CN104297484A

CN104297484A - 人类病原真菌免疫荧光诊断试剂及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN104297484A
Application number: CN201410553206.7A
Authority: CN
Inventors: 李明春; 陈家童; 喻其林
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2014-10-17
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2015-01-21

Abstract

本发明公开了一种诊断人类病原真菌感染的免疫荧光诊断试剂及其制备方法。以临床分离的病原真菌制备多克隆抗体或单克隆抗体，然后将抗体与荧光纳米量子点材料经酰胺脱水缩合，连接为荧光纳米量子点-抗体复合物，可直接用于对载体材料上已包被未知抗原（待测患者标本）的样品进行检测，也可预先将抗体包被在载体材料上，进而检测未知抗原。本发明具有对临床病原真菌感染检测特异性强，重复性好，操作便捷，检测准确快速等优点，能有效指导临床用药，减少抗生素滥用，降低患者的诊断检测及治疗费用,从而产生良好的经济效益和社会效益。

Description

人类病原真菌免疫荧光诊断试剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及可检测人体真菌感染的快速检测免疫荧光诊断试剂。具体涉及人真菌感染免疫荧光诊断试剂的制备及应用。

背景技术

病原真菌是一类极为重要的临床致病微生物，主要包括念珠菌属、曲霉属、青霉属、隐球酵母属、毛癣菌属、孢子丝菌属等。在健康人群中，这类真菌通常与机体处于共生状态。然而，在机体免疫力降低，或者局部微生态失调的情况下，该类真菌极易从共生态转变为致病态。尤其是念珠菌属、曲霉属、隐球酵母属等条件致病真菌不仅能引起浅层感染，还能导致播散性感染，从而危及生命。近年来，由于重症特护人群、免疫缺陷人群、放化疗人群的不断扩大及抗生素的滥用，条件致病真菌已成为医院获得性感染的主要病原菌之一，由其引发的播散性真菌病的感染率及死亡率呈不断上升态势，受到广泛关注。所以一旦病人发生了真菌感染，就有必要尽可能快速和准确地确定该致病菌的种类、性质和药敏检测结果，以便临床医师选择最有效的治疗方案进行治疗。目前，针对病原真菌感染的治疗策略较为单一，即主要选用唑类药物。该类药物能阻断真菌生长所必需的麦角甾醇的合成，对不同种类的病原真菌均具有良好的抑菌效果。因此，及时有效的诊断出病原真菌类型的感染，在此基础上进行药物干预，对于提高抗真菌药物的治疗效果、降低病原真菌感染的危害具有重要意义。

尽管病原真菌在临床感染中处于极为重要的地位，但迄今临床对该类真菌的鉴定仍是基于平板培养的形态学方法。这种传统方法存在操作步骤多、检测所需时间长、结果存在不确定性等问题。由于真菌通常比临床病原细菌具有更为缓慢的生长速率，一般的真菌培养结果需要2-6天时间才能有明确的结果。然而，临床上有很多感染患者，尤其是重症特护人群迫切需要快速的检测手段，以明确所感染病原菌的种类，便于临床医师尽快选用有效的抗生素进行对症治疗。尤其是对于念珠菌属、曲霉属等病原真菌而言，其引起的播散性感染往往危及患者生命，因此，研制针对这类真菌的快速、高效、准确的检测方法显得尤为重要。

近年来，由于生命科学的迅猛发展，各种各样的检测方法层出不穷。如基因探针检测法，聚合酶链反应法，电阻电导检测法，微量热法，免疫磁性微球法等一系列理化和免疫学方法。但是，在实际检测中也还存在着不少问题，使这些方法都未得到大规模临床应用，主要问题有：操作复杂、对仪器要求高、测试时间相对较长、费用较高等等。因此，开发新型的快速、高效、准确、便捷的检测方法具有极为重要的意义。免疫检测是近年来迅速发展起来的病原微生物诊断方法，具有高效、特异性强、操作简单等诸多优点，因而日益受到关注。值得注意的是，病原真菌表面均存在结构类似的甘露糖蛋白表面抗原，这为制备具有针对各种病原真菌的广谱免疫诊断试剂提供了可能。然而，迄今尚未见有针对所有病原真菌的免疫诊断试剂的报道。

发明内容

本发明目的是为了解决现有技术中存在的操作复杂、对仪器要求高、测试时间相对较长、费用较高等问题，而提供一种快速检测人类病原真菌感染的免疫荧光诊断试剂及其制备方法。

本发明中所制备的人类病原真菌免疫荧光诊断试剂，是以引发浅层感染或系统性感染的病原真菌为抗原，制备单克隆抗体或多克隆抗体，该抗体与粒径0.1- 10 nm的荧光纳米材料经缩合连接为荧光纳米量子点-抗体复合物，既可直接用于检测固定在载体材料上的未知抗原，又能将荧光纳米量子点-抗体复合物包被在载体材料上，进而检测未知抗原，所述的载体材料为硝酸纤维素制备的膜材、片材或棒材；或PVC材料制备的24孔板或96孔板，或平皿，或反应碟。荧光纳米量子点材料激发光波长为200 nm - 700nm。

一种人类病原真菌感染免疫荧光诊断试剂的制备方法，其步骤为：

第1、.制备抗体

第1.1、取临床病原真菌感染患者病样标本，分离病原真菌抗原标准株，确定其菌属性；

第1.2、扩大病原真菌的培养，制备可溶性抗原；并以该抗原为致敏源，免疫动物，制备特异性多克隆抗体，或利用体外培养细胞融合技术制备特异性单克隆抗体；

第2、荧光纳米量子点材料和抗体的酰胺脱水缩合

第2.1、.将粒径0.1- 10 nm荧光纳米量子点材料溶于无离子水，制成2 mg /1ml浓度的荧光纳米量子点溶液；

第2.2、.另将1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺（EDC）与无离子水按1 g /1ml浓度比的EDC溶液200 μl与上述第2.1步中的荧光纳米量子点溶液200 μl混合(EDC:量子点材料 = 500:1)后，于4℃摇床反应15-20 分钟，再加入0.5 mg NHSS/1ml无离子水浓度的NHSS溶液200 μl反应30分钟；

第2.3、.然后在上述反应体系中加入第1步制备、1 mg/ml的纯化抗体100-150 μl反应，置于4℃摇床过夜，即得到酰胺脱水缩合后的荧光纳米量子点-抗体复合物溶液，并可直接用于对未知抗原的检测或包被于载体材料。该方法适用于各类动物抗体与纳米量子点材料的缩合反应。

所述的荧光纳米量子点材料是非金属量子点荧光材料、金属量子点荧光材料或贵金属纳米团簇荧光材料，荧光纳米量子点的粒径：0.1- 10 nm。激发光波长为200 – 700 nm波长范围内的自发荧光物质或人工合成的荧光物质。荧光发光色为蓝色、绿色、黄色、橙色或红色。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供的人病原真菌感染免疫荧光诊断试剂，具有对所有病原真菌感染的疾病检测特异性强、适用于所有未知病原真菌、性质稳定；操作使用便捷，检测快速、准确、检测时间短等特点。有效的指导临床医生准确用药，减少抗生素滥用，降低患者的诊断检测及治疗费用。从而产生良好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1 临床分离菌株的形态学特征。

图2 临床分离菌株18S rDNA的系统发育树示意图。

图3 临床多种分离菌株的免疫荧光检测结果。

图4 临床标本的免疫荧光检测结果。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。

实施例1

（1）菌株分离：为检验科经口腔念珠菌病感染患者痰液中采集的病原真菌标本。经科玛嘉培养基平板划线培养48 h获得标准菌株。该菌株的形态学特征见图1。在YPD培养基中，该菌呈酵母形态；在添加10%血清的YPD培养基中，细胞转变为菌丝形态。因此初步证实该菌株为白念珠菌。

（2）菌株分子生物学鉴定：

采用玻璃珠振荡法，提取菌株的基因组；采用真菌18S rDNA通用扩增引物18SF (5’- TACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’) 及18SR (5’-CCTTGTTACGACTTTTACTT -3’)，从菌株基因组上扩增18S rDNA序列。将所扩增序列克隆至pMD19-T simple载体（Takara，中国），PCR检测转化子。挑取正确转化子，采用M13F-47 (5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)及M13-48 (5’-GAGCGGATAACAATTT CACACAGG-3’)，对插入片段进行双向测序。采用DNAMAN软件对双向序列进行拼接，得到菌株的18S rDNA序列。通过NCBI在线BLAST软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，对菌株的18S rDNA进行BLASTN分析。采用Clustal 1.8软件及MAGA 2 软件，通过N-J算法构建菌株的系统发育树。

通过NCBI在线BLASTN软件对菌株的168 rDNA序列进行分析，发现其与白念珠菌(Candida albicans) 菌株SC5314的18S rDNA具有极高的序列相似性，相似度达到100%。结合菌株的18S rDNA序列与形态学特征，确定菌株为白念珠菌。

采用N-J算法构建该临床分离菌株18S rDNA的系统发育树，结果见图2。

（3）抗原制备：

3.1. 挑取YPD平板培养的念珠菌菌落，接种至100 mL YPD 培养基中，30℃培养12 h。离心收集菌体，PBS洗涤一次，悬于100 mL PBS中。

3.2.加入菌悬液10%体积的福尔马林溶液，60℃水浴1小时灭活。

3.3.灭活全菌体抗用超声波细胞破碎仪破碎细胞壁，使抗原位点充分暴露，制得破碎全菌体抗原。破碎时在冰浴中进行，破碎3 min，强度70%，采用破碎5 s，暂停5 s，防止温度过高以及大量泡沫的产生。得到的破碎菌体的可溶性抗原浓度为5 mg/ml。-20℃保存备用。

（4）动物免疫和抗体制备

4.1.动物选择：

选用新西兰大耳白兔作为抗原免疫动物，使用1.5公斤左右的健壮、无感染性疾病的新西兰种大耳白兔。免疫前，抽取每只兔的耳缘静脉血10ml，4℃冰箱过夜，吸取血清，无菌离心4℃、10000转/分，15分钟。得正常兔血清作为阴性对照血清。-20℃保存备用。

4.2.抗原乳剂制备：

将制备的可溶性抗原液1.0ml吸入一支2ml无菌注射器中，取另一只2ml注射器吸取1.0ml的完全弗氏佐剂（或弗式不完全佐剂），两支注射器以无菌软管连接并反复对抽10min，直到充分乳化后，滴一滴到冷水中不扩散，即为达到油包水的完全乳化程度，用于免疫。

4.3.动物免疫：

采用多点法注射于兔子背部、腋下、腹股沟及颈部皮下。每周免疫一次，抗原剂量相同，并以褔氏佐剂乳化，乳化方法同前。

动物免疫日历：

Day1：第一次免疫可溶性抗原 + 完全弗氏佐剂；

Day8：第二次免疫可溶性抗原 + 不完全弗氏佐剂；

Day15：第三次免疫可溶性抗原 + 不完全弗氏佐剂；耳静脉取血测抗体效价。

Day22：第四次免疫可溶性抗原 + 不完全弗氏佐剂；耳静脉取血测抗体效价。

第四次免疫后72小时，或根据测定抗体效价达到1:50000以上，杀兔取血，分离血清。

4.4.抗血清分离及保存：

将收集免疫全血的离心管4℃冰箱过夜。吸取血清，无菌4℃、10000转/分钟离心20分钟，得到无菌抗血清，最终得抗血清，ELISA法测定其效价后，用1.5ml离心管分装，保存于-20℃冰箱内备用。

4.5.血清抗体效价测定：

自动物第三次免疫开始从耳静脉取血，分离血清，进行血清特异性抗体效价测定。采用酶联免疫吸附测定（ELISA法）进行抗体效价测定，确定抗体效价滴度。以动物免疫前所取正常血清为阴性对照。加强免疫后抗体效价已达1：50000。

4.6.抗体纯化：

将免疫、取血得到的抗血清，采用饱和硫酸铵沉淀及透析方法纯化抗体，获得临床病原真菌特异性抗体（0.35 mg/ml）5 ml。

（5）临床病原真菌免疫荧光诊断试剂的制备

5.1.荧光纳米材料的制备：

金属量子点荧光材料；IIB-VIA族结构的金属量子点应用较广且材料广泛。

实例选用Na₂S。称取0.01~1 mol的CdCl₂·2.5H₂O，0.01~1 mol的Na₂S和0.01~1 mol的半胱氨酸配成约300 mL水溶液，以0.1~1 mol L-1NaOH溶液调节pH至7~11，通氮气30~60分钟除氧气，100℃回流反应1~10小时，得到CdS量子点母液。用无水乙醇沉淀，12000 rpm转速下离心20 min，上清液吸出除去，并洗涤。反复3次，真空干燥24h。

材料特点：可激发400-450 nm的蓝光。量子点的粒径：0.1 - 10 nm。

5.2.荧光纳米量子点材料和抗体的酰胺脱水缩合：

先将荧光纳米量子点材料用无离子水配制成2 mg/1ml使用液，将EDC（1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺)用无离子水配制成1 g /1ml使用液，将NHSS（N-羟基琥珀酰亚胺钠盐）用无离子水配制成0.5 mg /1ml使用液。将200 μl EDC溶液与200 μl荧光纳米量子点材料溶液混合，使EDC:量子点材料 = 500:1。混合溶液于4℃摇床反应15-20分钟，再加入200 μl NHSS溶液反应30分钟，加入100-150μl 1mg/1ml浓度的纯化后的病原真菌抗体，将此反应体系置于4℃摇床过夜，即得到酰胺脱水缩合后的FNP-抗体复合物溶液。

EDC 通过与羧基反应形成O-酰基异硫脲中间体，然而，该中间体在水溶液中很不稳定，并易于水解。O-酰基异硫脲中间体在NHSS存在的情况下，可以转变为氨基反应活性的NHSS-活性酯，这种NHSS-活性酯中间体非常稳定。

（6）临床病原真菌荧光免疫诊断试剂对分离菌株检测效果的测定

6.1.抗原包被：用滴管吸取少量已知分离菌株的菌悬液，涂于载玻片，风干。

6.2.封闭：各样品上分别滴加100 ul 5%脱脂牛奶，37℃，孵育1h。

6.3.加荧光抗体试剂：在膜片上滴加100 u l荧光诊断试剂（FNP-抗体复合物），37℃，孵育1h。

6.4.洗涤：每次用2 ml PBS洗涤，洗3次，洗去未结合的多余抗体。

6.5.观察：将载玻片置于荧光显微镜下，以相关波长观察荧光发光情况（本测试以紫外光激发，发蓝色荧光）。

6.6.结果：大肠杆菌未检测到荧光信号，而白念珠菌、新型隐球酵母、烟曲霉三株病原真菌均检测到荧光信号，表明所制备的荧光诊断试剂具有真菌特异性。

（7）临床病原真菌荧光免疫诊断试剂的应用

7.1.抗原包被：用棉拭子蘸取患者口腔或其他病患部位样品；或用滴管吸取尿液样品；或用过滤器过滤尿液，得到滤膜样品；将样品涂抹于载玻片，风干。

7.2.封闭：各样品上分别滴加100 μl 5%脱脂牛奶，37℃，孵育1h。

7.3.加FNP-抗体复合物：在膜片上滴加100 μl荧光诊断试剂（FNP-抗体复合物），37℃，孵育1h。

7.4.洗涤：每次用2 ml PBS洗涤，洗3次，洗去未结合的多余抗体。

7.5.观察：将载玻片置于荧光显微镜下，以相关波长观察荧光发光情况。也可应用荧光检测仪，以及可激发不同波长的便携式激发光源仪器，如紫外显示器等。

7.6.结论：荧光观察结果见图4，证实菌培阴性样品未检测到荧光信号，而菌培阳性样品均检测到荧光信号，荧光检测结果阳性表明患者为病原真菌感染。

（8）临床检测结果见附录表1。

附录表1：病原真菌培养和免疫荧光诊断试剂对临床标本检测结果

Claims

1.一种人病原真菌感染免疫荧光诊断试剂，其特征在于：以引发浅层感染及系统性感染的临床病原真菌为抗原，制备多克隆抗体或单克隆抗体，该抗体与粒径0.1-10 nm的荧光纳米量子点材料缩合形成荧光纳米量子点-抗体复合物，既能直接用于检测固定在载体材料上的未知抗原，又能将荧光纳米量子点-抗体复合物包被在载体材料上，进而检测未知抗原；所述荧光纳米量子点材料激发光波长为200–700 nm。

2.根据权利要求1所述的人病原真菌感染免疫荧光诊断试剂，其特征在于：所述的载体材料为硝酸纤维素制备的膜材、片材或棒材；或PVC材料制备的24孔板或96孔板，或平皿，或反应碟。

3.如权利要求1所述的人病原真菌感染免疫荧光诊断试剂的制备方法，其特征包括：

第1、.制备抗体

第2、荧光纳米量子点材料和抗体的酰胺脱水缩合

第2.2、.另将1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺（EDC）与无离子水按1 g /1ml浓度比的EDC溶液200 μl与上述第2.1步中的荧光纳米量子点溶液200 μl混合，其中EDC:量子点材料 = 500:1，然后于4℃摇床反应15-20 分钟，再加入0.5 mg NHSS/1ml无离子水浓度的NHSS溶液200 μl反应30分钟；

第2.3、.然后在上述反应体系中加入第1步制备、纯化的1 mg/ml 抗体100-150 μl反应，置于4℃摇床过夜，即得到酰胺脱水缩合后的荧光纳米量子点-抗体复合物溶液，并可直接用于对未知抗原的检测或包被于载体材料。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述人病原真菌感染免疫荧光诊断试剂的制备方法适用于各类动物抗体与纳米量子点材料的缩合反应。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述的荧光纳米量子点材料是非金属量子点荧光材料、金属量子点荧光材料或贵金属纳米团簇荧光材料，荧光纳米量子点的粒径：0.1- 10 nm。

6.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述荧光纳米量子点材料是激发光波长为200nm – 700 nm波长范围内的自发荧光物质或人工合成的荧光物质。

7.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述的荧光纳米量子点材料的荧光发光色为蓝色、绿色、黄色、橙色或红色。