, enzymer, osv.)
Settene ifølge oppfinnelsen har stor praktisk nytte ved ekstrahering av bakterier og isolasjon av DNA for PCR-amplifikasjon. En egnet protokoll for bruk med settet ville være som følger, idet det antas at man har valgt magnetiske eller magnetiserbare perler som fast bærer (a): slå sammen bindingsbuffer (b) og perler, tilsett en prøve fra en overnatten-kultur og bland sammen, for eksempel i et Eppendorfrør,
plasser det hele under innvirkningen av en magnet og la bakterie-/perlekomplekset bevege seg mot siden av røret,
pipetter bort og kast supernatanten,
tilsett lysusbufferen (c) og inkuber med etanol,
bruk magneten til å adskille perlene fra supernatanten, og pipetter bort og kast supernatanten,
vask perlene og fjern supernatanten,
resuspender perle/DNA-prøven for PCR.
Ifølge et ytterligere trekk av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes anvendelse av en fast bærer som beskrevet heri ved grov adskillelse av celler fra en prøve. Adskil-lelsen er "grov" fordi den ikke er en celle-spesifikk iso-las j onsmetode, men heller en generell metode for å isolere celler, (for eksempel mikroorganismer) som foreligger i en prøve, fra de øvrige bestanddeler. Tidligere ble slike metoder oppnådd ved filtrering eller feining. Derimot kan de faste bærerne som beskrives heri brukes til å kombinere fordelene med ligand/reseptorbinding, men ikke på arts-eller celletypespesifikk måte. Som beskrevet heri, har ligandene som er bundet til den faste bærer, evnen til å binde til en betydelig andel, hvis ikke hovedparten, av mikroorganismetypene (for eksempel forskjellige bakteriespesier) eller eukaryotiske celletyper i prøven for å oppnå en grov adskillelse derav fra den samlede prøve.
Oppfinnelsen vil nå beskrives i større detalj i de følgende eksempler under henvisning til de vedlagte tegninger, hvor: Fig. 1 er et fotografi av en gel som viser PCR-produkter fra nukleinsyren i bakterier ( E. coli) som er bundet til perler bestrøket med mannose, maltose og GUM1; Fig. 2 er et fotografi av en gel som viser PCR-produkter fra nukleinsyren av bakterier ( B. cereus) som er bundet til GUMl-bestrøkne perler og ubestrøkne perler; Fig. 3 viser en rekke gelfotografier som angir bindingen av et bredt utvalg av bakterier til GUMl-bestrøkne perler; Fig. 4 er et fotografi av en gel som viser PCR-produkter fra nukleinsyren av Vibrio cholerae bundet til forskjellige bestrøkne perler; Fig. 5 er et fotografi av en gel som viser PCR-produkter fra nukleinsyren av Shigella flexneri bundet til forskjellige bestrøkne perler; Fig. 6 er et fotografi av en gel som viser PCR-produkter fra nukleinsyren av E. coli bundet til forskjellige be-strøkne perler; Fig. 7 er et fotografi av en gel som viser PCR-produkter fra nukleinsyren av Salmonella typhimurium bundet til forskjellige bestrøkne perler; Fig. 8 er et fotografi av en gel som viser PCR-produkter fra nukleinsyren av Campylobacter jejuni bundet til forskjellige bestrøkne perler; Fig. 9 er et fotografi av en gel som viser PCR-produkter fra nukleinsyren av Steptococcus pyogenes bundet til forskjellige bestrøkne perler; Fig. 10 er et fotografi av en gel som viser PCR-produkter fra nukleinsyren av Neisseria gonorrheae bundet til forskjellige bestrøkne perler; Fig. 11 er et fotografi av en gel som viser PCR-produkter fra nukleinsyren av humane hvite blodceller bundet til forskjellige bestrøkne perler; Fig. 12 er et fotografi av en gel som viser PCR-produkter fra nukleinsyren av E. coli bundet til bestrøkne og ubestrøkne Dynabeads; Fig. 13 er et fotografi av en gel som viser PCR-produkter fra nukleinsyren av forskjellige bakterier bundet til GUM-bestrøkne Dynabeads.
EKSEMPEL 1
Fremstilling av karbohydratbestrøkne partikler og testing av cellebindingsegenskapene.
Forbindelsen ble koblet på M-PVA OCN-aktiverte perler
(Chemagen AG)
Reaksjon:
aktiverte karbohydrat karbamat (uretan)
perler med hydrok- av karbohydrat sylgruppe
De modifiserte perler ble inkubert med forskjellige bakte-riekulturer, enten med rene ufortynnede kulturer (o.n.) eller kulturer som var blitt fortynnet i vann eller i en buffer (PBS). For å undersøke cellebindingen ble DNA isolert fra bakterie/perlekomplekset og deretter analysert ved å utføre PCR. Ref: WO 98/51693. Denne koplingsreaksjonen ble utført av Chemagen, og de resulterende modifiserte perler ble brukt i isolasjonsmetodene ifølge oppfinnelsen som beskrives heri.
EKSEMPEL 2
Protokoll for isolasjon av bakterier på perler og identifikasjon av bestemte bakterier.
Bakteriene ble dyrket over natten i 100 ml Tryptone Soya-kraft ved 30°C uten omrøring. 800 ul PBS (bindingsbuffer) og 10 ul perler ifølge oppfinnelsen (10 mg/ml) ble blandet, og deretter ble 100 ul av overnatten-kulturen tilsatt, og det hele ble forsiktig blandet ved pipettering. Røret fikk stå ved romtemperatur i 5 minutter. Supernatanten ble fjernet ved bruk av en magnetisk separator, og perle/- bakteriekomplekset ble resuspendert i 50 ul lysisbuffer (4M guaridintiocyanat - 1% sarkosyl). Prøvene ble inkubert ved 65% i 5 minutter med åpent lokk.
Deretter tilsatte man 100 ul 96% etanol, og inkubasjonen ble fortsatt i 5 minutter med lukket lokk. Supernatanten ble fjernet ved bruk av den magnetiske separator, og perle/DNA-prøven ble vasket to ganger med 1 ml 70% etanol.
Perle/DNA-prøven ble resuspendert i 45 ul H2O og inkubert ved 65°C i 15 minutter med åpent lokk for å fjerne alle spor av etanol (alternativt kan 5 ul H20 tilsettes for å fukte perlene, som deretter inkuberes ved 65°C i 5 minutter) . 20ul av det rensede materiale ble brukt i en 50 ul
PCR.
For å identifisere de isolerte bakterier, utførte man PCR-amplifikasjon med spesier - eller gruppespesifikke primere (X og Y).
Den følgende tabell 1 oppgir egnede primere for forskjellige bakterier. PCR- amplifikasjon ble utført i 50 ul volum: H2O - 17,5 ul; dNTP 2 mM - 5 ul; 10 x buffer DynaZyme - 5 ul; primer x (10 pmol/ul) - 1 ul; primer y 10 pmol/ul - 1 ul; enzym DynaZyme 2U/ul - 0,5 ul; sjablone - 20 ul. Temperaturprogrammet var: 94°C i 4 minutter, deretter 35 cykler med parameterne 96°C i 15 sekunder; 56°C i 30 sekunder; 72°C i 1 minutt; fulgt av 72°C i 7 minutter.
PCR-produktene ble visualisert ved agarosegel-elektrofo-rese.
EKSEMPEL 3
Protokollen fra eksempel 2 ble utført med M-PVA-perler med D-mannose koplet dertil.
Perlene viste seg å bindes til Bacillus, E. coli (patogent og ikke-patogent), Listeria, Salmonella, Yersinia.
EKSEMPEL 4
Protokollen fra eksempel 2 ble utført med M-PVA-perler med maltose koplet dertil.
Perlene viste seg å bindes til til Bacillus, E. coli (patogent og ikke-patogent), Listeria, Salmonella, Yersinia.
EKSEMPEL 5
Protokollen fra eksempel 2 ble utført med M-PVA-perler med galaktomannanpolysakkarid (GUM1) koplet dertil.
Perlene viste seg å bindes til blant annet Aeromonas, Bacillus, Campylobacter, Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, E. coli (patogent og ikke-patogent), Hafnia, Klebsiella, Listeria, Proteus, Salmonella, Shewanella, Serratia, Shigella, Vibrio, Yersinia.
Resultatene av disse eksperimenter fremgår fra gelfotogra-fiene på fig. 3. Båndene av PCR-produkt som angir bindingen av bestemte bakterier til perlene i henhold til føl-gende skjema vises.
Bane 1: DNA-markør (GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder, Fermentas);
Banene 2-3: henholdsvis Klebsiella pneumoniae og K. oxytoca;
Banene 4-6: henholdsvis Shigella flexneri, S. sonnei og S. boydii,
Banene 7-8 og
12-13: Vibrio cholerae (banene 7 og 12), V. vulnificus (bane 8), og V. parahaemolyticus;
Bane 9: Hafnia alvei;
Banene 10-11: henholdsvis Aeromonas sobria og A. hydrophila;
Banene 12-13: Vibrio, se ovenfor;
Bane 14: Proteus vulgaris;
Banene 15-16: henholdsvis Salmonella enterica ssp typhimurium og S. enterica ssp enteritidis;
Banene 17-18
og 41-44: Yersinia enterocolitica (banene 17-18 (sero-type ukjent), serotypene 0:9 (bane 42), 0:8 (bane 43) og 0:3 (bane 44)), og Y. pseudotuberculosis (bane 41);
Bane 19: Escherichia coli;
Banene 20-21: henholdsvis Listeria innocua og L. monocytogenes;
Banene 22-23
og 38-39: Bacillus cereus (bane 22), B. subtilis (bane 23) og B. simplex (banene 38-39);
Bane 24: Citrobacter freundii;
Banene 25-26: henholdsvis Clostridium perfringens og C. sordelli;
Banene 27-30: Escherichia coli, pathogenit;
Banene 31-37: Campylobacter jejuni (bane 31) og C. lari (banene 32-37);
Banene 38-39: Bacillus, se ovenfor;
Bane 40: Brochothrix thermosphacta;
Banene 41-44: Yersinia, se ovenfor;
Banene 45-47: henholdsvis Enterobacter sakazakii, E. aerogenes og E. cloacae;
Bane 48: Morganella morganii;
Bane 49: Serratia marcescens;
Banene 50-52: Shewanella putrefaciens;
Banene 53-54: henholdsvis Photobacterium phosphoreum og P. damsela;
Bane 55: Streptococcus thermophilus;
Bane 56: Lactococcus lactis;
Bane 57: Staphylococcus warneri;
Bane 58: Enterococcus faecalis;
Banene 59-60: Leuconostoc mesenteroides;
Banene 61-64: Pediococcus acidilactici (banene 61-62) og P. damnosus (banene 63-64);
Banene 65-69: Lactobacillus acidophilus (banene 65, 68 og 69) og L. plantarum (banene 66-67).
EKSEMPEL 6
E. coli ble isolert fra en overnatten-kultur ved bruk av perlene fra eksemplene 3, 4 og 5 og Dynabeads M-280 (Dynal, Norway) (uaktivert). Etter spaltning for å frigi nukleinsyre, ble en E. coli-DNA-sekvens med ca 600 bp lengde amplifisert ved bruk av primerne U59/L673 (se tabell 1).
Resultatene vises på fig. 1, hvor
Banene 2-5: 15 ul sjablone ble brukt, og i banene 7-10 ble 5 ul sjablone brukt;
Bane 1 og 6: DNA-markør <j)xl74/HaeIII;
Bane 2 og 7: mannose-bestrøkne perler;
Bane 3 og 8: maltose-bestrøkne perler;
Bane 4 og 9: GUMl-bestrøkne perler;
Bane 5 og 10: Dynabeads M-280 aktivert.
EKSEMPEL 7
B. cereus ATCC 14579 ble isolert ved bruk av perlene fra eksempel 5 og ubestrøkne perler fikk referansen UNC fra 2 ml overnatten-kultur (100 ml TSB ved 30°C) i henhold til de følgende fortynninger: Bane 1: DNA-markør <|>xl74/HaeIII;
Bane 2: 100^g UNC, ufortynnet kultur;
Bane 3: 50 ug GUM1, 10<1>fortynnet kultur;
Bane 4: 100^g GUM1, 10<1>fortynnet kultur;
Bane 5: 200^g GUM1, 10<1>fortynnet kultur;
Bane 6: 100^g UNC, 10<1>fortynnet kultur;
Bane 7: 50 ug GUM1, IO<2>fortynnet kultur;
Bane 8: 100^g GUM1, IO<2>fortynnet kultur;
Bane 9: 200^g GUM1, IO<2>fortynnet kultur;
Bane 10: 100^g UNC, IO<2>fortynnet kultur;
Bane 11: 50 ug GUM1, IO<3>fortynnet kultur;
Bane 12: 100^g GUM1, IO<3>fortynnet kultur;
Bane 13: DNA marker <|>xl74/HaeIII;
Bane 14: 200^g GUM1, IO<3>fortynnet kultur;
Bane 15: 100^g UNC, IO<3>fortynnet kultur;
Bane 16: 50 ug GUM1, IO<4>fortynnet kultur;
Bane 17: 100^g GUM1, IO<4>fortynnet kultur;
Bane 18: 200^g GUMl, IO<4>fortynnet kultur;
Bane 19: 100^g UNC, 10<4>fortynnet kultur;
Bane 20: 50 ug GUMl, 10<5>fortynnet kultur;
Bane 21: 100^g GUMl, 10<5>fortynnet kultur;
Bane 22: 200^g GUMl, IO<5>fortynnet kultur;
Bane 23: 100^g UNC, 10<5>fortynnet kultur.
Etter lysis for å frigi nukleinsyre ble en B. cereus-sekvens på ca 600 bp amplifisert ved bruk av primerne U552/L1254 (se tabell 1). Resultatene vises i fig. 2. Resultatet av en 10' fortynning ville være feil fordi 50
u<j GUMl og 200 ug GUMl ga positive resultater for påvisning av nukleinsyre, hvilket tyder på cellebinding. Til
sammen viser resultatene at bindingen er 100-1000 ganger bedre for GUMl enn for de ubestrøkne perler.
EKSEMPEL 8
Andre perler er blitt brukt for å illustrere prinsippet av oppfinnelsen, og en spesielt egnet perletype er Dynabeads M-270 Epoxy, Prod. nr. 143,02 (tilgjengelig fra Dynal AS, Norge).
Preparering av perlene.
2 ml sterilfiltrert 0,1 M natriumfosfatbuffer pH 7,4, ble tilsatt til 30 mg tørre perler for å gi en konsentrasjon på ca IO<9>perler per ml. Perlene ble resuspendert ved sentrifugering i 30 sekunder, og deretter inkubert med langsom vipperotasjon i 10 minutter. Røret ble plassert på en magnet i 4 minutter, og supernatanten ble forsiktig pipettert bort. 2 ml 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,4 ble igjen tilsatt til røret, og perlene ble blandet ordentlig ved virvling. Røret ble plassert på en magnet i 4 minutter, og supernatanten ble fjernet.
De vaskede perler ble resuspendert i 600 ul 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,4, for å gi den anbefalte perlekonsent-rasjon og ammoniumsulfatkonsentrasjon etter tilsetning av ligandoppløsning. Denne perleoppløsning ble brukt i be-strykningsprosedyren.
Bestrykningsprosedyre.
Liganden ble løst opp i PBS til en konsentrasjon på 1 mg/ml og sterilfiltrert.
600 ul ligand ble blandet med 600 ul perleoppløsning og 600 ul sterilfiltrert 3M ammoniumsulfat i henhold til Dynals
anbefaling. Røret ble inkubert med langsom rotasjon over natten ved romtemperatur.
Etter inkubasjonen ble røret plassert på en magnet i 4 minutter, og supernatanten ble fjernet. De bestrøkne perler ble vasket til sammen 4 ganger med 2 ml PBS. Perlene ble til slutt resuspendert i 1 ml PBS til en konsentrasjon på 30 mg/ml og lagret ved 4°C.
EKSEMPEL 9
Protokoll for Isolasjon av bakterier på perler og identifikasjon av bestemte bakterier.
Bakteriene ble dyrket over natten i 100 ml Trypton-Soya-kraft ved 37°C. 800 ul PBS (bindingsbuffer) og 20 ul perler i henhold til oppfinnelsen (10 mg/ml) ble blandet, deretter ble 100 ul av overnatten-kulturen tilsatt, og det hele ble forsiktig blandet ved pipettering. Røret fikk stå ved romtemperatur i 5 minutter. Supernatanten ble fjernet ved bruk av en magnetisk separator, og perle/bakterie-komplekset ble resuspendert i 50 ul lysisbuffer (4M guanidin-tiocyanat - 1% sarkosyl). Prøvene ble inkubert ved 80°C i 5 minutter med lukket lokk.
Deretter tilsatte man 150 ul 96% etanol, og inkubasjonen ble fortsatt i 5 minutter. Supernatanten ble fjernet ved bruk av den magnetiske separator, og perle/DNA-prøven ble vasket to ganger med 1 ml 70% etanol.
Perle/DNA-prøven ble resuspendert i 30 ul H20 og inkubert ved 80°C i 10 minutter med åpent lokk for å fjerne alle spor av etanol. Hele det rensede materiale (30 ul) ble brukt i en 50 ul PCR.
EKSEMPEL 10
Bakterier ble isolert ved bruk av protokoll fra eksempel 9, og for å identifisere de isolerte bakterier utførte man PCR-amplifikasjon med de følgende primere:
Eksperimentene A-E.
Som angitt i tabell 1.
Eksperiment F
Perlene som ble brukt i de følgende eksperimenter er M-270 Dynabeads fra Dynal AS eller M-PVA OCN-aktiverte perler fra Chemagen AG.
Bakteriene som ble brukt i de følgende eksperimenter A-G er som følger:
I de følgende eksperimenter ble amplifikasjonen generelt utført direkte på DNA-perlekomplekset. Imidlertid kan en identifikasjon på bakterielle arter ved bruk av amplifi-kas j onsteknikker utføres på supernatanten. For visse bin-dingsligander, så som heparin, dekstransulfat og kruskaragen kan dette være å foretrekke, idet sulfatgruppen kan in-hibere PCR-reaksjonen. Når det i de følgende eksperimenter brukes et kruskaragenbelegg, utføres, hvis intet annet er nevnt, PCR på supernatanten etter inkubasjon av perlene ved 80°C for å frigi all DNA fra perlene.
I dette eksempel viser kruskaragen til iota-kruskaragen (Sigma, C-3889). Heparin og dekstransulfat ble ervervet fra Sigma, katalogreferansenr. henholdsvis H3149 og D6924.
A. Isolasjon av genomisk DNA fra Vibrio kolera ved bruk av gummi, mannose og kruskaragen.
Resultatene av amplifikasjonen vises på gelfotografiet på fig. 4.
Idet man leser fra den øvre venstre kant av gelen:
Linje 1:
Brønn nr 1 = Hae III-markør (svak)
Brønn nr 2=100 ul IO<-2>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 3 = 100 ul IO<-3>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 4=100 ul IO<-4>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 5 = 100 ul 10<-5>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 6=100 ul IO<-2>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 7 = 100 ul IO<-3>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 8=100 ul IO<-4>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 9 = 100 ul 10<-5>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 10=100 ul IO<-2>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 11 = 100 ul IO<-3>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 12=100 ul IO<-4>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 13 = 100 ul 10<-5>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med kruskaragen
Linje 2
Brønn nr 1 = Hae III-markør
Brønn nr 2=100 ul IO<-2>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med gummi,
Brønn nr 3 = 100 ul IO<-3>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med gummi,
Brønn nr 4 = 100 ul IO<-4>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med gummi,
Brønn nr 5 = 100 ul 10<-5>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med gummi,
Brønn nr 6 = 100 ul IO<-2>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med mannose,
Brønn nr 7 = 100 ul IO<-3>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med mannose,
Brønn nr 8 = 100 ul IO<-4>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med mannose,
Brønn nr 9 = 100 ul 10<-5>fortynning av V. cholerae tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med mannose,
Brønn nr 10 = negativ kontroll
B. Isolasjon av genomisk DNA fra Shigella flexneri ved bruk av gummi, mannose og kruskaragen.
Resultatene av ampiifikasjonen vises på gelfotografiet på fig. 5
Idet man leser fra den øvre venstre kant av gelen:
Brønn nr 1 = Hae III-markør
Brønn nr 2 = 100 ul IO<-2>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 3 = 100 ul IO<-3>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 4 = 100 ul IO<-4>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 5 = 100 ul 10<-5>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 6 = 100 ul IO<-2>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 7 = 100 ul IO<-3>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 8 = 100 ul IO<-4>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 9 = 100 ul 10<-5>fortynning av S.flexnerii til-
satt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 10 = 100 ul IO<-2>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 11 = 100 ul IO<-3>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 12 = 100 ul 10<-4>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 13 = 100 ul 10<-5>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med kruskaragen.
Linje 2:
Brønn nr 1 = Hae III-markør
Brønn nr 2 = 100 ul IO<-2>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med gummi,
Brønn nr 3 = 100 ul 10<-3>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med gummi,
Brønn nr 4 = 100 ul 10<-4>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med gummi,
Brønn nr 5 = 100 ul 10-5 fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med gummi,
Brønn nr 6 = 100 ul 10~<2>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med mannose,
Brønn nr 7 = 100 ul 10<-3>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med mannose,
Brønn nr 8 = 100 ul 10~<4>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med mannose,
Brønn nr 9 = 100 ul 10<-5>fortynning av S.flexnerii tilsatt til 200 ug Chemagen bestrøket med mannose
C. Isolasjon av genomisk DNA fra E.coli ved bruk av kruskaragen, mannose, gummi, mannan
Resultatene av amplifikasjonen vises på gelfotografiet på fig. 6.
Det finnes 6 linjer på gelen, som alle representerer E.coli.
Idet man leser fra den øvre venstre kant på gelen:
Linje 1:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2=100 ul 10<-1>fortynning av E.coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 3=100 ul 10<-2>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 4=100 ul IO<-3>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 5=100 ul 10<-4>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 6=100 ul 10-5 fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 7=100 ul IO<-6>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 8=100 ul 10<-7>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 9 = negativ kontroll
Linje 2:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2=100 ul 10<-1>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose,
Brønn nr 3=100 ul 10~<2>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose,
Brønn nr 4=100 ul 10<-3>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose,
Brønn nr 5=100 ul 10<-4>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose,
Brønn nr 6=100 ul 10<-5>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose,
Brønn nr 7=100 ul IO<-6>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose,
Brønn nr 8=100 ul 10<-7>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose.
Linje 3:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2=100 ul 10<-1>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 3=100 ul 10<-2>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 4=100 ul 10<-3>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 5=100 ul 10<-4>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 6=100 ul 10<-5>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 7=100 ul IO<-6>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 8=100 ul 10<-7>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi.
Linje 4:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2=100 ul 10<-1>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannan,
Brønn nr 3 = 100 ul 10<-2>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannan,
Brønn nr 4=100 ul 10<-3>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannan,
Brønn nr 5 = 100 ul 10<-4>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannan,
Brønn nr 6=100 ul 10<-5>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannan,
Brønn nr 7 = 100 ul IO<-6>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannan,
Brønn nr 8=100 ul 10<-7>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannan.
Linje 5:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2=100 ul 10<-1>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 3 = 100 ul 10<-2>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 4 = 100 ul 10<-3>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 5 = 100 ul 10<-4>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 6 = 100 ul 10<-5>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 7 = 100 ul IO<-6>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 8 = 100 ul 10<-7>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose.
Linje 6:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2 = 100 ul 10<-1>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 3 = 100 ul 10<-2>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 4 = 100 ul 10<-3>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 5 = 100 ul 10<-4>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 6 = 100 ul 10<-5>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 7 = 100 ul IO<-6>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 8 = 100 ul 10<-7>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi.
D. Isolasjon av genomisk DNA fra salmonella typhimurium ved bruk av kruskaragen, mannose, gummi, mannan
Resultatene av amplifikasjonen vises på gelfotografiet på fig. 7.
Idet man leser fra øvre venstre kant av gelen:
Linje 1:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2 = 100 ul 10<-1>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 3 = 100 ul 10<-2>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 4 = 100 ul 10<-3>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 5 = 100 ul 10<-4>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 6 = 100 ul 10<-5>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 7 = 100 ul IO-6 fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 8 = 100 ul 10<-7>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 9 = negativ kontroll.
Linje 2:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2 = 100 ul 10<_1>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose, Brønn nr 3 = 100 ul 10<-2>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose, Brønn nr 4 = 100 ul 10~<3>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose, Brønn nr 5 = 100 ul 10<-4>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose, Brønn nr 6 = 100 ul 10-5 fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose, Brønn nr 7 = 100 ul IO<-6>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose, Brønn nr 8 = 100 ul 10<-7>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose.
Linje 3:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2 = 100 ul 10<-1>fortynning av S.typhimurium til satt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi, Brønn nr 3 = 100 ul 10<-2>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi, Brønn nr 4 = 100 ul 10<-3>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi, Brønn nr 5 = 100 ul 10<-4>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi, Brønn nr 6 = 100 ul 10<-5>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi, Brønn nr 7 = 100 ul IO<-6>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi, Brønn nr 8 = 100 ul 10<-7>fortynning av S.typhimurium tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi.
Linje 4:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2 = 100 ul 10<-1>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannan,
Brønn nr 3 = 100 ul 10<-2>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannan,
Brønn nr 4 = 100 ul 10~<3>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannan,
Brønn nr 5 = 100 ul 10<-4>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannan,
Brønn nr 6 = 100 ul 10~<5>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannan,
Brønn nr 7 = 100 ul IO<-6>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannan,
Brønn nr 8 = 100 ul 10<-7>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannan.
Linje 5:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2 = 100 ul 10<-1>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 3 = 100 ul 10<-2>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 4 = 100 ul 10<-3>fortynning av S. typhimurium
tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 5 = 100 ul 10<-4>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 6 = 100 ul 10<-5>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 7 = 100 ul IO<-6>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 8 = 100 ul 10<-7>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose.
Linje 6:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2 = 100 ul 10<-1>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 3 = 100 ul 10<-2>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 4 = 100 ul IO<-3>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 5 = 100 ul 10<-4>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 6 = 100 ul 10~<5>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 7 = 100 ul IO<-6>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 8 = 100 ul 10~<7>fortynning av S. typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi, Isolasjon av DNA fra salmonella typhimurium
E. Isolasjon av DNA fra campylobacter jejuni ved bruk av guar, gummi, mannose og kruskaragen.
Resultatene av amplifikasjonen vises på gelfotografiet på fig. 8.
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2 = 100 ul 10<-1>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med guar,
Brønn nr 3 = 100 ul 10<-2>fortynning av C. jejuni tilsatt
til 200 ug Dynabeads bestrøket med guar,
Brønn nr 4 = 100 ul 10<-3>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med guar,
Brønn nr 5=100 ul 10<-4>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med guar,
Brønn nr 6 = 100 ul 10<-5>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med guar,
Brønn nr 7=100 ul IO<-6>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med guar,
Brønn nr 8=100 ul 10<-1>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 9=100 ul IO<-2>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 10 = 100 ul IO<-3>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 11=100 ul 10<-4>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 12=100 ul 10<-5>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 13 = 100 ul 10~<6>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 14=100 ul 10<-1>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 15 = 100 ul 10<-2>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 16 = 100 ul 10<-3>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 17 = 100 ul 10<-4>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 18 = 100 ul 10<-5>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 19 = 100 ul IO<-6>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med mannose,
Brønn nr 20=100 ul 10<-1>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose,
Brønn nr 21=100 ul 10<-2>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose,
Brønn nr 22=100 ul 10<-3>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose,
Brønn nr 23 = 100 ul 10<-4>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose,
Brønn nr 24=100 ul 10<-5>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose,
Brønn nr 25 = 100 ul IO<-6>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med mannose,
Brønn nr 26 = 100 ul 10<-1>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 27 = 100 ul 10<-2>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler, bestrøket med gummi,
Brønn nr 28 = 100 ul 10<-3>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 29 = 100 ul 10<-4>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 30 = 100 ul 10<-5>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 31 = 100 ul IO<-6>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 32=100 ul 10<_1>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 33 = 100 ul 10<-2>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 34=100 ul 10<-3>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 35 = 100 ul 10<-4>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 36 = 100 ul 10<-5>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 37=100 ul IO<-6>fortynning av C. jejuni tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen.
F. Isolasjon av genomisk DNA fra streptococcus pyogenes ved bruk av gummi, heparin, kruskaragen og dekstransulfat
Resultatene av amplifikasjonen vises på gelfotografiet på fig. 9.
Linje 1:
PCR utført på supernatant, adskilt fra perlene med en magnet etter inkubasjon ved 90°C i 5 minutter.
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2 = 100 ul 10<-1>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 3 = 100 ul IO<-2>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 4 = 100 ul IO<-3>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 5 = 100 ul 10<-4>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 6 = 100 ul 10~<5>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 7 = 100 ul IO<-6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 8 = 100 ul 10~<6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 9 = 100 ul IO<-6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
PCR utført på resten av perlene etter resuspensjon i vann.
Brønn nr 10 = 100 ul 10<-1>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 11 = 100 ul 10<-2>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 12 = 100 ul 10<-3>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 13 = 100 ul 10<-4>fortynning av S.pyogenes tilsatt
til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 14 = 100 ul 10<-5>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 15=100 ul IO<-6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi.
Linje 2:
PCR utført på supernatant, adskilt fra perlene med en magnet etter inkubasjon ved 90°C i 5 minutter.
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2=100 ul 10<-1>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin,
Brønn nr 3 = 100 ul 10<-2>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin,
Brønn nr 4=100 ul 10<-3>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin,
Brønn nr 5 = 100 ul 10<-4>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin,
Brønn nr 6=100 ul 10<-5>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin,
Brønn nr 7 = 100 ul IO<-6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin,
Brønn nr 8=100 ul IO<-6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin,
Brønn nr 9 = 100 ul IO<-6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin,
PCR utført på resten av perlene etter resuspensjon i vann.
Brønn nr 10=100 ul 10<-1>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin,
Brønn nr 11=100 ul IO<-2>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin,
Brønn nr 12=100 ul 10<-3>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin,
Brønn nr 13=100 ul 10<-4>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin,
Brønn nr 14=100 ul 10<-5>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin,
Brønn nr 15=100 ul IO<-6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin.
Linje 3:
PCR utført på supernatant, adskilt fra perlene med en magnet etter inkubasjon ved 90°C i 5 minutter.
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2=100 ul 10<-1>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 3=100 ul IO<-2>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 4=100 ul 10<-3>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 5=100 ul 10<-4>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 6=100 ul 10<-5>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 7=100 ul 10~<6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 8=100 ul IO<-6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 9=100 ul 10~<6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen,
PCR utført på resten av perlene etter resuspensjon i vann.
Brønn nr 10 = 100 ul 10<-1>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 11=100 ul 10<-2>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 12=100 ul 10<-3>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 13=100 ul 10<-4>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 14=100 ul 10<-5>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen, Brønn nr 15 = 100 ul IO<-6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen.
Linje 4:
PCR utført på supernatant, adskilt fra perlene med en magnet etter inkubasjon ved 90°C i 5 minutter.
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2 = 100 ul 10<-1>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat, Brønn nr 3=100 ul 10<-2>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat, Brønn nr 4 = 100 ul 10<-3>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat , Brønn nr 5=100 ul 10<-4>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat , Brønn nr 6 = 100 ul 10<-5>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat , Brønn nr 7=100 ul IO<-6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat , Brønn nr 8 = 100 ul IO<-6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat , Brønn nr 9=100 ul IO<-6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat ,
PCR utført på resten av perlene etter resuspensjon i vann.
Brønn nr 10=100 ul 10<-1>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat , Brønn nr 11=100 ul 10<-2>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat , Brønn nr 12=100 ul 10<-3>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat , Brønn nr 13=100 ul 10<-4>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat, Brønn nr 14=100 ul 10<-5>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat,
Brønn nr 15 = 100 ul IO<-6>fortynning av S.pyogenes tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat
6. Isolasjon av genomisk DNA fra Neisseria gonorrhoeae ved bruk av gummi, heparin, kruskaragen og dekstransulfat
Resultatene av amplifikasjonen er vist på gelfotografiet av fig. 10.
Linje 1:
PCR utført på supernatant, adskilt fra perlene med en magnet etter inkubasjon ved 90°C i 5 minutter.
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2=100 ul 10<-1>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi, Brønn nr 3 = 100 ul 10-<2>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi, Brønn nr 4=100 ul 10<-3>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi, Brønn nr 5 = 100 ul 10-<4>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
PCR utført på resten av perlene etter resuspensjon i vann.
Brønn nr 6=100 ul 10<-5>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi, Brønn nr 7=100 ul IO<-6>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi, Brønn nr 8=100 ul IO<-6>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi, Brønn nr 9=100 ul IO<-6>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med gummi,
Linje 2:
PCR utført på supernatant, adskilt fra perlene med en magnet etter inkubasjon ved 90°C i 5 minutter.
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2 = 100 ul 10<-1>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin, Brønn nr 3=100 ul 10<-2>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin, Brønn nr 4 = 100 ul 10<-3>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin, Brønn nr 5=100 ul 10<-4>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin,
PCR utført på resten av perlene etter resuspensjon i vann.
Brønn nr 6=100 ul 10<-5>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin, Brønn nr 7=100 ul IO<-6>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin, Brønn nr 8=100 ul IO<-6>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin, Brønn nr 9=100 ul IO<-6>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med heparin.
Linje 3:
PCR utført på supernatant, adskilt fra perlene med en magnet etter inkubasjon ved 90°C i 5 minutter.
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2=100 ul 10<-1>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 3=100 ul 10<-2>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 4=100 ul 10<-3>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 5=100 ul 10<-4>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen,
PCR utført på resten av perlene etter resuspensjon i vann.
Brønn nr 6 = 100 ul 10<-5>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 7=100 ul IO<-6>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 8=100 ul IO<-6>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen,
Brønn nr 9=100 ul IO<-6>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med kruskaragen .
Linje 4:
PCR utført på supernatant, adskilt fra perlene med en magnet etter inkubasjon ved 90°C i 5 minutter.
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2=100 ul 10"<1>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat,
Brønn nr 3=100 ul 10<-2>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat,
Brønn nr 4=100 ul 10<-3>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat,
Brønn nr 5=100 ul 10<-4>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat,
PCR utført på resten av perlene etter resuspensjon i vann.
Brønn nr 6=100 ul 10<-5>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat,
Brønn nr 7=100 ul IO<-6>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat,
Brønn nr 8=100 ul IO<-6>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat,
Brønn nr 9 = 100 ul IO<-6>fortynning av N. gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med dekstransulfat .
EKSEMPEL 11
Eksperimentet ble utført på ren kultur av en kreft-B-celle-linje benevnt J558L. Primerne som ble brukt var:
Øvre: 5' CCCGCCCCTTGCCTCTC 3'
Nedre: 5' TGGTCGCTCGCTCCTCTC 3'
Resultatene av ampiifikasjonen vises på gelfotografiet på fig. 11. PCR ble utført på supernatanten, adskilt fra perlene med en magnet etter inkubasjon ved 90°C i 5 minutter.
Linje 1:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2=100 ul 10<-0>fortynning av B-celler tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med type V kruskaragen,
Brønn nr 3=100 ul 10<-1>fortynning av B-celler tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med type V kruskaragen,
Brønn nr 4=100 ul 10<-2>fortynning av B-celler tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med type V kruskaragen,
Brønn nr 5=100 ul 10<-3>fortynning av B-celler tilsatt til 200 ug Chemagen-perler bestrøket med type V kruskaragen .
Linje 2:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2 = 100 ul 10<-0>fortynning av B-celler tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med type I kruskaragen, Brønn nr 3=100 ul 10<-1>fortynning av B-cellertilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med type I kruskaragen, Brønn nr 4 = 100 ul 10<-2>fortynning av B-celler tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med type I kruskaragen, Brønn nr 5=100 ul 10<-3>fortynning av B-celler tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med type I kruskaragen.
Linje 3:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2=100 ul 10<-0>fortynning av B-celler tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med type II kruskaragen, Brønn nr 3=100 ul 10<-1>fortynning av B-cellertilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med type II kruskaragen, Brønn nr 4=100 ul 10~<2>fortynning av B-celler tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med type II kruskaragen, Brønn nr 5=100 ul 10<-3>fortynning av B-celler tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med type II kruskaragen.
Linje 4:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2=100 ul 10<-0>fortynning av B-celler tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med type V kruskaragen, Brønn nr 3 = 100 ul 10<-1>fortynning av B-celler tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med type V kruskaragen, Brønn nr 4=100 ul 10<-2>fortynning av B-celler tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med type V kruskaragen, Brønn nr 5=100 ul 10<-3>fortynning av B-celler tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med type V kruskaragen.
De forskjellige typer kruskaragen som ble brukt (med sine produktnumre i Sigma-katalogen): Type I-kruskaragen: hovedsakelig kappa-kruskaragen : C1013 Type II-kruskaragen: hovedsakelig iota-kruskaragen : C1138 Type V-kruskaragen: iota-kruskaragen : C-3889
EKSEMPEL 12
E. coli ble isolert fra perler som var bestrøket med GUM i henhold til protokollen fra eksempel 8. De ubestrøkne perler gjennomgikk den samme bestrykningsprosedyre som de be-strøkne perler, men det ble ikke tilsatt noe sukker. Man fulgte isolasjonsprotokollen fra eksempel 9 i henhold til de følgende fortynninger:
Linje 1:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2=100 ul 10<-1>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug ubestrøkne Dynabeads perler,
Brønn nr 3=100 ul 10<-1>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 4=100 ul 10~<2>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug ubestrøkne Dynabeads perler,
Brønn nr 5=100 ul 10<-2>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 6=100 ul 10~<3>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug ubestrøkne Dynabeads perler,
Brønn nr 7=100 ul 10<-3>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads perler bestrøket med gummi.
Brønn nr 8=100 ul 10<-4>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug ubestrøkne Dynabeads perler,
Brønn nr 9=100 ul 10<-4>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads perler bestrøket med gummi.
Linje 2:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2=100 ul 10<-5>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug ubestrøkne Dynabeads perler bestrøket,
Brønn nr 3=100 ul 10<-5>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 4=100 ul IO<-6>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug ubestrøkne Dynabeads perler bestrøket,
Brønn nr 5=100 ul IO<-6>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads perler bestrøket med gummi,
Brønn nr 7=100 ul 10<-7>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug ubestrøkne Dynabeads perler bestrøket,
Brønn nr 8=100 ul 10<-7>fortynning av E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads perler bestrøket med gummi.
Resultatene av amplifikasjonen vises på gelfotografiet i fig. 12.
EKSEMPEL 13
Forskjellige bakteriespesier ble isolert fra perler som var blitt bestrøket med GUM i henhold til protokollen fra eksempel 8. Man fulgte isolasjonsprotokollen fra eksempel 9, og resultatene fra amplifikasjonen vises på gelfotografiet på fig. 13 hvor:
Linje 1:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2 = 100 ul ufortynnet Shigella flexneri tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 3 = 100 ul ufortynnet Vibrio cholerae tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 4 = 100 ul ufortynnet Aeromonas hydrophila tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 5 = 100 ul ufortynnet Streptococcus pneumonia tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 6 = 100 ul ufortynnet Streptococcus pyogenes tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 7 = 100 ul ufortynnet Salmonella typhimurium tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi.
Brønn nr 8 = 100 ul ufortynnet Yersinia enterocolitica tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi.
Line 2:
Brønn nr 1 = Hae III-markør,
Brønn nr 2 = 100 ul ufortynnet E. coli tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 3 = 100 ul ufortynnet Listeria monocytogenes tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 4 = 100 ul ufortynnet Clostridium perfringens tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 5 = 100 ul ufortynnet Bacillus cereus tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 6 = 100 ul ufortynnet Campylobacter jejuni tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi,
Brønn nr 7 = 100 ul ufortynnet Neissseria gonorrhoeae tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi.
Brønn nr 8 = 100 ul ufortynnet Bordetella pertussis tilsatt til 200 ug Dynabeads bestrøket med gummi.
Primerne for bordetella var de samme som for Nesseria (se tabell 1).

Claims (22)

1. Fremgangsmåte for isolasjon av celler fra en prøve, hvilken fremgangsmåte omfatter å binde cellene til en fast bærer ved hjelp av en ikke-spesifikk ligand immobilisert på den faste bærer, hvor nevnte ligand er et polysakkarid omfattende mannose og/eller galaktose og/eller et derivat derav og hvor nevnte polysakkarid omfatter 13 eller flere kovalent bundne monosakkaridenheter.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor cellene er mikroorganismer.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, hvor mikroorganismene er bakterier.
4. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 3, hvor liganden er et næringsstoff.
5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av krav ene 1 til 4, hvor liganden er valgt fra gruppen omfattende gummi, guar, carrageenan og mannan.
6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 5, hvor den faste bærer er partikkelformet.
7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 6, som ytterligere omfatter et trinn med å identifisere én eller flere av cellene som bindes til den faste bærer.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, hvor cellene identifiseres ved bruk av en celletypespesifikk nukleinsyreprobe.
9. Fremgangsmåte ifølge kravene 7 eller 8, hvor de bundne celler spaltes for å frigi deres nukleinsyre.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor den frigitte nukleinsyre bindes til en fast bærer.
11. Fremgangsmåte ved påvisning av en celle i en prøve, hvilken fremgangsmåte omfatter å: (a) binde cellen til en fast bærer ved hjelp av en ikke-spesifikk ligand som er immobilisert på den faste bærer, hvor nevnte ligand er et polysakkarid omfattende mannose og/eller galaktose og/eller et derivat derav og hvor nevnte polysakkarid omfatter 13 eller flere kovalent bundne monosakkaridenheter; og (b) identifisere cellen som er bundet til den faste bærer.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, hvor trinn (b) omfatter å lysere cellen.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvor nukleinsyren som frigis fra de lyserte celler, bindes til en fast bærer.
14. Fast bærer som har en ligand immobilisert på seg som har evnen til å binde celler på ikke-spesifikk måte, hvor nevnte ligand er et polysakkarid omfattende mannose og/eller galaktose og/eller et derivat derav og hvor nevnte polysakkarid omfatter 13 eller flere kovalent bundne monosakkaridenheter.
15. Anvendelse av en fast bærer ifølge krav 14 ved adskillelse av celler fra en prøve.
16. Anvendelse ifølge krav 15, hvor cellene er mikroorganismer.
17. Fremgangsmåte ved isolasjon av nukleinsyre fra en prøve av celler, hvilken fremgangsmåte omfatter å: (a) binde cellene i prøven til en fast bærer ved hjelp av en ikke-spesifikk ligand som er immobilisert på den faste bærer, hvor nevnte ligand er et polysakkarid omfattende mannose og/eller galaktose og/eller et derivat derav og hvor nevnte polysakkarid omfatter 13 eller flere kovalent bundne monosakkaridenheter; (b) spalte de bundne celler; og (c) binde nukleinsyren som ble frigitt fra de spaltede celler, til en fast bærer.
18. Fremgangsmåte ved påvisning av nærvær eller fravær av en bestemt celle i en prøve, hvilken fremgangsmåte omfatter å: (a) binde celler i prøven til en fast bærer ved hjelp av en ikke-spesifikk ligand som er immobilisert på den faste bærer, hvor nevnte ligand er et polysakkarid omfattende mannose og/eller galaktose og/eller et derivat derav og hvor nevnte polysakkarid omfatter 13 eller flere kovalent bundne monosakkaridenheter; (b) spalte de bundne celler; (c) binde nukleinsyre som frigis fra de spaltede celler til en fast bærer; og (d) påvise nærvær eller fravær av nukleinsyre som er karakteristisk for de tilsiktede celler blant den bundne nukleinsyre.
19. Fremgangsmåte ifølge krav 17 eller 18, hvor nukleinsyren bindes til den samme faste bærer som cellene.
20. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 17 - 19, hvor cellene er mikroorganismer.
21. Sett for å isolere mikroorganismer fra en prøve omfattende: (a) en fast bærer som har en ligand immobilisert på seg som har evnen til ikke-spesifikk binding til mikroorganismer, hvor nevnte ligand er et polysakkarid omfattende mannose og/eller galaktose og/eller et derivat derav og hvor nevnte polysakkarid omfatter 13 eller flere kovalent bundne monosakkaridenheter; (b) et hjelpemiddel for å binde mikroorganismer til den faste bærer; valgfritt (c) et hjelpemiddel for å spalte cellene; og valgfritt (d) et hjelpemiddel for å binde nukleinsyre som frigis fra de spaltede celler til en fast bærer.
22. Fremgangsmåte, fast støttemateriale, anvendelse eller sett ifølge ethvert av kravene 1 til 4 og 6 til 21, hvor nevnte derivat er valgt fra gruppen bestående av aldoninsyre, uroninsyre, deoksy-, amino-, sulfaterte og alkohol-derivater av galaktose eller mannose og anhydrogalaktose.
NO20023474A 2000-01-21 2002-07-19 Fremgangsmate for isolasjon og pavisning av celler ved binding til en fast baerer med en uspesifikk polysakkaridligand, samt et sett for isolering av mikroorganismer fra en prove. NO332049B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0001450.6A GB0001450D0 (en) 2000-01-21 2000-01-21 Cell isolation method
PCT/GB2001/000240 WO2001053525A2 (en) 2000-01-21 2001-01-22 Cell isolation method

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO20023474D0 NO20023474D0 (no) 2002-07-19
NO20023474L NO20023474L (no) 2002-09-20
NO332049B1 true NO332049B1 (no) 2012-06-11

Family

ID=9884139

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20023474A NO332049B1 (no) 2000-01-21 2002-07-19 Fremgangsmate for isolasjon og pavisning av celler ved binding til en fast baerer med en uspesifikk polysakkaridligand, samt et sett for isolering av mikroorganismer fra en prove.

Country Status (13)

Country Link
US (1) US7964364B2 (no)
EP (2) EP1865068B1 (no)
JP (1) JP4594577B2 (no)
CN (2) CN101560545B (no)
AT (2) ATE549414T1 (no)
AU (2) AU785041B2 (no)
CA (1) CA2397067C (no)
DE (1) DE60129000T2 (no)
DK (1) DK1252328T3 (no)
ES (1) ES2288925T3 (no)
GB (1) GB0001450D0 (no)
NO (1) NO332049B1 (no)
WO (1) WO2001053525A2 (no)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7521178B1 (en) * 1998-04-23 2009-04-21 Takara Bio Inc. Method for synthesizing DNA
DE10129815A1 (de) 2001-06-24 2003-01-09 Profos Ag Verfahren zur Aufreinigung von Bakterienzellen und Zellbestandteilen
DE10230147A1 (de) 2001-10-09 2004-01-15 Profos Ag Verfahren zur unspezifischen Anreicherung von Bakterienzellen
US20040014154A1 (en) * 2002-02-01 2004-01-22 Adrian Ponce Methods and apparatus for assays of bacterial spores
US7419798B2 (en) * 2004-10-19 2008-09-02 Zybac Llc Rapid and sensitive detection of bacteria in blood products, urine, and other fluids
US7439062B2 (en) * 2004-12-23 2008-10-21 Biocept, Inc. Beads for capturing target cells from bodily fluid
US20090136982A1 (en) * 2005-01-18 2009-05-28 Biocept, Inc. Cell separation using microchannel having patterned posts
US20060252087A1 (en) * 2005-01-18 2006-11-09 Biocept, Inc. Recovery of rare cells using a microchannel apparatus with patterned posts
DE102005002342A1 (de) * 2005-01-18 2006-07-20 GEN-Institut für Angewandte Laboranalysen GmbH Verfahren sowie Kit zur Sterilisierung von Mikroorganismen enthaltenden Flüssigkeiten
KR20070116585A (ko) 2005-01-18 2007-12-10 바이오셉트 인코포레이티드 패턴화된 포스트를 갖는 마이크로채널을 이용하는 세포분리법
US8158410B2 (en) 2005-01-18 2012-04-17 Biocept, Inc. Recovery of rare cells using a microchannel apparatus with patterned posts
KR101157174B1 (ko) * 2005-11-24 2012-06-20 삼성전자주식회사 세포 또는 바이러스의 신속한 파괴 방법 및 장치
GB0525231D0 (en) * 2005-12-12 2006-01-18 Genpoint As Method
AU2006325531B2 (en) 2005-12-13 2012-04-19 Exthera Medical Corporation Method for extracorporeal removal of a pathogenic microbe, an inflammatory cell or an inflammatory protein from blood
US7695956B2 (en) * 2006-01-12 2010-04-13 Biocept, Inc. Device for cell separation and analysis and method of using
GB0601302D0 (en) * 2006-01-23 2006-03-01 Semikhodskii Andrei Diagnostic methods and apparatus
ATE517192T1 (de) * 2006-08-10 2011-08-15 Merck Patent Gmbh Verfahren zur isolierung von zellen
US20080044880A1 (en) * 2006-08-21 2008-02-21 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of and apparatus for separating microorganisms from sample using electrodialysis and microorganism capturing means
JP2008167722A (ja) 2007-01-15 2008-07-24 Konica Minolta Medical & Graphic Inc 磁性支持体上での加熱による核酸単離方法
US20100151469A1 (en) * 2007-04-25 2010-06-17 Wensheng Xia Sample-processing reagent compositions, methods, and devices
CA2685229A1 (en) * 2007-04-26 2008-11-06 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Health Process for isolating microorganisms from samples and system, apparatus and compositions therefor
FR2945819B1 (fr) 2009-05-19 2011-06-17 Commissariat Energie Atomique Dispositif et procede d'isolement de cibles biologiques ou chimiques
GB2475226A (en) 2009-11-03 2011-05-18 Genetic Analysis As Universal Prokaryote 16S ribosome PCR primer pair
WO2011068897A1 (en) 2009-12-01 2011-06-09 Exthera Medical, Llc Method for removing cytokines from blood with surface immobilized polysaccharides
EP2377920A1 (de) * 2010-04-15 2011-10-19 Qiagen GmbH Verfahren zur unspezifischen Anreicherung von Mikroorganismen
GB201011152D0 (en) * 2010-07-02 2010-08-18 Microsens Medtech Ltd Capture of micro-organisms
WO2012016107A1 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Sdix Methods and kits for detection of salmonella enteritidis and related serovars
GB201021397D0 (en) 2010-12-16 2011-01-26 Genetic Analysis As Diagnosis of Crohn's disease
GB201021399D0 (en) 2010-12-16 2011-01-26 Genetic Analysis As Oligonucleotide probe set and methods of microbiota profiling
GB201102693D0 (en) 2011-02-16 2011-03-30 Genetic Analysis As Method for identifying neonates at risk for necrotizing enterocolitis
KR20140023326A (ko) * 2011-06-06 2014-02-26 비오까르띠 에스아 이온성 계면활성제에 의한 세포의 선택적 용해
DK2861273T3 (da) 2012-06-13 2017-11-27 Exthera Medical Corp Anvendelse af heparin og kulhydrater til behandling af cancer.
US9759721B2 (en) * 2013-01-22 2017-09-12 Imicroq, S.L. Rapid method for detection of pathogen
JP6648009B2 (ja) 2013-06-24 2020-02-14 エクステラ・メディカル・コーポレーション マンノース被覆基材を含有する血液濾過システム
WO2015062699A1 (en) * 2013-10-30 2015-05-07 Merck Patent Gmbh Method for isolating microorganisms from a complex sample
MX2016005959A (es) 2013-11-08 2016-10-14 Exthera Medical Corp Métodos para diagnosticar enfermedades infecciosas usando medio de adsorción.
BR112016024569B1 (pt) 2014-04-24 2023-01-03 Exthera Medical Corporation Método ex vivo para remover bactérias de uma amostra retirada de um indivíduo que é suspeito de estar infectado com a mesma
MX2017003723A (es) 2014-09-22 2017-06-30 Exthera Medical Corp Dispositivo de hemoperfusion portatil.
US9594377B1 (en) * 2015-05-12 2017-03-14 Google Inc. Auto-height swing adjustment
EP3422943A4 (en) 2016-03-02 2019-10-16 ExThera Medical Corporation METHOD OF TREATING DRUG ENTRIES
US11911551B2 (en) 2016-03-02 2024-02-27 Exthera Medical Corporation Method for treating drug intoxication
GB201617519D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Genetic Analysis As A companion diagnostic method for use in the treatment of irritable bowel syndrome with dietary interventions or faecal microbiota transplant
DE102017204267B4 (de) 2017-03-14 2021-05-27 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren zur anreicherung von zellen aus einer probe und der nachfolgenden nukleinsäureisolierung aus diesen zellen
US11447811B2 (en) 2017-07-17 2022-09-20 smartDNA Pty Ltd Method of diagnosing a dysbiosis
GB201712459D0 (en) 2017-08-02 2017-09-13 Norges Miljø-Og Biovitenskapelige Univ Treatment or prevention of gastrointestinal dysbiosis
US11041855B2 (en) * 2018-03-05 2021-06-22 Board Of Trustees Of Michigan State University Non-specific, wireless detection of electrically or magnetically labeled bacteria and/or virus
GB201805479D0 (en) * 2018-04-03 2018-05-16 Momentum Bioscience Ltd Microorganism separation and detection
CN111705052B (zh) * 2020-07-15 2022-02-22 同济大学 一种厌氧固定化菌剂、制备方法及其应用
GB201914538D0 (en) 2019-10-08 2019-11-20 Momentum Bioscience Ltd Microorganism capture from antimicrobial-containing solution

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4111838A (en) * 1977-09-09 1978-09-05 Eastman Kodak Company Composition for chromatography
AU530410B2 (en) 1978-02-21 1983-07-14 Sintef Preparing aqueous emulsions
SE452336B (sv) * 1978-06-16 1987-11-23 Boehringer Mannheim Gmbh Forfarande for pavisning av sjukdomsalstrande mikroorganismer vilka adsorberats extrakorporalt pa en selektivt bindande adsorbent
NO155316C (no) 1982-04-23 1987-03-11 Sintef Fremgangsmaate for fremstilling av magnetiske polymerpartikler.
US4791063A (en) * 1983-02-14 1988-12-13 Cuno Incorporated Polyionene transformed modified polysaccharide supports
US4689294A (en) * 1984-11-19 1987-08-25 Miles Laboratories, Inc. Enhancement of hybridization of nucleic acids by anionic polymers
US4978616A (en) * 1985-02-28 1990-12-18 Verax Corporation Fluidized cell cultivation process
US4719182A (en) * 1985-03-18 1988-01-12 Eastman Kodak Company Fluorescent labels and labeled species and their use in analytical elements and determinations
US4935147A (en) 1985-12-20 1990-06-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Particle separation method
US5034314A (en) * 1986-12-22 1991-07-23 Olin Corporation Method and kit for separating double-stranded nucleic acid from a single-stranded/double-stranded mixture of nucleic acids
US4929452A (en) * 1987-09-30 1990-05-29 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method for rapidly fermenting alcoholic beverages
SE8704158L (sv) * 1987-10-26 1989-04-27 Carbomatrix Ab C O Ulf Schroed Mikrosfaerer, foerfarande foer framstaellning daerav och anvaendning daerav
US5225330A (en) * 1988-08-01 1993-07-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Diagnostic kit and diagnostic method utilizing carbohydrate receptors
NL8900725A (nl) 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
GB9003253D0 (en) 1990-02-13 1990-04-11 Amersham Int Plc Precipitating polymers
US5270189A (en) * 1990-07-03 1993-12-14 Martin Marietta Energy Systems, Inc. Biparticle fluidized bed reactor
DE69130536T2 (de) 1990-08-02 1999-04-22 Antex Biolog Inc Adhäsionsrezeptoren für pathogene oder opportunistische mikroorganismen
US5486457A (en) * 1993-08-25 1996-01-23 Children's Medical Center Corporation Method and system for measurement of mechanical properties of molecules and cells
US5773223A (en) * 1993-09-02 1998-06-30 Chiron Corporation Endothelin B1, (ETB1) receptor polypeptide and its encoding nucleic acid methods, and uses thereof
GB9425138D0 (en) 1994-12-12 1995-02-08 Dynal As Isolation of nucleic acid
US5965457A (en) * 1995-06-06 1999-10-12 Magnani; John L. Methods of screening for a candidate compound able to bind to CD34+ cells
DE19528029B4 (de) 1995-07-31 2008-01-10 Chemagen Biopolymer-Technologie Aktiengesellschaft Magnetische Polymerpartikel auf der Basis von Polyvinylalkohol, Verfahren für ihre Herstellung und Verwendung
GB9709728D0 (en) 1997-05-13 1997-07-02 Dynal As Single step method
EP1118676A2 (en) * 2000-01-21 2001-07-25 Chemagen AG Cell isolation method

Also Published As

Publication number Publication date
EP1252328B1 (en) 2007-06-20
JP2003520048A (ja) 2003-07-02
AU2006246478A1 (en) 2006-12-21
US7964364B2 (en) 2011-06-21
US20030153028A1 (en) 2003-08-14
EP1252328A2 (en) 2002-10-30
NO20023474D0 (no) 2002-07-19
ATE365225T1 (de) 2007-07-15
AU2695901A (en) 2001-07-31
AU2006246478B2 (en) 2010-09-30
CN101560545A (zh) 2009-10-21
ES2288925T3 (es) 2008-02-01
NO20023474L (no) 2002-09-20
CN100507001C (zh) 2009-07-01
ATE549414T1 (de) 2012-03-15
AU785041B2 (en) 2006-08-31
WO2001053525A3 (en) 2001-12-27
CA2397067A1 (en) 2001-07-26
DK1252328T3 (da) 2007-10-15
EP1865068B1 (en) 2012-03-14
CN101560545B (zh) 2012-07-18
CN1395620A (zh) 2003-02-05
WO2001053525A2 (en) 2001-07-26
DE60129000D1 (de) 2007-08-02
DE60129000T2 (de) 2008-04-10
CA2397067C (en) 2012-02-28
JP4594577B2 (ja) 2010-12-08
EP1865068A3 (en) 2010-04-07
EP1865068A2 (en) 2007-12-12
GB0001450D0 (en) 2000-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO332049B1 (no) Fremgangsmate for isolasjon og pavisning av celler ved binding til en fast baerer med en uspesifikk polysakkaridligand, samt et sett for isolering av mikroorganismer fra en prove.
JP7408229B2 (ja) ポリヌクレオチド捕捉材料およびその使用方法
Stevens et al. Bacterial separation and concentration from complex sample matrices: a review
JPH0767693A (ja) 生物体の検出方法
US20090186346A1 (en) Method for Detecting the Presence or Absence of a Target Cell in a Sample
WO2016024263A1 (en) Methods for isolating microbial dna from a blood sample
WO2016164407A2 (en) Detection of one or more pathogens
Rodrigues et al. Rapid detection of salmonellas in raw meats using a fluorescent antibody‐microcolony technique
EP1118676A2 (en) Cell isolation method
EP1668160B1 (en) Methods, compositions, and kits for the concentration and detection of microorganisms
CN114207154A (zh) 用于检测一种或多种病原体的选择性富集肉汤
US20060110749A1 (en) Primer composition and method of using the same in the detection of Shigella sonnei
JPH0994098A (ja) 微生物の選択的濃縮方法およびこれを用いた微生物検査法
Stevens The role of molecular methods in the detection of pathogens in food
AU2004274915B2 (en) Methods, compositions, and kits for the concentration and detection of microorganisms
Drosinos et al. 13 Microbial Foodborne Pathogens
Lucore Methods used to separate and concentrate bacteria from foods
Drosinos et al. 13 Microbial Foodborne
Fratamico Detecting pathogens in cattle and meat PM Fratamico, A. Gehring, J. Karns and J. van Kessel, United States Department of Agriculture
JPH0956399A (ja) 微生物の選択的濃縮方法及びこれを用いた微生物検査法

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees