CN108531499A - 一种标记β-D葡聚糖的结合蛋白及其纯化合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种标记β‑D葡聚糖的结合蛋白及其纯化合成方法，其中包括载体系统的转化及对表达菌株的优化诱导，少量试验后对高表达菌株筛选培养，进行大量的蛋白纯化合成洗脱。本发明产品通过构建好的表达载体转化到表达菌株内，筛选菌落并进行PCR测序验证，得到阳性菌株，进行少量预实验后，同时进行SDS‑PAGE,确认目的蛋白的表达，筛选出高表达菌株，随后对该高表达菌株进行大量培养，再进一步进行大量蛋白纯化，该结合蛋白能够有效与真菌细胞壁成份β‑D葡聚糖进行免疫亲和，准确标记真菌表面β‑D葡聚糖抗原。

Description

一种标记β-D葡聚糖的结合蛋白及其纯化合成方法
技术领域
本发明属于生物医学诊断技术领域，具体涉及一种能够标记真菌细胞壁成份β-D葡聚糖的结合蛋白及其纯化合成方法。
背景技术
真菌广泛分布于自然界，绝大多数对人类无害甚至有益，但其中400余种可引起人类疾病，亦即为我们所称致病性真菌。致病真菌可分为皮肤癣菌、酵母菌和霉菌。真菌引起的疾病称为真菌病，临床上真菌病可分为浅部真菌病和深部真菌病或系统性真菌病。浅部真菌病由只侵犯人体皮肤、毛发和甲等浅表组织的真菌引起。在我国90%以上的真菌病属于浅部真菌病。引起系统性真菌病的病原真菌包括组织胞浆菌、芽生菌、球孢子菌和副球孢子菌，这些都是双相真菌，在自然界中以霉菌形态菌如隐球菌属、念珠菌属、曲霉属等均可致严重的系统感染。
随着器官移植的大量开展及免疫抑制剂、肿瘤患者化疗药物的广泛使用，糖皮质类固醇激素的长期使用，体腔内有创检查的大量开展，人口老龄化和糖尿病等慢性疾病患者的增多，真菌病的发病率和死亡率在逐年增加，对人类健康的危害日趋严重。然而，作为条件致病真菌及大自然中原本认为不致病的真菌种类，近年发现在逐年上升，由于对很多真菌感染的微生物学特性了解甚少，因而出现临床诊治的困难，加之真菌感染的临床表现多种多样，故通常会出现临床的误诊漏诊，导致患者病情迁延甚至危及生命。面对这种现状，如何真菌病的诊断水平已成为国内外临床工作者们共同关心的热点问题，解决这一问题的关键在于提高实验室的真菌鉴定水平。尽管分子生物学等非培养技术的迅猛发展，目前仍缺乏早期快速的诊断方法，这些都给真菌病的预防和诊治带来挑战。因此，逐步开展临床致病真菌检测的研究对于临床上致病真菌的快速诊断及早期针对性的用药具有深刻的指导意义。
临床常见的用于真菌检测的方法包括镜检法、培养法和组织病理学方法等。
1.直接镜检法：直接涂片镜检是一种常用、简便而迅速的真菌检测方法,对真菌感染的诊断具有重要意义。直接涂片镜检是将所取标本直接置于玻片上,用染色或加10％KOH溶液,在光镜下检查。但是真菌与组织细胞之间的反差不大，鉴别真菌非常困难，还需要进一步培养鉴定。另外,直接镜检阴性也不能排除真菌感染的可能性。
2.分离培养方法：从临床标本中对致病菌进行培养，目的在于从临床标本中分离真菌,以确定是否有真菌感染,特别是在直接镜检为阴性时。从疑似患者身上采集的标本可以直接接种在培养基上。一般培养超过2周仍无真菌生长,可报告阴性。培养法虽然检测结果准确性高，但由于真菌生长缓慢,培养常需要数天甚至数周才有结果，常会延误患者病情。
3.组织病理学检查：真菌病的组织病理检查与直接镜检法和培养法同样具有相当重要的价值，尤其对于深部真菌病的诊断意义更大。通过病理组织的检查可确立感染的存在，排除真菌学检查中出现的污染等现象，PAS 染色、嗜银染色、黏蛋白卡红染色及阿尔辛蓝染色等可有助于组织中真菌的检测。然而，组织病理学染色只能确定部分真菌种属，适用范围受到限制。
β-D葡聚糖结合蛋白的抗体和荧光增白剂两种成分，其中β-D葡聚糖结合蛋白的抗体可特异性识别β-D葡聚糖成分，荧光增白剂共价结合几丁质多糖，双重标记真菌。荧光激发后在荧光显微镜的紫外激发光下呈现荧光。使用该结合蛋白抗体进行真菌检测，是区别于传统检验方法：直接镜检法和生化检测法两者的一种免疫荧光检测方法。其结合了免疫学及形态学的诊断方法，利用直接镜检的基本操作方法，通过抗体蛋白与真菌细胞壁β-D葡聚糖成分特异性结合，荧光增白剂共价结合几丁质多糖，双重标记真菌，能够对真菌感染导致的各种疾病，做出快速、准确的实验室检测。该方法具有阳性率高、适用范围广等优点。
发明内容
本发明针对现有技术不足，研发出一种能够标记真菌细胞壁成份β-D葡聚糖的结合蛋白及其合成方法，使得临床检验能够结合免疫学及形态学方法，提高常规镜检方法的阳性率及特异性。本发明产品稳定性好，大量合成便捷，标本标记只需一步操作即可完成荧光标记，临床使用更加方便、快捷，大大提高真菌的检测效率。
本发明具体技术方案如下：
一种能够标记真菌细胞壁成份β-D葡聚糖的结合蛋白及其合成方法，包括合成所需载体系统，表达菌株，表达条件，验证电泳实验，筛选菌株后的培养用培养基，及验证抗体蛋白结合效果的荧光增白剂。
本发明所述荧光增白剂可直接购买，选自选二苯乙烯类型荧光增白剂，优选双三嗪氨基二苯乙烯类型荧光增白剂，更优选荧光增白剂28，。优选荧光增白剂的浓度为0.1%-5%（W/V）。
荧光增白剂28结构如下所示：
。
本发明所述培养基为沙保罗琼脂培养基，供真菌及酵母样真菌的分离培养用。【配法】麦芽糖40g,，蛋白胨10g，琼脂20g，蒸馏水1L。将上述成分溶于水，加热溶解，调pH至6.0±0.2，分装三角瓶或试管中，118℃灭菌15min，倾注平板或置斜面，无菌试验后备用。
本发明结合免疫学及形态学观测特点，通过β-D葡聚糖的结合蛋白与真菌细胞壁β-D葡聚糖抗原结合，再使用荧光增白剂进行共价二次标记，使得抗体能够高灵敏标记，使原本低阳性率的检测方法能够实现快速高效标记，临床使用更加方便、快捷，大大提高真菌检测效率。
附图说明
图1为本发明对标本1的荧光标记结果。
图2为本发明对标本2的荧光标记结果。
图3为本发明对标本3的荧光标记结果。
图4为小量表达SDS-PAGE图谱，黑色箭头所示为目的蛋白条带，大小约为 83KDa，与预测大小相符。
图5为蛋白检测SDS-PAGE图谱，黑色箭头所示为目的蛋白条带，蛋白检测在上清中表达。
图6为纯化蛋白SDS-PAGE 图谱。
具体实施方案
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1 蛋白原核的表达实验
表达宿主：选E.coliRosetta为宿主表达菌。
表达条件：37℃，220rpm摇床震荡培养，待OD600=0.4-0.6之间时，加入终浓度为0.5mM的IPTG， 18℃诱导表达10 h；见图4、图5。
实施例2养方法及蛋白诱导表达后的洗脱纯化，将标本接种培养基，采取高表达菌株，与冷却至45℃左右沙保琼脂混合，倾注接种平板。分别置35℃和25℃恒温箱内同时培养。35℃培养48h,25℃需连续培养5天,逐日观察结果。发现真菌及酵母样可疑菌落，转种沙保菌斜面，获得纯培养后进行诱导蛋白表达并进行洗脱纯化。
结果显示，该蛋白纯化时可挂柱，洗脱下来的蛋白较少，批量做的时候需要①增加酶切时间，②增加DTT 浓度，③ 洗脱2-3次。目前约有300ug；见图6。
实施例3 临床真菌标本的抗原标记实验
选择大小形状重量接近的3份白带标本分别放置于载玻片上，分别用抗体蛋白及荧光增白剂依次对标本1,2,3进行标记，室温放置3分钟，加上盖玻片，而后在荧光显微镜下观察。用340nm–400nm的紫外光激活，真菌将显示出蓝色或蓝白色。结果如表1所示，结果表明3份标本均有较好标记效果，拍摄图依次图1-图3。
表1
标本1 标本2 标本3
染色时间 3分钟 5分钟 10分钟
染色效果 好 好 好

Claims (8)

1.一种能够标记真菌细胞壁成份β-D葡聚糖的结合蛋白，其特征在于其中包括载体系统转化及对表达菌株的优化诱导表达及菌株筛选后的大量纯化，所述载体序列为PTXB1 大肠杆菌表达载体，所述表达菌株为BL21(DE3)大肠杆菌。
2.如权利要求1所述的一种能够标记真菌细胞壁成份β-D葡聚糖的结合蛋白及其纯化合成方法，其特征在于所述转化所用的载体系统PTXB1。
3.如权利要求1所述的一种能够标记真菌细胞壁成份β-D葡聚糖的结合蛋白及其纯化合成方法，其特征在于所述载体系统转化后的表达菌株BL21(DE3)大肠杆菌进行优化诱导表达。
4.如权利要求1所述的一种能够标记真菌细胞壁成份β-D葡聚糖的结合蛋白及其纯化合成方法，其特征在于所述转化表达条件为37 ℃，220 rpm 摇床震荡培养，待 OD600=0.4-0.6 之间时，加入终浓度为 0.5 mM 的 IPTG， 18 ℃诱导表达 10 h。
5.如权利要求1所述的一种能够标记真菌细胞壁成份β-D葡聚糖的结合蛋白及其纯化合成方法，其特征在于优化诱导表达后，通过SDS-PAGE进行的目的蛋白的确认表达。
6.如权利要求1所述的一种能够标记真菌细胞壁成份β-D葡聚糖的结合蛋白及其纯化合成方法，其特征在于所述目的蛋白确认后的高表达菌株的培养，培养基为沙保罗琼脂培养基。【配法】麦芽糖40g,，蛋白胨10g，琼脂20g，蒸馏水1L。将上述成分溶于水，加热溶解，调pH至6.0±0.2，分装三角瓶或试管中，118℃灭菌15min，倾注平板或置斜面，无菌试验后备用。
7.如权利要求1所述的一种能够标记真菌细胞壁成份β-D葡聚糖的结合蛋白及其纯化合成方法，其特征在于所述大量培养后依照优化诱导表达方法进行大量诱导表达进行纯化。
8.如权利要求1所述的一种能够标记真菌细胞壁成份β-D葡聚糖的结合蛋白及其纯化合成方法，其特征在于所述纯化后的蛋白与真菌细胞壁成份β-D葡聚糖进行结合标记，抗体蛋白标记后添加双三嗪氨基二苯乙烯类型荧光增白剂观测标记结果。
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