DE69401717T2

DE69401717T2 - Verfahren zur Aktivierung von polyanionischen,fluoreszierenden Farbstoffen in schwach dielektrischen Medien mit quaternären Oniumverbindungen

Info

Publication number: DE69401717T2
Application number: DE69401717T
Authority: DE
Inventors: Christiane Salem Ma 01970 Munkholm
Original assignee: Ciba Corning Diagnosys Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-08-30
Publication date: 1997-05-22
Anticipated expiration: 2014-08-31
Also published as: JP2866201B2; ATE148788T1; PL313265A1; US5387525A; AU687854B2; AU7391094A; CA2170592A1; CA2170592C; HK1000100A1; EP0716740B1; JPH09500685A; WO1995006871A3; US5506148A; DK0716740T3; ES2099626T3; EP0716740A1; KR0171534B1; DE69401717D1; WO1995006871A2

Description

Hintergrund der Erfindung

A. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung der Fluoreszenz von polyanionischen Fluorophoren in schwach dielektrischen Medien mit Fluoreszenzaktivierung, die durch spezielle quaternäre Onium- Verbindungen erzeugt wird. Die Chemie kann in Lösungsphase oder in einer festen Phase, wie einer schwach dieleketrischen Polymerbeschichtung, verwendet werden, und wenn sie als Beschichtung verwendet wird, kann sie als optisches fluoreszierendes Sensormaterial für Analyten, die die Beschichtung durchdringen können und die Fluoreszenz auf spezielle Weise modulieren können, fungieren.

B. Beschreibung des Standes der Technik

Wenn die spektralen Eigenschaften eines kolorimetrischen oder fluorimetrischen Farbstoffes durch einen speziellen Analyten auf konzentrationsabhängige Weise moduliert werden, sagt man, daß der Farbstoff in der Lage ist, als Transducer für den Analyten zu funktionieren. Es liegt nun ein großer technologischer Umfang vor, der kolorimetrische und fluorimetrische Farbstoffe als Transducer verwendet. Historisch sind diese Farbstoffe in der Lösungs-Analyse verwendet worden, aber sie finden erneute Anwendung als immobilisierte Indikatoren auf optischen Oberflächen, wie optischen Fasern (W. Rudolf Seitz, CRC Critical Reviews in Anal. Chem., 1988, 19, 135).
Optische Nachweissysteme auf Fluoreszenz-Basis werden gegenüber denjenigen bevorzugt, die auf Nachweisschemata auf kolorimetrischer oder Absorbanz-Basis beruhen, da die Fluoreszenz um mehrere Größenordnungen empfindlicher ist, da sie ein Phänomen mit null Hintergrund ist. Auch kann in die Analyse eine größere spektrale Unterscheidungskraft einbezogen werden, da man Anregungs- und Emissionswellenlängen als selektive Parameter verwendet. Eine zusätzliche Selektivität ist möglich, indem man Fluoreszenz-Phänomene außer der direkten Intensität mißt, wie Fluoreszenz- Halbwertszeiten und -Polarisation. Ein technologischer Vorteil der Fluoreszenz-Analyse ist die Kompatibilität der Fluoreszenz mit Laseranregung.
Die photophysikalischen Eigenschaften von Fluorophoren sind innig mit deren molekularer Struktur sowie der Art und Ladung jeglicher Substituenten an der zentralen Struktur verbunden. Viele der üblicherweise für optische Sensoren verwendeten Fluorophore sind negativ geladen und werden typischerweise in polaren Medien verwendet.
Die Immobilisierung von Fluorophoren als Transducer für optische Sensoren ist mit einer Vielfalt von Verfahren bewerkstelligt worden, die allgemein in vier Klassen fallen: 1) Adsorption an einer geladenen Oberfläche oder einem geladenen Polymer (Orellana, G., Moreno-Bondi, M.C., Segovia, E., Marzuela, M.C., Analytical Chemistry, 64, 2210 - 2215, 1992), 2) Einschließen in ein Reservoir oder Polymer mit einer Deckmembran (Wolfbeis, O.S., Weis, L.J., Leiner, M.J.P., Ziegler, W.E., Analytical Chemistry, 60, 2028 - 2030, 1988), 3) kovalente Verknüpfung als Monoschicht mit der Substratoberfläche (Wolfbeis, O.S., Offenbacher, H., Kroneis, H., Marsoner, H., Mikrochimica Acta, I, 153 - 158, 1984) und 4) kovalente verknüpfung als Copolymer, das auf die Oberfläche gepfropft ist (Munkholm, C., Walt, D.R., Milanovich, F., Klainer, S.M., Anal. Chem. 58, 1427 - 1430, 1986).
Alle diese Verfahren weisen inhärent Beschränkungen auf, die für spezielle Anwendungen ein Problem sein können. Anionische Farbstoffe, die durch Adsorption an eine geladene Oberfläche immobilisiert sind, können in wäßrigen Proben eine schlechte Stabilität aufweisen, und der Farbstoff wird nicht vor anderen ionischen Bestandteilen in der Probe geschützt. Die Immobilisierung über ein Einschließen in einer flüssigen oder Gelreservoir-Phase erfordert das Hinzufügen einer Sperrmembran, die dazu dient, den Farbstoff zu erhalten, während sie für den interessierenden Analyten durchlässig ist. Bei klinischen Anwendungen ist diese zweite Membran typischerweise ein hydrophobes Polymer. Jedoch leiden optische Zweiphasen-Sensoren, die mit zwei Schichten aus inkompatiblem Material hergestellt sind, oft unter einer Fehlfunktion auf Grund von kleinlöchrigen Lecks und zeigen auch auf Grund der Diffusionserfordernisse durch die hydrophobe Membran verringerte Antwortzeiten. Es sind optische Sensoren mit Einzellagen-Beschichtungen mit kovalent immobilisierten Farbstoffen und Farbstoff-Copolymeren hergestellt worden. Jedoch kann eine kovalente Immobilisierung schwierig zu erreichen sein, während die intrinsischen photophysikalischen Eigenschaften des Farbstoffes beibehalten werden. Selbst bei einer kovalenten Immobilisierung des Transducers ist eine Sperrmembran notwendig, wenn der Sensor erfordert, daß der Farbstoff in einem speziellen internen Elektrolyten- oder Puffersystem isoliert wird.
Wenn man einen Fluorophor in einer hydrophoben oder nicht-polaren Polymermembran verwenden könnte, könnten die optischen Sensorkomponenten chemisch von der wäßrigen Probe getrennt werden. Jedoch sind polyanionische Farbstoffe für die Mikroumgebungs-Polarität des Lösungsmittels oder der festen Matrix, die den Fluorophor umgibt, äußerst empfindlich, und viele in dieser Klasse fluoreszieren nicht in nichtpolaren Medien. Fluorescein, das eine sehr hohe, pH-abhängige Quantenausbeute in wäßrigen Proben hat, hat eine nahezu völlig gequenchte Fluoreszenz, wenn es in einer nicht-polaren Umgebung eines schwach dielektrischen Lösungsmittels, wie Hexan oder Benzol, beobachtet wird, oder wenn es in einem hydrophoben Polymer, wie Polystyrol, eingeschlossen ist. In einem solchen durch die Umgebung gequenchten Zustand ist der Farbstoff als analytisches Reagenz nicht nützlich.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, das die Fluoreszenz-quenchende Wirkung von schwach dielektrischen Medien auf polyanionische Farbstoffe durch Einschluß einer quaternären Ammonium- Verbindung in eine Formulierung aufhebt, die für Beschichtungssubstrate für die Herstellung von optischen Sensoroberflächen verwendet wird. Das Quench-Phänomen kann aufgehoben werden, und die resultierende aktivierte Fluoreszenz kann für analytische Zwecke verwendet werden, indem man die speziellen chemischen Phänomene, von denen bekannt ist, daß sie die photophysikalischen Eigenschaften beeinflussen, wie Säure-Base- Gleichgewichte oder quenchende Wirkungen, an einen Analyten kuppelt, der in der Lage ist, das schwach dielektrische Medium zu durchdringen und mit dem aktivierten Fluorophor wechselzuwirken. Man kann jeden Fluoreszenz- Parameter, wie absolute Intensität, Phasenmodulation, Polarisation, Halbwertszeiten oder Phosphoreszenz, bei der Spektralanalyse überwachen.
Obwohl die vorliegende Erfindung sich hauptsächlich mit Ammonium- Verbindungen beschäftigt, versteht der Fachmann, daß Ammonium-Verbindungen lediglich ein Beispiel einer Klasse von Verbindungen sind, die als Onium- Verbindungen bezeichnet werden. Andere Mitglieder der Onium-Klasse schließen beispielsweise Phosphonium-Verbindungen, wie Tetrabutylphosphoniumbromid, ein, die als gemeinsames Merkmal eine Alkyl- oder Aryl-derivatisierte kationische Funktion, kombiniert mit einem anionischen Gegenion, aufweisen. Es wird erwartet, daß andere Onium- Verbindungen ähnliche Leistungen wie die Ammonium-Verbindungen zeigen, insbesondere wenn man das geeignete Gegenion und den geeigneten Alkyl- Liganden verwendet. In der gesamten Diskussion wird die neue Leistung mit Bezug auf die gesamte Klasse an Onium-Verbindungen besprochen.
Gemäß der Erfindung muß der fluoreszierende Farbstoff ein polyanionischer Farbstoff sein, der einem vollständigen Verlust der Fluoreszenz unterzogen wird, wenn er in einem schwach dielektrischen Medium, wie Hexan oder Toluol, oder festen Medium, wie Polystyrol, solubilisiert wird. Farbstoffe dieser Klasse umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Fluorescein und Derivate, sulfonatierte Pyrene und Derivate, Seminaphthorhodafluore und Derivate und Seminaphthofluoresceine und Derivate.
Die Zugabe einer Verbindung, die in der nicht-polaren Umgebung solubilisiert werden kann und die eine positive Ladung aufweist, wie eine quaternäre Ammonium-Verbindung, bildet einen Ionenkomplex oder aggregierten Komplex mit dem in dem Medium gelösten polyanionischen Farbstoff. Die aktivierenden Onium-Verbindungen (AcOC), die in dieser Erfindung als Beispiele dienen, sind Alkyl- und Aryl-substituierte Ammonium-Verbindungen, wie Tetrabutylammoniumhydroxid, und ein Acrylat- Copolymer, das funktionelle Ammoniumgruppen enthält. Diese zwei Aktivatoren weisen einen organischen Liganden, der in einem schwach dielektrischen Medium löslich ist, und eine kationische Ammonium-Einheit auf, die die Ladungs-Ladungs-Wechselwirkung mit dem polyanionischen Farbstoff bildet. Die Assoziierung und das Zusammentreffen dieser zwei geladenen Spezies hat aggregierte Mikrodomänen zur Folge, und in dieser polareren Mikroumgebung ist das Farbstoffmolekül von der quenchenden Wirkung des schwach dielektrischen Hauptmediums abgeschirmt. Unter Verwendung dieses Verfahrens werden Farbstoffe, die in Wasser eine sehr hohe Quantenausbeute haben, wie Fluorescein und Hydroxypyrentrisulfonsäure (HPTS), bezüglich der relativen Photonenemission oft auf gleiche oder ähnliche Niveaus gebracht, wenn sie in Lösungsmitteln verwendet werden, die typischerweise die Fluoreszenz quenchen. Andere AcOC-Verbindungen mit ähnlichen Eigenschaften können ebenfalls verwendet werden.
In einer Ausführungsform wird die Fluoreszenzaktivierung unter Zugabe der AcOC zu polyanionischen Fluorophoren in schwach dielektrischen Lösungsmitteln in Lösung gezeigt. Das Fluoreszenzsignal ist 50 - 2000-fach verstärkt und tritt sowohl bei pH-empfindlichen als auch bei pH- unempfindlichen polyanionischen Farbstoffen auf. In einer zweiten Ausführungsform wird die Fluoreszenzaktivierung in der festen Phase in schwach dielektrischen Polymeren auf Glassubstraten gezeigt. Eine Fluorophor/Polymer-Lösung, die für eine Membranbeschichtung verwendet wird, wird mit einer AcOC aktiviert und bleibt in der Lage, nach Verdampfen des Beschichtungslösungsmittels in dem Beschichtungspolymer fluoreszierend zu sein. Der Farbstoff funktioniert in der Beschichtung mit seinen chemisch spezifischen Eigenschaften weiter. Beispielsweise wurden ein CO&sub2;-Sensor, der auf einem pH-Gleichgewicht beruht, sowie ein O&sub2;-Sensor auf der Grundlage von Fluoreszenz-Quenchen hergestellt. Was wichtig ist, ist, daß diese hydrophoben Membranen in flüssigen Proben stabil sind, was die Herstellung von sehr dünnen fluoreszierenden Filmen für die Herstellung von optischen Sensoren gestattet.
Eine dritte Ausführungsform verwendet ein Polymer, das eine funktionelle Ammoniumgruppe enthält, die sowohl zur Fluoreszenzaktivierung als auch zur Membranbildung dient, was zeigt, daß es möglich ist, den Fluoreszenzaktivierungs-Mechanismus mit dem Polymerträger zu kombinieren.
Die offenbarte Erfindung der Fluoreszenzaktivierung ermöglicht die Verwendung von einigen der üblichsten und stark verwendeten Fluorophore in Umgebungen, wo sie zuvor auf Grund der quenchenden Wirkungen des Mediums nicht funktionierten. Die aktivierten Fluorphore behalten auch ihre charakteristischen chemischen Eigenschaften, d.h. pH-Empfindlichkeit, bei. Mit dieser Erfindung kann man Sensorbeschichtungen herstellen, in denen der Transducer durch die Zugabe der aktivierenden Verbindung funktionierend gemacht wird. Weiter ist die Sensormembran auf Grund der Unlöslichkeit der nicht-polaren Membran in der wäßrigen Probe von der klinischen Probe abgetrennt, was die Notwendigkeit für Bedeckungsmembrane oder kovalente Chemie als Verfahren der Verhütung des Auswaschens des Farbstoffes minimiert. Man kann dann Sensoren für jeden Analyten herstellen, der die Membran, die den aktivierten Fluorophor enthält, durchdringen kann.
Wenn die schwach dielektrischen Sensorbeschichtungen mit hydrophoben Polymeren hergestellt werden, können polare Analyten, wie beispielsweise Elektrolyten, daran gehindert sein, in das Sensormedium einzudringen, wenn sie nicht mit einem Vektormolekül komplexiert werden. Analyten, die durch die Beschichtung und in die durch den aktivierten Komplex geschaffenen Sensor-Mikrodomänen diffundieren können, sind solche, die durch ein schwach dielektrisches Medium hindurchdringen können, wie dampf- oder gasförmige Analyten. Nicht-polare Analyten könnten ebenfalls direkt aus der flüssigen Phase in den Sensor diffundieren. Beispiele von Analyten, die mit dieser Chemie gekuppelt werden könnten, wären O&sub2;, CO&sub2; und NH&sub3;, die durch verschiedene fluoreszierende Transducer nachgewiesen werden können. Ebenfalls könnte jede Reaktion, die ein Gas erzeugt, wie ein Enzymsystem, das Ammoniak liefert, oder ein chemisches Katalysesystem, das ein schwach dielektrisches Nebenprodukt aufweist, mit der Sensorschicht, die den geeigneten fluoreszierenden Transducer enthält, gekuppelt werden.
Das hierin beschriebene Verfahren muß von dem kolorimetrischen Ablesesystem unterschieden werden, das in US-Patent 5,005,572 (Raemer, Walt, Munkholm) beschrieben wird. Dieser Stand der Technik beschreibt die erste Beobachtung einer nützlichen Wechselwirkung, die zwischen pH- empfindlichen kolorimetrischen Farbstoffen und quaternären Onium- Verbindungen (als Phasentransfer-Verstärker oder -Katalysatoren bezeichnet) auftritt, für den Zweck der Bereitstellung eines visuellen Farbänderungs-Ablesesystems in einer medizinischen Vorrichtung. Die Zugabe des Phasentransfer-Katalysators erzeugte nicht das Auftreten von Farbe, sondern sensibilisierte vielmehr die Geschwindigkeit der Säure/Base- Antwort des Farbstoffes als Festphasen-Transducer für Atmungs-CO&sub2; in einem endotrachealen Rohr. Die kolorimetrischen Farbstoffe, die in US-Patent 5,005,572 verwendet wurden, lagen in einer Konzentration vor, die mit dem bloßen Auge beobachtet werden konnte, und es gab kein Ergebnis, das mit der Aktivierung oder der Steigerung der Nachweisbarkeit des Transducers für entweder visuelle oder instrumentelle Zwecke in Beziehung stand. Raemer et al. beanspruchten die Verwendung von allen Phasentransfer- Katalysatoren, und die hierin offenbarte Erfindung ist auf die quaternären Ammonium-Verbindungen, die die Fluoreszenz steigern, eingeengt. Bei Raemer wurde auch keine Unterscheidung bezüglich der Polarität des Substrats gemacht, das verwendet wurde, um den Transducer zu tragen. Die Farbstoffe wurden alle in wäßrigem Medium hergestellt und wurden niemals aus einem schwach dielektrischen Lösungsmittel abgeschieden oder darin verwendet. Im Gegensatz dazu ist die vorliegende Erfindung auf die Aktivierung von Fluoreszenzfarbstoffen in nicht-polaren, quenschenden Umgebungen und die anschließende Fähigkeit der aktivierten Fluorophore, als Transducer in hydrophoben Membranen zu wirken, gerichtet. Weiter ist die vorliegende Erfindung nicht auf die pH-empfindlichen Fluorophore beschränkt, die im US-Patent 5,005,572 besprochen werden, und der Aktivator ist nicht auf die Phasentransfer-Katalysatoren beschränkt, die bei Raemer besprochen werden. Eine andere Patentveröffentlichung, WO 91/05252 (Mills, McMurray), dupliziert die Offenbarung des US-Patents 5,005,572 bezüglich der kolorimetrischen Ablesung von Atmungs-CO&sub2; in einer Intubationsvorrichtung. Die hierin offenbarte Arbeit beschreibt drei neue Verbesserungen gegenüber dem Stand der Technik: 1) ein generisches Verfahren für die Fluoreszenzaktivierung von polyanionischen Fluorophoren in nicht-polaren (d.h. schwach dielektrischen) Medien, 2) die Herstellung von hydrophoben fluoreszierenden Membranen, die aus schwach dielektrischen Polymeren hergestellt werden, und 3) die anschließende Verwendung der Polymerbeschichtungen als optische Sensoren bei Geräten, die irgendeine der Fluoreszenz-Moden der Signalübertragung verwenden.
Das Verfahren dieser Erfindung ist sowohl für in-vitro- als auch in- vivo-Anwendungen nützlich, einschließlich Blutgas-Instrumenten und optischen Fasern oder planaren Wellenleitern, die als Komponenten eines Sensors verwendet werden, sowohl in medizinischen als auch in Umgebungs- Sensorvorrichtungen. Obwohl wir die Messungen von direkter Fluoreszenzintensität beschreiben, beschränken wir die Erfindung nicht auf Intensitätsmessungen. Jeder Fluoreszenz-Modus, wie Halbwertszeit- Messungen, Phasen-Modulation (Szmacinski, H., Lakowicz, J.R., Analytical Chemistry, 65, 1668 - 1674, 1993) oder Polarisierung, kann mit der Analyse sowie der Verwendung von Nachweisschemata, die mehrfache Fluorophore verwenden, wie Systeme auf der Basis von Energieübertragung, gekuppelt werden. Nicht-fluoreszierende polyanionische Farbstoffe können ebenfalls in diesen Energieübertragungs-Systemen verwendet werden sowie in analytischen Anwendungen verwendet werden, in denen lediglich kolorimetrische Farbstoffe verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt die vergleichende Fluoreszenzemission von Fluorescein in Wasser, Toluol und Toluol plus AcOC. Figur 2 zeigt die Fluoreszenzaktivierung in Lösungsmitteln, die unterschiedlich dielektrisch sind. Figur 3 zeigt die Fluoreszenzaktivierung bei variierten Verhältnissen von Hexan und Aceton. Figur 4 zeigt die vergleichenden Fluoreszenzanregungs-Spektren von HPTS in Toluol und Ethanol und der gleichen Lösung, wobei das Ammonium-Copolymer zugesetzt ist. Figur 5 zeigt Beispiele für polyanionische Fluorophore, die durch AcOC-Verbindungen aktiviert werden können. Figur 6 zeigt die Fluoreszenzintensität von Polymermembranen als Funktion des Molverhältnisses von AcOC zu Farbstoff. Figur 7 zeigt die vergleichenden Fluoreszenzanregungs-Spektren von HPTS mit einer Titration von AcOC in der Toluol-Lösung. Figur 8 zeigt die CO&sub2;- Antwort einer Sensormembran.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

A. Hintergrundstheorie

Die Empfindlichkeit von Fluorophoren für die Polarität ihrer Umgebung ist eine gut charakterisierte Eigenschaft der Fluoreszenz und wird oft für die Analyse von Mikroumgebungs-Phänomenen ausgenützt. Die Lippert-Gleichung, die den Einfluß des Lösungsmittels auf die Dipole im Grundzustand und im angeregten Zustand in Beziehung setzt, wird verwendet, um den Unterschied zwischen den Energien der Anregungs- und Emissionsbanden, als Stokes-Shift bekannt, die für einen gegebenen Fluorophor in Medien mit varuerender Polarität erwartet wird (Lakowicz, J., Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York, S. 190), vorherzusagen. Sowohl der dielektrische als auch der Brechungsindex des Lösungsmittels tragen zu einem reaktiven Feld bei, das im Lösungsmittel induziert wird, das den Farbstoff umgibt, und die Wechselwirkung des Dipols des Farbstoffes in diesem Feld bestimmt den Lösungsmittel-Relaxationszustand und die Energie der Emissionswellenlänge.
Die Quantenausbeute eines Farbstoffes wird ebenfalls durch Lösungsmittelpolarität sowie durch zahlreiche andere Faktoren beeinflußt. Neben den allgemeinen Lösungsmittelwirkungen, die durch die Lippert- Gleichung beschrieben werden, können Lösungsmittel auch spezielle chemische Wirkungen, wie Wasserstoffbrückenbindung, auf einen Fluorophor aufweisen. Wie die Quantenausbeute eines speziellen Farbstoffes durch ein Lösungsmittel beeinflußt wird, hängt von der relativen Bedeutung sowohl der allgemeinen als auch der speziellen Lösungsmittelwirkungen ab. Auch chemische Wirkungen auf Grund von Fremdverbindungen können die Quantenausbeute ändern.
Wenn man einen Farbstoff bezüglich seiner Empfindlichkeit auf die Lösungsmittelpolarität bewertet, ist es bekannt, daß Fluorophore, die die größten Veränderungen im Dipolmoment zwischen dem Grundzustand und dem angeregten Zustand aufweisen, am empfindlichsten für eine Lösungsmittelpolarität sind (J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 1986, Plenum Press, New York, 3. Auflage, S. 187 - 208). Die Fluoreszenz-Quantenausbeute und -Energie werden durch die Fähigkeit von Lösungsmittelmolekülen beeinflußt, auf die Dipolveränderungen zu antworten, die bei der Anregung des Farbstoffes auftreten, ein Phänomen, das als Lösungsmittelrelaxation bekannt ist. Obwohl die Lösungsmittelpolarität oder der Lösungsmitteldipol ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung dieser Lösungsmittelstabilisierung des angeregten Zustandes ist, schließen andere Faktoren, die dieses Phänomen beeinflussen, die Lösungsmittelstruktur, die Farbstoffstruktur, die Mikroviskosität und die Temperatur ein (E.L. Wehry, Modern Fluorescence Spectroscopy, 1976, Plenum Press, New York, S. 93 - 101).
Nicht-polare Lösungsmittel, wie Hexan, weisen ein kleines oder kein Dipolmoment auf. Dementsprechend ist die Lösungsmittelrelaxation auf Grund einer Dipolumorientierung unbedeutend, und Fluorophore, die in nichtpolaren Lösungsmitteln gelöst sind, weisen einen kleinen Stokes-Shift auf im Vergleich zu demjenigen, der in polaren Lösungsmitteln beobachtet wird. Die Quantenausbeute als Funktion des Dipols ist weniger vorhersagbar; einige Fluorophore, wie Anilinonaphthalinsulfonsäure (ANS), weisen in nicht-polaren Lösungsmitteln eine höhere Quantenausbeute als in polaren Medien auf. Andere Fluorophore, wie Fluorescein, zeigen einen hohen Quantenausbeuten-Zustand in polaren wäßrigen Lösungsmitteln und werden in nicht-polaren Lösungsmitteln gequencht.
Die Quantenausbeute eines Farbstoffes in einem gegebenen Lösungsmittel kann auf Grund spezieller chemischer Effekte, die entweder die Struktur des Farbstoffes oder der Mikroumgebung des Farbstoffes ändern, einer Verstärkung oder Aktivierung der Fluoreszenz unterliegen. Beispiele, die die Struktur des Farbstoffes verändern, sind die Aktivierung der Fluoreszenz von Fluoresceinamin durch Umsetzung mit Acylhalogeniden (Munkholm, C., Parkinson, D.R., Walt, D.R., Journal of the American Chemical Society, 112, 2608 - 2612, 1990) und die Fluoreszenzaktivierung durch Chelatisierung mit einer Elektronenentziehenden Gruppe (Huston, M.E., Akkaya, E.U., Czarnik, A.W., Journal of the American Chemical Society, 111, 8735, 1989). Ein Beispiel für einen spezifischen chemischen Effekt, der die Umgebung des Farbstoffes verändert, ist die Verwendung von Tensiden, bei denen beobachtet worden ist, daß sie die Absorptionsfähigkeit, den Stokes-Shift und/oder die Quantenausbeute von einigen Farbstoffen beeinflussen (Diaz Garcia, M.E., Sanz-Medel, A., Talanta, 33(3), 255 - 264, 1986). Tenside sind amphiphile Moleküle, die einen deutlichen hydrophoben Bereich von Kohlenstoffketten (8 - 18 Atome, unverzweigt) und hydrophile ionische Kopfgruppen enthalten. In Wasser versammelt sich die längliche Alkylkette des Tensids über hydrophobe Wechselwirkungen zu einer organisierten Ansammlung, die als Mizelle bekannt ist. Farbstoffe, die in der weniger polaren Pseudo-Phase der Mizelle löslich werden, erleben eine unterschiedliche Umgebung, und wenn die physikalischen Eigenschaften des Farbstoffes polaritätsabhängig sind, beobachtet man eine Veränderung im Extinktionskoeffizienten, des Stokes-Shifts und/oder der Quantenausbeute. Diese Technik ist benutzt worden, um Analysen auf Lösungs-Basis zu sensibilisieren, und sie ist zur Bestimmung der kritischen Mizellenkonzentration (cmc) für ein gegebenes Tensid verwendet worden. Wenn Tenside zu einem nicht-polaren Lösungsmittel, wie Benzol oder Tetrachlorkohlenstoff, gegeben werden, aggregieren die polaren Kopfgruppen unter Bildung von Umkehr-Mizellen.
Phasentransfer-Katalysatoren (PTC) sind eine andere Klasse von amphiphilen Molekülen, da sie quaternäre Ammoniumionen sind und Tensiden ähnlich sind, da sie eine organische Einheit in Verbindung mit einer geladenen Kopfgruppe und einem Gegenion aufweisen. Die polare Gruppe kann verschiedene Bestandteile und Ladungen aufweisen, und der nicht-polare Bereich kann mit Alkyl- oder Arylgruppen variierender Länge und Natur substituiert sein. Es ist die Länge der Alkylgruppe, die den Unterschied zwischen Phasentransfer-Katalysatoren und Tensiden bildet, wobei die Länge in der Tensid-Klasse typischerweise 8 - 18 Kohlenstoffatome und in der PTC-Klasse weniger als 8 Kohlenstoffatome ist. Viele der AcOCs, die in dieser Arbeit verwendet werden, sind als Phasentransfer-Katalysatoren klassifiziert, obwohl das Hexadecyltrimethylammoniumhydroxid eine Alkylkette aufweist, die die typische Länge eines PTC überschreitet.
Mit den gegebenen polaren und nicht-polaren Bereichen eines PTC- Moleküls sind diese fast ausschließlich wegen ihrer Fähigkeit ausgenutzt worden, Synthesen zu erleichtern, die an den Grenzen von hydrophoben und hydrophilen Phasen einer inhomogenen Lösung von Reagenzien auftreten. (Starks, C.M., Liotta, C., Phase Transfer Catalysis, Principles and Techniques, 1978, Academic Press, New York, S. 1 - 21.) Wegen der kurzen Länge ihrer Alkylgruppen ist von PTCs berichtet worden, daß sie keine Mizellen bilden (Mulder, W.J., Engberts, J.B.F.N., Journal of Organic Chemistry, 53, 3353 - 3355, 1988). Quaternäre Ammoniumionen sind für Ionenpaar-Extraktion mit Triphenylmethan-Farbstoffen verwendet worden (Motomizu, S., Toei, K., Analytica Chimica Acta, 120, 267 - 277, 1980), aber es ist niemals von ihnen berichtet worden, daß sie die photophysikalischen Eigenschaften von fluoreszierenden oder kolorimetrischen Farbstoffen aktivieren.
B. Prinzip der Fluoreszenzverstärkung in schwach dielektrischen Medien mit speziellen Onium-Verbindungen
Das Verfahren dieser Erfindung beruht auf einer neuen Fluoreszenzaktivierungs-Chemie, die durch Zugabe von speziellen Onium- Verbindungen, wie Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH), zu einem schwach dielektrischen Medium erzeugt wird, in dem die Fluoreszenz eines polyanionischen Fluorophors gequencht wird. Typischerweise besitzt der Fluorophor in wäßrigen oder polaren Medien eine hohe Quantenausbeute und wird in nicht-polaren Medien, wie Hexan, nicht-fluoreszierend gemacht. Die Zugabe des Aktivierungsreagenz verursacht, daß der Farbstoff, wenn er in einer nicht-polaren Flüssigkeit oder einem nicht-polaren festen Medium ist, die photophysikalischen Eigenschaften zeigt, die typischerweise in wäßrigen Medien beobachtet werden.
Figur 1 zeigt die vergleichenden Emissionsspektren bei identischen Konzentrationen (5 x 10&supmin;&sup7; M) von Fluorescein in: a) wäßrigem Puffer, pH 7,5, b) Toluol und c) Toluol mit 5 x 10&supmin;&sup4; M Tetrabutylammoniumhydroxid eingeschlossen. Die Lösungen wurden alle mit einer 488 nm-Quelle (Perkin Elmer, LS-50, Fluorimeter) angeregt, und die Emission wurde mit einem dazwischengeschobenen 530 nm-Filter gesammelt. Die Fluoreszenz im Puffer ist typisch für Fluorescein in einem basischen wäßrigen Zustand, wo die Quantenausbeute im Bereich von 0,90 liegt. Die gleiche Konzentration an Fluorescein in Toluol zeigt keinerlei Fluoreszenzemission; nach der Zugabe des Tetrabutylammoniumhydroxids wird die Fluoreszenz auf 83% des in der wäßrigen Probe beobachteten Signals wiederhergestellt. Der Farbstoff ist voll aktiviert, wenn das AcOC/Farbstoff-Molverhältnis ungefähr 1000 beträgt. Dieses Molverhältnis von AcOC/Farbstoff für eine vollständige Aktivierung ist eine Funktion des speziellen Farbstoffes und der Farbstoffkonzentration, der speziellen AcOC und des bei der Titration verwendeten Lösungsmittels.
Mit der gegebenen amphiphilen Natur sowohl des Farbstoffes als auch der aktivierenden Verbindung ist es wahrscheinlich, daß eine Selbstansammlung über Ladungs-Ladungs-Wechselwirkungen auftritt, und diese Aggregate erwerben eine viel polarere Mikroumgebung als diejenige des Großteiles des Mediums. Wenn der Farbstoff in dieser polaren Domäne solubilisiert wird, zeigt er die Fluoreszenz mit hoher Quantenausbeute, die typischerweise in wäßrigen Proben beobachtet wird.
Es wurde beobachtet, daß das Ausmaß und die Kinetik des Aktivierungsprozesses eine Funktion der Dielektriziätskonstanten des Mediums sind. Das Coulomb-Gesetz legt fest, daß die Kraft zwischen zwei geladenen Teilchen umgekehrt mit der Dielektrizitätskonstanten des Mediums in Beziehung steht:
F = e&sub1;-e&sub2;/&epsi;r² (1)
worin e&sub1; und e&sub2; die geladenen Spezies sind, &epsi; die Dielektrizitätskonstante des Mediums ist und r der Abstand zwischen den Ladungen ist. Wenn die Dielektrizitätskonstante abnimmt, nimmt die Kraft zwischen den Ladungen zu, da der Dipolmangel in dem Medium die Dipolsolvatisierung der einzelnen Ladungen verhindert.
Die Veränderungen bezüglich AcOCs, die für die Aktivierung eines Fluorophors als Funktion des Lösungsmittels des Farbstoffes erforderlich sind, können in Figur 2 beobachtet werden. In diesem Titrationsexperiment wurde TBAH (0,02 M in Ethanol) mit vier Lösungen von HPTS (5 x 10&supmin;&sup7; M) in verschiedenen organischen Lösungsmitteln mit variierenden Dielektrizitätskonstanten titriert: 1) Hexan = 1,0, 2) Ethanol = 24, 3) Methanol 32 und 4) N,N-Dimethylacetamid (N,N-DMA) = 38. Es kann beobachtet werden, daß die vollständige Fluoreszenzaktivierung in Hexan, dem Lösungsmittel mit der niedrigsten Dielektrizitätskonstanten, mit nur 5 µl TBAH auftritt, was eine TBAH-Endkonzentration von 0,024 mM ergibt, beträchtlich weniger als eine Tensidkonzentration, die zur Mizellenbildung erforderlich ist (140 - 0,5 mM, wobei die höheren Konzentrationen bei Tensiden erforderlich sind, die kürzere Alkylketten aufweisen). Die Titrationen, die in Ethanol und Methanol durchgeführt wurden, erzeugten eine allmählichere Fluoreszenzaktivierung und waren bei einer Zugabe von 75 µl TBAH (0,36 mM) nicht bis zur Vervollständigung gegangen. Die in N,N- DMA durchgeführte Titration brachte keine Erzeugung von Fluoreszenz hervor. Wir schlossen aus dieser lösungsmittelabhänigen Fluoreszenzaktivierung, daß der Komplex, der für die Fluoreszenzerzeugung erforderlich war, stark durch die Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittels beeinflußt war.
Eine andere Titration wurde durchgeführt, die verschiedene Verhältnisse von zwei Lösungsmitteln mit niedriger und mittlerer Dielektrizitätskonstante verwendete, so daß der Fluorophor durch den gleichen Typ an Lösungsmittelmolekülen ohne Einführung eines spezifischen Lösungsmitteleffekts, wie Wasserstoffbrückenbindung, der mit Alkoholen auftreten kann, solvatisiert wird. Figur 3 zeigt die Daten für die Titration von HPTS mit Tetrabutylammoniumhydroxid, wobei die relativen Konzentrationen an Hexan (= 1) und Aceton (= 20) variiert werden. Man beobachtet, daß die Fluoreszenz in allen vier Lösungsmittelverhältnissen vollständig gequencht ist und daß die Rate und der Grad an Fluoreszenzaktivierung mit der relativen Dielektrizitätskonstanten variiert, wobei das Lösungsmittelsystem mit der niedrigsten Dielektrizitätskonstanten (9:1, Hexan:Aceton) am schnellsten die höchste Fluoreszenzintensität unter Zugabe von TBAH erzeugt. In dieser Titration wurde eine aktivierte Fluoreszenz anfänglich bei einer TBAH-Konzentration von so wenig wie 0,005 nM beobachtet, was wiederum eine Konzentration ist, die viel geringer ist als diejenige, die typischerweise für eine Mizellenbildung in mit Tensid verstärkter Fluoreszenz mitgeteilt wird. Wir versuchten die identische Titration unter Verwendung der 9:1 Hexan:Aceton- Lösung von HPTS mit den folgenden Tensiden: 1) dem kationischen Tricaprylylmonomethylammoniumchlorid, 2) dem anionischen Natriumtridecylsulfat und 3) dem neutralen Triton 100X. Unter Verwendung der in Butanol gelösten Tenside als Titrant gaben wir so viel wie 3,3 mM Tensid zu gequenchten Lösungen von HPTS, und bei allen drei Tensid- Titrationen wurde keinerlei Erzeugung von Fluoreszenz beobachtet. Bei der Triton-Titration gaben wir nach der Endzugabe des nicht-aktivierenden Tensids 20 µl 10&supmin;² M TBAH dazu und sahen eine deutliche Steigerung des Fluoreszenzsignals.
Das hierin beschriebene Verfahren muß von dem Aufbau für eine Sensorvorrichtung unterschieden werden, die im US-Patent 5,047,637 (Yim, Hubbard, Melkerson, Secton, Fieggen) beschrieben wird und für die Sensormembran ein Copolymer von Methylmethacrylat und Methacrylamidopropyltrimethylammoniumchlorid verwendet. Die quaternäre Verbindung wird verwendet, um eine Ionenpermeabilität und die Hydrophilie zu verleihen, die für den Ionennachweis erforderlich sind. Jedoch hängt das Sensorsignal oder die Analytenempfindlichkeit nicht von der Anwesenheit der quaternären Verbindung ab, und Yim et al. lehren, daß "Methylmethacrylat alternativ mit anderen ionogenen oder neutralen Monomeren, wie Hydroxymethylmethacrylat, N-Vinylpyrrolidon oder Acrylsäure, copolymerisiert oder legiert werden kann, um der resultierenden Polymermatrix eine Analytenpermeabilität zu verleihen". Die quaternäre Ammonium-Verbindung ist kein absolutes Erfordernis für ihre Chemie und zeigt, wenn anwesend, keine Wechselwirkung mit dem Indikatormolekül. Die Chemie, die Munkholm lehrt, verwendet die Ammonium- Verbindung als Fluoreszenz-aktivierendes Reagenz für das Indikatormolekül, und die Chemie kann nicht ohne diesen Bestandteil durchgeführt werden.
Man würde annehmen, daß die Coloumb-Wechselwirkung in einem schwach dielektrischen Medium für alle positiv geladenen kationischen Verbindungen in schwachen dielektrischen Medien mit polyanionischen Farbstoffen existieren würde. Jedoch haben wir beobachtet, daß nicht alle diese Verbindungen eine identische Leistung als Aktivatoren für die Fluoreszenz zeigen. Die am erfolgreichsten in unserer Arbeit als AcOCs verwendeten quaternären Onium-Verbindun gen schließen Tetrabutylammoniumhydroxid, Hexadecyltrimethylammoniumhydroxid, Tetraethylammoniumhydroxid, Tetramethylammoniumhydroxid, Benzyltrimethylammoniumhydroxid und Benzyltrimethylammoniummethanolat ein. Die folgenden Onium-Verbindungen erzeugen wenig oder keine Fluoreszenz, wenn sie in Hexan- oder Toluol- Lösungen von Farbstoffen überprüft werden: n-Hexadecyltributylphosphoniumbromid, Tetrabutylammoniumtrifluormethansulfonat, Tetrabutylainmoniumtetraphenylborat, Tetrabutylammoniumhydrogensulfat, Tetrabutylphosphoniumbromid und Tetrabutylammoniumbromid. Die Komponente, die den bemerkenswertesten Unterschied zwischen den aktivierenden und nicht-aktivierenden Verbindungen bereitstellt, ist das Gegenion, und wir glauben, daß die Wahl des Gegenanions ein kritischer Faktor in diesem Verfahren sein könnte. Es ist bekannt, daß Halogene Fluoreszenz quenchen können (Lakowicz, S. 258), und es könnte sein, daß das Tetrabutylammoniumbromid ein Ladungs-Ladungs- Aggregat mit dem Farbstoff bildet, das auf Grund des Quenchens aus der hochwirksamen Konzentration von Bromid in der polaren Mikrodomäne nicht fluoreszierend ist.
Vergleichende Titrationen, um die relativen Aktivierungseigenschaften von vier der quaternären Ammonium-Verbindungen zu beurteilen, wurden mit den folgenden Reagenzien durchgeführt: 1) Tetrabutylammoniumhydroxid, 2) Tetramethylammoniumhydroxid, 3) Benzyltrimethylammoniumhydroxid und 4) Benzyltrimethylainmoniummethanolat. Identische Konzentrationen an HPTS in vier verschiedenen Lösungsmitteln (Hexan, Toluol, 2-Butanol und Methanol) wurden mit diesen Verbindungen titriert, und die Fluoreszenzaktivierung wurde für die vier AcOCs in jedem Lösungsmittel bestimmt. Es wurde gefunden, daß das spezielle bei der Titration verwendete Lösungsmittel ein wichtiger Faktor bei der relativen Leistung dieser vier AcOCs ist (Tabelle I). Die Tetrabutylammoniumhydroxid-Titrierung erzeugte die meiste relative Fluoreszenz sowohl in Hexan (I&sub0; 480) als auch in Toluol (I&sub0; = 450). Das Tetramethylammoniumhydroxid erzeugte die meiste aktivierte Fluoreszenz, wenn die Titration in Methanol (I&sub0; - 400) durchgeführt wurde, was zu der Beobachtung führte, daß die Löslichkeit des Alkyl-Liganden in dem Lösungsmittel ein Faktor für den Erfolg der Aggregationsbildung sein könnte. Das Benzyltrimethylammoniumhydroxid erzeugte eine ähnliche Fluoreszenz in Toluol, 2-Butanol und Methanol, und das Benzyltrimethylammoniummethanolat zeigte ein ähnliches Muster, allerdings mit überlegenen Ergebnissen in 2-Butanol. Bei diesen vier Aktivierungsverbindungen beobachteten wir keine identischen Korrelationen mit der Dielektrizitätskonstanten des Lösungsmittels. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Lösungsmittellöslichkeit der Alkyl-Liganden am quaternären Ammoniumion ein wichtiger Optimierungsfaktor sein könnte; sie könnten die Kapazität für ein Alkylammoniumion bestimmen, sich in einem spezielles Lösungsmittelsystem zu verteilen.
Während diesen Titrationsuntersuchungen ist auch beobachtet worden, daß das für die AcOC-Verdünnung verwendete Lösungsmittel ein Faktor bei dem Grad der Fluoreszenzerzeugung war. Wenn beispielsweise die AcOC in Methanol gelöst war und der Farbstoff in Butanol gelöst war, wurde der Farbstoff in die AcOC/MeOH-Phase extrahiert, und eine Fluoreszenz wurde nur in dem sehr kleinen, nicht-mischbaren Volumen der Zugabe und nicht in dem größten Teil der Lösung beobachtet. Nach Umänderung des AcOC- Lösungsmittels in eines, das mit Butanol mischbar war, wie beispielsweise Ethanol, beobachteten wir die Erzeugung von Fluoreszenz in der vorherrschenden Farbstoff/Butanol-Lösung. Überlegene Ergebnisse wurden oft erhalten, wenn das Farbstoff-Lösungsmittel und das AcOC-Lösungsmittel dasselbe Lösungsmittel waren.
Quaternäre Ammoniumnydroxide sind als Titranten in nicht-wäßrigen Medien verwendet worden (Harlow, G.A., Noble, C.M., Wyld, G.E.A., Analytical Chemistry, 28, 787, 1956), und es ist vorgeschlagen worden, daß wir eine Titration eines pH-empfindlichen Fluorophors zu einem deprotonierten Zustand mit hoher Quantenausbeute beobachten. Jedoch weist HPTS sowohl in seiner protonierten als auch in seiner deprotonierten Form einen hohen Quantenzustand auf, und in Abwesenheit von AcOCs beobachten wir keine Form der Fluoreszenz, wenn sich der Farbstoff in einem quenchenden Medium befindet. Auch haben wir dieses Verfahren erfolgreich verwendet, um die Fluoreszenz von Farbstoffen zu aktivieren, die nicht pH- empfindlich sind und deshalb nicht zur Protonen-Titration in der Lage sind: Pyrentetrasulfonat und Ethylendiaminpyrentrisulfonat. Jedoch wird HPTS in seiner basischen Form aktiviert, da wir immer die Erzeugung des Anregungsspektrums im 455 - 465 nm-Bereich beobachten, und es ist wahrscheinlich, daß der Farbstoff durch das Hydroxid- und Methanolat- Gegenion der quaternären Ammoniumionen, die erfolgreich die Fluoreszenz aktivierten, deprotoniert wird.
Diese Experimente legen nahe, daß die AcOC sowohl auf allgemeine Weise als auch auf spezielle Weise mit dem Fluorophor wechselwirken kann. Die allgemeine Wechselwirkung erzeugt das Ladungs-Ladungs-Aggregat, das die Mikroumgebungs-Polarität des Farbstoffes ändert, und die spezifische Wechselwirkung, die durch das Gegenion erzeugt wird, kann die Eigenschaften der aktivierten Fluoreszenz modulieren oder im Fall von gewissen Gegenionen die aktivierte Fluoreszenz quenchen.
Die Aktivierung der Fluoreszenz in Lösung mit einem Copolymer, das aus Methylmethacrylat und Methacrylamidopropyltrimethylammoniumchlorid (MAPTAC) hergestellt wird, ist ebenfalls gezeigt worden. Da das Polymer eine Trimethylpropylammoniumgruppe enthält, weist es eine Funktionalität auf, die der kationischen Komponente in TBAH oder anderen fraglichen AcOCs ähnlich ist. Figur 4 zeigt (a) das Anregungsspektrum einer Lösung von HPTS, 2 x 10&supmin;&sup6; M in Toluol:Ethanol (8:2) und (b) der gleichen Lösung nach Zugabe des Ammonium-Copolymers (0,06%). Die durch MAPTAC aktivierte Fluoreszenz unterschied sich von der durch TBAH aktivierten Fluoreszenz, da die Anregungsbanden eine größere Anwesenheit der sauren Form (402 nm) des Farbstoffes anzeigen, als sie bei dem durch TBAH aktivierten Fluorophor beobachtet wird, obwohl die basische Form im Überschuß vorliegt. Es wurde auch beobachtet, daß, wenn sich das Polymer im Teströhrchen absetzte, es fluoreszierend grün war, was eine Komplexierung mit der basischen Form des Farbstoffes anzeigte. Die Verwendung eines Polymers als Fluoreszenz-Aktivator ist von Interesse, da dies die Möglichkeit zur Herstellung von fluoreszierenden Beschichtungen anbietet, in denen der Aktivator und die Polymerkomponente in einem einzigen Reagenz vereinigt sind. Wenn das Polymer auch eine zusätzliche funktionelle Gruppe enthalten würde, die für eine kovalente Immobilisierung geeignet ist, könnte man so eine Fluoreszenzbeschichtung herstellen, die kovalent an das Substrat gekoppelt ist. Das MAPTAC-Polymer hat auch die Fluoreszenzaktivierung in der festen Phase gezeigt, sowohl als Aktivator- Komponente, die zu einer anderen Polymerlösung gegeben wurde, als auch, wenn es allein verwendet wurde, indem es als Aktivator und alleinige Membranpolymer-Komponente diente
Die Aktivierung von Fluoreszenz auf der Oberfläche eines starken anionischen Austauscherharzes (Dowex 19880) ist ebenfalls gezeigt worden. Wenn dieses Harz zu einer nicht-fluoreszierenden Lösung von in Heptan gelöstem HPTS gegeben wurde, wurde das Harz hochfluoreszierend grün, die Farbe, die konsistent ist mit der Aktivierung von HPTS in ihrer basischen Struktur. Das Harz enthält eine Ammoniumgruppe, und die erzeugte Fluoreszenz beruhte auf den Komplex, der zwischen dem Ammoniumkation und dem negativ geladenen Farbstoff gebildet wurde, mit der Neutralisation der quenchenden Wirkung des nicht-polaren Lösungsmittels. Nach Entfernung des Harzes vom Lösungsmittel blieb das Harz fluoreszierend grün, was anzeigte, daß man dieses Verfahren verwenden kann, um fluoreszierende Beschichtungen auf Ammonium-derivatisierten Oberflächen aus schwach dielektrischen Lösungsmitteln abzuscheiden.
Eine bedeutende Komponente dieser Erfindung ist die Identifizierung einer Klasse von Farbstoffen, die erfolgreich in einer Umgebung, in der ihre Fluoreszenz normalerweise gequencht wird, in Farbstoffe mit hoher Quantenausbeute überführt werden. Die hauptsächlichen Erfordernisse für diese Klasse von Farbstoffen sind: 1) die Anwesenheit von negativ geladenen Substituenten an der Struktur des Farbstoffes, 2) eine hohe Quantenausbeute in Wasser, 3) eine niedrige Quantenausbeute in nichtpolaren Medien, 4) Löslichkeit in einem nicht-polaren Lösungsmittel und 5) der Farbstoff muß, wenn er pH-empfindlich ist, mindestens eine andere Position von negativer Ladung in der Struktur des Moleküls aufweisen, die von der Position der Deprotonierung verschieden ist.
Es wurden Titrationsexperimente mit Farbstoffen durchgeführt, die in Hexan oder Toluol gelöst waren und dann mit Tetrabutylammoniumhydroxid titriert wurden. Die sechs Farbstoffe, die aus einem gequenchten Zustand zu einem hohen Quanten-Fluoreszenzzustand in den schwach dielektrischen Medien titriert wurden, waren: Fluorescein - siehe Fig. 5B, 2',7'- Dimethylrhodol (DM-NERF von Molecular Probes), Seminaphthofluorescein (SNAFL - siehe Fig. 5D - von Molecular Probes), Hydroxypyrentrisulfonat (HPTS - siehe Fig. 5A), Ethylendiaminpyrentrisulfonattrinatrium-Salz (erhältlich als CASCADE BLUE Ethylendiamintrinatrium-Salz - siehe Fig. 5C, Produkt C-621 von Molecular Probes, Inc.) und Pyrentetrasulfonat. Diese Farbstoffe sind alle polyanionisch. Typischerweise sind diese Farbstoffe hochfluoreszierend (besitzen eine hohe Quantenausbeute), wenn sie in wäßrigen Lösungen gemessen werden. Es ist nicht erforderlich, daß der Farbstoff für eine Fluoreszenzaktivierung mit einer AcOC pH-empfindlich ist, was durch die Ethylendiaminpyrentrisulfonat- und Pyrentetrasulfonat- Titrationen gezeigt wird, da keiner dieser Farbstoffe pH-empfindlich ist. Andere Pyrentrisulfonat-Derivate, wie diejenigen, die mit Acetylazid, Aminoethyl-p-azidobenzamid, Cadaverin oder Hydrazid hergestellt werden, sind hierin ebenfalls als aktivierbare fluoreszierende Farbstoffe verwendbar.
Es ist klar, daß nicht alle fluoreszierenden Farbstoffe durch dieses Verfahren aktiviert werden. Farbstoffe, die ungeladen sind, wie Pyren und neutrales Rot, zeigten in dem nicht-polaren Lösungsmittel kein Quenchen und wurden durch die Zugabe einer AcOC nicht beeinflußt. Das pH- empfindliche Hydroxypyren wurde in dem nicht-polaren Lösungsmittel nicht gequencht, und die Zugabe von TBAH verursachte einen Verlust an Fluoreszenz, der mit den Säure/Base-Eigenschaften des Farbstoffes konsistent ist; in einem basischen Puffer weist die deprotonierte Struktur eine niedrige Quantenausbeute auf, und in diesem Experiment funktioniert TBAH als deprotonierende Base in der Hexan-Lösung.
Dieses Verfahren ist auch verwendet worden, um Fluoreszenz in Polymerbeschichtungen zu aktivieren, die mit schwach dielektrischen Lösungsmitteln hergestellt werden, wie Polystyrol-Beschichtungen, die in Toluol hergestellt werden. Tabelle 2 zeigt die vergleichende Fluoreszenz von Beschichtungen, die aus Polystyrol/Fluorophoren und Polystyrol/AcOC- aktivierten Fluorophoren hergestellt wurden. Die Kontrollen, die ohne Aktivator hergestellt wurden, zeigten wenig oder keine Fluoreszenz, während diejenigen mit Aktivator eine signifikant höhere Fluoreszenz zeigten. Die Beschichtungen wurden hergestellt, indem man eine Polymer/Farbstoff-Lösung auf eine Glasoberfläche aufschleuderte und dann das Verdampfen des Lösungsmittels in Luft gestattete. Die fluoreszierende Beschichtung ist stabil und hängt von der Konzentration der AcOC in der Formel ab. Figur 6 zeigt die Fluoreszenzabhängigkeit von der AcOC- Konzentration in Lösung, die für die Beschichtung einer Reihe von Substraten verwendet wurde, die sich nur in ihrer Konzentration an Aktivator unterschieden, wobei die Farbstoff- und Polymerkonzentrationen identisch waren. Mit zunehmender AcOC-Konzentration steigt die Fluoreszenz der Beschichtung an. Wieder wurde die Fluoreszenz an der Oberfläche der beschichteten Substrate gemessen, nachdem das Lösungsmittel verdampft war und sich das Polymer in einem effektiv trockenem Zustand befand.
Ein anderer wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines schwach dielektrischen Mediums als Lösungsmittel oder festen Träger für den aktivierten Fluoreszenzkomplex. Schwach dielektrische Lösungsmittel sind organische Lösungsmittel mit einem kleinen oder keinem Dipolmoment, wie Hexan oder Butan, sowie gewisse aromatische Lösungsmittel, wie Benzol und Toluol. Polymere, die in diesen schwach dielektrischen Lösungsmitteln löslich sind, werden ebenfalls als schwach dielektrische Medien angesehen, und sie behalten ihre nicht-polare Mikroumgebungs-Natur, nachdem das Lösungsmittel verdampft ist. Ein geladener Fluoreszenz-Farbstoff erfährt, wenn er in einem schwach dielektrischen Lösungsmittel oder Polymer gelöst wird, eine Veränderung in den photophysikalischen Eigenschaften, wie eine bathochrome oder hypsochrome Verschiebung oder ein vollständiges Quenchen der Fluoreszenz, abhängig von der Natur und der Zahl der Ladungen auf dem Farbstoff sowie dem Unterschied zwischen dem Dipol des Grundzustandes und dem Dipol des angeregten Zustandes. Dieses Phänomen wurde bei den polyanionischen Fluorophoren beobachtet, die in dieser Erfindung beschrieben werden. Diese Erfindung ist nicht auf ein genaues Abschneiden im dielektrischen Bereich beschränkt, da die spezielle Abhängigkeit von verschiedenen Farbstoffen von der Dielektrizitätskonstante variiert. Wir richten diese Erfindung auf fluoreszierende Farbstoffe, die bei einer gegebenen Dielektrizitätskonstanten des Mediums für den speziellen Farbstoff einen Verlust an Quantenausbeute erfahren, wobei dies die Dielektrizitätskonstante ist, bei der die Photonemission abnimmt oder nicht auftritt.
Wie angeführt, beschreibt diese Erfindung auch ein Verfahren zur Aktivierung von Fluoreszenz in Polymerbeschichtungen, in denen die Fluoreszenz normalerweise ohne die Zugabe einer AcOC gequencht würde. Wiederum kann der genaue dielektrische Bereich des Polymers nicht definiert werden, sondern ist eine Funktion des Farbstoffes, der in der Formel eingeschlossen ist. Wenn die Dielektrizitätskonstante derart ist, daß die Ladungs-Ladungs-Wechselwirkung der AcOC und des Farbstoffes begünstigt wird, tritt eine Fluoreszenzaktivierung bei Zugabe der Aktivierungsverbindung auf und kann nach Eindampfen des Farbstoffes aufrechterhalten werden.
Polymere, die für diese Erfindung nützlich sein können und als Sensorbeschichtung und/oder Deckmembran über der Sensorbeschichtung verwendet werden, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgende Liste: Poly(diene) wie Poly(1,3-butadien), Poly(butadien-co-acrylnitril), Poly(diemthylbutadien) und Poly(isopren); Poly(alkene) wie Poly(ethylen), Poly(isobutan-co-isopren), Poly(4-methylpenten), Poly(propylen), Poly(ethylmethacrylat), Poly(styrol), Poly(tetrafluorethylen), Poly(vinylalkohol), Poly(vinylchlorid) und Poly(oxymethylen); Cellulose und Cellulose-Derivate, wie Cellulosehydrat, Celluloseacetat, Cellulosenitrat, Ethylcellulose und Ethylmethacrylat; Poly(methacrylate) wie Poly(methylmethacrylat) und Poly(ethylmethacrylat); sowie Poly(siloxane), Poly(ester) und Poly(carbonate).
Ein anderes wichtiges Merkmal der Erfindung ist die Fähigkeit, diese schwach dielektrischen Beschichtungen in wäßrigen Proben ohne Verlust des Farbstoffes aus der Membran zu verwenden, da das schwach dielektrische Polymer dazu neigt, hydrophob zu sein. Jedoch könnte man die diffusions- oder permeabilitätsabhängigen Antworteigenschaften durch Hinzufügen einer zweiten Beschichtung über dem Polymer, das die aktivierte Fluoreszenz enthält, modifizieren. Diese zweite Beschichtung könnte aus dem gleichen Polymer oder aus einem Polymer mit verschiedener Struktur, aber zur Erleichterung der Abscheidung mit der ersten Beschichtung kompatibel, hergestellt werden. Weiter ist es möglich, die aktivierende Verbindung und den Fluorophor mit dem festen Material (z.B. schwach dielektrisches Polymer oder Glas) zu vereinigen, wenn das feste Material gegossen wird, so daß diese Verbindungen in das feste Material eingebaut werden.
Obwohl die Polymere mit der aktivierten Fluoreszenz als fluoreszierende Beschichtungen verwendet werden können, ist die neue analytische Anwendung ihre Verwendung als Transducer-Beschichtungen für optische Sensoren. Wir haben beobachtet, daß die Fluorophore, wenn sie in dem Polymer aktiviert sind, nicht nur eine hohe wiederhergestellte Quantenausbeute aufweisen, sondern auch jede spezielle chemische Empfindlichkeit zeigen, für die der Farbstoff charakteristisch ist. Wenn beispielsweise ein Farbstoff ein pH-abhängiges Säure/Base-Gleichgewicht aufweist, ist diese Eigenschaft in der wiederhergestellten Fluoreszenz intakt, wird aber den Mikroumgebungs-pH messen. Wir können indirekt die pH-Empfindlichkeit testen, indem wir einen Analyten einführen, der durch das Polymer hindurchtreten kann und in der polaren Mikrodomäne des AcOC/Farbstoff-Aggregats solubilisiert werden kann. Innerhalb dieser Mikrodomänen erfährt der Farbstoff eine Mikroumgebung, die derjenigen von Wasser ähnlich ist, und kann als analytisches Reagenz funktionieren, das für den Farbstoff in Wasser charakteristisch ist. Diese reaktiven Mikrodomänen sind nun über die Polymermembran hinweg dispergiert, die als Träger für den Transducer dient. Da das Polymer hydrophob ist, beruht die Sensor-Antwort nur auf einem Analyten, der das Polymer durchwandern kann, wie ein Dampf oder ein Gas.
Das herkömmliche Verfahren zur Herstellung eines optischen CO&sub2;- Sensors beruht auf dem Severinghaus-Modell (Severinghaus, J.W.; Bradley, A.F., J. Appl. Physiol., 1958, 13, 515), in dem eine Transducer-Schicht vorliegt, die einen pH-empfindlichen Fluorophor oder Chromophor enthält, die in einer NaHCO&sub3;-Lösung eingeweicht und dann mit einem hydrophoben Deckmembran-Material, wie einem Polymer auf Siloxan-Basis, beschichtet wird (Munkholm, C., Walt, D.R., Milanovich, F.P., Talanta, 35(2), 109 - 112, 1988). Die Einwirkung von CO&sub2; erzeugt eine quantifizierbare Änderung in der Fluoreszenz auf Grund von CO&sub2;, das in die Sensor-Membran eindiffundiert und den Mikroumgebungs-pH mit der begleitenden Veränderung in der Fluoreszenz des pH-empfindlichen Fluorophors ändert. Eine Schwierigkeit, die den Severinghaus-Sensoren innewohnt, ist ihr Potential, auf Grund von kleinlöchrigen Lecks in der Deckmembran zu versagen. Sensoren, die durch die vorliegende Erfindung hergestellt werden, stellen ebenfalls quantitative Messungen von CO&sub2;-Konzentrationen über eine pH- empfindliche Modulation der Mikroumgebung des aktivierten Fluorophors bereit. Da diese Sensor-Mikroumgebungen über das schwach dielektrische Medium hinweg dispergiert sind, erfordert die Herstellung eines derartigen Sensors lediglich die einzige Anwendung des Membranmaterials, und diese Konfiguration mit einer einzigen Membran beseitigt das Problem von kleinlöchrigen Lecks. Diese Sensoren sind in flüssigen Proben zur kontinuierlichen Messung von CO&sub2; über einen Zeitraum von 50 Stunden verwendet worden, wobei sie lediglich einen allmählichen Verlust der Intensität auf Grund von Photobleichung zeigten. Die Sensoren antworteten nicht auf Veränderungen im pH der Hauptflüssigkeit, was anzeigt, daß die Transducer-Mikrodomänen von der Probe abgeschirmt waren. Dieser Sensor ist in einem System, das die reflektierte Oberflächenfluoreszenz mißt, sowie in einem System, das ein abklingendes Wellensignal mißt, verwendet worden. Andere Gase, die über ihre Wechselwirkung mit einem pH-Transducer nachgewiesen werden können, wie NH&sub3; (Wolfbeis, O.S., Posch, H.E., Analytica Chimica Acta, 185, 321 - 327, 1986), könnten die Grundlage für einen analytischen Sensor darstellen, der über das AcOC-Sensorverfahren hergestellt wird.
Sauerstoff ist ein Analyt, der häufig über optische Verfahren, wie Fluoreszenzquenchung, bestimmt wird. Fluorophore, die unsere Anforderungen für eine AcOC-Aktivierung erfüllen und die auch Fluoreszenz- Halbwertszeiten aufweisen, die geeigneterweise lang genug sind für eine quantitative Bestimmung der Fluoreszenzquenchung als Funktion der O&sub2;- Konzentration, wären Kandidaten für ein AcOC-Sensorpräparat.
Ein Vorteil von optischen Sensoren ist deren Fähigkeit, Informationen von verschiedenen Analyten über deren diskrete Wellenbanden aufzulösen. In diesem Fall würde man zwei Sensoren zusammen in der gleichen Membran kuppeln, aber die Ableseinformationen bei gesonderten Wellenlängen sammeln. Die offenbarte Erfindung würde einen befähigen, derartige Sensorkonfigurationen in einer einzigen Schicht herzustellen. Die Sensor-Mikrodomänen würden durch mehrere Transducer besetzt werden, aber die Chemie und die Signalverarbeitung würden durchgeführt, als ob sich die Sensoren in gesonderten Schichten befänden.
Unter Verwendung dieses Verfahrens kann man extrem dünne Sensorfilme herstellen, die ein nachweisbares Maß an Fluoreszenz aufweisen. Solche Dünnfilme können eine ungewöhnlich schnelle Antwortzeit bereitstellen und ideal zur Beschichtung von ebenen Sensoren sein, die bei den Nachweisverfahren mit abklingender Welle verwendet werden, wo eine fluoreszierende Beschichtung erwünscht ist, die innerhalb der gleichen Dimensionen wie die sich fortpflanzende Welle liegt. Sensoren, die durch dieses Verfahren hergestellt werden, werden durch kleinlöchrige Lecks nicht beeinträchtigt, da das Sensormaterial in der Beschichtung kontinuierlich ist. Diese Sensorfilme können auf Grund ihres Mangels an einer wäßrigen Schicht auch eine längere Lagerbeständigkeit aufweisen.

Beispiele

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, aber sollen die Nützlichkeit derselben nicht beschränken.

Beispiele 1 - 4: Fluorophor-Aktivierung mit quaternären Ammoniumionen

Wie oben besprochen, erfordert die spezielle Fähigkeit eines Farbstoffes, der in diesem System der Fluoreszenzaktivierung verwendet werden soll, daß der Farbstoff polyanionisch ist und eine hohe Quantenausbeute in Wasser und eine niedrige Quantenausbeute in einem schwach dielektrischen Medium aufweist. Es sollte möglich sein, unter Verwendung der existierenden Spektrendaten-Basis geeignete Farbstoffe für dieses Verfahren auszuwählen, da gefunden wurde, daß alle Farbstoffe, die dieses Kriterium erfüllen, durch Zugabe von speziellen quaternären Ammoniumionen aktiviert werden, wenn sie in einem Medium gelöst werden, das die Fluoreszenz quencht. Die quaternären Ammoniumionen, die erfolgreich die Fluoreszenz aktiviert haben, wiesen entweder ein Hydroxid- oder ein Methanolat-Gegenion auf, und sie wurden in Lösungsmitteln gelöst, die mit dem für den Fluorophor verwendeten Lösungsmittel mischbar waren.

Beispiel 1

Eine Probe, die Fluorescein in einem schwach dielektrischen Lösungsmittel, Toluol, enthielt, wurde in einem Fluorimeter (Perkin-Elmer, LS-50) bestrahlt, um die sehr geringe oder abwesende Grundlinien- Fluoreszenz aufzustellen. Die Anregung war bei 488 nm und die Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines 530 nm-Filters im Emissionsstrahl bei 530 nm gemessen, I&sub0; = 2. Ein quaternäres Ammoniumion, Tetrabutylammoniumhydroxid, wurde mit einem Lösungsmittel, Butanol, verdünnt, das mit dem für die Farbstoffprobe verwendeten Lösungsmittel mischbar ist. Die Fluorescein- Lösung wurde dann mit der quaternären Ammonium-Lösung titriert, bis die überwachte Fluoreszenzemission auf ein stabiles Niveau erzeugt war, I&sub1; = 289. (In den Beispielen bezieht sich I&sub0; auf die Fluoreszenz des gequenchten Zustands des Fluorophors, und I&sub1; bezieht sich auf die Fluoreszenz des aktivierten Zustands des Fluorophors.)

Beispiel 2

Die Fluoreszenzaktivierung von Fluorescein wurde in vier Lösungsmitteln verglichen, indem man 5 x 10&supmin;&sup7; M Konzentrationen des Farbstoffes in Hexan, Toluol, Tetrahydrofuran und 2-Butanol herstellte. Die Emissionsspektren wurden bei einer 488 nm-Anregung aufgenommen. Eine fast vollständig gequenchte Fluoreszenz wurde in Hexan, Toluol und Tetrahydrofuran beobachtet; in 2-Butanol I&sub1; = 250. Die Lösungen wurden mit 0,01 M Tetrabutylammoniumhydroxid, gelöst in Ethanol, titriert, bis ein stabiles Fluoreszenzniveau erzeugt war. Die vier Systeme erforderten variierende Menge an Aktivator und lieferten auch verschiedene Pegel an fluoreszierenden Signalen (Tabelle 3). Von diesen vier Lösungsmitteln weist Hexan die niedrigste Dielektrizitätskonstante auf, und die Fluorescein/Hexan-Lösung erzeugte die größte Steigerung an Fluoreszenz bei der niedrigsten Konzentration an TBAH, die für eine volle Aktivierung erforderlich war. (Man bemerke, daß das 2-Butanol ein spezieller Fall war, da es nicht voll gequencht war.)

Beispiel 3

Hydroxypyrentrisulfonat (HPTS) wurde in einem schwach dielektrischen Lösungsmittel, Toluol, gelöst, und es wurde ein Anregungsspektrum zwischen 350 nm und 500 nm unter Verwendung der 510 nm-Emission erzeugt, um die Grundlinien-Fluoreszenz aufzustellen, I&sub0; = 1 bei 462 nm. Ein quaternäres Ammoniumion, Tetrabutylammoniumhydroxid, wurde mit 2-Butanol, das mit dem für die Farbstoffprobe verwendeten Lösungsmittel mischbar ist, auf 0,01 M verdünnt. Die HPTS-Lösung wurde dann mit der quaternären Ammonium-Lösung titriert, bis die überwachte Fluoreszenzanregung auf ein stabiles Niveau erzeugt war, I&sub1; = 192 bei 462 nm. Bei dem mit Tetrabutylammoniumhydroxid titrierten HPTS wurde das Energiemaximum der aktivierten Anregung bei 482 nm beobachtet, was mit dem vorliegenden Farbstoff in der basischen Form konsistent ist. (Figur 7.)

Beispiel 4

Ethylendiaminpyrentrisulfonat wurde in Toluol gelöst, so daß sich 5 x 10&supmin;&sup7; M ergab. Unter Verwendung der 423 nm-Emission wurde ein Anregungsspektrum zwischen 300 nm und 410 nm erzeugt, um die Grundlinien- Fluoreszenz aufzustellen. Bei den 378 nm- und 399 nm-Anregungsmaxima wurde fast keine Fluoreszenz beobachtet. Die Zugabe von 0,250 ml Tetrabutylammoniumhydroxid (0,01 M, 2-Butanol) erzeugte 650 Fluoreszenz- Einheiten, wobei die Maxima bei 378 nm und 399 nm auftraten, dort, wo die Anregungsmaxima in wäßrigen Medien angegeben werden. Als die gleiche Titration mit Ethylendiaminpyrentrisulfonat in 2-Butanol gelöst durchgeführt wurde, erzeugte die Zugabe von 0,01 ml der gleichen AcOC eine Fluoreszenzintensität, die extrem aus dem Rahmen fiel, abgeschätzt bei 2000+ relativen Fluoreszenz-Einheiten. Dieser Farbstoff ist pH- unempfindlich.

Beispiele 5 - 6: Fluorophor-Aktivierung durch ein Polymer, das eine funktionelle quaternäre Ammoniumgruppe enthält

Die Zugabe von MAPTAC, einem Copolymer, das eine quaternäre Ammoniumgruppe enthält, aktivierte ebenfalls die Fluoreszenz eines gequenchten Fluorophors in einem schwach dielektrischen Lösungsmittel. Die Verwendung des Polymers als Fluoreszenz-Aktivator hatte mehr eine Mischung von sauren und basischen Formen des aktivierten Farbstoffes zur Folge.

Beispiel 5

HPTS wurde in einem schwach dielektrischen Lösungsmittel-System von Toluol:Ethanol, 6:4, gelöst. Unter Verwendung der 510 nm-Emission wurde ein Anregungsspektrum zwischen 350 nm und 500 nm erzeugt, um die Grundlinien-Fluoreszenz aufzustellen, I&sub0; = 21 (405 nm) und I&sub0; = 8 (465 nm). Die HPTS-Probe wurde mit einer 5%-igen (Gew./Vol.) Lösung des MAPTAC- Polymers, gelöst in Ethanol, titriert, bis ein stabiles Fluoreszenzniveau erzeugt war, I&sub1; = 140 (405 nm) und I&sub1; = 211 (465 nm). Die Anregungsbanden erschienen bei 405 nm und 465 nm, was anzeigte, daß eine Mischung von sauren und basischen Formen des Farbstoffes im aktivierten Zustand vorlag.

Beispiel 6

HPTS wurde in Hexan gelöst, und unter der Verwendung der 510 nm- Emission wurde ein Anregungsspektrum zwischen 350 nm und 500 nm erzeugt, um die Grundlinien-Fluoreszenz aufzustellen, I&sub0; = 5 (405 nm) und I&sub0; = 5 (465 nm). Die HPTS-Probe wurde mit einer 5%-igen (Gew./Vol.) Lösung des MAPTAC-Polymers, gelöst in Ethanol, titriert, bis ein stabiles Niveau der Fluoreszenz erzeugt war, I&sub1; = 250 (405 nm) und I&sub1; = 39 (465 nm). Da die intensiver aktivierte Anregungsbande bei 405 nm erschien, wurde angezeigt, daß vorherrschend die saure Form des Farbstoffes aktiviert war. Als diese Titration in Ethanol durchgeführt wurde, lag die basische Form des aktivierten Farbstoffes im Überschuß vor, I&sub1; = 200 (405 nm - protonierte Form) und I&sub1; = 598 (465 nm - deprotonierte Form).

Beispiel 7

Fluorophor-Aktivierung mit einem Anionenaustauscherharz

Eine Oberfläche, die eine Ammoniumgruppe enthielt, ist ebenfalls verwendet worden, um die Aktivierung eines gequenchten Fluorophors in einem schwach dielektrischen Medium zu zeigen. In diesem Beispiel wird der Farbstoff durch Komplexierung mit dem festen Harz aus der Lösung extrahiert.
HPTS (10&supmin;&sup5; M) wurde in Hexan gelöst und zu dieser Lösung wurden ungefähr 250 mg DOWEX 19880 Anionenaustauscher gegeben. Nach Wirbeln wurde das Harz durch Filtration aus der Farbstoff-Lösung entfernt und mit Hexan gespült. Durch Beobachtung unter ultraviolettem Licht erschien das Harz fluoreszierend grün, die typische Farbe von HPTS in der basischen Form. Um die Anwesenheit eines aktivierten Fluorophors zu bestätigen, wurde eine Spektralmessung vorgenommen, indem das Harz auf einem Deckglas mit frisch aufgetragenem Polystyrol immobilisiert wurde. Nachdem das Polymer getrocknet war, wurde die Fluoreszenz des Deckglases in dem LS-50 getestet, und es wurde Fluoreszenz bei der 465 nm-Anregungsbande beobachtet, was mit HPTS in basischer Form konsistent ist.

Beispiele 8 - 13: Fluorophor-Aktivierung in einer Polymermembran unter Verwendung einer quaternären Ammoniumion-Verbindung

Die Zugabe einer AcOC zu einer Polymer/Farbstoff-Lösung, gelöst in einem schwach dielektrischen Lösungsmittel, erzeugte eine Fluoreszenzaktivierung in der flüssigen Probe. Als die Lösung auf ein Deckglas aufgetragen wurde, wobei das Lösungsmittel verdampft wurde, war die Polymerbeschichtung hochfluoreszierend.

Beispiel 8

Fluorescein (2 mg) und Tetrabutylammoniumhydroxid (1,5 ml, 1,0 M) wurden in 10 ml 2-Butanol gelöst. Eine Polystyrol-Lösung wurde hergestellt, indem man 0,7 g Polystyrol in 10 ml Toluol löste. Eine 5 ml- Aliquote der Polymerlösung wurde mit 0,91 ml Farbstoff/TBAH-Lösung vereinigt. Diese Lösung war im Teströhrchen hochfluoreszierend. Die Polymer/Farbstoff-Lösung wurde dann auf Glassubstrate aufgeschleudert, und die Beschichtung, die sich ergab, war fluoreszierend, I&sub1; = 270, wobei sie die gleichen spektralen Eigenschaften von Fluorescein, wie sie in einem wäßrigen System beobachtet werden, zeigte, Anregungsmaximum = 490 nm und Emissionsmaximum = 520 nm.

Beispiel 9

Eine Polystyrol-Lösung wurde hergestellt, indem man 0,6 g Polystyrol in 10 ml Toluol löste. Eine Lösung von 10&supmin;³ M HPTS wurde mit 2-Butanol hergestellt. Die HPTS-Lösung (1 ml) wurde zu 10 ml Polymer gegeben. Nach Mischen wurde eine 3 ml-Aliquote der Polymer/Farbstoff-Lösung entfernt und mit 0,082 ml 1,0 M Tetrabutylammoniumhydroxid gemischt. Die aktivierte und die nicht-aktivierte Polymer/Farbstoff-Lösung wurden dann mittels Schleuderbeschichtung auf Deckgläser aufgetragen. Polymer/Farbstoff ohne AcOC erzeugte eine Beschichtung mit wenig Fluoreszenz, I&sub0; = 10, und die Polymer/Farbstoff/AcCO-Lösung erzeugte eine Beschichtung, die fluoreszierend war, I&sub1; = 380.

Beispiel 10

Eine Methylcelluloseacetat-Lösung wurde durch Lösen von 0,5 g Polymer in 5 ml Toluol:Ethanol (4:1) hergestellt. Eine Lösung von 10&supmin;² M HPTS wurde mit Methanol hergestellt. Die HPTS-Lösung (0,5 ml) wurde zu der Polymer-Lösung gegeben. Unter Zugabe von 0,03 ml 1,0 M Tetrabutylammoniumnydroxid wurde die Lösung leuchtend fluoreszierend grün. Die Polymerlösung wurde auf ein Deckglas aufgetragen, und nach Verdampfen des Lösungsmittels blieb die Polymerbeschichtung fluoreszierend.

Beispiel 11

Eine 8%-ige Lösung eines Marken-Acrylatpolymers wurde durch Auflösen von 0,4 g in 5 ml Toluol hergestellt. Zu der Lösung wurden 0,25 ml HPTS (10&supmin;³ M, 2-Butanol) gegeben, und 1 ml der Polymer/Farbstoff-Lösung wurde als Kontrolle entfernt. Zu den verbleibenden 4 ml Polymer/Farbstoff wurden 0,060 ml 1,0 M Tetrabutylammoniumhydroxid gegeben, und die Lösung wurde leuchtend fluoreszierend grün. Sowohl die fluoreszierende als auch die Kontrollösung wurden auf Glassubstrate aufgeschleudert, und nach Verdampfen des Lösungsmittels blieb das Polymer mit der aktivierten Fluoreszenz hochfluoreszierend, I&sub1; = 390 (465 nm Anregung, 510 nm Emission), und die Beschichtung, die mit der Kontrolle hergestellt worden war, zeigte wenig Fluoreszenz, I&sub0; = 9.

Beispiel 12

Eine 6%-ige Lösung von Ethylcellulose wurde hergestellt, indem man 0,6 g in 10 ml Toluol:Ethanol, 8:2, löste. Zu der Polymerlösung wurden 1,0 ml HPTS (10&supmin;³ M, Methanol) gegeben. 2 ml Polymer/Farbstoff-Lösung wurden als Kontrolle entfernt. Zu dem verbleibenden Polymer/Farbstoff wurden 0,283 ml 1,0 M Tetrabutylammoniumhydroxid gegeben, und die Lösung wurde leuchtend fluoreszierend grün. Sowohl die fluoreszierende als auch die Kontrollösung wurden auf Glassubstrate aufgeschleudert, und nach Verdampfen des Lösungsmittels blieb das Polymer mit der aktivierten Fluoreszenz hochfluoreszierend, I&sub1; = 560 (465 nm Anregung, 510 nm Emission), und die Beschichtung, die mit der Kontrolle hergestellt worden war, war nicht sehr fluoreszierend, I&sub0; = 21.

Beispiel 13

Eine 5%-ige Lösung von Polystyrol wurde mit Toluol hergestellt. Eine 10&supmin;³ M-Lösung von Pyrentetrasulfonat wurde hergestellt, indem man 12,2 mg in absolutem Ethanol löste. Zu 2 ml der Polymerlsung wurden 0,2 ml Pyrentetrasulfonat und 0,06 ml 1,0 M Tetrabutylammoniumhydroxid gegeben, was eine fluoreszierende Lösung erzeugte. Eine Kontrollösung wurde ohne AcOC hergestellt. Sowohl die fluoreszierende als auch die Kontrollösung wurden auf Glassubstrate aufgeschleudert, und nach Verdampfen des Lösungsmittels blieb das Polymer mit der aktivierten Fluoreszenz hochfluoreszierend, I&sub1; = 742 (Anregung 375 nm und Emission 404 nm), und die Beschichtung mit der Kontrolle wies wenig Fluoreszenz auf, I&sub0; = 21.

Beispiele 14 - 15: Fluorophor-Aktivierung in einer Polymerbeschichtung, die funktionelle quaternäre Ammoniumgruppen enthält

Die Fluoreszenzaktivierung eines gequenchten Fluorophors ist durch Einschluß des copolymers mit einer funktionellen quaternären Ammoniumgruppe, das als MAPTAC bezeichnet wird, in eine Polymerbeschichtung erreicht worden.

Beispiel 14

Eine 10%-ig MAPTAC-Lösung wurde mit 95%-igem Ethanol hergestellt. Zu einer 2 ml-Polymerlösung wurden 0,1 ml HPTS (10&supmin;&sup5; M, Ethanol) gegeben, und die Lösung wurde intensiv fluoreszierend, wie in dem Teströhrchen beobachtet. Die Polymer/Farbstoff-Lösung wurde auf ein Deckglas aufgetragen, und das Lösungsmittel wurde über Nacht verdampft. Die Fluoreszenz wurde gemessen; I&sub1; = 473 (405 nm Anregung, 510 nm Emission) und I&sub1; = 262 (455 nm Anregung, 510 nm Emission). Bei einer Kontrollösung von HPTS in Ethanol waren die Fluoreszenzmessungen: I&sub0; = 22 (402 nm Anregung) und I&sub0; = 4 (455 nm Anregung).

Beispiel 15

Eine 2%-ige Lösung von Ethylcellulose wurde mit Toluol:Ethanol, 6:4, hergestellt, und HPTS wurde zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2 x 10&supmin;&sup6; M zu ergeben. Eine 10%-ige MAPTAC-Lösung wurde mit Ethanol hergestellt, und die Ethylcellulose-Lösung wurde damit titriert, bis die Fluoreszenz voll aktiviert war. Die Polymer/Farbstoff-Lösung wurde auf ein Deckglas aufgetragen, und das Lösungsmittel wurde über Nacht verdampft. Es wurde ein Anregungsspektrum zwischen 350 nm und 500 nm unter Verwendung der 510 nm-Emission erzeugt. Bei 402 nm ist die Anregungsintensität = 623 und bei 465 nm ist die Anregungsintensität = 175. Eine Kontrollösung von Ethylcellulose/HPTS zeigte wenig Fluoreszenz.

Beispiele 16 - 19: Herstellung von CO&sub2;-Sensoren mit durch quaternäre Ammoniumionen aktivierter Fluoreszenz

Mehrere der aktivierten fluoreszierenden pH-empfindlichen Farbstoff/Polymer-Formulierungen sind als Membranen auf ein Glassubstrat aufgeschleudert worden, und es wurde erfolgreich gezeigt, daß sie sowohl beim Flüssigkeits als auch beim Gasphasen-Testen quantitative CO&sub2;- Sensoren sind.

Beispiel 16

Unter Verwendung der in Beispiel 8 beschriebenen Formulierung wurden Sensoren durch Schleuderbeschichtung der Polymer/Farbstoff-Lösung auf Deckgläser hergestellt, die mit Glass Clad beschichtet waren, einem Marken-Silanisierungsreagenz, das Glas hydrophob macht. Die Sensoren wurden bei Raumtemperatur gehärtet, und das Lösungsmittel wurde über Nacht verdampft. Für den CO&sub2;-Test wurde der Sensor in das Perkin-Elmer LS-50- Fluorimeter eingeführt und verschiedenen Konzentrationen an gasförmigem CO&sub2; ausgesetzt, welches durch die Durchflußzelle strich, die sich on-line mit dem Sensor befand. Der Sensor antwortete reversibel und reproduzierbar auf Schwankungen in CO&sub2;: Luft (0,03% CO&sub2;), I&sub1; = 268, 3% CO&sub2;, I&sub1; = 252, 5% CO&sub2;, I&sub1; = 242, und 7%, I&sub1; = 230.

Beispiel 17

Eine 5%-ige Lösung von Ethylcellulose wurde mit Toluol:Ethanol, 9:1, hergestellt. Eine HPTS-Lösung, die mit Butanol hergestellt worden war, wurde zu dem Polymer gegeben, so daß sich eine Konzentration von 1 x 10&supmin;&sup7; M ergab, und Hexadecyltrimethylammoniumhydroxid wurde zugesetzt, so daß sich 1 x 10&supmin;&sup5; M ergab. Die intensiv fluoreszierende Lösung wurde mittels Schleuderbeschichtung auf Deckgläser aufgetragen, die mit Glass Clad- Silanreagenz behandelt worden waren, und man ließ die Sensoren über Nacht bei Umgebungsbedingungen härten. Der Sensor wurde in einem Fluidik-System getestet und er zeigte eine reversible, quantitative Antwort auf tonometrische CO&sub2;-Puffer über einen Zeitraum, der 100 Stunden überschritt. Repräsentative 30 Minuten des Testens sind in Figur 8 dargestellt, wobei die Fluoreszenzniveaus diese Konzentrationen an CO&sub2; maßen: A> 0,03%, B) 2,66%, C) 5,33% und D) 8,33%.

Beispiel 18

Unter Verwendung der in Beispiel 9 beschriebenen Formulierung wurden Sensoren wie in Beispiel 16 beschrieben hergestellt und mit der gleichen Ausrüstung unter Verwendung von Puffern getestet, die mit variierenden Konzentrationen an CO&sub2; tonometrisch gemacht worden waren. Eine Kalibrierungskurve wurde erzeugt, indem man die Fluoreszenzantwort des Sensors in Standardkonzentrationen von tonometrisierten CO&sub2;-Puffern auftrug. Die Fluoreszenz des Sensors wurde dann bestimmt, als er in verschiedene Proben eingeführt wurde, die unbekannte Mengen an CO&sub2; enthielten, und die Konzentration des CO&sub2; in denselben wurde dann durch Bezug auf die Kalibrierungskurve bestimmt. Der Sensor zeigte reversible und gut aufgelöste Messungen von CO&sub2;: Wasser (0,03% CO&sub2;), I&sub1; = 525; 2,66% CO&sub2;, I&sub1; = 450; 5,33% CO&sub2;, I&sub1; = 390; und 8,66% CO&sub2;, I&sub1; = 321. Der Sensor wurde über mehrere Stunden einer kontinuierlichen Kreislaufführung mit den CO&sub2;-Proben getestet.

Beispiel 19

Die gleiche wie in Beispiel 18 beschriebene Sensor-Herstellung wurde verwendet, um Sensoren herzustellen. Nach dem Abscheiden und Trocknen der Polymer/Farbstoff-Schicht wurde eine zusätzliche Schicht von 5% Polystyrol in Toluol als Schutzschicht auf dem Sensor aufgetragen. Beim flüssigen Testen zeigte der Sensor reversible, schnelle und gut aufgelöste Messungen von CO&sub2;: Wasser (0,03% CO&sub2;), I&sub1; = 575; 2,66% CO&sub2;, I&sub1; = 440; 5,33% CO&sub2;, I&sub1; = 350; und 8,66% CO&sub2;, I&sub1; = 310.

Beispiele 20 - 21: Herstellung von CO&sub2;-Sensoren mit mit quaternärem Ammonium derivatisiertem Polymer

Das MAPTAC-Polymer, das als Aktivator der Fluoreszenz und auch als das Polymer verwendet wurde, das die Membranstruktur aufbaute, erzeugte eine fluoreszierende Beschichtung, die auf Veränderungen in CO&sub2; antwortete.

Beispiel 20

Unter Verwendung der in Beispiel 14 beschriebenen Formulierung wurde die aktivierte fluoreszierende Polymerlösung durch Auftropfen auf Deckgläser aufgebracht, die mit Glass Clad-Silanisierungsreagenz behandelt worden waren. Die Sensoren wurden über Nacht an Luft getrocknet und blieben nach Verdampfen des Lösungsmittels hochfluoreszierend. Beim Gas- Testen (455 nm Anregung, 510 nm Emission) zeigte der Sensor einen Verlust an Fluoreszenz mit der Einführung von CO&sub2;: Luft (0,33% CO&sub2;), I&sub1; = 620; 3% CO&sub2;, I&sub1; = 550; und bei 7% CO&sub2; I&sub1; = 525.

Beispiel 21

Unter Verwendung der in Beispiel 15 beschriebenen Formulierung wurde die aktivierte fluoreszierende Polymerlösung auf Deckgläser aufgebracht, die mit Glass Clad-Silanisierungsreagenz behandelt worden waren. Die Sensoren wurden über Nacht bei Umgebungsbedingungen getrocknet. Beim Gas- Testen der Fluoreszenzabhängigkeit von der CO&sub2;-Konzentration zeigte der Sensor einen Verlust an Fluoreszenz mit der Einführung von CO&sub2;: Luft, I&sub1; = 290 und 7% CO&sub2;, I&sub1; = 250.

Beispiel 22

Herstellung eines O&sub2;-Sensors mit durch quaternäre Ammoniumionen aktivierter Fluoreszenz

Man kann Sensoren für andere Analyten durch Immobilisierung eines aktivierten Fluorophors herstellen, welcher durch einen speziellen Analyten moduliert wird. Von Sauerstoff war bekannt, daß er die Fluoreszenz von immobilisierten Pyren-Derivaten quencht, und etwas Arbeit wurde auf die Herstellung von Sauerstoff-Sensoren mit einem aktivierten Fluorophor in einem schwachen dielektrischen Medium gerichtet. Der Sensor zeigte eine kleine Antwort auf Sauerstoff, die sich bei Optimierung der Herstellung vielleicht verbessert hätte.
Eine 5%-ige Polystyrol-Lösung wurde mit Toluol hergestellt. Zu 2 ml Polymer wurden 0,2 ml Pyrentetrasulfonat (10&supmin;³ M, abs. Ethanol) und 0,06 ml Tetrabutylammoniumhydroxid (1,0 M, Methanol) gegeben. Die Polymer/Farbstoff-Lösung wurde mittels Schleuderbeschichtung auf Deckgläser aufgetragen, und das Lösungsmittel wurde über Nacht verdampft. Der Sensor wurde bezüglich Fluoreszenzquenchung (375 nm Anregung, 404 nm Emission) auf Grund von O&sub2; getestet: 100% O&sub2;, I&sub1; = 529, 0% O&sub2;, I&sub1; = 565. Alternative Ausführungsformen
Die Diskussion hat die Anwendung dieser Chemie auf die Fluoreszenzaktivierung in einer Lösung sowie in einem festen Medium und die Verwendung der letztgenannten als optischen Sensor angesprochen.
Andere Anwendungen können durchgeführt werden, insbesondere in der organischen Chemie. Die Zugabe einer AcOC zu einem schwach dielektrischen Medium, das für die Extraktion eines Fluorophors in einem Abtrennungsschritt verwendet wird, kann die Fähigkeit verstärken, den gewünschten Fluorophor nachzuweisen. Eine andere Abwandlung wäre der Einschluß einer AcOC in einem chromatographischen Schema, um die Isolierung eines fluoreszierenden Produkts aus einem schwach dielektrischen Lösungsmittelsystem zu unterstützen. Tabelle 1: Vergleichende Fluoreszenzaktivierung von HPTS durch vier quaternäre Ammonium-Verbindungen. Tabelle 2. Vergleichende Fluoreszenz von Fluorophoren in Polymermedien, W und W/Ö quaternäres Ammonium-Aktivierungsreagenz (AcOC). Tabelle 3: Vergleichende Fluoreszenzaktivierung von Fluorescein in vier Lösungsmitteln nach Zugabe von Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH).

Claims

1. Verfahren zur Aktivierung der Fluoreszenz eines polyanionischen Fluoreszenzfarbstoffes in einem schwach dielektrischen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

a) Aufnehmen des Fluoreszenzfarbstoffes in ein schwach dielektrisches Medium, das flüssig, gasförmig oder fest vorliegen kann, wobei dieser Farbstoff in diesem Medium gelöscht wird;

b) zugeben einer Aktivierungskomponente mit einer quaternären Oniumverbindung, die mit dem gelöschten Fluorophor derart zusammenwirkt, daß die Fluoreszenz wiederhergestellt wird und ein aktiviertes Fluorophor im schwach dielektrischen Medium erzeugt wird; und

c) Bestimmen der erzeugten Fluoreszenz oder des auf die Fluoreszenz bezogenen Parameters.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Aktivierungskomponente eine quaternäre Oniumverbindung, bevorzugt mit einem Methoxid- oder Hydroxid-Gegenion, eine mit einer quaternären Oniumverbindung derivatisierte Oberfläche oder ein mit einer quaternären Oniumverbindung, bevorzugt Trimethylpropylammoniumchlorid, derivatisiertes Polymer ist, wobei das Polymer sowohl als das schwach dielektrische Medium als auch als die Aktivierungskomponente, zu der der Farbstoff zugegeben wird, dienen kann.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Aktivierungskomponente aus Tetrabutylammoniumhydroxid, Tetraethylammoniumhydroxid, Tetramethylammoniumhydroxid, Benzyltrimethylammoniumhydroxid, Benzyltrimethylammoniummethoxid und Hexadecyltrimethylammoniumhydroxid ausgewählt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Fluoreszenzfarbstoff aus Fluorescein oder seinen Derivaten, sulfonierten Pyrenen oder ihren Derivaten, Seminaphthorhodafluorverbindungen oder ihren Derivaten und Seminaphthofluoresceinen oder ihren Derivaten ausgewählt wird, bevorzugt ausgewählt aus 2',7'-Dimethylrhodol, 7'- Chlorrhodol, Seminaphthofluorescein, Hydroxypyrentrisulfonat, Pyrentetrasulfonat und Pyrentrisulfonat, wobei das Pyrentrisulfonat bevorzugt mit Ethylendiamin, Acetylazid, Aminoethyl-p-azidobenzamid, Cadaverin oder Hydrazid derivatisiert ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das schwach dielektrische Medium eine Flüssigkeit ist, ausgewählt aus Toluol, Hexan, Butanol, Methanol, Tetrahydrofuran und einer Kombination aus zwei oder mehr dieser Flüssigkeiten, oder es ein Polymer ist, bevorzugt ausgewählt aus Poly(dien), Poly(alken), Cellulose oder einem Cellulosederivat, Poly(methacrylat), Poly(siloxan), Poly(ester) und Poly(carbonat).

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das schwach dielektrische Medium durch eine Schicht entweder aus dem gleichen oder einem unterschiedlichen Polymer als es im Medium verwendet wird, beschichtet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der aktivierte Fluorophor, der pH-sensitiv sein kann, verwendet wird, um einen Analyten zu bestimmen, der die Fluoreszenz moduliert.

8. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, der die Fluoreszenz eines Fluorophors verändert, wobei der Analyt befähigt ist, ein schwach dielektrisches Medium zu durchdringen, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

a) Aufnehmen eines Fluorophors und einer quaternären Oniumverbindung in ein schwach dielektrisches Medium, wobei der Fluorophor ein polyanionischer Fluoreszenzfarbstoff ist, der einem vollständigen Fluoreszenzverlust unterliegt, wenn er in einem schwach dielektrischen Medium gelöst wird, und dessen Fluoreszenz in Gegenwart der quaternären Oniumverbindung wiederhergestellt wird;

b) Bestimmen der Fluoreszenz;

c) In Kontaktbringen des Mediums mit einer den zu bestimmenden Analyten enthaltenden Lösung;

d) Bestimmen der durch den Analyten verursachten Fluoreszenzänderung; und

e) Bestimmen der Konzentration des Analyten durch Bezugnahme auf eine Kalibrierungskurve, wobei der Analyt wahlweise befähigt ist, das schwach dielektrische Medium zu durchdringen und mit dem aktivierten Fluorophor in einer Weise wechselwirken kann, die einen Verlust oder eine Steigerung der Fluoreszenz bewirkt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Analyt Kohlendioxid oder Sauerstoff, Ammoniak oder ein gasförmiges Nebenprodukt einer Enzymreaktion ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei:

a) der Fluorophor aus Fluorescein und seinen Derivaten, sulfonierten Pyrenen und ihren Derivaten, Seminaphthorhodafluorverbindungen und ihren Derivaten und Seminaphthofluoresceinen und ihren Derivaten ausgewählt wird; und

b) der Analyt aus Kohlendioxid, Sauerstoff, Ammoniak und einem gasförmigen Nebenprodukt einer Enzymreaktion ausgewählt wird.

11. Optische Meßvorrichtung zum Bestimmen der Konzentration eines Analyten, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein polyanionisches Fluorophor und eine quaternäre Oniumverbindung in einer schwach dielektrischen Polymermembran auf der Oberfläche einer optischen Komponente umfaßt, die für einfallende und emittierte elektromagnetische Wellen durchlässig ist, wobei sie optisch mit Mitteln zum Sammeln der Strahlungsemission verbunden ist, um die Fluoreszenz zu bestimmen, die die Konzentration des Analyten anzeigt.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei sie eine optische Faser, eine planare Wellenleiter oder einen abklingenden Meßfühler aufweist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12, die zwei oder mehr Meßfühler enthält.

14. Schwach dielektrisches Substrat, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Fluoreszenzfarbstoff und eine Aktivierungskomponente mit einer quaternären Oniumverbindung aufweist, wobei der Farbstoff fluoreszenzgelöscht wird, wenn er in einem schwach dielektrischen Medium ohne die Aktivierungskomponente vorliegt, er aber fluoresziert, wenn die Aktivierungskomponente in diesem Medium vorliegt.

15. Substratbeschichtung, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Fluoreszenzfarbstoff in einem schwach dielektrischen Polymermedium aufweist, das eine Aktivierungskomponente mit einer quaternären Oniumverbindung aufweist, wobei der Farbstoff in einem derartigen Medium fluoreszenzgelöscht wird, wobei die Beschichtung bevorzugt durch Aufschleudern einer Lösung aus einem Polymer und einem Farbstoff auf eine Glasoberfläche und Verdampfen des Lösungsmittels hieraus hergestellt wird.