ES2288925T3 - Metodo y medios para aislar microorganismos. - Google Patents
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Abstract
Un método para aislar los microorganismos de una muestra, método que comprende unir dichos microorganismos a un soporte sólido por medio de un ligando inespecífico inmovilizado sobre dicho soporte sólido, en el que dicho ligando es un polisacárido que comprende manosa y/o galactosa y/o derivados de las mismas, incluyendo derivados sulfatados, en el que dicho polisacárido comprende 13 o más unidades monosacáridas covalentemente enlazadas.
Description
Método y medios para aislar microorganismos.
El presente invento se refiere a un método para
aislar los microorganismos presentes en una muestra; en particular,
a un método para aislar las bacterias presentes en una muestra.
La mayoría de las técnicas actuales con las que
se trata de analizar cualitativa y cuantitativamente muestras en
cuanto a la presencia de microorganismos están dirigidas a la
identificación de un microorganismo específico, tal como, por
ejemplo, un agente patógeno. Se ha descrito la separación
inmunomagnética de cepas de Listeria y Salmonella a
partir de muestras alimentarias y clínicas (véase, por ejemplo,
Skjerve et al., Appl. Environ. Microbiol. 1990,
3478-3481). Dichas técnicas se basan en el uso de
ligandos, generalmente anticuerpos, específicos para el
microorganismo de interés. Puesto que se basa en el uso de ligandos
específicos, la separación inmunomagnética sólo es aplicable en
situaciones en que se busca identificar un microorganismo concreto y
no cuando se desea una exploración general de los microorganismos
que pueden estar presentes. La separación inmunomagnética no
descubrirá fácilmente microorganismos insospechados.
Hay situaciones, por ejemplo cuando se analizan
muestras ambientales, tales como muestras de agua, en las que puede
ser deseable obtener una imagen completa de las diferentes especies
de microorganismos presentes o una estimación de la concentración
total de microorganismos. Se pueden poner límites a la cantidad
total de bacterias que pueden estar presentes en el suministro de
agua, lo que es independiente de un interés acerca de la presencia
de bacterias concretas. La identificación de muchas clases de
microorganismos en, por ejemplo, un río o lago, puede proporcionar
una información útil acerca del estado de esa masa de agua, los
niveles de nutrientes, la fuga de productos agroquímicos, etc.
Si se puede proporcionar un método general para
aislar los microorganismos de una muestra, la identificación de los
microorganismos concretos presentes puede ser luego llevada
convenientemente a cabo en una operación subsiguiente. Para
identificar microorganismos específicos, se podrían utilizar
convenientemente ensayos basados en ácido nucleico.
En el documento WO91/06007 se describe un método
para aislar microorganismos usando glicolípidos con grupos
carbohidrato formados por menos de 13 subunidades monosacáridas. En
el documento US 5.696.000 también se describen glicolípidos que se
unen a microorganismos. Los grupos carbohidrato tienen cuatro o
menos subunidades monosacáridas. En el documento US 4.543.328 se
describe un procedimiento para detectar agentes patógenos en sangre,
en el que se utilizan absorbentes biocompatibles que se unen
selectivamente al agente patógeno. Los absorbentes se hacen
biocompatibles por copulación con heparina y/o albúmina que actúan
como agentes antitrombogénicos. En el documento US 4.935.147 se
describe un método para promover la unión inespecífica entre
partículas magnéticas y no magnéticas. La unión es inducida por un
reactivo poliiónico soluble.
Los métodos actualmente utilizados para obtener
estimaciones de la cantidad total de microorganismos presentes en
una muestra o para aislar los microorganismos de la muestra para un
análisis ulterior se basan en técnicas de separación más bien
toscas que implican filtración y/o centrifugación y el cultivo en
placas de agar. La determinación de la concentración bacteriana
total puede ser llevada a cabo por citometría de flujo o por
filtración y cultivo en un medio general en, por ejemplo, una placa
Petri. Estos métodos pueden durar varios días y son bastante
complejos e imprecisos. Se han observado problemas particulares con
los métodos convencionales utilizados para analizar muestras de
alimentos ya que éstas contienen una gran cantidad de materia sólida
(agregados y partículas grasas) que tiende a bloquear los filtros y
a producir, después de la centrifugación, un sedimento en el que
las bacterias están atrapadas, no quedando asequibles a la lisis ni
a la unión con anticuerpos.
Por lo tanto, existe la necesidad de un método
mediante el cual se pueda aislar un número de diferentes especies
de microorganismos a partir de una muestra, preferiblemente en una
sola operación, que sea rápido y conveniente de llevar a cabo.
El presente invento se enfrenta a estas
necesidades y, de esta manera, de acuerdo con un aspecto del
presente invento se proporciona un método para aislar los
microorganismos de una muestra, método que comprende unir dichos
microorganismos a un soporte sólido por medio de un ligando
inespecífico inmovilizado sobre dicho soporte sólido, en el que
dicho ligando es un polisacárido que comprende manosa y/o galactosa
y/o derivados de las mismas, incluyendo derivados sulfatados, en el
que dicho polisacárido comprende 13 o más unidades monosacáridas
covalentemente enlazadas.
Por lo tanto, el presente invento proporciona,
por medio de la utilización de las interacciones entre ligandos
inespecíficos fijados a soportes sólidos y parejas de unión para
dichos ligandos (receptores) que se hallan en la superficie de los
microorganismos, un método de separación general que permite la
captura de muchas clases de microorganismos. Puesto que la esencia
del presente invento es la interacción inespecífica entre el
ligando inmovilizado y los microorganismos, cuando aquí se hace
referencia a "aislar microorganismos" se quiere describir el
aislamiento de microorganismos de un modo no especifico para la
especie y no especifico para el género. En otras palabras, el
ligando inmovilizado es capaz de unirse a varios géneros de
microorganismos, al menos a 2 géneros diferentes, preferiblemente a
3 o más, más preferiblemente a al menos 5 o 7 géneros diferentes,
muy preferiblemente a al menos 10 o incluso 14 o más géneros
diferentes.
De esta manera, el presente invento proporciona
un método general para aislar los microorganismos, especialmente
las bacterias, de los demás componentes de una muestra. El método es
"general" en el sentido de que no se centra en una especie
bacteriana sino que se lleva a cabo un sistema de separación grosero
para obtener información acerca de la población total de
microorganismos o para facilitar una segunda operación a través de
la cual se obtenga una información específica de las especies, por
ejemplo, a nivel del ácido nucleico usando sondas específicas para
las especies.
Los microorganismos son "aislados" ya que
se unen al soporte sólido y pueden ser luego separados del resto de
la muestra retirando el soporte sólido con los microorganismos
unidos a él o retirando el resto de la muestra mediante, por
ejemplo, decantación. Cuando soporte sólido es magnético, la
manipulación del complejo de soporte/microorganismo es especialmente
conveniente.
El método del presente invento puede ser
utilizado para aislar una gran variedad de microorganismos,
incluyendo todos los microorganismos que pueden unirse a células
eucarióticas, incluyendo protistas, algas, protozoos y hongos, así
como micoplasmas y todas las bacterias y virus. Los métodos del
invento pueden ser utilizados en el aislamiento de parásitos
eucarióticos, particularmente de aquellos que son capaces de unirse
a los polisacáridos complejos hallados en células humanas (u otros
organismos huésped). Dichos parásitos eucarióticos incluyen
Cryptosporodium, Entamoeba histolytica y el parásito de la
malaria. Por lo tanto, ha de considerarse que una referencia aquí a
"microorganismos" incluye dichos parásitos.
Los métodos del invento son particularmente
adecuados para la aislamiento de bacterias. La clasificación
bacteriana es una ciencia compleja y siempre cambiante, pero las
bacterias "verdaderas" (eubacterias) pueden ser divididas en
un número de Partes ("Manual of Determinative Biology" de
Bergey); por ejemplo, bacterias fototróficas, bacterias
deslizantes, bacterias con vaina, y cocos Gram positivos. Cada
Parte, a su vez, puede ser dividida en uno o más órdenes, con
familias y géneros en ese orden. Usando los métodos del presente
invento se pueden aislar bacterias de más de un género, familia u
orden, o incluso Parte. Usando los métodos presentes se puede
llevar a cabo una separación eficaz de algunas o todas las
siguientes familias y géneros de bacterias procedentes de una
muestra de bacterias: Aeromonas, Bacillus, Campylobacter,
Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Escherichia (patógena y no
patógena), Hafnia, Klebsiella, Listeria, Proteus, Salmonella,
Shewanella, Serratia, Shigella, Vibrio, Yersinia, Morganella,
Photobacterium, Streptococcus, Lactococcus, Staphylococcus,
Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus y
Brochothrix.
El método puede ser utilizado para aislar
simultáneamente bacterias y otros tipos de microorganismos, tales
como, por ejemplo, algas, protozoos, hongos y virus.
En ciertas circunstancias, la muestra puede
contener sólo un número limitado de tipos de bacterias y el método
puede dar sólo lugar a que se unan y, por lo tanto, se aíslen de la
muestra, unas cuantas especies de bacterias, o incluso sólo una o
dos especies. Dicho método aún no es un método de aislamiento
específico ya que el ligando inmovilizado es capaz de unirse a una
gran variedad de bacterias aun cuando las poblaciones bacterianas
disponibles sean bastante limitadas.
El hecho de que no sea necesario seleccionar un
complejo específico de soporte sólido-ligando con
objeto de llevar a cabo un método de aislamiento dado proporciona
una ventaja significativa en términos de flexibilidad y coste ya
que un soporte sólido con ligando fijado puede ser utilizado en una
gran variedad de métodos de aislamiento/separación. Por lo tanto,
lo que es particularmente ventajoso es la capacidad general de unión
del soporte sólido.
Preferiblemente, los métodos del invento darán
lugar a que se aísle una gran proporción de los microorganismos
(por ejemplo, bacterias) presentes en la muestra, tanto en términos
de la proporción de todas las células bacterianas presentes como de
la proporción de tipos de bacterias. De esta manera, preferiblemente
al menos el 30%, más preferiblemente al menos el 50%, muy
preferiblemente al menos el 70 u 80%, de los microorganismos de la
muestra se unirán al soporte sólido. Por supuesto, el porcentaje de
microorganismos de la muestra que se unan dependerá de la cantidad
de soporte sólido añadido a la muestra y de la relación de ligando a
microorganismo. En cuanto a los porcentajes anteriores, se supone
que hay un exceso de soporte sólido y de ligando presentes en la
mezcla.
Considerado alternativamente, se aislarán
preferiblemente representantes de al menos el 20% de las diferentes
especies (por ejemplo, bacterianas) presentes; más preferiblemente,
se unirán al soporte sólido representantes de al menos el 30 o 40%,
muy preferiblemente al menos el 50%, particularmente al menos el 60
o 70% o incluso al menos el 80%, de las diferentes especies (por
ejemplo, bacterianas) presentes.
El ligando "inespecífico" será uno que,
como se discutió anteriormente, sea capaz de unirse a más de un tipo
de microorganismo y/o género bacteriano, preferiblemente a más de 2
ó 3, más preferiblemente a más de 5 ó 7, por ejemplo, a más de 10 ó
14, géneros diferentes. Hay una interacción entre el ligando y
su(s) pareja(s) de unión en la superficie del
microorganismo que es responsable de la unión; no es el caso de que
simplemente haya una atracción o asociación general entre las
células y el soporte sólido, como puede ser el caso cuando las
células se unen por precipitación. El caracter inespecífico del
ligando no se refiere al hecho de que sea capaz de unirse o
asociarse indiscriminadamente con grupos situados en la superficie
de los microorganismos, sino a que su(s) pareja(s) de
unión no es(son) específica(s) para un cierto tipo o
especie de microorganismo. Por lo tanto, se puede considerar que el
ligando es un ligando general de unión.
Puesto que las parejas de unión adecuadas se
encuentran relativamente extendidas entre los diferentes
microorganismos, en particular entre los diferentes géneros de
bacterias, se proporciona un método de aislamiento bastante general
y, en consecuencia, inespecífico. De esta manera, el ligando, aunque
puede tener una o más parejas de unión específicas, es
"inespecífico" en el sentido de que es capaz de unirse a una
variedad de bacterias diferentes, todas las cuales poseen una
pareja de unión adecuada. Aunque sin pretender un respaldo teórico,
parece que una diversidad de parejas de unión diferentes, que son en
sí típicamente específicas de la especie, son capaces de unirse al
mismo ligando, proporcionando de este modo un método de separación
que no es específico de la especie. Las lectinas específicas de la
especie son capaces de proporcionar un sistema de separación no
específico de la especie con ligandos basados en carbohidratos.
Las parejas de unión son típicamente proteínas
situadas en la superficie de los microorganismos y pueden variar de
especie a especie. No se sabe mucho acerca de las parejas de unión
pero, no obstante, los inventores han sido capaces de identificar
ligandos adecuados para uso en los métodos del invento.
El ligando no es proteico y, por lo tanto, los
anticuerpos y los derivados y fragmentos de los mismos quedan
excluidos. Por contraste con los ligandos inespecíficos del presente
invento, dichos ligandos proteicos son capaces de interacciones muy
específicas (es decir, específicas de los géneros; en particular,
específicas de las especies) con, por ejemplo, proteínas de las
superficies celulares.
Los ligandos inespecíficos son polisacáridos que
comprenden manosa y/o galactosa y/o derivados de las mismas,
incluyendo derivados sulfatados, polisacáridos que comprenden 13 o
más unidades monosacáridas covalentemente enlazadas. Son
particularmente preferidos los polisacáridos que llevan incorporados
los monómeros monosacáridos discutidos más adelante. Los
monosacáridos incluyen hexosas y pentosas en forma de piranosa o
furanosa según sea apropiado, así como derivados de azúcares tales
como ácidos aldónicos y urónicos, desoxiazúcares o aminoazúcares,
azúcares sulfatados, y azúcar-alcoholes. Los
monosacáridos adecuados pueden ser ejemplificados por manosa (por
ejemplo, D-manosa), galactosa (por ejemplo,
D-galactosa), glucosa (por ejemplo,
D-glucosa), fructosa, fucosa (por ejemplo,
L-fucosa), N-acetilglucosamina,
N-acetilgalactosamina, ramnosa, galactosamina,
glucosamina (por ejemplo, D-glucosamina), ácido
galacturónico, ácido glucurónico, ácido
N-acetilneuramínico,
metil-D-manopiranosido (manosido),
\alpha-metil-glucosido,
galactosido, ribosa, xilosa, arabinosa, sacarato, manitol, sorbitol,
inositol, glicerol y derivados de estos monómeros. De entre estos,
se prefieren la manosa, la galactosa y la fucosa.
Los polisacáridos comprenden 13 o más unidades
monosacáridas covalentemente enlazadas que pueden ser iguales o
diferentes y que pueden ser lineales o ramificadas, preferiblemente
ramificadas. Los polisacáridos adecuados serán ricos en manosa,
galactosa, glucosa, fructosa o ácidos urónicos. Un ejemplo es el
polisacárido galactomanano (al que aquí se hace referencia como
GOMA o GOMA 1; Sigma G-0753), del que se cree que es
un polímero de cadena lineal de manosa con una ramificación de
galactosa en cada cuarta manosa.
Los polisacáridos que están compuestos de
subunidades de manosa y galactosa son un tipo preferido de ligando,
y un ejemplo más es la goma guar, la cual tiene una cadena principal
lineal de manosas enlazadas por \beta-1,4, con
una unidad lateral de galactosa aproximadamente en una unidad sí y
otra no fijadas por un enlace \alpha-1,6; la
relación de manosa a galactosa es de aproximadamente 1,8:1 a
aproximadamente 2:1. La goma guar utilizada en los experimentos
aquí descritos es de Sigma, número de referencia G1429 del
catálogo.
Otros polisacáridos incluyen la goma arábiga
(Sigma G 9752), de la que se cree que es un polímero ramificado de
galactosa, ramnosa, arabinosa y ácido glucurónico, y la goma karaya
(Sigma G 0503), de la que se cree que es un polímero parcialmente
acetilado de galactosa, ramnosa y ácido glucurónico, así como el
homopolisacárido manano, compuesto de unidades de manosa.
Los derivados de azúcar que son ligandos
adecuados incluyen el carragenano (varias formas). Los azúcares
sulfatados son una clase preferida de los derivados de azúcar.
Los inventores han hallado que los ligandos
basados en moléculas que son nutrientes para microorganismos
proporcionan medios de separación adecuados. Un objeto del presente
método fue proporcionar un sistema de aislamiento que, además de
utilizar las interacciones de receptor/ligando, se aprovechara de la
respuesta proactiva de las bacterias a la presencia de nutrientes
en los medios con el fin de potenciar la captura de
microorganismos.
Un soporte sólido tiene inmovilizado sobre él un
ligando que es capaz de unirse a células de una manera inespecífica,
en el que dicho ligando es un polisacárido que comprende manosa y/o
galactosa y/o derivados de las mismas, incluyendo derivados
sulfatados, en el que dicho polisacárido comprende 13 o más unidades
monosacáridas covalentemente enlazadas.
En el contexto de investigar la hemaglutinación
sensible a fucosa y sensible a manosa de las bacterias Vibrio
cholerae, se han fijado covalentemente L-fucosa
y D-manosa a glóbulos de agarosa [Sánchez et
al., APMIS (1990) 98, 353-357] y, por lo
tanto, estos complejos de soporte sólido-ligando no
están incluidos en el alcance del presente invento. Este trabajo
previo fue la investigación de una interacción muy específica en que
estaba implicada sólo una especie de bacteria y no es un método de
aislamiento bacteriano general. Por lo tanto, el uso de estos
complejos de glóbulo-ligando en el contexto de los
métodos aquí definidos comprende un aspecto del presente
invento.
Aunque, como aquí se discute, se proporciona un
método de separación general, los inventores han hallado que los
ligandos que llevan incorporados ciertos azúcares son
particularmente adecuados para separar ciertas clases muy amplias
de microorganismos. De esta manera, por ejemplo, las especies
bacterianas presentes en el intestino son aisladas muy eficazmente
cuando se usa un ligando que contiene manosa (el ligando puede ser
un polímero que lleva incorporada manosa), y las bacterias que
entran por los pulmones son aisladas muy eficazmente utilizando
azúcares sulfatados como ligandos. De esta forma, el uso de dichos
ligandos en métodos para separar las bacterias de una muestra
obtenida del intestino o el pulmón constituye aspectos más
preferidos del presente invento.
La muestra a partir de la cual se pueden aislar
los microorganismos incluye muestras ambientales tales como
muestras de agua, por ejemplo, de lagos, ríos, instalaciones para
tratamiento de aguas residuales y otros centros para tratamiento de
aguas, y muestras de suelo. Los métodos son particularmente útiles
en el análisis de muestras de alimentos y, generalmente, en
aplicaciones de salud e higiene en que se desea controlar los
niveles bacterianos, tal como, por ejemplo, en zonas donde se
preparan alimentos. Por ejemplo, los productos lácteos pueden ser
analizados en cuanto a Listeria. Las técnicas convencionales
para la aislamiento bacteriano en que se utilizan anticuerpos
inmovilizados han demostrado ser mucho menos eficaces que los
métodos presentes para aislar Listeria usando ligandos
inespecíficos, posiblemente a causa de la naturaleza hidrófoba del
anticuerpo inmovilizado. Cuando la muestra es una muestra de agua,
el ligando es preferiblemente un nutriente para los microorganismos
de interés.
Las muestras de alimentos pueden ser analizadas
homogeneizando primero, cuando es necesario (si se trata de una
muestra sólida), mezclando luego con un medio de incubación adecuado
(por ejemplo, agua de peptona) e incubando durante la noche a 37ºC.
De esta manera se pueden analizar alimentos tales como queso,
helados, huevos, margarina, pescado, camarones, pollo, carne de
vaca, costillas de cerdo, harina de trigo, copos de avena, arroz
hervido, pimienta, vegetales tales como tomate, brécol, judías y
cacahuetes, y mazapán. Los métodos del invento presentan ventajas
particulares para el análisis de muestras de alimentos ya que éstas
contienen una gran cantidad de materia sólida (agregados y
partículas grasas) que tiende a bloquear los filtros y a producir,
después de la centrifugación, un sedimento en el que las bacterias
están atrapadas, no quedando asequibles a la lisis ni a la unión con
anticuerpos.
Las muestras a partir de las cuales se pueden
aislar microorganismos de acuerdo con el presente método pueden ser
muestras clínicas obtenidas de un organismo humano o animal. Las
muestras adecuadas incluyen sangre completa y productos derivados
de la sangre, orina, heces, liquido cefalorraquídeo y cualesquier
otros fluidos corporales, así como muestras tisulares y muestras
obtenidas mediante, por ejemplo, el frotis de una cavidad
corporal.
La muestra puede también incluir materiales de
partida relativamente puros o parcialmente purificados, tales como
preparaciones semipuras obtenidas mediante otros procedimientos de
separación celular.
Los soportes sólidos adecuados para uso en el
presente invento pueden ser cualesquiera de los bien conocidos
soportes o matrices que actualmente se utilizan o proponen mucho
para inmovilizaciones, separaciones, etc. Estos pueden tener la
forma de partículas, láminas, geles, filtros, membranas, fibras,
capilares, tiras de microtitulación, tubos, placas o pocillos,
etc.
Convenientemente, el soporte puede estar hecho
de vidrio, sílice, látex o un material polímero. Se prefieren los
materiales que presentan una elevada superficie específica para la
unión de las células y, posteriormente, del ácido nucleico. Dichos
soportes tendrán generalmente una superficie irregular y pueden ser,
por ejemplo, porosos o corpusculares, por ejemplo, como partículas,
fibras, hojas, productos sinterizados o tamices. Se prefieren
generalmente los materiales corpusculares, por ejemplo, los
glóbulos, particularmente los glóbulos polímeros, a causa de su
mayor capacidad de unión.
Convenientemente, un soporte sólido corpuscular
utilizado de acuerdo con el invento comprenderá glóbulos esféricos.
El tamaño de los glóbulos no es crítico, pero éstos pueden tener,
por ejemplo, un diámetro del orden de al menos 1 \mu y
preferiblemente de al menos 2 \mum, y tienen un diámetro máximo
preferiblemente no superior a 10 \mum y más preferiblemente no
superior a 6 \mum. Por ejemplo, se ha mostrado que los glóbulos de
2,8 \mum y 4,5 \mum de diámetro se comportan bien.
Los glóbulos polímeros no magnéticos adecuados
para uso en el método del invento son asequibles de Dyno Particles
AS (Lillestrøm, Noruega) y también de Qiagen, Pharmacia y
Serorec.
Sin embargo, para facilitar la manipulación y la
separación, se prefieren los glóbulos magnéticos. El término
"magnético", como se utiliza aquí, significa que al soporte se
le puede comunicar un momento magnético cuando es puesto en un
campo magnético, y que, por consiguiente, el soporte es desplazable
bajo la acción de ese campo. En otras palabras un soporte que
comprende partículas magnéticas puede ser fácilmente separado por
agregación magnética, lo que proporciona un modo rápido, sencillo y
eficaz para separar las partículas después de las operaciones de
unión de las células y el ácido nucleico, y es un método mucho menos
riguroso que técnicas tradicionales tales como la centrifugación,
que generan fuerzas de cizallamiento que pueden romper las células o
degradar los ácidos nucleicos.
De esta forma, usando el método del invento, las
partículas magnéticas con células fijadas pueden ser desplazadas a
una superficie adecuada mediante la aplicación de un campo magnético
usando, por ejemplo, un imán permanente. Normalmente, basta aplicar
un imán a la cara del recipiente que contiene la mezcla de muestra
para que se peguen las partículas a la pared del recipiente y poder
separar el resto de la muestra por decantación.
Son partículas superparamagnéticas especialmente
preferidas las descritas, por ejemplo, por Sintef en el documento
EP-A-106873, ya que con ellas se
pueden evitar la agregación y la aglutinación magnéticas de las
partículas durante la reacción, asegurándose por ello una
extracción de ácido nucleico uniforme. Las bien conocidas partículas
magnéticas vendidas por Dynal AS (Oslo, Noruega) como DYNABEADS,
son adecuadas para uso en el presente invento.
Se pueden preparar partículas revestidas y
hechas funcionales para uso en el presente invento mediante la
modificación de los glóbulos de acuerdo con las Patentes de EE.UU.
números 4.336.173, 4.459.378 y 4.654.267. De esta manera se pueden
preparar glóbulos, u otros soportes, que tengan diferentes tipos de
superficie hecha funcional, tal como, por ejemplo, positiva o
negativamente cargada, hidrófila o hidrófoba.
Las partículas proporcionarán preferiblemente
una gran superficie específica para la unión y, por lo tanto, se
tenderá a que sean pequeñas y posiblemente no lisas.
Preferiblemente, la superficie del soporte sólido no será hidrófoba
(ni antes ni después de la inmovilización del ligando).
Las partículas polímeras de forma esférica
(glóbulos) basadas en poli(alcohol vinílico) (PVA; del
inglés, polyvinyl alcohol) en las que se ha
encapsulado un coloide magnético son partículas particularmente
preferidas para uso como soporte sólido en los métodos del invento.
Estos glóbulos pueden ser producidos mediante la suspensión de una
fase de polímero que contiene coloides magnéticos, en una fase de
aceite vegetal que contiene un agente emulsivo, como se describe en
el documento CA 2.227.608. Las partículas, cuyo tamaño puede variar
de 1 a 8 \mum, son preferiblemente asequibles de Chemagen AG,
Alemania.
Se pueden utilizar tampones, etc. apropiados
como medios para el aislamiento, con objeto de conseguir unas
condiciones apropiadas para la unión. Convenientemente, se puede
añadir un tampón de carga, osmolaridad, etc. apropiadas a la
muestra antes de, simultáneamente con o después de, el contacto con
el soporte sólido. La disolución salina tamponada con fosfato (PBS;
del inglés, phosphate buffered saline) es un
adecuado tampón para la unión
celular.
celular.
Los métodos para la fijación de un ligando a un
soporte sólido son bien conocidos en la técnica. Típicamente, el
soporte sólido será primero activado y será luego hecho reaccionar
con el ligando, ligando que puede haber sido ligeramente modificado
para la fijación covalente al soporte sólido. En el caso de los
glóbulos superparamagnéticos de Chemagen que se discutieron
anteriormente, la matriz de poli(alcohol vinílico) puede ser
activada mediante la introducción de funciones isocianato a través
de un espaciador de 8 átomos. Estos glóbulos activados
(M-PVA A k2x) pueden ser luego utilizados para la
copulación directa de moléculas que contienen funciones amino o
hidroxilo. Una reacción de copulación típica sería la siguiente:
Chemagen tiene patentes relativas a la
modificación de sus glóbulos por copulación.
Con objeto de investigar la unión celular y la
situación en que se necesitara información cualitativa o
cuantitativa acerca de microorganismos específicos, se puede llevar
a cabo una operación de identificación adicional. La combinación de
un método general de separación celular como el anteriormente
descrito con un método de detección específico de especies
representa una realización particularmente preferida del presente
invento.
La identidad de los microorganismos unidos puede
ser investigada mediante el análisis del ácido nucleico de los
microorganismos o mediante otras técnicas conocidas en este campo
técnico, tal como mediante el uso de anticuerpos marcados que son
específicos para ciertos tipos de microorganismos. Convenientemente,
una vez que las células se han unido al soporte sólido, el ácido
nucleico del complejo de microorganismos-glóbulo
puede ser aislado y ser analizado mediante, por ejemplo, la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase
chain reaction). De esta manera, una vez que los
microorganismos se hayan unido a dicho soporte sólido, tendrá lugar
una operación de lisis celular para liberar el ácido nucleico de los
microorganismos para su subsiguiente análisis. El ácido nucleico
liberado puede ser analizado en disolución pero es más
convenientemente analizado una vez que se ha unido a un soporte
sólido, soporte sólido que puede ser igual o diferente, aunque es
preferiblemente igual, que el soporte sólido al que se unieron los
propios microorganismos. El presente invento permite el análisis de
una muestra que contiene microorganismos.
En un aspecto más, el invento proporciona un
método para detectar un microorganismo en una muestra, método que
comprende:
(a) unir dichos microorganismos a un soporte
sólido por medio de un ligando inespecífico inmovilizado sobre
dicho soporte sólido, en que dicho ligando es un polisacárido que
comprende manosa y/o galactosa y/o derivados de las mismas,
incluyendo derivados sulfatados, en que dicho polisacárido comprende
13 o más unidades monosacáridas covalentemente enlazadas; y
(b) identificar los microorganismos unidos a
dicho soporte sólido.
\vskip1.000000\baselineskip
La operación (b) es llevada convenientemente a
cabo:
(c) lisando los microorganismos; y,
opcionalmente
(d) uniendo a un soporte sólido el ácido
nucleico liberado procedente de dichos microorganismos lisados.
\vskip1.000000\baselineskip
En el documento WO98/51693 se proporcionan
métodos adecuados para lisar los microorganismos, unir el ácido
nucleico así liberado, y analizar el ácido nucleico. De esta manera,
un aspecto más del presente invento es un método para aislar el
ácido nucleico de una muestra de microorganismos, método que
comprende:
(a) unir los microorganismos de dicha muestra a
un soporte sólido por medio de un ligando inespecífico inmovilizado
sobre dicho soporte sólido, en que dicho ligando es un polisacárido
que comprende manosa y/o galactosa y/o derivados de las mismas,
incluyendo derivados sulfatados, en que dicho polisacárido comprende
13 o más unidades monosacáridas covalentemente enlazadas;
(b) lisar las células unidas; y
(c) unir a un soporte sólido el ácido nucleico
liberado procedente de dichas células lisadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Aún otro aspecto más es un método para detectar
la presencia o ausencia de un microorganismo objetivo en una
muestra, método que comprende:
(a) unir los microorganismos de dicha muestra a
un soporte sólido por medio de un ligando inespecífico inmovilizado
sobre dicho soporte sólido, en que dicho ligando es un polisacárido
que comprende manosa y/o galactosa y/o derivados de las mismas,
incluyendo derivados sulfatados, en que dicho polisacárido comprende
13 o más unidades monosacáridas covalentemente enlazadas;
(b) lisar los microorganismos unidos;
(c) unir a un soporte sólido el ácido nucleico
liberado procedente de dichos microorganismos lisados; y
(d) detectar la presencia o ausencia de ácido
nucleico característico de dicho microorganismo objetivo en dicho
ácido nucleico unido. Los microorganismos, ligandos y soportes
sólidos preferidos son como los anteriormente discutidos.
El ácido nucleico puede ser DNA, RNA o cualquier
modificación de los mismos sea sintética o sea presente en la
naturaleza, y combinaciones de los mismos. Sin embargo, el ácido
nucleico será preferiblemente DNA, el cual puede ser de cadena
sencilla o doble o tener cualquier otra forma, tal como, por
ejemplo, lineal o circular.
Después de la unión, los microorganismos
aislados o unidos al soporte son lisados para liberar su ácido
nucleico. Los métodos para la lisis celular son bien conocidos en
la técnica y ampliamente descritos en la bibliografía, y se puede
utilizar cualquiera de los métodos conocidos. Diferentes métodos
pueden ser más apropiados para diferentes microorganismos, pero se
podría utilizar cualquiera de, por ejemplo, los métodos siguientes:
lisis por detergente utilizando, por ejemplo, dodecilsulfato sódico
(SDS; del inglés, sodium dodecylsulfate), LiDS o sarcosilo
(N-laurilsarcosinato sódico) en tampones apropiados;
usos de agentes caotrópicos tales como hidrocloruro de guanidinio
(GHCl), tiocianato de guanidinio (GTC), yoduro sódico (NaI),
perclorato, etc.; rotura mecánica, tal como mediante una prensa
francesa, sonicación, trituración con glóbulos de vidrio o con
alúmina o en nitrógeno líquido; lisis enzimática usando, por
ejemplo, lisozima, proteinasas, pronasas o celulasas, o cualquiera
de las demás enzimas de lisis comercialmente asequibles; lisis de
células mediante infección con bacteriófagos o virus;
liofilización; choque osmótico; tratamiento con microondas;
tratamiento térmico mediante, por ejemplo, calentamiento o
ebullición, o mediante congelación en, por ejemplo, nieve carbónica
o nitrógeno líquido, y descongelación; y lisis alcalina. Como se
mencionó anteriormente, todos los métodos citados son técnicas de
lisis estándares y son bien conocidos en este campo técnico, y se
puede utilizar cualquiera de dichos métodos o una combinación de
métodos.
Convenientemente, la lisis puede ser llevada a
cabo de acuerdo con el presente invento utilizando agentes
caotrópicos y/o detergentes. Por ejemplo, en el caso de células
bacterianas, se ha hallado que la combinación de un agente
caotrópico con un detergente es particularmente eficaz. De esta
manera, un agente de lisis adecuado ejemplar incluye un agente
caotrópico tal como GTC o GHCl y un detergente tal como SDS o
sarcosilo. Los agentes de lisis pueden ser proporcionados en una
disolución acuosa sencilla, o pueden estar incluidos en una
disolución tampón, para formar el llamado "tampón de lisis".
Se puede utilizar cualquier tampón adecuado, incluyendo, por
ejemplo, tampones de Tris, Bicina, Tricina y fosfato.
Alternativamente, los agentes de lisis pueden ser añadidos
separadamente. Las concentraciones y cantidades adecuadas de los
agentes de lisis variarán de acuerdo con el sistema concreto, la
naturaleza de las células, etc., y pueden ser apropiadamente
determinadas, pero se pueden utilizar agentes caotrópicos tales
como GTC, GHCl, NaI y perclorato en concentraciones de, por ejemplo,
2 M a 7 M, agentes alcalinos tales como NaOH en concentraciones de
0,1 M a 1 M, y detergente en concentraciones de 0,1 a 50%
(peso/volumen), por ejemplo, de 0,5 a 15%. De este modo, un ejemplo
de un tampón de lisis representativo adecuado incluye una
disolución acuosa 4 M de GTC y sarcosilo al 1% (peso/volumen).
Los microorganismos aislados, unidos al soporte,
pueden ser convenientemente retirados o separados del resto de la
muestra, con concentración o enriquecimiento por ello de las
células. De este modo, la operación de unión celular sirve para
enriquecimiento o concentración de las células en un volumen más
pequeño que el de la muestra inicial. La lisis puede ser luego
llevada convenientemente a cabo añadiendo un tampón de lisis
apropiado que contenga los agentes de lisis deseados o sometiendo
las células aisladas a las condiciones de lisis deseadas. Por
ejemplo, en el caso de la simple adición de un tampón de lisis que
contiene agentes de lisis apropiados, las células aisladas pueden
ser simplemente incubadas en presencia del tampón de lisis durante
un intervalo adecuado que permita que tenga lugar la lisis.
Condiciones de incubación diferentes pueden ser apropiadas para
sistemas de lisis diferentes, y dichas condiciones son conocidas en
la técnica. Por ejemplo, para un tampón de lisis que contiene un
detergente y/o un agente caotrópico, la incubación puede tener lugar
a temperatura ambiental o a temperaturas superiores tales como, por
ejemplo, 37ºC o 65ºC. Asimismo, el tiempo de incubación puede ser
variado de unos pocos minutos, por ejemplo, 5 ó 10 minutos, a horas,
por ejemplo, de 1 a 2 horas. En el caso de tampones de lisis de
GTC/sarcosilo y células bacterianas, se ha hallado que es apropiada
una incubación a, por ejemplo, 65ºC durante 10-20
minutos pero, por supuesto, estas condiciones pueden ser variadas
de acuerdo con las necesidades. Para la lisis enzimática,
utilizando, por ejemplo, proteinasa K, etc., puede que se requieran
tiempos de tratamiento más prolongados, por ejemplo, durante la
noche.
Después de la lisis, el ácido nucleico liberado
es convenientemente unido a un soporte sólido, preferiblemente
aquél al que se unen los microorganismos lisados, aunque, por
ejemplo, se puede proporcionar una población mixta de glóbulos,
algunos glóbulos con un ligando inespecífico para la unión a
microorganismos y otros adaptados para unirse a ácido nucleico.
Esta unión del ácido nucleico puede ser llevada
a cabo de cualquier modo conocido en la técnica para unir ácido
nucleico a un soporte sólido. Convenientemente, el ácido nucleico se
une inespecíficamente al soporte, es decir, independientemente de
la secuencia. De este modo, por ejemplo, el ácido nucleico liberado
puede ser hecho precipitar sobre el soporte usando cualesquiera de
los agentes precipitantes conocidos para el ácido nucleico, tales
como, por ejemplo, alcoholes, combinaciones de alcohol/sal,
polietilenglicoles (PEGs), etc. En, por ejemplo, el documento WO
91/12079 se describe la precipitación de ácidos nucleicos sobre
glóbulos de esta manera. Por lo tanto, se puede añadir sal al
soporte y al ácido nucleico liberado en disolución y añadir luego
el alcohol, lo que causará la precipitación del ácido nucleico.
Alternativamente, se pueden añadir la sal y el alcohol juntos, o se
puede prescindir de la sal. Como se describió anteriormente en
relación con la operación de unión celular, se puede utilizar
cualquier sal o alcohol adecuado y se pueden determinar fácilmente
las cantidades o concentraciones apropiadas.
Técnicas alternativas para la unión inespecífica
de ácido nucleico incluyen el uso de detergentes, como se describe
en el documento WO 96/18731 de Dynal AS (el llamado procedimiento
"DNA Direct"), y el uso de agentes caotrópicos y una fase
sólida unitiva de ácido nucleico, tal como partículas de sílice,
como se describe en el documento
EP-A-0389063 de Akzo N.V.
La unión iónica del ácido nucleico al soporte
puede ser llevada a cabo utilizando un soporte sólido que tenga una
superficie cargada, tal como, por ejemplo, un soporte revestido con
poliaminas.
El soporte que se usa en el método del invento
puede llevar también grupos funcionales que ayudan a la unión
especifica o inespecífica de ácidos nucleicos, tales como, por
ejemplo, proteínas unitivas de DNA, por ejemplo, cremalleras de
leucina o histonas, o colorantes intercalantes (por ejemplo, bromuro
de etidio o Hoechst 42945), con los que se puede revestir el
soporte.
Asimismo, se puede proporcionar el soporte con
parejas de unión que tomen parte en la captura selectiva de ácidos
nucleicos. Por ejemplo, se pueden usar secuencias de DNA o RNA
complementarias o proteínas unitivas de DNA, o proteínas víricas
que se unen a ácido nucleico vírico. La fijación de dichas proteínas
al soporte sólido puede ser llevada a cabo usando técnicas bien
conocidas en este campo técnico.
Un método conveniente para precipitar el ácido
nucleico de acuerdo con el invento es añadir un agente precipitante,
tal como, por ejemplo, alcohol, a la mezcla que contiene el soporte
y las células lisadas. De esta manera, se puede añadir simplemente
un volumen apropiado de alcohol, por ejemplo, etanol al 100% o 96%,
a la mezcla e incubar el conjunto durante un período de tiempo
suficiente para permitir que el ácido nucleico liberado llegue a
unirse al soporte. Las condiciones de incubación para esta operación
no son críticas y pueden comprender simplemente una incubación
durante 5-10 minutos a temperatura ambiental. Sin
embargo, se puede variar el espacio de tiempo y se puede aumentar la
temperatura según se requiera.
\newpage
Aunque no es necesario, puede que sea
conveniente introducir una o más operaciones de lavado en el método
de aislamiento del invento, por ejemplo, después de la operación de
unión del ácido nucleico. Se pueden utilizar cualesquier tampones
de lavado convencionales u otros medios. En términos generales, se
prefieren tampones con una fuerza iónica de baja a moderada, tal
como, por ejemplo, Tris-HCl 10 mM, pH de 8,0/NaCl 10
mM. Si se desea, también se pueden utilizar otros medios de lavado
estándares que, por ejemplo, contengan alcoholes; por ejemplo, un
lavado con etanol al 70%.
El uso de partículas magnéticas permite
operaciones de lavado fáciles simplemente agregando las partículas,
separando el medio unitivo de ácido nucleico, añadiendo el medio de
lavado y volviendo a agregar las partículas tantas veces como sea
necesario.
Después del proceso de aislamiento del ácido
nucleico y de cualesquier operaciones de lavado opcionales que se
puedan desear, el soporte que lleva el ácido nucleico unido puede
ser transferido a, por ejemplo, resuspendido o sumergido en,
cualquier medio adecuado, tal como, por ejemplo, agua o un tampón de
baja fuerza iónica. Dependiendo del soporte y de la naturaleza de
cualquier subsiguiente procesamiento deseado, puede ser o no
deseable liberar el ácido nucleico del soporte.
En el caso de un soporte sólido corpuscular tal
como glóbulos magnéticos o no magnéticos, éste puede ser usado
directamente en muchos casos, tal como, por ejemplo, en una PCR o en
otras multiplicaciones, sin eluir el ácido nucleico del soporte.
Además, en muchos métodos de detección o identificación de DNA, la
elución no es necesaria ya que, aunque el DNA puede estar
aleatoriamente en contacto con la superficie del glóbulo y unirse
en diversos puntos mediante enlace de hidrógeno, enlace iónico u
otras fuerzas, habrá generalmente tramos suficientes de DNA
disponibles para la hibridación con oligonucleótidos y para
multiplicación.
Sin embargo, si se desea, la elución del ácido
nucleico puede ser llevada fácilmente a cabo usando medios
conocidos, tal como, por ejemplo, por calentamiento a, por ejemplo,
70-90ºC durante un periodo de 5 a 10 minutos,
después de lo cual el soporte puede ser retirado del medio para
dejar el ácido nucleico en disolución. Dicho calentamiento se
obtiene automáticamente en la PCR mediante la operación de
desnaturalización del DNA que precede al programa de generación de
ciclos.
Si se desea eliminar el RNA del DNA, esto puede
ser llevado a cabo destruyendo el RNA mediante, por ejemplo, la
adición de una Rnasa o un álcali tal como NaOH, antes de la
operación de separación del DNA.
Una ventaja del presente invento es que se lleva
a cabo de forma rápida y sencilla, y la sencillez del método permite
un gran rendimiento en el procesamiento de muestras.
El invento es ventajosamente susceptible de
automatización, particularmente si se usan partículas, y
especialmente partículas magnéticas, como soporte.
Como se mencionó anteriormente, el método del
invento presenta una particular utilidad como primera operación
preliminar para preparar ácido nucleico para uso en procedimientos
de detección basados en ácido nucleico.
Como se mencionó anteriormente, no es necesario
que el ácido nucleico ventajosamente unido sea eluido o separado
del soporte antes de que se realice la operación de detección,
aunque esto puede ser llevado a cabo si se desea. El que el ácido
nucleico sea eluido o no puede también depender del método concreto
que se usó en la operación de unión del ácido nucleico. Así, el
ácido nucleico se unirá más fuertemente mediante ciertos
procedimientos de unión de ácido nucleico que mediante otros. Por
ejemplo, en el caso de la unión de DNA usando detergentes (por
ejemplo, mediante "DNA Direct"), el ácido nucleico será eluido
del soporte sólido cuando se introduzca un tampón de elución u otro
medio apropiado. El ácido nucleico unido por medio de un agente
precipitante, tal como un alcohol, o un agente caotrópico
permanecerá unido más fuertemente y puede que no sea eluido cuando
se ponga en un medio tampón, y puede que se requiera calentamiento
para su elución.
Por lo tanto, el ácido nucleico unido al soporte
puede ser utilizado directamente en un procedimiento de detección
basado en ácido nucleico, especialmente si el soporte es
corpuscular, simplemente resuspendiendo el soporte en, o añadiendo
al soporte, un medio apropiado para la operación de detección. El
ácido nucleico puede ser eluido en el medio o, como se mencionó
anteriormente, puede que no sea necesaria su elución. Cuando se
utilizan azúcares sulfatados como ligando, se prefiere la
elución.
Se conocen diversas técnicas diferentes para
detectar ácidos nucleicos, técnicas que son descritas en la
bibliografía, y cualquiera de ellas puede ser utilizada de acuerdo
con el presente invento. En la más sencilla, el ácido nucleico
puede ser detectado por hibridación con una sonda, y se han descrito
muchísimos protocolos de hibridación (véase, por ejemplo, Sambrook
et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual",
2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York,
EE.UU.). Muy corrientemente, la detección implicará una operación
de hibridación in situ, y/o una operación de multiplicación
in vitro utilizando cualquiera de los métodos descritos para
ello en la bibliografía. Por lo tanto, como se mencionó, se pueden
usar técnicas tales como LAR, 3SR y el sistema de replicasa del
virus Q-beta. Sin embargo, la PCR y sus diversas
modificaciones, tales como, por ejemplo, el uso de cebadores
anidados, serán generalmente el método de elección (véase, por
ejemplo, Abramson y Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology,
4: 41-47, para una revisión de las tecnologías de
multiplicación de ácido nucleico).
Otros métodos de detección se pueden basar en un
procedimiento de secuenciación, tal como, por ejemplo, el
procedimiento de minisecuenciación descrito por Syvänen y Söderlung,
1990, Genomics, 8: 684-692).
En técnicas de multiplicación tales como la PCR,
el calentamiento necesario en la primera operación para fundir el
DNA dúplex puede liberar el DNA unido del soporte. Por lo tanto, en
el caso de una subsiguiente operación de detección, tal como una
PCR, el ácido nucleico unido al soporte se puede añadir directamente
a la mezcla de reacción, y el ácido nucleico resultará eluido en la
primera operación del proceso de detección. En la operación de
detección se puede usar la muestra aislada completa de ácido
nucleico unido al soporte, obtenida de acuerdo con el invento, o una
parte alícuota.
Los resultados de la PCR o de otra operación de
detección pueden ser detectados o visualizados por cualquier medio,
medios que se describen en la técnica. Por ejemplo, los productos de
la PCR o de otra multiplicación pueden ser desarrollados en un gel
de electroforesis, por ejemplo, un gel de agarosa teñido con bromuro
de etidio, utilizando técnicas conocidas. Alternativamente, se
puede utilizar el sistema DIANA, que es una modificación de la
técnica de los cebadores anidados. En el sistema DIANA (detección de
ácidos nucleicos multiplicados e inmovilizados; en inglés,
Detection of Immobilised Amplified
Nucleic Acids) [véase Wahlberg et al., Mol.
Cell Probes 4: 285 (1990)], los cebadores internos del
segundo par llevan, respectivamente, medios para inmovilización,
para permitir la captura del DNA multiplicado, y un marcador o
medios para la fijación de un marcador, para permitir el
reconocimiento. Esto proporciona la doble ventaja de una señal de
fondo reducida y un medio rápido y sencillo para la detección del
DNA multiplicado. En la detección de DNA se pueden usar métodos de
PCR en tiempo real, tales como, por ejemplo,
PCR-5'-nucleasa o técnicas en que se
usan sondas fluorescentes.
El ácido nucleico multiplicado puede ser también
detectado, o el resultado puede ser confirmado, por secuenciación
usando cualquiera de las muchas tecnologías diferentes de
secuenciación que están ahora disponibles, tales como, por ejemplo,
secuenciación estándar, secuenciación en fase sólida, secuenciación
cíclica, secuenciación automática y minisecuenciación.
Los diversos reaccionantes y componentes
requeridos para llevar los métodos del invento a cabo pueden ser
convenientemente suministrados en forma de sistema. Dichos sistemas
representan un aspecto más del invento.
En su forma más sencilla, este aspecto del
invento proporciona un sistema para aislar los microorganismos
procedentes de una muestra, que comprende:
(a) un soporte sólido que tiene inmovilizado
sobre él un ligando que es capaz de una unión inespecífica con
microorganismos, en el que dicho ligando es un polisacárido que
comprende manosa y/o galactosa y/o derivados de las mismas,
incluyendo derivados sulfatados, en el que dicho polisacárido
comprende 13 o más unidades monosacáridas covalentemente
enlazadas;
(b) medios para unir los microorganismos a dicho
soporte sólido; opcionalmente
(c) medios para lisar dichos microorganismos; y,
opcionalmente
(d) medios para unir a un soporte sólido el
ácido nucleico liberado procedente de dichos microorganismos
lisados.
Los diversos medios (b), (c) y (d) pueden ser
como se describieron y discutieron anteriormente en relación con el
método del invento.
Un sistema típico puede comprender un soporte
sólido, por ejemplo, partículas revestidas con un polisacárido tal
como GOMA1, un tampón de unión, por ejemplo, PBS, y un tampón de
lisis.
Un componente opcional más es (e), medios para
detectar la presencia o ausencia de ácido nucleico característico
de un microorganismo objetivo. Como se discutió anteriormente,
dichos medios pueden incluir secuencias oligonucleotídicas de sonda
o cebador apropiadas para uso en técnicas de detección basadas en
hibridación y/o multiplicación.
Además, en dicho sistema se pueden incluir
opcionalmente tampones, sales, polímeros, enzimas, etc.
Los sistemas del invento tienen gran utilidad
práctica en la extracción de bacterias y en el aislamiento de DNA
para multiplicación por PCR. Un protocolo adecuado para uso con el
sistema sería el siguiente, habiéndose supuesto que se han elegido
glóbulos magnéticos o magnetizables como soporte sólido (a):
- combinar el tampón (b) de unión y los
glóbulos, añadir una muestra de un cultivo realizado durante la
noche y mezclar en, por ejemplo, un tubo Eppendorf;
- colocar bajo la influencia de un imán y dejar
que el complejo de bacterias/glóbulo se desplace a un lado del
tubo;
- extraer el sobrenadante con una pipeta y
desecharlo;
- añadir el tampón (c) de lisis e incubar con
etanol;
- usar el imán para separar los glóbulos del
sobrenadante, y extraer el sobrenadante con una pipeta y
desecharlo;
- lavar los glóbulos y retirar el sobrenadante;
y
- resuspender la muestra de DNA/glóbulo para
PCR.
El presente invento permite el uso de un soporte
sólido como el aquí descrito en la separación grosera de las
células de una muestra. La separación es "grosera" porque no es
un método de aislamiento celularmente específico sino más bien un
método general para aislar, de los demás componentes, los
microorganismos presentes en una muestra. Previamente, dichos
métodos habían sido llevados a cabo por filtración o precipitación.
Por contraste, los soportes sólidos aquí descritos pueden ser
utilizados para combinar las ventajas de la unión de
ligando-receptor pero no de un modo específico de la
especie ni del tipo celular. Como aquí se describe, los ligandos
fijados a los soportes sólidos son capaces de unirse a una
proporción significativa, si no a la mayoría, de los tipos de
microorganismos (por ejemplo, diferentes especies bacterianas)
presentes en la muestra con objeto de llevar a cabo una separación
grosera de los mismos a partir de la muestra total.
El invento será ahora descrito con más detalle
mediante los siguientes ejemplos no restrictivos con referencia a
los dibujos, en los que:
La Figura 1 es una fotografía de un gel que
muestra productos de PCR del ácido nucleico de bacterias (E.
coli) unidas a glóbulos revestidos con manosa, maltosa y
GOMA1;
La Figura 2 es una fotografía de un gel que
muestra productos de PCR del ácido nucleico de bacterias (B.
cereus) unidas a glóbulos revestidos con GOMA1 y glóbulos no
revestidos:
La Figura 3 muestra una serie de fotografías de
geles que indican la unión de una gran variedad de bacterias a
glóbulos revestidos con GOMA1;
La Figura 4 es una fotografía de un gel que
muestra productos de PCR del ácido nucleico de Vibrio
cholerae unido a diversos glóbulos revestidos;
La Figura 5 es una fotografía de un gel que
muestra productos de PCR del ácido nucleico de Shigella
flexneri unida a diversos glóbulos revestidos;
La Figura 6 es una fotografía de un gel que
muestra productos de PCR del ácido nucleico de E. coli unida
a diversos glóbulos revestidos;
La Figura 7 es una fotografía de un gel que
muestra productos de PCR del ácido nucleico de Salmonella
typhimurium unida a diversos glóbulos revestidos;
La Figura 8 es una fotografía de un gel que
muestra productos de PCR del ácido nucleico de Campylobacter
jejuni unido a diversos glóbulos revestidos;
La Figura 9 es una fotografía de un gel que
muestra productos de PCR del ácido nucleico de Streptococcus
pyogenes unido a diversos glóbulos revestidos;
La Figura 10 es una fotografía de un gel que
muestra productos de PCR del ácido nucleico de Neisseria
gonorrheae unida a diversos glóbulos revestidos;
La Figura 11 es una fotografía de un gel que
muestra productos de PCR del ácido nucleico de glóbulos blancos
humanos unidos a diversos glóbulos revestidos;
La Figura 12 es una fotografía de un gel que
muestra productos de PCR del ácido nucleico de E. coli unida
a Dynabeads revestidos y no revestidos; y
La Figura 13 es una fotografía de un gel que
muestra productos de PCR del ácido nucleico de diversas bacterias
unidas a Dynabeads revestidos con GOMA.
\newpage
El compuesto fue copulado con glóbulos
M-PVA activados con OCN (Chemagen AG). Reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los glóbulos modificados fueron incubados con
diferentes cultivos bacterianos, ya fuera con cultivos no diluidos
puros (durante la noche) o ya fuera con cultivos diluidos en agua o
en un tampón (PBS). Con objeto de investigar la unión celular, el
DNA fue aislado del complejo de bacterias-glóbulo y
fue luego analizado realizando una PCR; Ref.: WO 98/51693. Esta
reacción de copulación fue llevada a cabo por Chemagen, y los
glóbulos modificados resultantes fueron usados en los métodos de
aislamiento del invento aquí discutidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron las bacterias durante la noche en
100 ml de caldo de soja-triptona a 30ºC sin
agitación. Se mezclaron 800 \mul de PBS (tampón de unión) y 10
\mul de glóbulos de acuerdo con el invento (10 mg/ml) y luego se
añadieron 100 \mul del cultivo nocturno y se mezcló el conjunto
suavemente por aspiración con una pipeta. Se dejó el tubo a
temperatura ambiental durante 5 minutos. Se retiró el sobrenadante
usando un separador magnético y se resuspendió el complejo de
glóbulo-bacterias en 50 \mul de tampón de lisis
(tiocianato de guanidina 4 M - sarcosilo al 1%). Se incubaron las
muestras a 65ºC durante 5 minutos con las tapas abiertas.
Luego se añadieron 100 \mul de etanol al 96% y
se continuó la incubación durante 5 minutos con las tapas cerradas.
Se retiró el sobrenadante utilizando el separador magnético y se
lavó dos veces la muestra de glóbulo-DNA con 1 ml de
etanol al 70%.
La muestra de glóbulo-DNA fue
resuspendida en 45 \mul de H_{2}O y fue incubada a 65ºC durante
15 minutos con las tapas abiertas para eliminar todo resto de
etanol (como alternativa, se pueden añadir 5 \mul de H_{2}O
para humedecer los glóbulos, los cuales son luego incubados a 65ºC
durante 5 minutos). Se usaron 20 \mul del material purificado en
una PCR de 50 \mul.
Para identificar las bacterias aisladas, se
llevó a cabo una multiplicación por PCR con cebadores (X e Y)
específicos de especie o grupo.
La Tabla 1 siguiente proporciona cebadores
adecuados para diferentes bacterias.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La multiplicación por PCR fue llevada a cabo en
un volumen de 50 \mul: H_{2}O - 17,5 \mul; dNTP 2 mM - 5
\mul; tampón DynaZyme 10x - 5 \mul; cebador x (10
picomoles/\mul) - 1 \mul; cebador y (10 picomoles/\mul) - 1
\mul; enzima DynaZyme (2 U/\mul) - 0,5 \mul; molde - 20
\mul. El programa de temperaturas fue 94ºC - 4 minutos, y luego
35 ciclos con los parámetros: 96ºC - 15 segundos; 56ºC - 30
segundos; y 72ºC - 1 minuto; seguido de 72ºC - 7 minutos.
Los productos de PCR fueron visualizados
mediante electroforesis en gel de agarosa.
Se llevó a cabo el protocolo del Ejemplo 2 con
glóbulos M-PVA a los que se había copulado
D-manosa.
Se mostró que los glóbulos se unen a
Bacillus, E. coli (patógena y no patógena), Listeria,
Salmonella y Yersinia.
Se llevó a cabo el protocolo del Ejemplo 2 con
glóbulos M-PVA a los que se había copulado
maltosa.
Se mostró que los glóbulos se unen a
Bacillus, E. coli (patógena y no patógena), Listeria,
Salmonella y Yersinia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo el protocolo del Ejemplo 2 con
glóbulos M-PVA a los que se había copulado el
polisacárido galactomanano (GOMA1).
Se mostró que los glóbulos se unen, inter
alia, a Aeromonas, Bacillus, Campylobacter, Citrobacter,
Clostridium, Enterobacter, E. coli (patógena y no patógena),
Hafnia, Klebsiella, Listeria, Proteus, Salmonella, Shewanella,
Serratia, Shigella, Vibrio y Yersinia.
Los resultados de estos experimentos se pueden
ver en las fotografías de geles de la Figura 3. Se muestran bandas
del producto de PCR que indican la unión de bacterias específicas a
los glóbulos de acuerdo con el esquema siguiente.
Carril 1: marcador de DNA [Escalera de DNA
GeneRuler^{TM}, de 100 pares de bases (bp; del inglés, base
pair), Fermentas];
Carriles 2-3: Klebsiella
pneumoniae y K. oxytoca, respectivamente;
Carriles 4-6: Shigella
flexneri, S. sonnei y S. boydii,
respectivamente;
Carriles 7-8 y
12-13: Vibrio cholerae (carriles 7 y 12),
V. vulnificus (carril 8) y V. parahaemolyticus;
Carril 9: Hafnia alvei;
Carriles 10-11: Aeromonas
sobria y A. hydrophila, respectivamente;
Carriles 12-13: Vibrio,
véase más arriba;
Carril 14: Proteus vulgaris;
Carriles 15-16: Salmonella
enterica ssp typhimurium y S. enterica ssp enteritidis,
respectivamente;
Carriles 17-18 y
41-44: Yersinia enterocolitica [serotipo
desconocido (carriles 17-18) y serotipos O:9 (carril
42), O:8 (carril 43) y O:3 (carril 44)] y
Y.pseudotuberculosis (carril 41);
Carril 19: Escherichia coli;
Carriles 20-21: Listeria
innocua y L. monocytogenes, respectivamente;
Carriles 22-23 y
38-39: Bacillus cereus (carril 22), B.
subtilis (carril 23) y B. simplex (carriles
38-39);
Carril 24: Citrobacter freundii;
Carriles 25-26: Clostridium
perfringens y C. sordelli, respectivamente;
Carriles 27-30: Escherichia
coli, patógena;
Carriles 31-37: Campylobacter
jejuni (carril 31) y C. lari (carriles
32-37);
Carriles 38-39: Bacillus,
véase más arriba;
Carril 40: Brochothrix thermosphacta;
Carriles 41-44: Yersinia,
véase más arriba;
Carriles 45-47: Enterobacter
sakazakii, E. aerogenes y E. cloacae,
respectivamente;
Carril 48: Morganella morganii;
Carril 49: Serratia marcescens;
Carriles 50-52: Shewanella
putrefaciens;
Carriles 53-54:
Photobacterium phosphoreum y P. damsela,
respectivamente;
Carril 55: Streptococcus
thermophilus;
Carril 56: Lactococcus lactis;
Carril 57: Staphylococcus warneri;
Carril 58: Enterococcus faecalis;
Carriles 59-60: Leuconostoc
mesenteroides;
Carriles 61-64: Pediococcus
acidilactici (carriles 61-62) y P.
damnosus (carriles 63-64);
Carriles 65-69: Lactobacillus
acidophilus (carriles 65, 68 y 69) y L. plantarum
(carriles 66-67).
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló E. coli de un cultivo nocturno
usando los glóbulos de los Ejemplos 3, 4 y 5 y Dynabeads
M-280 (Dynal, Noruega) (inactivados). Después de
una lisis para liberar el ácido nucleico, se multiplicó una
secuencia de DNA de aproximadamente 600 bp de E. coli usando
los cebadores U59/L673 (véase la Tabla 1).
Los resultados se muestran en la Figura 1,
habiéndose usado 15 \mul de molde en los carriles
2-5 y 5 \mul de molde en los carriles
7-10.
Carriles 1 y 6: marcador de DNA
\Phix174/HaeIII;
Carriles 2 y 7: glóbulos revestidos con
manosa;
Carriles 3 y 8: glóbulos revestidos con
maltosa;
Carriles 4 y 9: glóbulos revestidos con
GOMA1;
Carriles 5 y 10: Dynabeads M-280
activados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló B. cereus ATCC 14579 usando los
glóbulos del Ejemplo 5 y glóbulos no revestidos, dada la referencia
UNC a partir de 2 ml de cultivo nocturno (100 ml de TSB a 30ºC), de
acuerdo con las diluciones siguientes:
Carril 1: marcador de DNA \Phix174/HaeIII;
Carril 2: 100 \mug de UNC, cultivo sin
diluir;
Carril 3: 50 \mug de GOMA1, cultivo diluido
10^{1};
Carril 4: 100 \mug de GOMA1, cultivo diluido
10^{1};
Carril 5: 200 \mug de GOMA1, cultivo diluido
10^{1};
Carril 6: 100 \mug de UNC, cultivo diluido
10^{1};
Carril 7: 50 \mug de GOMA1, cultivo diluido
10^{2};
Carril 8: 100 \mug de GOMA1, cultivo diluido
10^{2};
Carril 9: 200 \mug de GOMA1, cultivo diluido
10^{2};
Carril 10: 100 \mug de UNC, cultivo diluido
10^{2};
Carril 11: 50 \mug de GOMA1, cultivo diluido
10^{3};
Carril 12: 100 \mug de GOMA1, cultivo diluido
10^{3};
Carril 13: marcador de DNA
\Phix174/HaeIII;
Carril 14: 200 \mug de GOMA1, cultivo diluido
10^{3};
Carril 15: 100 \mug de UNC, cultivo diluido
10^{3};
Carril 16: 50 \mug de GOMA1, cultivo diluido
10^{4};
Carril 17: 100 \mug de GOMA1, cultivo diluido
10^{4};
Carril 18: 200 \mug de GOMA1, cultivo diluido
10^{4};
Carril 19: 100 \mug de UNC, cultivo diluido
10^{4};
Carril 20: 50 \mug de GOMA1, cultivo diluido
10^{5};
Carril 21: 100 \mug de GOMA1, cultivo diluido
10^{5};
Carril 22: 200 \mug de GOMA1, cultivo diluido
10^{5};
Carril 23: 100 \mug de UNC, cultivo diluido
10^{5}.
Después de una lisis para liberar el ácido
nucleico, se multiplicó una secuencia de aproximadamente 600 bp de
B. cereus utilizando los cebadores U552/L1254 (véase la Tabla
1). Los resultados se muestran en la Figura 2. Parece que el
resultado para una dilución 10^{1} es un error ya que tanto 50
\mug de GOMA1 como 200 \mug de GOMA1 proporcionaron resultados
positivos en cuanto a la detección de ácido nucleico, lo que es
indicativo de unión celular. En conjunto, los resultados muestran
que la unión es 100-1000 veces mejor para GOMA1 que
para los glóbulos no revestidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han usado otros glóbulos para ilustrar los
principios del invento; un tipo de glóbulo particularmente adecuado
es Dynabead M-270 Epoxy, Nº de Producto: 143.02
(asequible de Dynal AS, Noruega).
Se añadieron 2 ml de tampón de fosfato sódico
0,1 M, pH de 7,4, esterilizado por filtración, a 30 mg de glóbulos
secos para obtener una concentración de aproximadamente 10^{9}
glóbulos por ml. Los glóbulos fueron resuspendidos durante 30
segundos mediante agitación con formación de remolinos y fueron
luego incubados durante 10 minutos con rotación lenta en
inclinación. Se colocó el tubo sobre un imán durante 4 minutos y se
separó cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.
Se añadieron de nuevo 2 ml de tampón de fosfato
sódico 0,1 M, pH de 7,4, al tubo y se mezclaron apropiadamente los
glóbulos mediante agitación con formación de remolinos. Se colocó el
tubo sobre un imán durante 4 minutos y se separó el
sobrenadante.
Los glóbulos lavados fueron resuspendidos en 600
\mul de tampón de fosfato sódico 0,1 M, pH de 7,4, para obtener
la concentración de glóbulos y la concentración de sulfato amónico
recomendadas después de la adición de la disolución de ligando.
Esta disolución de glóbulos fue utilizada en el procedimiento de
revestimiento.
Se disolvió el ligando en PBS hasta una
concentración de 1 mg/ml y se esterilizó la disolución por
filtración.
Se mezclaron 600 \mul del ligando con 600
\mul de la disolución de glóbulos y 600 \mul de una disolución
3 M de sulfato amónico esterilizada por filtración, de acuerdo con
la recomendación de Dynal. El tubo fue incubado durante la noche a
temperatura ambiental con rotación lenta.
Después de la incubación, se puso el tubo sobre
un imán durante 4 minutos y se separó el sobrenadante. Los glóbulos
revestidos fueron lavados un total de cuatro veces con 2 ml de PBS.
Los glóbulos fueron finalmente resuspendidos en 1 ml de PBS hasta
una concentración de 30 mg/ml y fueron almacenados a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron las bacterias durante la noche en
100 ml de caldo de soja-triptona a 37ºC. Se
mezclaron 800 \mul de PBS (tampón de unión) y 20 \mul de
glóbulos de acuerdo con el invento (10 mg/ml) y luego se añadieron
100 \mul del cultivo nocturno y se mezcló el conjunto suavemente
por aspiración con una pipeta. Se dejó el tubo a temperatura
ambiental durante 5 minutos. Se retiró el sobrenadante usando un
separador magnético y se resuspendió el complejo de
glóbulo-bacterias en 50 \mul de tampón de lisis
(tiocianato de guanidina 4 M - sarcosilo al 1%). Se incubaron las
muestras a 80ºC durante 5 minutos con las tapas cerradas,
\global\parskip0.990000\baselineskip
Luego se añadieron 150 \mul de etanol al 96% y
se continuó la incubación durante 5 minutos. Se retiró el
sobrenadante utilizando el separador magnético y se lavó dos veces
la muestra de glóbulo-DNA con 1 ml de etanol al
70%.
Se resuspendió la muestra de
glóbulo-DNA en 30 \mul de H_{2}O y se incubó la
suspensión a 80ºC durante 10 minutos con las tapas abiertas para
eliminar todo resto de etanol. Se usaron los 30 \mul del material
purificado en una PCR de
50 \mul.
50 \mul.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron las bacterias usando el protocolo
del Ejemplo 9 y, para identificar las bacterias aisladas, se llevó a
cabo una multiplicación por PCR con los cebadores siguientes:
Como en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
| SUPERIOR: | 5' TGCTTTACACATGCAAGTCG 3' |
| INFERIOR: | 5' CAT CTC TAC GCA TTT CAT TG 3' |
Los glóbulos usados en los experimentos
siguientes fueron Dynabeads M-270 de Dynal AS, o
glóbulos M-PVA activados con OCN, de Chemagen
AG.
Las bacterias utilizadas en los Experimentos
A-G siguientes fueron las siguientes:
- Aeromonas hydrophila
- CCUG 25942
- Bacillus cereus
- ATCC 11778
- Bacillus cereus
- NVH 0075-95
- Campylobacter jejuni
- CCUG 25903
- Clostridium perfringens
- ATCC 13124
- Escherichia coli
- ATCC 25922
- Escherichia coli
- CCUG 38081
- Helicobacter pylori
- CCUG 38771
- Listeria monocytogenes
- ATCC 35152
- Listeria monocytogenes
- CCUG 15527
- Neisseria gonorrhoeae
- ATCC 49226
- Salmonella typhimurium
- ATCC 14028
- Salmonella typhimurium
- CCUG 31969
- Shigella flexneri
- CCUG 38947
- Streptococcus pyogenes
- CCUG 30917
- Streptococcus pneunoniae
- CCUG 33062
- Vibrio cholerae
- CCUG 42534
- Yersinia enterocolitica
- Noma ref 102, Y842
\global\parskip1.000000\baselineskip
En general, en los experimentos siguientes, la
multiplicación fue llevada directamente a cabo sobre el complejo de
DNA-glóbulo. Sin embargo, la identificación de
especies bacterianas usando técnicas de multiplicación puede ser
llevada a cabo sobre el sobrenadante. Para ciertos ligandos
unitivos, tales como heparina, sulfato de dextrano y carragenano,
se puede preferir esto ya que el grupo sulfato puede inhibir la
reacción PCR. En los experimentos siguientes, a menos que se
indique otra cosa, cuando se usa un revestimiento de carragenano la
PCR es llevada a cabo sobre el sobrenadante después de la incubación
de los glóbulos a 80ºC para liberar todo el DNA de los glóbulos.
En este Ejemplo, "carragenano" se refiere
al carragenano iota (Sigma, C-3889). La heparina y
el sulfato de dextrano se obtuvieron de Sigma (números de referencia
H3149 y D6924 del catálogo, respectivamente).
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la multiplicación se muestran
en la fotografía de gel de la Figura 4.
Leyendo desde la parte superior izquierda del
gel:
Línea
1:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III (débil)
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con Goma
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con Goma
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con Goma
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con Goma
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con manosa
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con manosa
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con manosa
Pocillo nº 9 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con manosa
\vskip1.000000\baselineskip
Pocillo nº 10 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con carragenano
Pocillo nº 11 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con carragenano
Pocillo nº 12 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con carragenano
Pocillo nº 13 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con carragenano
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
2:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con Goma
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con Goma
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con Goma
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con Goma
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con manosa
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con manosa
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con manosa
Pocillo nº 9 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de V. cholerae, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con manosa
Pocillo nº 10 = testigo negativo.
Los resultados de la multiplicación se muestran
en la fotografía de gel de la Figura 5.
Leyendo desde la parte superior izquierda del
gel:
Línea
1:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con Goma
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con Goma
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con Goma
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con Goma
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con manosa
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con manosa
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con manosa
Pocillo nº 9 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con manosa
\vskip1.000000\baselineskip
Pocillo nº 10 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con carragenano
Pocillo nº 11 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con carragenano
Pocillo nº 12 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con carragenano
Pocillo nº 13 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con carragenano
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
2:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con Goma
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con Goma
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con Goma
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con Goma
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con manosa
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con manosa
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con manosa
Pocillo nº 9 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. flexneri, añadidos a 200 \mug de Chemagen revestido
con manosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la multiplicación se muestran
en la fotografía de gel de la Figura 6.
Hay seis línea en el gel, todas las cuales
representan E. coli. Leyendo desde la parte superior
izquierda del gel:
\newpage
Línea
1:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-7}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 9 = testigo negativo
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
2:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-7}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestido con manosa
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
3:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-7}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestido con Goma
\newpage
Línea
4:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
manano
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
manano
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
manano
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
manano
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
manano
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
manano
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-7}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestido con
manano
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
5:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
manosa
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
manosa
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
manosa
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
manosa
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
manosa
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
manosa
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-7}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestido con
manosa
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
6:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
Goma
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
Goma
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
Goma
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
Goma
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
Goma
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
Goma
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-7}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestido con
Goma
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la multiplicación se muestran
en la fotografía de gel de la Figura 7.
Leyendo desde la parte superior izquierda del
gel:
\newpage
\global\parskip0.930000\baselineskip
Línea
1:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-7}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 9 = testigo negativo
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
2:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-7}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
3:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
\global\parskip1.000000\baselineskip
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-7}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
4:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con manano
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con manano
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con manano
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con manano
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con manano
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con manano
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-7}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con manano
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
5:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con manosa
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con manosa
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con manosa
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con manosa
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con manosa
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con manosa
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-7}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con manosa
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
6:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-7}
de S. typhimurium, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Aislamiento de DNA de Salmonella
typhimurium
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la multiplicación se muestran
en la fotografía de gel de la Figura 8.
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con goma guar
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con goma guar
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con goma guar
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con goma guar
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con goma guar
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con goma guar
\vskip1.000000\baselineskip
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con Goma
Pocillo nº 9 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con Goma
Pocillo nº 10 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con Goma
Pocillo nº 11 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con Goma
Pocillo nº 12 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con Goma
Pocillo nº 13 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con Goma
\vskip1.000000\baselineskip
Pocillo nº 14 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con manosa
Pocillo nº 15 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con manosa
Pocillo nº 16 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con manosa
Pocillo nº 17 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con manosa
Pocillo nº 18 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con manosa
Pocillo nº 19 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con manosa
\vskip1.000000\baselineskip
Pocillo nº 20 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 21 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 22 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 23 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 24 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
Pocillo nº 25 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con manosa
\vskip1.000000\baselineskip
Pocillo nº 26 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 27 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 28 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 29 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 30 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 31 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
\vskip1.000000\baselineskip
Pocillo nº 32 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 33 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 34 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 35 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 36 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 37 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de C. jejuni, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la multiplicación se muestran
en la fotografía de gel de la Figura 9.
Línea
1:
PCR llevada a cabo sobre el
sobrenadante, separado de los glóbulos con un imán después de una
incubación a 90ºC durante 5
minutos.
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 9 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
\newpage
PCR desarrollada sobre el resto de
los glóbulos después de una resuspensión en
agua
Pocillo nº 10 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 11 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 12 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 13 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 14 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 15 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
2:
PCR llevada a cabo sobre el
sobrenadante, separado de los glóbulos con un imán después de una
incubación a 90ºC durante 5
minutos.
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 9 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
\vskip1.000000\baselineskip
PCR desarrollada sobre el resto de
los glóbulos después de una resuspensión en
agua
Pocillo nº 10 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 11 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 12 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 13 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
\newpage
Pocillo nº 14 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 15 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.950000\baselineskip
Línea
3:
PCR llevada a cabo sobre el
sobrenadante, separado de los glóbulos con un imán después de una
incubación a 90ºC durante 5
minutos.
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 9 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
\vskip1.000000\baselineskip
PCR desarrollada sobre el resto de
los glóbulos después de una resuspensión en
agua
Pocillo nº 10 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 11 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 12 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 13 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 14 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 15 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
4:
PCR llevada a cabo sobre el
sobrenadante, separado de los glóbulos con un imán después de una
incubación a 90ºC durante 5
minutos.
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
\global\parskip1.000000\baselineskip
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 9 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
\vskip1.000000\baselineskip
PCR desarrollada sobre el resto de
los glóbulos después de una resuspensión en
agua
Pocillo nº 10 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 11 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 12 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 13 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 14 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 15 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de S. pyogenes, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la multiplicación se muestran
en la fotografía de gel de la Figura 10.
Línea
1:
PCR llevada a cabo sobre el
sobrenadante, separado de los glóbulos con un imán después de una
incubación a 90ºC durante 5
minutos.
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
\vskip1.000000\baselineskip
PCR desarrollada sobre el resto de
los glóbulos después de una resuspensión en
agua
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
Pocillo nº 9 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con Goma
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
2:
PCR llevada a cabo sobre el
sobrenadante, separado de los glóbulos con un imán después de una
incubación a 90ºC durante 5
minutos.
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
\vskip1.000000\baselineskip
PCR desarrollada sobre el resto de
los glóbulos después de una resuspensión en
agua
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
Pocillo nº 9 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con heparina
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
3:
PCR llevada a cabo sobre el
sobrenadante, separado de los glóbulos con un imán después de una
incubación a 90ºC durante 5
minutos.
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
\vskip1.000000\baselineskip
PCR desarrollada sobre el resto de
los glóbulos después de una resuspensión en
agua
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
Pocillo nº 9 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con carragenano
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
4:
PCR llevada a cabo sobre el
sobrenadante, separado de los glóbulos con un imán después de una
incubación a 90ºC durante 5
minutos.
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
\vskip1.000000\baselineskip
PCR desarrollada sobre el resto de
los glóbulos después de una resuspensión en
agua
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
Pocillo nº 9 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de N. gonorrhoeae, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen
revestidos con sulfato de dextrano
\vskip1.000000\baselineskip
El experimento se llevó a cabo sobre un cultivo
puro de una línea cancerosa de células B llamada J558L. Los
cebadores usados fueron:
| SUPERIOR: | 5' CCCGCCCCTTGCCTCTC 3' |
| INFERIOR: | 5' TGGTCGCTCGCTCCTCTC 3' |
Los resultados de la multiplicación se muestran
en la fotografía de gel de la Figura 11. La PCR fue llevada a cabo
sobre el sobrenadante, separado de los glóbulos con un imán después
de una incubación a 90ºC durante 5 minutos.
Línea
1:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-0}
de células B, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen revestidos
con carragenano de Tipo V
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de células B, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen revestidos
con carragenano de Tipo V
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de células B, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen revestidos
con carragenano de Tipo V
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de células B, añadidos a 200 \mug de glóbulos Chemagen revestidos
con carragenano de Tipo V
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
2:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-0}
de células B, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
carragenano de Tipo I
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de células B, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
carragenano de Tipo I
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de células B, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
carragenano de Tipo I
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de células B, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
carragenano de Tipo I
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
3:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-0}
de células B, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
carragenano de Tipo II
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de células B, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
carragenano de Tipo II
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de células B, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
carragenano de Tipo II
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de células B, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
carragenano de Tipo II
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
4:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-0}
de células B, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
carragenano de Tipo V
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de células B, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
carragenano de Tipo V
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de células B, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
carragenano de Tipo V
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de células B, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
carragenano de Tipo V
\vskip1.000000\baselineskip
Los distintos tipos de carragenano usados (con
su Nº de Producto del catálogo de Sigma) son:
carragenano de Tipo I - principalmente
carragenano kappa: C1013
carragenano de Tipo II - principalmente
carragenano iota: C1138
carragenano de Tipo V -carragenano iota:
C-3889.
Se aisló E. coli de glóbulos revestidos
con GOMA de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 8. Los glóbulos no
revestidos pasaron por el mismo procedimiento de revestimiento que
los glóbulos revestidos, pero sin la adición de azúcar. Se siguió
el protocolo de aislamiento del Ejemplo 9 de acuerdo con las
diluciones siguientes:
Línea
1:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Dynabeads no
revestidos
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-1}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Dynabeads no
revestidos
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-2}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 6 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Dynabeads no
revestidos
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-3}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Dynabeads no
revestidos
Pocillo nº 9 = 100 \mul de dilución 10^{-4}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con
Goma
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
2:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Dynabeads no
revestidos
Pocillo nº 3 = 100 \mul de dilución 10^{-5}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 4 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Dynabeads no
revestidos
Pocillo nº 5 = 100 \mul de dilución 10^{-6}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 7 = 100 \mul de dilución 10^{-7}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Dynabeads no
revestidos
Pocillo nº 8 = 100 \mul de dilución 10^{-7}
de E. coli, añadidos a 200 \mug de glóbulos Dynabeads
revestidos con Goma
Los resultados de la multiplicación se muestran
en la fotografía de gel de la Figura 12.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron diversas especies bacterianas a
partir de glóbulos revestidos con GOMA de acuerdo con el protocolo
del Ejemplo 8. Se siguió el protocolo de aislamiento del Ejemplo 9,
y los resultados de la multiplicación se muestran en la fotografía
de gel de la Figura 13, en la que:
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
1:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de Shigella
flexneri sin diluir, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 3 = 100 \mul de Vibrio
cholerae sin diluir, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 4 = 100 \mul de Aeromonas
hydrophila sin diluir, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 5 = 100 \mul de Streptococcus
pneumoniae sin diluir, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 6 = 100 \mul de Streptococcus
pyogenes sin diluir, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 7 = 100 \mul de Salmonella
typhimurium sin diluir, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 8 = 100 \mul de Yersinia
enterocolitica sin diluir, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
\vskip1.000000\baselineskip
Línea
2:
Pocillo nº 1 = marcador Hae III
Pocillo nº 2 = 100 \mul de E. coli sin
diluir, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos con Goma
Pocillo nº 3 = 100 \mul de Listeria
monocytogenes sin diluir, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 4 = 100 \mul de Clostridium
perfringens sin diluir, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 5 = 100 \mul de Bacillus
cereus sin diluir, añadidos a 200 \mug de Dynabeads revestidos
con Goma
Pocillo nº 6 = 100 \mul de Campylobacter
jejeuni sin diluir, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 7 = 100 \mul de Neisseria
gonorrhoeae sin diluir, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Pocillo nº 8 = 100 \mul de Bordetella
pertussis sin diluir, añadidos a 200 \mug de Dynabeads
revestidos con Goma
Los cebadores para Bordetella fueron los
mismos que para Neisseria (véase la Tabla 1).
\global\parskip0.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Genpoint AS
\hskip1cmKolpus, Tone
\hskip1cmRefseth, Unn Hilde
\hskip1cmGardner, Rebecca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método de aislamiento de células
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 9.1.72278/001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/GB01/00240
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
22-01-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtcgaacg gtaacagga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccgctaca cctgraat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgagatta aggctgataa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacattaaccc caggaagag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ()..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacatgcaag tcgagcggc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptgccttttgt agaatgacc
\hfill19
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\hskip-.1em\dddseqskipcggcattctc acttctaagc
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctttacac atgcaagtcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
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<211> 20
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<212> DNA
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<220>
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<221> característica_misc
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<223> cebador
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<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcatctctacg catttcattg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcccgcccctt gcctctc
\hfill17
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<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtcgctcg ctcctctc
\hfill18
Claims (21)
1. Un método para aislar los microorganismos de
una muestra, método que comprende unir dichos microorganismos a un
soporte sólido por medio de un ligando inespecífico inmovilizado
sobre dicho soporte sólido, en el que dicho ligando es un
polisacárido que comprende manosa y/o galactosa y/o derivados de las
mismas, incluyendo derivados sulfatados, en el que dicho
polisacárido comprende 13 o más unidades monosacáridas
covalentemente
enlazadas.
enlazadas.
2. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1,
en el que los microorganismos son bacterias.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
o la reivindicación 2, en el que dichos derivados son seleccionados
del grupo que consiste en ácido aldónico-derivados,
ácido urónico-derivados, desoxiderivados,
aminoderivados, derivados sulfatados y
alcohol-derivados, de galactosa o manosa.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
o la reivindicación 2, en el que el ligando es seleccionado del
grupo que consiste en Goma, goma guar, carragenano y manano.
5. Un método de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en el que el soporte sólido es
corpuscular.
6. Un método de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, que comprende además una operación para
identificar uno o más de los microorganismos unidos a dicho soporte
sólido.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6,
en el que los microorganismos son identificados utilizando una sonda
de ácido nucleico específica del tipo celular.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 6
o la reivindicación 7, en el que los microorganismos unidos son
lisados para liberar su ácido nucleico.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8,
en el que el ácido nucleico liberado es unido a un soporte
sólido.
10. Un método para detectar un microorganismo en
una muestra, método que comprende:
(a) llevar a cabo un método para aislar
microorganismos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1
a 9; y
(b) identificar dicho microorganismo unido a
dicho soporte sólido.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación
10, en el que la operación (b) comprende lisar los
microorganismos.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que el ácido nucleico liberado procedente de dichos
microorganismos lisados se une a un soporte sólido.
13. Un método para aislar ácido nucleico
procedente de una muestra de microorganismos, método que
comprende:
(a) llevar a cabo un método para aislar
microorganismos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1
a 9;
(b) lisar los microorganismos unidos; y
(c) unir a un soporte sólido el ácido nucleico
liberado procedente de dichos microorganismos lisados.
14. Un método para detectar la presencia o
ausencia de un microorganismo objetivo en una muestra, método que
comprende:
(a) llevar a cabo un método para aislar
microorganismos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1
a 9;
(b) lisar los microorganismos unidos;
(c) unir a un soporte sólido el ácido nucleico
liberado procedente de dichos microorganismos lisados; y
(d) detectar la presencia o ausencia de ácido
nucleico característico de dicho microorganismo objetivo en dicho
ácido nucleico unido.
15. Un método de acuerdo con la reivindicación
13 o la reivindicación 14, en el que el ácido nucleico se une al
mismo soporte sólido al que se unen los microorganismos.
\newpage
16. Un sistema para aislar los microorganismos
de una muestra, que comprende:
(a) un soporte sólido que tiene inmovilizado
sobre él un ligando que es capaz de una unión inespecífica con
microorganismos, en que dicho ligando es un polisacárido que
comprende manosa y/o galactosa y/o derivados de las mismas,
incluyendo derivados sulfatados, en que dicho polisacárido comprende
13 o más unidades monosacáridas covalentemente enlazadas; y
(b) un tampón apropiado para la unión de
microorganismos a dicho soporte sólido.
17. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
16, en el que dichos derivados son seleccionados del grupo que
consiste en ácido aldónico-derivados, ácido
urónico-derivados, desoxiderivados, aminoderivados,
derivados sulfatados y alcohol-derivados, de
galactosa o manosa.
18. El sistema de la reivindicación 16 o la
reivindicación 17, que comprende además medios para lisar dichos
microorganismos.
19. El sistema de la reivindicación 18, que
comprende además medios para unir a un soporte sólido el ácido
nucleico liberado procedente de dichos microorganismos lisados.
20. Un soporte sólido que tiene inmovilizado
sobre él un ligando que es capaz de una unión inespecífica con
microorganismos, en que dicho ligando es un polisacárido que
comprende manosa y/o galactosa y/o derivados de las mismas,
incluyendo derivados sulfatados, en que dicho polisacárido comprende
13 o más unidades monosacáridas covalentemente enlazadas.
21. Un soporte sólido de acuerdo con la
reivindicación 20, en el que dichos derivados son seleccionados del
grupo que consiste en ácido aldónico-derivados,
ácido urónico-derivados, desoxiderivados,
aminoderivados, derivados sulfatados y
alcohol-derivados, de galactosa o manosa.
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