ES2535004T3 - Método de análisis de plaquetas - Google Patents
Método de análisis de plaquetas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2535004T3 ES2535004T3 ES07021079.4T ES07021079T ES2535004T3 ES 2535004 T3 ES2535004 T3 ES 2535004T3 ES 07021079 T ES07021079 T ES 07021079T ES 2535004 T3 ES2535004 T3 ES 2535004T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- dye
- platelets
- reagent
- ppm
- blue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 claims abstract description 193
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 77
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 51
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 125000000853 cresyl group Chemical group C1(=CC=C(C=C1)C)* 0.000 claims abstract description 30
- QQOPAWAPLFHEEP-UHFFFAOYSA-M [7-(dimethylamino)-2-methylphenoxazin-3-ylidene]-diethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].O1C2=CC(N(C)C)=CC=C2N=C2C1=CC(=[N+](CC)CC)C(C)=C2 QQOPAWAPLFHEEP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 19
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- XJCPMUIIBDVFDM-UHFFFAOYSA-M nile blue A Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4[O+]=C3C=C(N)C2=C1 XJCPMUIIBDVFDM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract 4
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 claims description 69
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 193
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 155
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 48
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 46
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 46
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 41
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 30
- SHXOKQKTZJXHHR-UHFFFAOYSA-N n,n-diethyl-5-iminobenzo[a]phenoxazin-9-amine;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=[NH2+])C2=C1 SHXOKQKTZJXHHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 17
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 15
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 14
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000000306 component Substances 0.000 description 14
- -1 hydroxyethyl group Chemical group 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 13
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 8
- BCHZICNRHXRCHY-UHFFFAOYSA-N 2h-oxazine Chemical compound N1OC=CC=C1 BCHZICNRHXRCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 7
- DDXLVDQZPFLQMZ-UHFFFAOYSA-M dodecyl(trimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C DDXLVDQZPFLQMZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 7
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 5
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 5
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical compound [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 4
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000006539 C12 alkyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M cetyltrimethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- PLMFYJJFUUUCRZ-UHFFFAOYSA-M decyltrimethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCC[N+](C)(C)C PLMFYJJFUUUCRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 3
- CIYKWVNUXJDNNK-UHFFFAOYSA-N oxazine-750 Chemical compound N1=C2C3=CC=CC=C3C(NCC)=CC2=[O+]C2=C1C=C1CCCN3CCCC2=C13 CIYKWVNUXJDNNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 3
- 125000004191 (C1-C6) alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanol Chemical compound OCCC1=CC=CC=C1 WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010021245 Idiopathic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical group [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031981 Thrombocytopenic Idiopathic Purpura Diseases 0.000 description 2
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 2
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 2
- SQHOAFZGYFNDQX-UHFFFAOYSA-N ethyl-[7-(ethylamino)-2,8-dimethylphenothiazin-3-ylidene]azanium;chloride Chemical compound [Cl-].S1C2=CC(=[NH+]CC)C(C)=CC2=NC2=C1C=C(NCC)C(C)=C2 SQHOAFZGYFNDQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 2
- XCOHAFVJQZPUKF-UHFFFAOYSA-M octyltrimethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCC[N+](C)(C)C XCOHAFVJQZPUKF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000004893 oxazines Chemical class 0.000 description 2
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 2
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 101100439662 Arabidopsis thaliana CHR5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100439663 Arabidopsis thaliana CHR7 gene Proteins 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M Cetrimide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PNKUSGQVOMIXLU-UHFFFAOYSA-N Formamidine Chemical compound NC=N PNKUSGQVOMIXLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical class O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Chemical class CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000999 acridine dye Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910001508 alkali metal halide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000008045 alkali metal halides Chemical class 0.000 description 1
- 229910001615 alkaline earth metal halide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- BTVWZWFKMIUSGS-UHFFFAOYSA-N dimethylethyleneglycol Natural products CC(C)(O)CO BTVWZWFKMIUSGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000002449 erythroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-M iodide Chemical compound [I-] XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- VHGXRGXCDVQIKS-KRWDZBQOSA-N methyl (2s)-3-(4-methylphenyl)sulfonyloxy-2-(phenylmethoxycarbonylamino)propanoate Chemical compound C([C@@H](C(=O)OC)NC(=O)OCC=1C=CC=CC=1)OS(=O)(=O)C1=CC=C(C)C=C1 VHGXRGXCDVQIKS-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M methyl sulfate(1-) Chemical compound COS([O-])(=O)=O JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- YYGBVRCTHASBKD-UHFFFAOYSA-M methylene green Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=C([N+]([O-])=O)C2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 YYGBVRCTHASBKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- OELZFJUWWFRWLC-UHFFFAOYSA-N oxazine-1 Chemical compound C1=CC(N(CC)CC)=CC2=[O+]C3=CC(N(CC)CC)=CC=C3N=C21 OELZFJUWWFRWLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 125000001501 propionyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002572 propoxy group Chemical group [*]OC([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 150000003248 quinolines Chemical class 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 1
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/101666—Particle count or volume standard or control [e.g., platelet count standards, etc.]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/107497—Preparation composition [e.g., lysing or precipitation, etc.]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Un método para el análisis de plaquetas mediante la discriminación de las plaquetas de los glóbulos rojos fragmentados, que comprende las etapas de: preparar una muestra de medición mezclando una muestra y un colorante para la tinción de plaquetas, seleccionándose el colorante del grupo que consiste en azul Capri de fórmula (1), azul Nilo de fórmula (2) y azul cresil brillante de fórmula (3); medir la luz dispersada y la fluorescencia emitida a partir de células en la muestra de medición mediante irradiación de las células con luz; y detectar las plaquetas basándose en la luz dispersada y la fluorescencia,**Fórmula** en donde la concentración del azul Capri en la muestra de medición es de 0,1 a 2,0 ppm; la concentración del azul Nilo en la muestra de medición es de 0,05 a 2,0 ppm; y la concentración del azul cresil brillante en la muestra de medición es de 0,5 a 5,0 ppm.
Description
Método de análisis de plaquetas
Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para el análisis de plaquetas. La presente invención también se refiere a un método para el análisis de plaquetas y reticulocitos.
2. Descripción de la técnica relacionada
La sangre humana contiene varias células de la sangre tales como glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas. Entre éstas, las plaquetas son células anucleadas de 2 a 3 µl de diámetro. En la sangre humana normal, hay de
150.000 a 350.000 plaquetas por microlitro.
Sin embargo, se sabe que el número de plaquetas en la sangre se reduce después de la afectación por trombocitopenia tal como púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) o con leucemia aguda. Por lo general, se considera que la transfusión de sangre es necesaria cuando el número de plaquetas en sangre es menor de 10.000 por µl. En consecuencia, la medición rápida y precisa del número de plaquetas es importante en el campo clínico.
Uno de los métodos conocidos de medición de plaquetas es un método de utilización de la resistencia eléctrica. Este método es un método que consiste en medir un pulso de impedancia eléctrica al pasar una muestra que contiene plaquetas entre 2 electrodos y analizarla en un histograma. En el método de utilización de la resistencia eléctrica, sin embargo, existe el problema de que no se puede lograr suficiente precisión de la medición dependiendo de una muestra.
En consecuencia, se conoce un método para medir el número de plaquetas mediante el uso de un anticuerpo específico marcado para el antígeno de superficie de las plaquetas (véase American Journal of Clinical Patologists (2001):115, págs. 460-464). Se sabe que el método descrito en esta publicación es un método altamente sensible, pero que el método generalmente requiere mucho tiempo hasta que se obtienen resultados debido a se utiliza en la medición una reacción antígeno-anticuerpo. En consecuencia, este método no es adecuado como método de medición de las plaquetas en el campo clínico que requiere, por ejemplo, el criterio urgente de si se requiere transfusión de sangre o no.
Los reticulocitos también se encuentran en la sangre. Los reticulocitos son glóbulos rojos jóvenes inmediatamente después de la liberación de células eritroblásticas enucleadas en la médula ósea a la sangre periférica. Los reticulocitos se caracterizan porque en el procedimiento de maduración de las células, están contenidos en forma de trazas en sus células una pequeña cantidad de ARN y orgánulos tales como mitocondrias y ribosomas, que no están contenidos en los glóbulos rojos maduros.
En el campo del examen clínico, la clasificación y el recuento de reticulocitos es muy importante para entender la hematopoyesis en la médula ósea en un paciente. En un sujeto saludable con mielopoyesis normal, reticulocitos representan de 0,5 a 3,0% de todos los glóbulos rojos de la sangre. Por otro lado, el número de reticulocitos se reduce en un estado anormal de mielopoyesis (por ejemplo, en un estado de supresión de mielopoyesis) o aumenta en un estado acelerado de mielopoyesis. En concreto, los reticulocitos disminuyen durante la anemia aplásica y la terapia química para el tumor maligno o aumentan en la anemia hemolítica etc.
Se conoce un método para medir rápidamente las células en la sangre (es decir, células de la sangre tales como glóbulos blancos, reticulocitos y glóbulos rojos) utilizando el principio de la citometría de flujo. En cuanto a tal método de medición, se describen un método de recuento e identificación de reticulocitos, glóbulos rojos y plaquetas en una muestra de sangre completa, así como una composición de reactivo para su uso en el método en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.114.173. En el método, una mezcla de reactivos que contiene un colorante catiónico (en particular, oxazina 750) se mezcla con una muestra que contiene reticulocitos. A continuación, se miden la luz dispersada y la luz absorbida de la mezcla resultante por medio de citometría de flujo. Mediante el uso de la luz dispersada y la luz absorbida como parámetros, se cuentan los reticulocitos y se distinguen de los glóbulos rojos y plaquetas.
La Patente de los Estados Unidos Núm. 4.882.284 describe un método para discriminar los glóbulos blancos de los glóbulos rojos y las plaquetas en la sangre completa no lisada. En el método, un reactivo que contiene un colorante fluorescente que absorbe luz roja se pone en contacto con sangre completa no lisada. Se describe allí que un colorante de oxazina utilizado como colorante fluorescente que absorbe luz roja tiñe glóbulos blancos, y por lo tanto los glóbulos blancos se pueden distinguir de los glóbulos rojos y las plaquetas mediante medición utilizando
citometría de flujo.
La Patente de los Estados Unidos Núm. 5.891.731describe un reactivo para la medición de reticulocitos, que comprende al menos un colorante que tiñe específicamente reticulocitos y un colorante que tiñe específicamente a 5 los glóbulos blancos. Esta patente también describe que un colorante con una base de oxazina puede teñir específicamente glóbulos blancos.
El documento US 4.336.029 describe métodos y composiciones para la cuantificación de reticulocitos y plaquetas mediante fluorescencia en un citómetro de flujo. Se describe una composición que comprende el colorante naranja 10 de acridina.
En la sangre puede aparecer fragmentación de glóbulos rojos, lípidos y similares. En la medición de las plaquetas, los glóbulos rojos, lípidos y similares fragmentados tienen un tamaño similar a las plaquetas y por lo tanto se conocen como contaminantes que incluyen en la medición. La influencia de estos contaminantes es significativa en
15 particular en la medición de una muestra en la que el número de plaquetas es tan bajo que es necesaria la transfusión de sangre. Sin embargo, las publicaciones mencionadas más arriba no describen que las plaquetas se miden con mayor precisión mediante la supresión de la influencia de tales contaminantes.
A partir de lo anterior, existe una demanda de técnicas capaces de medir plaquetas distinguiéndolas más claramente 20 de otras células de la sangre y contaminantes de la sangre, tales como partículas lipídicas.
Compendio de la invención
El alcance de la presente invención está definido únicamente por las reivindicaciones adjuntas, y no se ve afectado 25 en ningún grado por las declaraciones dentro de este compendio.
La presente invención proporciona un método capaz de analizar las plaquetas al discriminarlas más claramente de otras células de la sangre y contaminantes en la sangre, tales como partículas lipídicas en un método de análisis mediante citometría de flujo.
30 La presente invención proporciona un método para el análisis de las plaquetas al discriminar las plaquetas de los glóbulos rojos fragmentados, que comprende las etapas de: preparar una muestra de medición mediante la mezcla de una muestra y un colorante para la tinción de plaquetas, seleccionándose el colorante del grupo que consiste en azul Capri, azul Nilo y azul cresil brillante; medir la luz dispersada y la fluorescencia emitida a partir de células en la
35 muestra de medición irradiando las células con luz; y detectar las plaquetas sobre la base de la luz dispersada y la fluorescencia, en donde la concentración de azul Capri en la muestra de medición es de 0,1 a 2,0 ppm; la concentración del azul de Nilo en la muestra de medición es de 0,05 a 2,0 ppm; y la concentración del azul cresil brillante en la muestra de medición es de 0,5 a 5,0 ppm.
40 Descripción de los dibujos
Las Figs. 1A a C muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando un reactivo que contiene un colorante de oxazina diferente. La Fig. 2 muestra diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo para el
45 análisis de plaquetas con diferentes concentraciones de Capri azul. Las Figs. 3A y B muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo de medición de plaquetas con diferentes concentraciones de azul Nilo. Las Figs. 4A y B muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo para el análisis de plaquetas con diferentes concentraciones de azul cresil brillante.
50 Las Figs. 5A y B muestran gráficos que muestran la correlación entre el número de plaquetas determinado por medio del método en una realización de la invención y el número de plaquetas determinado por medio de un método convencional. Las Figs. 6A a C muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo para el análisis de reticulocitos y plaquetas con diferentes concentraciones de un colorante para tinción de
55 reticulocitos. Las Figs. 7A a C muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo para el análisis de reticulocitos y plaquetas con diferentes concentraciones de un colorante para la tinción de reticulocitos y diferentes concentraciones de un colorante (Capri azul) para la tinción de plaquetas. Las Figs. 8A a C muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo
60 para el análisis de reticulocitos y plaquetas con diferentes concentraciones de un colorante para la tinción de reticulocitos y diferentes concentraciones de un colorante (azul Nilo) para la tinción de plaquetas. Las Figs. 9A a C muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo para el análisis de reticulocitos y plaquetas con diferentes concentraciones de un colorante para la tinción de reticulocitos y diferentes concentraciones de un colorante (azul cresil brillante) para la tinción de
plaquetas.
Descripción de las realizaciones preferidas
5 Para la obtención de un reactivo de medición de plaquetas capaz de medir las plaquetas al discriminarlas más claramente de otras células de la sangre y contaminantes de la sangre, tales como partículas lipídicas en un método de medición usando citometría de flujo, los autores de la presente invención realizaron un extenso estudio con 100 o más colorantes. Como resultado, encontraron que un colorante oxazina específico puede teñir específicamente las plaquetas, y por lo tanto se completó la presente invención. No se sabía que el colorante de oxazina específico que
10 se ha encontrado ahora que es utilizable para la tinción de plaquetas pudiera teñir específicamente plaquetas a un grado tal que las plaquetas se pudieran distinguir de contaminantes tales como las partículas lipídicas. Este colorante de oxazina puede teñir fluorescentemente las plaquetas. Las plaquetas teñidas con este colorante de oxazina pueden emitir fluorescencia fuerte en la medición mediante citometría de flujo. Las plaquetas se pueden distinguir de ese modo de los contaminantes.
15 En esta memoria descriptiva, los "contaminantes" de la sangre se refieren a componentes de la sangre que pueden impedir la medición precisa de las plaquetas. Tales contaminantes incluyen partículas lipídicas, glóbulos rojos fragmentados y similares contenidos en la sangre.
20 El reactivo para el análisis de plaquetas (en lo sucesivo denominado a veces como reactivo PLT) comprende un colorante para la tinción de plaquetas. El colorante es capaz de teñir específicamente plaquetas. El colorante es al menos un colorante de oxazina seleccionado del grupo que consiste en azul Capri, azul Nilo y azul cresil brillante. El colorante es preferiblemente un colorante capaz de teñir plaquetas con el fin de hacer que sean distinguibles de las partículas lipídicas. Al utilizar el reactivo PLT que contiene el colorante, las plaquetas, incluso en una muestra que
25 contiene contaminantes capaces de evitar la detección de las plaquetas, se pueden medir rápidamente con una mayor precisión mediante la prevención de la influencia de tales contaminantes y otras células de la sangre en la sangre.
El azul Capri es el azul GON de fórmula (II): 30
El azul cresil brillante es el azul cresil brillante ALD de fórmula (IV): 5
Los colorantes anteriormente mencionados para la tinción de las plaquetas están disponibles comercialmente. Por ejemplo, el azul Capri GON está disponible de Chroma Gesellshaft Schmid & Co., el azul Nilo de Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. y Sigma-Aldrich, respectivamente, y el azul cresil brillante ALD de Sigma-Aldrich.
Los colorantes mencionados anteriormente pueden teñir las plaquetas hasta tal punto que las plaquetas se pueden distinguir de los glóbulos rojos fragmentados.
También se encontró que un reactivo que contiene un colorante capaz de teñir específicamente reticulocitos y el colorante anteriormente para la tinción de plaquetas se pueden utilizar para distinguir los reticulocitos y las plaquetas más claramente de otras células de la sangre y contaminantes de la sangre. A partir de lo anterior, se pueden mencionar un reactivo para el análisis de reticulocitos y plaquetas (en lo sucesivo denominado a veces como reactivo RET/PLT) que contiene un primer colorante para la tinción de las plaquetas y un segundo colorante para la tinción de reticulocitos.
El colorante anterior para la tinción de plaquetas se puede utilizar como el primer colorante contenido en el reactivo RET/PLT.
El segundo colorante contenido en el reactivo RET/PLT puede ser un colorante capaz de teñir reticulocitos en un grado tal que sea distinguible de otras células o contaminantes de la sangre. El segundo colorante es preferiblemente un colorante de cianina capaz de teñir un ácido nucleico (en lo sucesivo denominado a veces como colorante de cianina que tiñe ácidos nucleicos). El colorante de cianina que tiñe ácidos nucleicos puede ser un colorante conocido convencionalmente. Los ejemplos de tales colorantes pueden incluir los colorantes descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.891.731. Los colorantes descritos en el documento WO 98/26007, los colorantes descritos en el documento WO 01/086264 y los colorantes descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.957.870. Entre estos colorantes son preferibles los representados por la siguiente fórmula (I):
en donde R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1 a C6, o -CH2(CHR5)xOR6; R2 y R3 representan independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo alquilo C1 a C6, un grupo alcoxi C1 a C6, un grupo arilo, o un grupo aralquilo; R4 representa un grupo alquilo C1 a C6, -CH2(CHR7)yOR8, un grupo arilo, o un grupo aralquilo; R5 y R7 representan independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo hidroxialquilo C1 a C3; R6 y R8 representan independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo acilo, o un grupo alquilo C1 a C3; Z representa un átomo de azufre, un átomo de oxígeno, un átomo de selenio, o CR9R10; R9 y R10 representan independientemente un grupo alquilo C1 a C3; n es un número entero de 1 ó 2; X e Y representan independientemente un número entero de 0 a 3; y X-es un anión.
El grupo alquilo C1 a C6 representado por R1 en la fórmula (I) puede ser lineal o ramificado. El grupo alquilo C1 a C6 representado por R1 incluye, por ejemplo, un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo butilo, un grupo isobutilo, grupo sec-butilo, un grupo terc-butilo, un grupo pentilo y un grupo hexilo. Entre estos grupos, es preferible un grupo metilo o etilo.
El grupo representado por cada uno de R2 y R3 en la fórmula (I) puede estar sustituido en cualquiera de las posiciones orto, meta y para. El grupo alquilo C1 a C6 representado por cada uno de R2 y R3 puede incluir los mismos grupos descritos anteriormente. El grupo alcoxi C1 a C6 puede incluir un grupo metoxi, un grupo etoxi, grupo propoxi etc. Entre estos grupos, es preferible un grupo metoxi o etoxi. El grupo arilo representado por cada uno de R2 y R3 puede incluir un grupo fenilo etc. El grupo aralquilo representado por cada uno de R2 y R3 puede incluir un grupo bencilo etc. El grupo representado por cada uno de R2 y R3 en la fórmula (I) es más preferiblemente hidrógeno.
El grupo alquilo C1 a C6, el grupo arilo y el grupo aralquilo representado por R4 en la fórmula (I) pueden incluir los mismos grupos descritos anteriormente.
El grupo hidroxialquilo C1 a C3 representado por cada uno de R5 y R7 puede incluir un grupo hidroximetilo, grupo hidroxietilo y un grupo hidroxipropilo. Entre estos grupos, es preferible un grupo hidroximetilo o hidroxietilo.
El grupo acilo representado por cada uno de R6 y R8 es preferiblemente un grupo acilo derivado de un ácido 5
carboxílico alifático. El grupo acilo incluye un grupo acetilo y un grupo propionilo, entre los cuales es preferible un grupo acetilo. El grupo alquilo C1 a C3 representado por cada uno de R6 y R8 puede incluir los mismos grupos que se han descrito anteriormente.
5 Z en la fórmula (I) anterior es un átomo de azufre, un átomo de oxígeno, un átomo de selenio o CR9R10, entre los que es preferible un átomo de azufre.
El grupo alquilo C1 a C3 representado por cada uno de R9 y R10 puede incluir los mismos grupos que se han descrito anteriormente.
10 El anión representado por X-en la fórmula (I) anterior incluye, por ejemplo, un ion de halógeno, un ion de haluro de boro, un ion de compuesto de fósforo, un ion de oxiácido de halógeno, un ion de fluorosulfato, un ion de sulfato de metilo, y un ion de compuesto de tetrafenilboro que tiene un átomo de halógeno o un grupo haloalquilo como sustituyente en un anillo fenilo. El ion de halógeno incluye un ion de flúor, ion de cloro, ion de bromo e ion de yodo.
15 El ion de haluro de boro incluye BF4-, BCl4-y BBr4-. Entre estos iones, es preferible un ion de bromo o BF4-.
Los ejemplos del colorante de la fórmula (I) se muestran a continuación:
Azul de tiazol
Entre los colorantes representados por la fórmula (I), los colorantes en la que n = 1 se pueden sintetizar por ejemplo, por medio del siguiente método. En primer lugar, se hace reaccionar formamidina N,N-disustituida, con un compuesto representado por la siguiente fórmula (V):
El producto obtenido por la reacción se hace reaccionar con un derivado de quinolina representado por la fórmula
(VI) de más abajo y después se trata con borofluoruro de sodio.
Los colorantes de la fórmula (I) en donde n = 1 se pueden sintetizar de esta manera.
Los colorantes de la fórmula (I) en donde n = 2 se pueden sintetizar mediante la misma reacción que para los 20 colorantes en donde n = 1, excepto que, por ejemplo, se utiliza sal de malondialdehído bis(fenilimina) en lugar de formamidina N,N-disustituida.
Además de los colorantes de cianina que tiñen ácidos nucleicos descritos anteriormente, también se conocen colorantes tales como Nuevo Azul de Metileno y Oxazina 750 como colorantes para reticulocitos y se pueden utilizar 25 como segundo colorante.
El colorante para la tinción de plaquetas está contenido en el reactivo de tal manera que la concentración del colorante, aunque varían dependiendo del tipo de colorante o el tipo de reactivo, pasa a ser de 0,01 a 10 ppm cuando se mezcla con una muestra.
30 Por ejemplo, cuando el colorante para la tinción de plaquetas está contenido en el reactivo PLT, el colorante está contenido en el reactivo PLT de manera que la concentración del colorante, aunque varía dependiendo del tipo de colorante, pasa a ser preferiblemente de 0,01 a 5 ppm, más preferiblemente de 0,05 a 2,0 ppm o menos, cuando se mezcla con una muestra. En particular, cuando se utiliza azul Capri GON como colorante para la tinción de
plaquetas para discriminar las plaquetas de partículas lipídicas, el colorante está contenido en el reactivo PLT de manera que la concentración del colorante, cuando se mezcla con una muestra, para a ser preferiblemente de 0,1 a 5,0 ppm, más preferiblemente de 0,2 a 2,0 ppm. Cuando se utiliza azul Capri GON para discriminar las plaquetas de los glóbulos rojos fragmentados, el colorante está contenido en el reactivo PLT de manera que la concentración del colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser de 0,1 a 2. 0 ppm, preferiblemente de 0,2 a 1,0 ppm. Cuando se utiliza azul Nilo para discriminar las plaquetas de las partículas lipídicas, el colorante está contenido en el reactivo PLT de manera que la concentración del colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser preferiblemente de 0,05 a 5,0 ppm, más preferiblemente de 0,1 a 2,0 ppm. Cuando se utiliza azul Nilo para discriminar las plaquetas de los glóbulos rojos fragmentados, el colorante está contenido en el reactivo PLT de manera que la concentración del colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser de 0,05 a 2,0 ppm, preferiblemente de 0,1 a 1,0 ppm. Cuando se utiliza azul cresil brillante ALD para discriminar las plaquetas de las partículas lipídicas, el colorante está contenido en el reactivo PLT de manera que la concentración del colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser preferiblemente de 0,1 a 5,0 ppm, más preferiblemente de 0,5 a 2,0 ppm. Cuando se utiliza azul cresil brillante ALD para discriminar las plaquetas de los glóbulos rojos fragmentados, el colorante está contenido en el reactivo PLT de manera que la concentración del colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser de 0,5 a 5,0 ppm, preferiblemente de 0,5 a 2,0 ppm.
Para una mejora adicional en la discriminación de las plaquetas de otras células y contaminantes de la sangre, la concentración del colorante en el reactivo PLT se encuentra en el intervalo definido anteriormente.
Cuando el colorante para la tinción de plaquetas está contenido como primer colorante en el reactivo RET/PLT, el colorante está contenido en el reactivo de manera que la concentración del primer colorante, aunque variando dependiendo del tipo de colorante, pase a ser preferiblemente de 0,01 a 10 ppm, más preferiblemente de 0,1 a 2,0 ppm o menos, cuando se mezcla con una muestra. En particular, cuando se utiliza azul Capri GON como primer colorante para discriminar las plaquetas de las partículas lipídicas y los glóbulos rojos fragmentados, el primer colorante está contenido en el reactivo RET/PLT de manera que la concentración del primer colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser de 0,2 a 3,0 ppm, más preferiblemente de 0,5 a 2,0 ppm. Cuando se utiliza azul Nilo para discriminar las plaquetas de las partículas lipídicas y los glóbulos rojos fragmentados, el primer colorante está contenido en el reactivo RET/PLT de manera que la concentración del primer colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser preferiblemente de 0,1 a 2,0 ppm. Cuando se utiliza ALD azul brillante para discriminar las plaquetas de las partículas lipídicas y los glóbulos rojos fragmentados, el primer colorante está contenido en el reactivo RET/PLT de manera que la concentración del primera colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser preferiblemente de 0,5 a 3,0 ppm, más preferiblemente de 1,0 a 2,0 ppm.
Para una mejora adicional en la discriminación de las plaquetas de otras células y contaminantes de la sangre, es preferible que la concentración del colorante en el primera reactivo RET/PLT se encuentre en el intervalo definido anteriormente.
El segundo colorante está contenido en el reactivo RET/PLT de manera que la concentración del segundo colorante, aunque varía dependiendo del tipo de colorante, pasa a ser preferiblemente de 0,1 a 50 ppm, más preferiblemente de 0,5 a 10 ppm más o menos, cuando se mezcla con una muestra. Cuando la concentración del segundo colorante en el reactivo RET/PLT está en el intervalo definido anteriormente, los reticulocitos se pueden distinguir de otras células y contaminantes de la sangre.
El segundo colorante para tinción de reticulocitos en la composición del reactivo RET/PLT puede penetrar rápidamente en el reticulocito y teñir el ARN en la célula.
Preferiblemente, el reactivo RET/PLT comprende adicionalmente un anión multivalente para la supresión de la tinción no específica de glóbulos rojos. El anión multivalente incluye un ion sulfato, ion fosfato, ion carbonato e ion carboxilato multivalente. Los compuestos capaces de suministrar estos iones incluyen ácido cítrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, EDTA y sales de metales alcalinos de los mismos. El reactivo RET/PLT puede incluir uno o más de estos compuestos en forma de aniones multivalentes.
La proporción de los aniones multivalentes puede ser al menos 50% de todo el componente aniónico en el reactivo. La proporción de los aniones multivalentes es preferiblemente al menos 70% de todo el componente aniónico en el reactivo.
Mediante la incorporación de los aniones multivalentes, se puede prevenir la tinción no específica de los glóbulos rojos, y se puede facilitar la discriminación entre los reticulocitos, plaquetas y glóbulos rojos.
El reactivo PLC y el reactivo RET/PLT pueden contener un tampón para mantener constante el pH. El tampón puede estar contenido en una concentración de varios mM a aproximadamente 100 mM. El tampón no está particularmente limitado con tal que se utilice usualmente, y por ejemplo, se pueden utilizar un carboxilato, un fosfato, tampón de Good, taurina y trietanolamina dependiendo del pH deseado.
El pH del reactivo PLT y del reactivo RET/PLT se encuentra preferiblemente en el intervalo de 6,0 a 11,0, más preferiblemente de 7,0 a 10,0, aún más preferiblemente de 8,0 a 9,5. Cuando el pH es mucho más bajo que el intervalo anterior, los glóbulos rojos se hacen frágiles y se destruyen fácilmente, por lo que puede aumentar la cantidad de glóbulos rojos fragmentados como contaminantes. Cuando el pH es mucho más alto que el intervalo anterior, los grupos funcionales ácidos de una membrana de los glóbulos rojos se disocian de manera que los glóbulos rojos se pueden unir fácilmente al colorante catiónico, aumentando de este modo la tinción no específica de los glóbulos rojos fragmentados.
Cuando un compuesto capaz de suministrar los iones multivalentes tiene acción tamponadora en el reactivo RET/PLT, el compuesto también puede ser utilizado como un tampón.
La presión osmótica del reactivo PLT y del reactivo RET/PLT es preferiblemente de 150 a 600 mOsm/kg, más preferiblemente de 200 a 300 mOsm/kg. Una presión osmótica en este intervalo está próxima a la presión osmótica fisiológica, y por lo tanto puede evitar la hemólisis hipotónica de los glóbulos rojos.
Para mantener la presión osmótica descrita anteriormente, los reactivos PLT y RET/PLT pueden contener un agente de compensación de la presión osmótica. El agente de compensación de la presión osmótica puede ser un agente utilizado convencionalmente, y los ejemplos incluyen sales de metales alcalinos tales como propionatos y azúcares tales como glucosa y manosa. También se pueden utilizar haluros de metal alcalino tales como NaCl y haluros de metales alcalinotérreos. Estos agentes de compensación de presión osmótica pueden utilizarse solos o en forma de una mezcla de dos o más de los mismos. Cuando el tampón anterior se puede utilizar para regular la presión osmótica del reactivo en el intervalo anterior, el agente de compensación de presión osmótica puede no ser utilizado.
El reactivo PLT y el reactivo RET/PLT contienen un promotor de la tinción para estimular la penetración del colorante en una célula. El promotor de tinción es un tensioactivo catiónico. Un tensioactivo catiónico preferible está
en donde R11 representa un grupo alquilo C8 a C12, R12, R13 y R14 representan independientemente un grupo alquilo C1 a C6, e Y-representa un anión.
El grupo alquilo C8 a C12 representado por R11 en la fórmula (VII) puede ser lineal o ramificado. El grupo alquilo C8 a C12 representado por R11 incluye, por ejemplo, un grupo octilo, un grupo decilo, un grupo laurilo, un grupo cetilo y un grupo miristilo.
El grupo alquilo C1 a C6 representado por cada uno de R12, R13 y R14 en la fórmula (VII) puede ser lineal o ramificado. El grupo alquilo C1 a C6 representado por cada uno de R12, R13 y R14 incluye, por ejemplo, un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo butilo, un grupo isobutilo, grupo sec-butilo, un grupo terc-butilo, un grupo pentilo y un grupo hexilo. Entre estos grupos, es preferible un grupo metilo o etilo.
El anión representado por Y-en la fórmula (VII) es preferiblemente un ion de bromo o un ion de cloro.
Los ejemplos preferibles del tensioactivo catiónico representado por la fórmula (VII) incluyen bromuro de deciltrimetilamonio (DTAB), bromuro de octiltrimetilamonio (OTAB), cloruro de lauriltrimetilamonio (LTAC), cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC) y bromuro de miristiltrimetilamonio (MTAB). Estos tensioactivos catiónicos pueden utilizarse solos o como una mezcla de dos o más de los mismos.
El tensioactivo catiónico anterior está contenido en el reactivo PLT o el reactivo RET/PLT preferiblemente a una concentración tal que cuando el reactivo PLT o el reactivo RET/PLT se mezcla con una muestra, el tensioactivo catiónico puede promover la tinción de plaquetas, o de reticulocitos y plaquetas, y no causa la destrucción de los glóbulos rojos. Dicha concentración varía dependiendo del tipo de tensioactivo catiónico, pero es habitualmente de aproximadamente 50 a 20000 ppm. Por ejemplo, cuando se utiliza DTAB, su concentración en el reactivo es preferiblemente de aproximadamente 500 a 3000 ppm. Cuando se utiliza LTAC por ejemplo, su concentración en el reactivo es preferiblemente de aproximadamente 100 a 500 ppm.
El reactivo PLT y el reactivo RET/PLT pueden contener, por ejemplo, conservantes tales como 2-piridiltio-1-óxido de sodio y alcohol β-fenetílico, además de los componentes descritos anteriormente.
El reactivo PLT se puede producir disolviendo el colorante para la tinción de plaquetas y componentes arbitrarios (un tampón, un agente de compensación de la presión osmótica, un promotor de la tinción, un conservante, etc.), en un
disolvente adecuado a las concentraciones adecuadas descritas anteriormente. El disolvente no está particularmente limitado con tal que pueda disolver de forma estable estos componentes. Los ejemplos del disolvente incluyen agua y disolventes orgánicos solubles en agua. Como disolvente orgánico soluble en agua, es posible utilizar etanol, dimetilsulfóxido, etilenglicol o una mezcla disolvente de los mismos.
Los respectivos componentes pueden disolverse en un orden arbitrario sin limitación al orden de su disolución en el disolvente. Alternativamente, los componentes se disuelven previamente en diferentes disolventes adecuados, respectivamente, y justo antes de su uso, las respectivas soluciones se pueden mezclar para su uso como reactivo PLT. Por ejemplo, si el colorante para la tinción de plaquetas es inestable en una solución acuosa, el colorante puede disolverse en un disolvente orgánico soluble en agua y mezclarse justo antes del uso con una disolución acuosa que contiene los otros componentes para constituir una disolución para uso como reactivo PLT.
El reactivo RET/PLT se puede producir disolviendo el primer colorante para la tinción de plaquetas, el segundo colorante para tinción de reticulocitos, y componentes arbitrarios (aniones multivalentes, un tampón, un agente de compensación de la presión osmótica, un promotor de la tinción, un conservante, etc.), en un disolvente adecuado a las concentraciones adecuadas descritas anteriormente. El disolvente no está particularmente limitado con tal que pueda disolver de forma estable estos componentes. Los ejemplos del disolvente incluyen agua y disolventes orgánicos solubles en agua. Como disolvente orgánico soluble en agua, es posible utilizar etanol, dimetilosulfóxido, etilenglicol o una mezcla disolvente de los mismos.
Los respectivos componentes pueden disolverse en un orden arbitrario sin limitación al orden de su disolución en el disolvente. Alternativamente, los componentes se disuelven previamente en diferentes disolventes adecuados, respectivamente, y justo antes de su uso, las respectivas disoluciones se pueden mezclar para su uso como reactivo RET/PLT. Por ejemplo, si el primer y segundo colorantes son inestables en una disolución acuosa, los colorantes se pueden disolver en un disolvente orgánico soluble en agua y se mezclan justo antes del uso con una disolución acuosa que contiene los otros componentes para constituir una disolución para su uso como reactivo RET/PLT. El primer y segundo colorantes se pueden disolver en el mismo disolvente orgánico soluble en agua o en diferentes disolventes orgánicos solubles en agua.
El reactivo PLT producido de este modo se puede mezclar y hacer reaccionar con una muestra para preparar una muestra de medición, tiñéndose de ese modo las plaquetas que pueden estar contenidas en la muestra, o el reactivo RET/PLT producido de este modo se puede mezclar y hacer reaccionar con una muestra para preparar una muestra de medición, tiñéndose de ese modo los reticulocitos y las plaquetas que puedan estar contenidos en la muestra. En esta memoria descriptiva, la muestra se refiere a la sangre (sangre completa, plasma rico en plaquetas (PRP) etc.) o un producto aspirado de médula ósea obtenido del cuerpo biológico (particularmente mamíferos incluyendo seres humanos), o a una muestra obtenida diluyendo la sangre o producto aspirado de médula en la sangre con una disolución adecuada tal como una solución tampón.
La razón de mezcla (razón en volumen) del reactivo PLT (o el reactivo RET/PLT) con respecto a una muestra se establece preferiblemente de tal manera que reactivo : muestra = 100 : 1 a 1000 : 1. La temperatura a la que el reactivo PLC (o el reactivo RET/PLT) se hace reaccionar con una muestra es preferiblemente de aproximadamente 25 a 50°C, más preferiblemente de aproximadamente 35 a 45°C. El tiempo de reacción, aunque varía dependiendo del tipo de colorante, es preferiblemente de aproximadamente 10 segundos a 5 minutos, más preferiblemente de aproximadamente 20 segundos a 2 minutos, aún más preferiblemente de 20 segundos a 60 segundos.
La muestra de medición preparada como se ha descrito anteriormente es irradiada con luz, y se miden la luz dispersada y la fluorescencia emitida a partir de las células en la muestra de medición. El aparato para la irradiación de luz es preferiblemente un citómetro de flujo. Cuando se utiliza un citómetro de flujo, la muestra de medición se introduce en una celda de flujo del citómetro de flujo, las células en la muestra de medición que fluye en la celda de flujo se irradian con luz.
La fuente de luz del citómetro de flujo utilizado no está particularmente limitada, y se puede utilizar una fuente de luz con longitudes de onda adecuadas (por ejemplo, en las proximidades de 600 a 680 nm) para excitar el colorante para la tinción de plaquetas o el primer colorante para la tinción de las plaquetas y el segundo colorante para tinción de reticulocitos. La fuente de luz incluye, por ejemplo, un láser semiconductor rojo y un láser de He-Ne. En particular, es preferible un láser semiconductor porque es poco costoso en comparación con un láser de gas.
La luz dispersada emitida a partir de células tras la irradiación con luz en el citómetro de flujo puede ser luz dispersada frontalmente (en la vecindad de un ángulo de recepción de luz de 0 a 20°) o luz dispersada lateralmente (en la vecindad de un ángulo de recepción de luz de 90°). La luz dispersada frontalmente puede ser ya sea la luz dispersada frontal de bajo ángulo (en la vecindad de un ángulo de recepción de luz de 1 a 5°) o luz dispersada frontal de alto ángulo (en la vecindad de un ángulo de recepción de luz de 6 a 20°). La luz dispersada es conocido por ser un parámetro que refleja información sobre el tamaño de la célula.
Para la fluorescencia emitida a partir de células tras la irradiación con luz en el citómetro de flujo, se puede seleccionar una longitud de onda adecuada de luz recibida dependiendo del colorante utilizado.
En base a la luz dispersada y la fluorescencia obtenida como se ha descrito anteriormente utilizando el reactivo PLT, se pueden preparar diagramas de dispersión para detectar plaquetas distinguiendo las plaquetas de otras células y contaminantes de la sangre tales como partículas lipídicas. También se pueden contar las plaquetas detectadas de este modo. Preferiblemente se utiliza soporte lógico de análisis adecuado en la detección y el recuento de plaquetas.
Basándose en la luz dispersada y la fluorescencia obtenida como se ha descrito anteriormente utilizando el reactivo RET/PLT, se pueden preparar diagramas de dispersión para detectar reticulocitos y plaquetas distinguiendo los reticulocitos y las plaquetas de otras células y contaminantes de la sangre tales como partículas lipídicas. También se pueden contar los reticulocitos y las plaquetas detectados de este modo. El soporte lógico de análisis adecuado se utiliza preferiblemente en la detección y el recuento de reticulocitos y plaquetas.
La presente solicitud describe un kit de reactivos para el análisis de plaquetas (en lo sucesivo denominado a veces como kit de reactivos PLT) que comprende un primer reactivo que contiene un tampón para mantener constante el pH durante la medición y un segundo reactivo que contiene un colorante para la tinción de plaquetas, en donde el colorante es al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de azul Capri, azul Nilo y azul cresil brillante.
El tampón en el primer reactivo en el kit de reactivos PLT puede ser el mismo que se ha descrito anteriormente.
El primero y segundo reactivos en el kit de reactivos PLT se pueden preparar disolviendo el tampón y el colorante de tinción de plaquetas en un disolvente adecuado, respectivamente.
El kit de reactivos PLT puede contener adicionalmente un agente osmótico de compensación de la presión, un promotor de la tinción, un conservante, etc., que pueden estar contenidos de forma arbitraria en el reactivo PLT. Estos componentes pueden estar contenidos en el primer o segundo reactivo en el kit de reactivos PLT o pueden estar contenidos en otros reactivos en el kit.
Mezclando los reactivos en el kit de reactivos PLT con una muestra, se puede preparar una muestra de medición. El orden de mezcla de los respectivos reactivos en el reactivo PLT con una muestra no está particularmente limitado. La razón de mezcla (razón en volumen) se establece preferiblemente de tal manera que el total de los respectivos reactivos en el kit de reactivos : muestra = 100 : 1 a 1000 : 1.
El método para preparar una muestra de medición utilizando el kit de reactivo PLT, el método para medir la luz dispersada y la fluorescencia de la muestra de medición y el método para la detección de plaquetas basándose en la luz dispersada y la fluorescencia puede ser el mismo que en el reactivo PLT descrito más arriba.
La presente solicitud describe adicionalmente un kit de reactivos para el análisis de reticulocitos y plaquetas (en lo sucesivo denominado a veces como kit de reactivos RET/PLT), que comprende un primer reactivo que contiene un primer colorante para la tinción de plaquetas, que se selecciona del grupo que consiste de azul Capri, azul Nilo y azul cresil brillante, y un segundo reactivo que contiene un segundo colorante de tinción de reticulocitos. El kit de reactivos RET/PLT puede comprender adicionalmente un tercer reactivo que contiene un tampón para mantener constante el pH durante la medición.
El tampón puede ser el mismo que se ha descrito anteriormente.
El primer reactivo, el segundo reactivo y el tercer reactivo en el kit de reactivo RET/PLT se pueden preparar disolviendo el primer colorante, el segundo colorante y el tampón en disolventes adecuados, respectivamente.
La presente solicitud describe adicionalmente un kit de reactivos RET/PLT, que comprende un primer reactivo que contiene un tampón para mantener constante el pH durante la medición y un segundo reactivo que contiene un primer colorante para la tinción de plaquetas, que se selecciona del grupo que consiste de azul Capri, azul Nilo y azul cresil brillante, y un segundo colorante para la tinción de reticulocitos.
El tampón puede ser el mismo que se ha descrito anteriormente.
El primer reactivo y el segundo reactivo en el kit de reactivos RET/PLT se pueden preparar disolviendo el tampón y el primer y segundo colorantes en disolventes adecuados, respectivamente.
El kit de reactivos RET/PLT puede comprender adicionalmente aniones multivalentes, un agente de compensación de la presión osmótica, un promotor de la tinción, un conservante, etc., que pueden estar contenidos arbitrariamente en el reactivo RET/PLT. Estos reactivos pueden estar contenidos en el primer, segundo o tercer reactivos o pueden estar contenidos en otros reactivos en el kit.
Mediante la mezcla de los respectivos reactivos en el kit de reactivos RET/PLT con una muestra, se puede preparar una muestra de medición. El orden de mezcla de los respectivos reactivos en el reactivo PET/PLT con una muestra no está particularmente limitado. La razón de mezcla (razón en volumen) se establece preferiblemente de tal manera que el total de los respectivos reactivos en el kit de reactivos : muestra = 100 : 1 a 1000 : 1.
El método para preparar una muestra de medición utilizando el kit de reactivo RET/PLT, el método para medir la luz dispersada y la fluorescencia de la muestra de medición y el método para la detección de reticulocitos y plaquetas basándose en la luz dispersada y la fluorescencia pueden ser los mismos que en el reactivo RET/PLT descrito anteriormente.
La presente invención también se refiere a un método para el análisis de plaquetas, que comprende las etapas de: preparar una muestra de medición mezclando una muestra y un colorante para la tinción de plaquetas, que se selecciona del grupo que consiste de azul Capri, azul Nilo y azul cresil brillante a una concentración específica como se mencionó anteriormente; medir la luz dispersada y la fluorescencia emitida a partir de células en la muestra de medición irradiando las células con luz; y detectar las plaquetas basándose en la luz dispersada y la fluorescencia medidas. Específicamente, el reactivo PLT descrito anteriormente se puede mezclar con una muestra para preparar una muestra de medición. A continuación, la muestra de medición resultante se analiza con un analizador de sangre conocido equipado con una fuente de luz (por ejemplo, un citómetro de flujo), con lo cual se pueden obtener la intensidad de dispersión de luz y la intensidad de fluorescencia de la muestra de medición. Utilizando el soporte lógico de análisis adecuado, las plaquetas pueden, en función de la intensidad de dispersión de luz y la intensidad de fluorescencia, ser discriminadas de otras células y contaminantes de la sangre tales como partículas lipídicas, clasificando de ese modo las plaquetas. Además, las plaquetas clasificadas se pueden contar con soporte lógico de análisis adecuado. La intensidad de dispersión de luz incluye intensidad de dispersión de luz frontal e intensidad de dispersión de luz lateral.
Adicionalmente, la presente invención se refiere a un método para el análisis de reticulocitos y plaquetas, que comprende las etapas de: preparar una muestra de medición mezclando una muestra, un primer colorante de tinción de plaquetas, que se ha mencionado anteriormente, y un segundo colorante para medir reticulocitos; medir la luz dispersada y la fluorescencia emitida a partir de las células en la muestra de medición mediante irradiación de las células con luz; y detectar reticulocitos y plaquetas basándose en la luz dispersada y la fluorescencia medida. Específicamente, el reactivo RET/PLT como se ha descrito anteriormente se puede mezclar con una muestra para preparar una muestra de medición. A continuación, la muestra de medición resultante se analiza con un analizador de sangre conocido equipado con una fuente de luz (por ejemplo, un citómetro de flujo), con lo cual se puede obtener la intensidad de dispersión de luz y la intensidad de fluorescencia de la muestra de medición. Utilizando el soporte lógico de análisis adecuado, los reticulocitos y las plaquetas pueden, basándose en la intensidad de dispersión de luz y la intensidad de fluorescencia, ser discriminados de otras células y contaminantes de la sangre tales como partículas lipídicas, clasificando de ese modo las plaquetas los reticulocitos y las plaquetas respectivamente. Adicionalmente, los reticulocitos y las plaquetas clasificados pueden ser contados con soporte lógico de análisis adecuado. La intensidad de dispersión de luz incluye intensidad de dispersión de luz frontal e intensidad de dispersión de luz lateral.
Ejemplos
De aquí en adelante, la presente invención se describe con más detalle por referencia a los Ejemplos, pero no se pretende que estos ejemplos limiten el alcance de la invención.
Ejemplos 1 a 3 y Ejemplos Comparativos 1 a 12
(Reactivo)
Se produjo un reactivo para el análisis de plaquetas que tenía la siguiente composición.
- (1) Disolución de colorante
- Colorante para la tinción de plaquetas
- Concentración se muestra más abajo
- Etilenglicol
- 1L
- (2) Diluyente
- Tricina (tampón)
- 1,8 g
- Dihidrato de citrato trisódico (anión multivalente)
- 29 g
- Cloruro de lauriltrimetilamonio (LTAC)
- 0,15 g
- Agua purificada
- 1L
(ajustado a pH 9,0 y una presión osmótica de 200 mOsm/kg·H2O)
Como colorante para la tinción de plaquetas, se utilizó cada uno de los colorantes mostrados a continuación a la concentración mostrada a continuación. La concentración final del colorante después de mezclar el reactivo con una muestra se muestra en paréntesis. Las fórmulas químicas de estos colorantes se muestran en la Fig. 1.
Ejemplos:
- 1.
- Azul capri GON (Croma) 20,5 ppm (0,4 ppm)
- 2.
- Cloruro de azul Nilo
- (Tokio Industria Química Co. , Ltd. ) 20,5 ppm (0,4 ppm)
- 3.
- Azul cresil brillante ALD (Sigma) 51,25 ppm (1 ppm)
Ejemplos comparativos:
- 1.
- Azure A (Sigma) 102,5 ppm (2 ppm)
- 2.
- Azure D (Sigma) 102,5 ppm (2 ppm)
- 3.
- Azure C (Sigma) 102,5 ppm (2 ppm)
- 4.
- Azul de metileno NNX (Sigma) 102,5 ppm (2 ppm)
- 5.
- Acetato de cresil-violeta (Sigma) 1025 ppm (20 ppm)
- 6.
- Verde Básico 5
- (Tokio Industria Química Co. , Ltd. ) 1025 ppm (20 ppm)
- 7.
- Azul de metileno (Sigma) 102,5 ppm (2 ppm)
- 8.
- Nuevo azul de metileno (Croma) 1025 ppm (20 ppm)
- 9.
- Azul de toluidina
- (Tokio Industria Química Co. , Ltd. ) 102,5 ppm (2 ppm)
- 10.
- Oxazina 750 (Nacalai Tesque, Inc) 102,5 ppm (2 ppm)
- 11.
- Oxazina 1 (excitón) 1025 ppm (20 ppm)
- 12.
- Oxazina 4 (excitón) 1025 ppm (20 ppm)
(Método) 15 Se pipeteó 1 mL del diluyente a un tubo y se calentó en un baño de agua a 40°C.
Se añadieron 20 µl de la disolución de colorante y 5 µl de sangre completa como una muestra de un ser humano sano al diluyente y después se incubó a 40°C durante 25 segundos para preparar una muestra de medición. 20 Después de eso, la muestra de medición se introdujo en una parte de detección que tenía una fuente de luz de excitación a 633 nm en un citómetro de flujo. En la parte de detección, las células de la muestra de medición se irradiaron con luz de excitación, y se detectaron una señal de de dispersión de la luz y una señal fluorescencia
emitidas por las células. Se analizaron las señales obtenidas para medir plaquetas en la muestra de medición.
(Resultados)
Los diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando las disoluciones de colorantes respectivas descritas anteriormente se muestran en las Figs. 1A, 1B y 1C. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de la luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. En diagrama de dispersión (2) es el mismo que el del diagrama de dispersión (1), excepto que el eje de ordenadas se ha convertido en log. En el diagrama de dispersión (2), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua.
Como se puede observar a partir del resultado en las Figs. 1A a C, azul Capri, Nilo azul o azul cresil brillante pueden distinguir las plaquetas más claramente con una mayor intensidad de la fluorescencia de otras células de la sangre que por los otros colorantes. Cuando una muestra está contaminada con contaminantes tales como partículas lipídicas, aparece un grupo de contaminaciones en una posición de baja intensidad de fluorescencia en el diagrama de dispersión. Por consiguiente, se puede observar que cuando se utilizan azul Capri, azul Nilo o azul cresil brillante como colorante para la tinción de plaquetas, las plaquetas se pueden distinguir de los contaminantes.
Ejemplo 4
Examen de una concentración adecuada de azul Capri en el reactivo para el análisis de plaquetas
En este ejemplo, las plaquetas se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que estaba contenida azul Capri GON como colorante para la tinción de las plaquetas de la disolución de colorante en el Ejemplo 1, y también que estaba contenido azul Capri GON en la disolución de colorante de manera que la concentración final de azul Capri GON pasó a ser de 0,1 a 5,0 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. Como muestra, se utilizaron respectivamente sangre completa de un sujeto sano, sangre que contenía glóbulos rojos fragmentados, y sangre que contenía lípidos.
(Resultados)
Los diagramas de dispersión resultantes se muestran en la Fig. 2. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de la luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. El diagrama de dispersión (2) es el mismo que el del diagrama de dispersión (1), excepto que el eje de ordenadas se ha convertido en log. El diagrama de dispersión (3) es una ampliación de un área que incluye y alrededor de la región en la que las plaquetas aparecen en el diagrama de dispersión (2). En el diagrama de dispersión (3), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua. A partir de este resultado, se encontró que cuando la concentración de azul Capri GON es de 0,1 a 5,0 ppm, de plaquetas se pueden distinguir claramente de los contaminantes, incluso si se producen lípidos como contaminante. También se encontró que cuando la concentración de azul Capri GON es de 0,1 a 2,0 ppm, las plaquetas se pueden distinguir claramente de los contaminantes, incluso si se producen glóbulos rojos fragmentados como contaminante.
Ejemplo 5
Examen de una concentración adecuada de azul Nilo en el reactivo para el análisis de plaquetas
En este ejemplo, las plaquetas se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que el cloruro de azul Nilo estaba contenido como colorante para la tinción de plaquetas en la disolución de colorante en el Ejemplo 2, y también que el cloruro de azul Nilo estaba contenido en la disolución de colorante de tal manera que la concentración final de cloruro de azul Nilo pasó a ser de 0,05 a 5 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. Como muestra, se utilizaron sangre completa de un sujeto sano, sangre que contenía una mayor cantidad de glóbulos rojos fragmentados, y sangre que contenía lípidos respectivamente.
(Resultados)
Los diagramas de dispersión resultantes se muestran en las Figs. 3A y 3B. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. El diagrama de dispersión (2) es el mismo que el diagrama de dispersión 1, excepto que el eje de ordenadas se ha convertido en log. El diagrama de dispersión (3) es una ampliación de un área que incluye y alrededor de la región en la que las plaquetas aparecen en el diagrama de dispersión (2). En el diagrama de dispersión (3), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua. A partir de este resultado, se encontró que cuando la concentración de cloruro de azul Nilo es de 0,05 a 5,0 ppm, las plaquetas pueden distinguirse claramente de los contaminantes, incluso si se producen lípidos como contaminante. También se encontró que cuando la concentración de cloruro de azul Nilo es de 0,05 a 2,0 ppm, las plaquetas pueden distinguirse claramente de los
contaminantes, incluso si se producen glóbulos rojos fragmentados como contaminante. Ejemplo 6
Examen de una concentración adecuada de azul cresil brillante en el reactivo para el análisis de plaquetas
En este ejemplo, las plaquetas se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 3, excepto que el azul cresil brillante ALD estaba contenido como colorante para la tinción de plaquetas en la disolución de colorante en el Ejemplo 3, y también que azul cresil brillante ALD estaba contenido en la disolución de colorante de tal manera que la concentración final de azul cresil brillante ALD pasó a ser de 0,1 a 10 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. Como muestra, se utilizaron sangre completa de un sujeto sano, sangre que contenía glóbulos rojos fragmentados, y sangre que contenía lípidos respectivamente.
(Resultados)
Los diagramas de dispersión resultantes se muestran en las Figs. 4A y 4B. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. El diagrama de dispersión (2) es el mismo que el del diagrama de dispersión (1), excepto que el eje de ordenadas se ha convertido en log. El diagrama de dispersión (3) es una ampliación de un área que incluye y alrededor de la región en la que las plaquetas aparecen en el diagrama de dispersión (2). En el diagrama de dispersión (3), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua. A partir de este resultado, se encontró que cuando la concentración de azul cresil brillante ALD es 0,1 a 10,0 ppm, las plaquetas se pueden distinguir claramente de los contaminantes, incluso si se producen lípidos como contaminante. También se encontró que cuando la concentración de azul cresil brillante ALD es de 0,2 a 2,0 ppm, las plaquetas pueden distinguirse claramente de los contaminantes, incluso si se producen glóbulos rojos fragmentados como contaminante.
Ejemplo 7
Comparación entre el método de medición de la invención y un método convencional (método de inmunotinción)
En este ejemplo se examinó la correlación entre el método de medición de la invención y un método convencional utilizando inmunotinción.
(Medición de plaquetas mediante inmunotinción)
El número de plaquetas se midió de acuerdo con un método estándar recomendado por el International Committee for Standardization of Hematology (ICSH), como método convencional descrito en American Journal of Clinical Pathologists (2001):115, págs. 460-464. Este método se basa en la inmunotinción con un anticuerpo específico para un antígeno de superficie de las plaquetas. Es decir, se pipetearon 5 µl de anticuerpo anti-CD41a humano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (fabricado por Becton Dickinson), 5 l de FITC marcado con anticuerpo anti-CD61 humano (fabricado por Becton Dickinson) y 100 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2 a 7,4, fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en un tubo. Se añadieron a esto 5 µl de una muestra (sangre) y se agitó suavemente. La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad. Se añadieron 4,85 mL de PBS a la mezcla. La mezcla resultante se midió con FACS Canto (fabricado por Becton Dickinson) para proporcionar un resultado de medición de las plaquetas "a" y un resultado de medición de glóbulos rojos "b". La muestra (sangre) que se utiliza en la presente memoria se midió con un contador de células de la sangre automático XE-2100 (fabricado por Sysmex Corporation) para determinar el número de glóbulos rojos "c", y finalmente, se utilizó la siguiente ecuación para calcular el número de plaquetas mediante el método convencional. Número de plaquetas = Número de glóbulos rojos "c" x (resultado de la medición de las plaquetas "a"/resultado de la medición de los glóbulos rojos "b")
(Método de medición de la invención)
El azul Capri GON estaba contenido como colorante para la tinción de plaquetas en la disolución de colorante en el Ejemplo 1. El azul Capri GON estaba contenido en la disolución de colorante de manera que cuando el reactivo se mezcló con una muestra, la concentración final de azul Capri GON pasó a ser de 1,2 ppm. El cloruro de azul Nilo estaba contenido como colorante para teñir de plaquetas en la disolución de colorante en el Ejemplo 2. El cloruro de azul Nilo estaba contenido en la disolución de colorante de manera que cuando el reactivo se mezcló con una muestra, la concentración final de cloruro de azul Nilo pasó a ser de 0,5 ppm. De la misma manera que en los Ejemplos 1 y 2 a excepción de lo anterior, se detectaron las plaquetas y se calculó el número de plaquetas. Como muestra, se utilizó la misma sangre que se utilizó en la inmunotinción.
(Resultados)
Los gráficos en donde el número de plaquetas según se determina por medio del método de medición de la
invención se representa en función del número de plaquetas según se determina por medio del método de inmunotinción se muestra en las Figs. 5A y 5B. La Fig. 5A muestra el resultado del método de la invención utilizando azul Capri GON. La Fig. 5B muestra el resultado del método de la invención utilizando cloruro de azul Nilo.
5 Como se puede observar en la Fig. 5A y 5B, los resultados obtenidos por medio del método de la invención, en comparación con los resultados obtenidos por medio del método convencional utilizando la inmunotinción, muestran una excelente correlación con menos dispersión.
Ejemplo 8
10 En este ejemplo, el reactivo para el análisis de reticulocitos y plaquetas, que comprende un primer colorante para la tinción de las plaquetas y un segundo colorante de tinción de reticulocitos, se preparó para medir reticulocitos y plaquetas.
15 (Reactivo)
La composición del reactivo es la siguiente:
- Disolución de colorante
- Primer colorante
- Concentración mostrada a continuación
- Segundo colorante
- Concentración mostrada a continuación
- Diluyente
- Tricina (tampón)
- 1,8 g
- Dihidrato de citrato trisódico (anión multivalente)
- 29 g
- Cloruro de lauriltrimetilamonio (LTAC)
- 0,15 g
- Agua purificada
- 1L
(ajustado a pH 9,0 y una presión osmótica de 200 mOsm/kg · H2O)
20 Como segundo colorante para la tinción de reticulocitos, se utilizó un colorante mostrado en la siguiente fórmula. El segundo colorante estaba contenido en la disolución de colorante de tal manera que cuando el reactivo se mezcló con una muestra, la concentración final del segundo colorante pasó a ser de 0,5 ppm, 6 ppm o 10 ppm.
25 Como primer colorante para teñir de plaquetas, se utilizó azul Capri GON, cloruro de azul Nilo o cresil brillante ALD. El primer colorante estaba contenido en la disolución de colorante de manera que cuando el reactivo se mezcló con una muestra, la concentración final del colorante pasó a ser de 1 ppm para azul Capri GON, 0,5 ppm para el cloruro de azul Nilo, o 1,5 ppm para el azul cresil brillante ALD.
30 Como muestra, se utilizaron respectivamente sangre completa de un humano sano, sangre que contenía glóbulos rojos fragmentados, y sangre que contenía lípidos. La medición se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 1.
35 (Resultados)
Los diagramas de dispersión resultantes se muestran en las Figs. 6A, 6B y 6C. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. El diagrama de dispersión (2) es el mismo que el del diagrama de dispersión (1), excepto que el eje de
40 ordenadas se ha convertido en log. El diagrama de dispersión (3) es una ampliación de un área que incluye y alrededor de la región en la que las plaquetas aparecen en el diagrama de dispersión (2). En el diagrama de dispersión (1), la región en la que aparecen los reticulocitos se muestra en la línea continua. En el diagrama de dispersión (3), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua.
Para la comparación, los diagramas de dispersión en los que el primer colorante para la tinción de plaquetas no se añadió a la disolución de colorante también se muestran en las Figs. 6A, 6B y 6C.
A partir de los resultados de las Figs. 6A a 6C, se puede observar que cuando la concentración del segundo colorante se encuentra en el intervalo de 0,5 a 10 ppm, las plaquetas y los reticulocitos se pueden distinguir más claramente incluso en presencia de glóbulos rojos fragmentados y de lípidos mediante el reactivo al que se añadió el primer colorante que por el reactivo al que no se añadió el primer colorante.
Ejemplo 9
En este ejemplo, el segundo colorante para tinción de reticulocitos utilizado en el Ejemplo 8 estaba contenido en la disolución de colorante en el Ejemplo 8. El segundo colorante estaba contenido en la disolución de colorante de manera que la concentración final del segundo colorante pasó a ser de 0,5 ppm, 6 ppm o 10 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. El azul Capri GON estaba contenido como primer colorante para la tinción de plaquetas en esta disolución de colorante. El azul Capri GON estaba contenido en la disolución de colorante de tal manera que la concentración final de azul Capri GON pasó a ser de 0,5 ppm, 1 ppm o 2 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. La muestra utilizada fue la misma que en el Ejemplo 8. La medición se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 8.
(Resultados)
Los diagramas de dispersión resultantes se muestran en las Figs. 7A, 7B y 7C. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. El diagrama de dispersión (2) es el mismo que el del diagrama de dispersión (1), excepto que el eje de ordenadas se ha convertido en log. El diagrama de dispersión (3) es una ampliación de un área que incluye y alrededor de la región en la que las plaquetas aparecen en el diagrama de dispersión (2). En el diagrama de dispersión (1), la región en la que aparecen los reticulocitos se muestra en la línea continua. En el diagrama de dispersión (3), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua. A partir de este resultado, se encontró que cuando la concentración del segundo colorante es de 0,5 ppm a 10 ppm y el azul Capri GON es de 0,5 a 2,0 ppm, los reticulocitos y plaquetas pueden distinguirse claramente de los contaminantes, incluso si se producen lípidos y glóbulos rojos fragmentados como contaminantes.
Ejemplo 10
En este ejemplo, el segundo colorante para tinción de reticulocitos utilizado en el Ejemplo 8 estaba contenido en la disolución de colorante en el Ejemplo 8. El segundo colorante estaba contenido en la disolución de colorante de manera que la concentración final del segundo colorante pasó a ser de 0,5 ppm, 6 ppm o 10 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. El cloruro de azul Nilo también estaba contenido como primer colorante para teñir las plaquetas en esta disolución de colorante. El cloruro de azul Nilo estaba contenido en la disolución de colorante de tal manera que la concentración final de cloruro de azul Nilo pasó a ser de 0,1 ppm, 0,5 ppm o 2 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. La muestra utilizada fue la misma que en el Ejemplo 8. La medición se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 8.
(Resultados)
Los diagramas de dispersión resultantes se muestran en las Figs. 8A, 8B y 8C. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. El diagrama de dispersión (2) es el mismo que el del diagrama de dispersión (1), excepto que el eje de ordenadas se ha convertido en log. El diagrama de dispersión (3) es una ampliación de un área que incluye y alrededor de la región en la que las plaquetas aparecen en el diagrama de dispersión (2). En el diagrama de dispersión (19, la región en la que aparecen los reticulocitos se muestra en la línea continua. En el diagrama de dispersión (3), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua. A partir de este resultado, se encontró que cuando la concentración del segundo colorante es de 0,5 ppm a 10 ppm y el cloruro de azul Nilo es de 0,5 a 2,0 ppm, los reticulocitos y las plaquetas pueden distinguirse claramente de los contaminantes, incluso si se producen lípidos y glóbulos rojos fragmentados como contaminantes.
Ejemplo 11
En este ejemplo, el segundo colorante para la tinción de reticulocitos utilizado en el Ejemplo 8 estaba contenido en la disolución de colorante en el Ejemplo 8. El segundo colorante estaba contenido en la disolución de colorante de manera que la concentración final del segundo colorante pasó a ser de 0,5 ppm, 6 ppm o 10 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. El azul cresil brillante ALD también estaba contenido como primer colorante para la tinción de plaquetas en esta disolución de colorante. El azul cresil brillante ALD estaba contenido en la disolución de
colorante de tal manera que la concentración final de azul cresil brillante ALD pasó a ser de 1 ppm, 1,5 ppm o 2 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. La muestra utilizada fue la misma que en el Ejemplo 8. La medición se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 8.
5 (Resultados)
Los diagramas de dispersión resultantes se muestran en las Figs. 9A, 9B y 9C. En estos diagramas de dispersión, "BCB" se refiere a azul cresil brillante ALD. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. El diagrama de dispersión (2) 10 es el mismo que el del diagrama de dispersión (1), excepto que el eje de ordenadas se ha convertido en log. El diagrama de dispersión (3) es una ampliación de un área que incluye y alrededor de la región en la que las plaquetas aparecen en el diagrama de dispersión (2). En el diagrama de dispersión (1), la región en la que aparecen los reticulocitos se muestra en la línea continua. En el diagrama de dispersión (3), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua. A partir de este resultado, se encontró que cuando la concentración del
15 segundo colorante es de 0,5 ppm a 10 ppm y el azul cresil brillante ALD es de 1,0 a 2,0 ppm, los reticulocitos y las plaquetas pueden distinguirse claramente de los contaminantes, incluso si se producen lípidos y glóbulos rojos fragmentados como contaminantes.
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1. Un método para el análisis de plaquetas mediante la discriminación de las plaquetas de los glóbulos rojos fragmentados, que comprende las etapas de:5 preparar una muestra de medición mezclando una muestra y un colorante para la tinción de plaquetas, seleccionándose el colorante del grupo que consiste en azul Capri de fórmula (1), azul Nilo de fórmula (2) y azul cresil brillante de fórmula (3); medir la luz dispersada y la fluorescencia emitida a partir de células en la muestra de medición mediante irradiación de las células con luz; y10 detectar las plaquetas basándose en la luz dispersada y la fluorescencia,15 en donde la concentración del azul Capri en la muestra de medición es de 0,1 a 2,0 ppm;la concentración del azul Nilo en la muestra de medición es de 0,05 a 2,0 ppm; y la concentración del azul cresil brillante en la muestra de medición es de 0,5 a 5,0 ppm.
- 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa de preparación comprende mezclar el primer5 colorante para la tinción de plaquetas, la muestra y un segundo colorante para tinción de reticulocitos para preparar la muestra de medición, y la etapa de detección comprende la detección de plaquetas y reticulocitos en base a la luz dispersada medida y a la fluorescencia medida.
- 3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la muestra de medición se introduce en una celda de10 flujo de un citómetro de flujo, y las células de la muestra de medición que fluyen en la celda de flujo se irradian con luz.
- 4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente una etapa derecuento de las plaquetas detectadas. 15
- 5. El método de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende adicionalmente una etapa de recuento de las plaquetas detectadas y una etapa de recuento de reticulocitos detectados.
- 6. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el segundo colorante es un colorante de cianina capaz de 20 teñir un ácido nucleico.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006294504A JP4806330B2 (ja) | 2006-10-30 | 2006-10-30 | 網状赤血球及び血小板測定用試薬、網状赤血球及び血小板測定用試薬キット並びに網状赤血球及び血小板測定方法 |
| JP2006294504 | 2006-10-30 | ||
| JP2006294525A JP4794414B2 (ja) | 2006-10-30 | 2006-10-30 | 血小板測定用試薬、血小板測定用試薬キット並びに血小板測定方法 |
| JP2006294525 | 2006-10-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2535004T3 true ES2535004T3 (es) | 2015-05-04 |
Family
ID=38941806
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES07021079.4T Active ES2535004T3 (es) | 2006-10-30 | 2007-10-29 | Método de análisis de plaquetas |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20080102526A1 (es) |
| EP (1) | EP1918709B1 (es) |
| ES (1) | ES2535004T3 (es) |
| PL (1) | PL1918709T3 (es) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080102526A1 (en) | 2006-10-30 | 2008-05-01 | Sysmex Corporation | Reagent, reagent kit and analyzing method |
| KR101151592B1 (ko) * | 2008-02-18 | 2012-05-31 | 시스멕스 가부시키가이샤 | 혈소판 측정용 시약, 혈소판 측정용 시약 키트 및 혈소판 측정 방법 |
| JP5670052B2 (ja) * | 2009-03-26 | 2015-02-18 | シスメックス株式会社 | 血液分析装置、血液分析方法及びコンピュータプログラム |
| CN110243651B (zh) * | 2018-03-07 | 2023-06-30 | 深圳市帝迈生物技术有限公司 | 一种网织红细胞检测试剂盒及其应用 |
| CN117825345A (zh) * | 2018-04-28 | 2024-04-05 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 一种血液分析仪及分析方法 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3884579A (en) * | 1973-06-14 | 1975-05-20 | Cambridge Chemical Products In | Method for counting blood platelets |
| DE2515869C3 (de) * | 1975-04-11 | 1979-11-08 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von vorbeschichteten Objektträgern |
| US4336029A (en) * | 1980-08-15 | 1982-06-22 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Method and reagents for quantitative determination of reticulocytes and platelets in whole blood |
| US4882284A (en) * | 1987-04-13 | 1989-11-21 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Method for quantitating and differentiating white blood cells |
| JP2549665B2 (ja) * | 1987-07-31 | 1996-10-30 | 東亜医用電子株式会社 | フロ−サイトメトリ用網状赤血球測定試薬 |
| US5691204A (en) * | 1995-04-21 | 1997-11-25 | Abbott Laboratories | Compositions and methods for the rapid analysis of reticulocytes |
| TW379284B (en) * | 1996-04-12 | 2000-01-11 | Toa Medical Electronics | Agent for detecting reticulocyte |
| US6114173A (en) * | 1997-04-03 | 2000-09-05 | Bayer Corporation | Fully automated method and reagent composition therefor for rapid identification and characterization of reticulocytes erythrocytes and platelets in whole blood |
| EP1036129A4 (en) * | 1997-11-07 | 2000-12-27 | Omd Devices Llc | FLUORESCENCE COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF OPTICAL STORAGE DISKS |
| US6835431B1 (en) * | 1997-11-07 | 2004-12-28 | D Data Inc. | Fluorescent composition for the manufacture of CD-ROM type optical memory disks |
| JP3837006B2 (ja) | 2000-03-22 | 2006-10-25 | シスメックス株式会社 | 細菌の染色方法及び検出方法 |
| DE10027236A1 (de) * | 2000-05-31 | 2001-12-06 | Wack O K Chemie Gmbh | Verfahren und Testflüssigkeit zum Nachweisen von sauren Flußmittelrückständen an elektronischen Baugruppen |
| US6689391B2 (en) * | 2001-03-30 | 2004-02-10 | Council Of Scientific & Industrial Research | Natural non-polar fluorescent dye from a non-bioluminescent marine invertebrate, compositions containing the said dye and its uses |
| AU2002366209A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-06-10 | Visco Dye Aps | Visco dye |
| JP4212827B2 (ja) | 2002-05-16 | 2009-01-21 | シスメックス株式会社 | 骨髄液有核細胞自動分析方法 |
| US20080102526A1 (en) | 2006-10-30 | 2008-05-01 | Sysmex Corporation | Reagent, reagent kit and analyzing method |
-
2007
- 2007-10-24 US US11/923,259 patent/US20080102526A1/en not_active Abandoned
- 2007-10-29 EP EP07021079.4A patent/EP1918709B1/en active Active
- 2007-10-29 PL PL07021079T patent/PL1918709T3/pl unknown
- 2007-10-29 ES ES07021079.4T patent/ES2535004T3/es active Active
-
2010
- 2010-04-02 US US12/753,565 patent/US8293536B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-08-21 US US13/590,843 patent/US8597952B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8597952B2 (en) | 2013-12-03 |
| US8293536B2 (en) | 2012-10-23 |
| EP1918709A1 (en) | 2008-05-07 |
| US20100255591A1 (en) | 2010-10-07 |
| US20080102526A1 (en) | 2008-05-01 |
| PL1918709T3 (pl) | 2015-08-31 |
| US20120315667A1 (en) | 2012-12-13 |
| EP1918709B1 (en) | 2015-04-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2160962C (en) | Reagent for analyzing solid components in urine and method for analyzing solid components by employing the same | |
| JP3886271B2 (ja) | 赤芽球の分類計数用試薬及び分類計数方法 | |
| AU712405B2 (en) | A reagent for measuring reticulocytes and a method of measuring them | |
| US8367358B2 (en) | Reagent, kit and method for differentiating and counting leukocytes | |
| EP0882983B1 (en) | Reagent and method for classification and counting of leukocytes | |
| EP0767382B1 (en) | Fluorescent compounds and their use for measuring reticulocytes | |
| ES2535004T3 (es) | Método de análisis de plaquetas | |
| ES2490865T3 (es) | Kit de reactivos para análisis de muestras y método de análisis de muestras | |
| JP4806330B2 (ja) | 網状赤血球及び血小板測定用試薬、網状赤血球及び血小板測定用試薬キット並びに網状赤血球及び血小板測定方法 | |
| CN103424540A (zh) | 一种白细胞分类试剂盒及其分类方法 | |
| JPWO2010013678A1 (ja) | 子宮頸部異常細胞検出用試薬及びそれを用いる子宮頸部異常細胞検出方法 | |
| KR101151592B1 (ko) | 혈소판 측정용 시약, 혈소판 측정용 시약 키트 및 혈소판 측정 방법 | |
| JPH08170960A (ja) | 尿中有形成分分析用試薬及びその試薬を用いた有形成分分析方法 | |
| CN101344472A (zh) | 网织红细胞检测试剂和检测方法 | |
| JP4794414B2 (ja) | 血小板測定用試薬、血小板測定用試薬キット並びに血小板測定方法 | |
| JP2006208401A (ja) | 赤芽球の分類計数方法 | |
| JP3553691B2 (ja) | 網状赤血球測定用試薬及び測定方法 | |
| JP3485436B2 (ja) | 網状赤血球測定用試薬及び測定方法 | |
| JP4107441B2 (ja) | 赤芽球の分類計数用試薬 | |
| RU2445628C1 (ru) | Реактив для измерения тромбоцитов, набор реактивов для измерения тромбоцитов и способ измерения тромбоцитов | |
| BR112016019807B1 (pt) | Método de análise de amostra de urina |