ES2535004T3

ES2535004T3 - Método de análisis de plaquetas

Info

Publication number: ES2535004T3
Application number: ES07021079.4T
Authority: ES
Inventors: Yusuke Mori; Hiroki Takeshita
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2006-10-30
Filing date: 2007-10-29
Publication date: 2015-05-04
Anticipated expiration: 2027-10-29
Also published as: US20080102526A1; US20120315667A1; EP1918709A1; US8293536B2; US8597952B2; US20100255591A1; PL1918709T3; EP1918709B1

Abstract

Un método para el análisis de plaquetas mediante la discriminación de las plaquetas de los glóbulos rojos fragmentados, que comprende las etapas de: preparar una muestra de medición mezclando una muestra y un colorante para la tinción de plaquetas, seleccionándose el colorante del grupo que consiste en azul Capri de fórmula (1), azul Nilo de fórmula (2) y azul cresil brillante de fórmula (3); medir la luz dispersada y la fluorescencia emitida a partir de células en la muestra de medición mediante irradiación de las células con luz; y detectar las plaquetas basándose en la luz dispersada y la fluorescencia,**Fórmula** en donde la concentración del azul Capri en la muestra de medición es de 0,1 a 2,0 ppm; la concentración del azul Nilo en la muestra de medición es de 0,05 a 2,0 ppm; y la concentración del azul cresil brillante en la muestra de medición es de 0,5 a 5,0 ppm.

Description

Método de análisis de plaquetas

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para el análisis de plaquetas. La presente invención también se refiere a un método para el análisis de plaquetas y reticulocitos.

2. Descripción de la técnica relacionada

La sangre humana contiene varias células de la sangre tales como glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas. Entre éstas, las plaquetas son células anucleadas de 2 a 3 µl de diámetro. En la sangre humana normal, hay de

150.000 a 350.000 plaquetas por microlitro.

Sin embargo, se sabe que el número de plaquetas en la sangre se reduce después de la afectación por trombocitopenia tal como púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) o con leucemia aguda. Por lo general, se considera que la transfusión de sangre es necesaria cuando el número de plaquetas en sangre es menor de 10.000 por µl. En consecuencia, la medición rápida y precisa del número de plaquetas es importante en el campo clínico.

Uno de los métodos conocidos de medición de plaquetas es un método de utilización de la resistencia eléctrica. Este método es un método que consiste en medir un pulso de impedancia eléctrica al pasar una muestra que contiene plaquetas entre 2 electrodos y analizarla en un histograma. En el método de utilización de la resistencia eléctrica, sin embargo, existe el problema de que no se puede lograr suficiente precisión de la medición dependiendo de una muestra.

En consecuencia, se conoce un método para medir el número de plaquetas mediante el uso de un anticuerpo específico marcado para el antígeno de superficie de las plaquetas (véase American Journal of Clinical Patologists (2001):115, págs. 460-464). Se sabe que el método descrito en esta publicación es un método altamente sensible, pero que el método generalmente requiere mucho tiempo hasta que se obtienen resultados debido a se utiliza en la medición una reacción antígeno-anticuerpo. En consecuencia, este método no es adecuado como método de medición de las plaquetas en el campo clínico que requiere, por ejemplo, el criterio urgente de si se requiere transfusión de sangre o no.

Los reticulocitos también se encuentran en la sangre. Los reticulocitos son glóbulos rojos jóvenes inmediatamente después de la liberación de células eritroblásticas enucleadas en la médula ósea a la sangre periférica. Los reticulocitos se caracterizan porque en el procedimiento de maduración de las células, están contenidos en forma de trazas en sus células una pequeña cantidad de ARN y orgánulos tales como mitocondrias y ribosomas, que no están contenidos en los glóbulos rojos maduros.

En el campo del examen clínico, la clasificación y el recuento de reticulocitos es muy importante para entender la hematopoyesis en la médula ósea en un paciente. En un sujeto saludable con mielopoyesis normal, reticulocitos representan de 0,5 a 3,0% de todos los glóbulos rojos de la sangre. Por otro lado, el número de reticulocitos se reduce en un estado anormal de mielopoyesis (por ejemplo, en un estado de supresión de mielopoyesis) o aumenta en un estado acelerado de mielopoyesis. En concreto, los reticulocitos disminuyen durante la anemia aplásica y la terapia química para el tumor maligno o aumentan en la anemia hemolítica etc.

Se conoce un método para medir rápidamente las células en la sangre (es decir, células de la sangre tales como glóbulos blancos, reticulocitos y glóbulos rojos) utilizando el principio de la citometría de flujo. En cuanto a tal método de medición, se describen un método de recuento e identificación de reticulocitos, glóbulos rojos y plaquetas en una muestra de sangre completa, así como una composición de reactivo para su uso en el método en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.114.173. En el método, una mezcla de reactivos que contiene un colorante catiónico (en particular, oxazina 750) se mezcla con una muestra que contiene reticulocitos. A continuación, se miden la luz dispersada y la luz absorbida de la mezcla resultante por medio de citometría de flujo. Mediante el uso de la luz dispersada y la luz absorbida como parámetros, se cuentan los reticulocitos y se distinguen de los glóbulos rojos y plaquetas.

La Patente de los Estados Unidos Núm. 4.882.284 describe un método para discriminar los glóbulos blancos de los glóbulos rojos y las plaquetas en la sangre completa no lisada. En el método, un reactivo que contiene un colorante fluorescente que absorbe luz roja se pone en contacto con sangre completa no lisada. Se describe allí que un colorante de oxazina utilizado como colorante fluorescente que absorbe luz roja tiñe glóbulos blancos, y por lo tanto los glóbulos blancos se pueden distinguir de los glóbulos rojos y las plaquetas mediante medición utilizando

citometría de flujo.

La Patente de los Estados Unidos Núm. 5.891.731describe un reactivo para la medición de reticulocitos, que comprende al menos un colorante que tiñe específicamente reticulocitos y un colorante que tiñe específicamente a 5 los glóbulos blancos. Esta patente también describe que un colorante con una base de oxazina puede teñir específicamente glóbulos blancos.

El documento US 4.336.029 describe métodos y composiciones para la cuantificación de reticulocitos y plaquetas mediante fluorescencia en un citómetro de flujo. Se describe una composición que comprende el colorante naranja 10 de acridina.

En la sangre puede aparecer fragmentación de glóbulos rojos, lípidos y similares. En la medición de las plaquetas, los glóbulos rojos, lípidos y similares fragmentados tienen un tamaño similar a las plaquetas y por lo tanto se conocen como contaminantes que incluyen en la medición. La influencia de estos contaminantes es significativa en

15 particular en la medición de una muestra en la que el número de plaquetas es tan bajo que es necesaria la transfusión de sangre. Sin embargo, las publicaciones mencionadas más arriba no describen que las plaquetas se miden con mayor precisión mediante la supresión de la influencia de tales contaminantes.

A partir de lo anterior, existe una demanda de técnicas capaces de medir plaquetas distinguiéndolas más claramente 20 de otras células de la sangre y contaminantes de la sangre, tales como partículas lipídicas.

Compendio de la invención

El alcance de la presente invención está definido únicamente por las reivindicaciones adjuntas, y no se ve afectado 25 en ningún grado por las declaraciones dentro de este compendio.

La presente invención proporciona un método capaz de analizar las plaquetas al discriminarlas más claramente de otras células de la sangre y contaminantes en la sangre, tales como partículas lipídicas en un método de análisis mediante citometría de flujo.

30 La presente invención proporciona un método para el análisis de las plaquetas al discriminar las plaquetas de los glóbulos rojos fragmentados, que comprende las etapas de: preparar una muestra de medición mediante la mezcla de una muestra y un colorante para la tinción de plaquetas, seleccionándose el colorante del grupo que consiste en azul Capri, azul Nilo y azul cresil brillante; medir la luz dispersada y la fluorescencia emitida a partir de células en la

35 muestra de medición irradiando las células con luz; y detectar las plaquetas sobre la base de la luz dispersada y la fluorescencia, en donde la concentración de azul Capri en la muestra de medición es de 0,1 a 2,0 ppm; la concentración del azul de Nilo en la muestra de medición es de 0,05 a 2,0 ppm; y la concentración del azul cresil brillante en la muestra de medición es de 0,5 a 5,0 ppm.

40 Descripción de los dibujos

Las Figs. 1A a C muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando un reactivo que contiene un colorante de oxazina diferente. La Fig. 2 muestra diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo para el

45 análisis de plaquetas con diferentes concentraciones de Capri azul. Las Figs. 3A y B muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo de medición de plaquetas con diferentes concentraciones de azul Nilo. Las Figs. 4A y B muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo para el análisis de plaquetas con diferentes concentraciones de azul cresil brillante.

50 Las Figs. 5A y B muestran gráficos que muestran la correlación entre el número de plaquetas determinado por medio del método en una realización de la invención y el número de plaquetas determinado por medio de un método convencional. Las Figs. 6A a C muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo para el análisis de reticulocitos y plaquetas con diferentes concentraciones de un colorante para tinción de

55 reticulocitos. Las Figs. 7A a C muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo para el análisis de reticulocitos y plaquetas con diferentes concentraciones de un colorante para la tinción de reticulocitos y diferentes concentraciones de un colorante (Capri azul) para la tinción de plaquetas. Las Figs. 8A a C muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo

60 para el análisis de reticulocitos y plaquetas con diferentes concentraciones de un colorante para la tinción de reticulocitos y diferentes concentraciones de un colorante (azul Nilo) para la tinción de plaquetas. Las Figs. 9A a C muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo para el análisis de reticulocitos y plaquetas con diferentes concentraciones de un colorante para la tinción de reticulocitos y diferentes concentraciones de un colorante (azul cresil brillante) para la tinción de

plaquetas.

Descripción de las realizaciones preferidas

5 Para la obtención de un reactivo de medición de plaquetas capaz de medir las plaquetas al discriminarlas más claramente de otras células de la sangre y contaminantes de la sangre, tales como partículas lipídicas en un método de medición usando citometría de flujo, los autores de la presente invención realizaron un extenso estudio con 100 o más colorantes. Como resultado, encontraron que un colorante oxazina específico puede teñir específicamente las plaquetas, y por lo tanto se completó la presente invención. No se sabía que el colorante de oxazina específico que

10 se ha encontrado ahora que es utilizable para la tinción de plaquetas pudiera teñir específicamente plaquetas a un grado tal que las plaquetas se pudieran distinguir de contaminantes tales como las partículas lipídicas. Este colorante de oxazina puede teñir fluorescentemente las plaquetas. Las plaquetas teñidas con este colorante de oxazina pueden emitir fluorescencia fuerte en la medición mediante citometría de flujo. Las plaquetas se pueden distinguir de ese modo de los contaminantes.

15 En esta memoria descriptiva, los "contaminantes" de la sangre se refieren a componentes de la sangre que pueden impedir la medición precisa de las plaquetas. Tales contaminantes incluyen partículas lipídicas, glóbulos rojos fragmentados y similares contenidos en la sangre.

20 El reactivo para el análisis de plaquetas (en lo sucesivo denominado a veces como reactivo PLT) comprende un colorante para la tinción de plaquetas. El colorante es capaz de teñir específicamente plaquetas. El colorante es al menos un colorante de oxazina seleccionado del grupo que consiste en azul Capri, azul Nilo y azul cresil brillante. El colorante es preferiblemente un colorante capaz de teñir plaquetas con el fin de hacer que sean distinguibles de las partículas lipídicas. Al utilizar el reactivo PLT que contiene el colorante, las plaquetas, incluso en una muestra que

25 contiene contaminantes capaces de evitar la detección de las plaquetas, se pueden medir rápidamente con una mayor precisión mediante la prevención de la influencia de tales contaminantes y otras células de la sangre en la sangre.

El azul Capri es el azul GON de fórmula (II): 30

El azul cresil brillante es el azul cresil brillante ALD de fórmula (IV): 5

Los colorantes anteriormente mencionados para la tinción de las plaquetas están disponibles comercialmente. Por ejemplo, el azul Capri GON está disponible de Chroma Gesellshaft Schmid & Co., el azul Nilo de Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. y Sigma-Aldrich, respectivamente, y el azul cresil brillante ALD de Sigma-Aldrich.

Los colorantes mencionados anteriormente pueden teñir las plaquetas hasta tal punto que las plaquetas se pueden distinguir de los glóbulos rojos fragmentados.

También se encontró que un reactivo que contiene un colorante capaz de teñir específicamente reticulocitos y el colorante anteriormente para la tinción de plaquetas se pueden utilizar para distinguir los reticulocitos y las plaquetas más claramente de otras células de la sangre y contaminantes de la sangre. A partir de lo anterior, se pueden mencionar un reactivo para el análisis de reticulocitos y plaquetas (en lo sucesivo denominado a veces como reactivo RET/PLT) que contiene un primer colorante para la tinción de las plaquetas y un segundo colorante para la tinción de reticulocitos.

El colorante anterior para la tinción de plaquetas se puede utilizar como el primer colorante contenido en el reactivo RET/PLT.

El segundo colorante contenido en el reactivo RET/PLT puede ser un colorante capaz de teñir reticulocitos en un grado tal que sea distinguible de otras células o contaminantes de la sangre. El segundo colorante es preferiblemente un colorante de cianina capaz de teñir un ácido nucleico (en lo sucesivo denominado a veces como colorante de cianina que tiñe ácidos nucleicos). El colorante de cianina que tiñe ácidos nucleicos puede ser un colorante conocido convencionalmente. Los ejemplos de tales colorantes pueden incluir los colorantes descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.891.731. Los colorantes descritos en el documento WO 98/26007, los colorantes descritos en el documento WO 01/086264 y los colorantes descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.957.870. Entre estos colorantes son preferibles los representados por la siguiente fórmula (I):

en donde R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1 a C6, o -CH2(CHR5)xOR6; R2 y R3 representan independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo alquilo C1 a C6, un grupo alcoxi C1 a C6, un grupo arilo, o un grupo aralquilo; R4 representa un grupo alquilo C1 a C6, -CH2(CHR7)yOR8, un grupo arilo, o un grupo aralquilo; R5 y R7 representan independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo hidroxialquilo C1 a C3; R6 y R8 representan independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo acilo, o un grupo alquilo C1 a C3; Z representa un átomo de azufre, un átomo de oxígeno, un átomo de selenio, o CR9R10; R9 y R10 representan independientemente un grupo alquilo C1 a C3; n es un número entero de 1 ó 2; X e Y representan independientemente un número entero de 0 a 3; y X-es un anión.

El grupo alquilo C1 a C6 representado por R1 en la fórmula (I) puede ser lineal o ramificado. El grupo alquilo C1 a C6 representado por R1 incluye, por ejemplo, un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo butilo, un grupo isobutilo, grupo sec-butilo, un grupo terc-butilo, un grupo pentilo y un grupo hexilo. Entre estos grupos, es preferible un grupo metilo o etilo.

El grupo representado por cada uno de R2 y R3 en la fórmula (I) puede estar sustituido en cualquiera de las posiciones orto, meta y para. El grupo alquilo C1 a C6 representado por cada uno de R2 y R3 puede incluir los mismos grupos descritos anteriormente. El grupo alcoxi C1 a C6 puede incluir un grupo metoxi, un grupo etoxi, grupo propoxi etc. Entre estos grupos, es preferible un grupo metoxi o etoxi. El grupo arilo representado por cada uno de R2 y R3 puede incluir un grupo fenilo etc. El grupo aralquilo representado por cada uno de R2 y R3 puede incluir un grupo bencilo etc. El grupo representado por cada uno de R2 y R3 en la fórmula (I) es más preferiblemente hidrógeno.

El grupo alquilo C1 a C6, el grupo arilo y el grupo aralquilo representado por R4 en la fórmula (I) pueden incluir los mismos grupos descritos anteriormente.

El grupo hidroxialquilo C1 a C3 representado por cada uno de R5 y R7 puede incluir un grupo hidroximetilo, grupo hidroxietilo y un grupo hidroxipropilo. Entre estos grupos, es preferible un grupo hidroximetilo o hidroxietilo.

El grupo acilo representado por cada uno de R6 y R8 es preferiblemente un grupo acilo derivado de un ácido 5

carboxílico alifático. El grupo acilo incluye un grupo acetilo y un grupo propionilo, entre los cuales es preferible un grupo acetilo. El grupo alquilo C1 a C3 representado por cada uno de R6 y R8 puede incluir los mismos grupos que se han descrito anteriormente.

5 Z en la fórmula (I) anterior es un átomo de azufre, un átomo de oxígeno, un átomo de selenio o CR9R10, entre los que es preferible un átomo de azufre.

El grupo alquilo C1 a C3 representado por cada uno de R9 y R10 puede incluir los mismos grupos que se han descrito anteriormente.

10 El anión representado por X-en la fórmula (I) anterior incluye, por ejemplo, un ion de halógeno, un ion de haluro de boro, un ion de compuesto de fósforo, un ion de oxiácido de halógeno, un ion de fluorosulfato, un ion de sulfato de metilo, y un ion de compuesto de tetrafenilboro que tiene un átomo de halógeno o un grupo haloalquilo como sustituyente en un anillo fenilo. El ion de halógeno incluye un ion de flúor, ion de cloro, ion de bromo e ion de yodo.

15 El ion de haluro de boro incluye BF4-, BCl4-y BBr4-. Entre estos iones, es preferible un ion de bromo o BF4-.

Los ejemplos del colorante de la fórmula (I) se muestran a continuación:

Azul de tiazol

Entre los colorantes representados por la fórmula (I), los colorantes en la que n = 1 se pueden sintetizar por ejemplo, por medio del siguiente método. En primer lugar, se hace reaccionar formamidina N,N-disustituida, con un compuesto representado por la siguiente fórmula (V):

El producto obtenido por la reacción se hace reaccionar con un derivado de quinolina representado por la fórmula

(VI) de más abajo y después se trata con borofluoruro de sodio.

Los colorantes de la fórmula (I) en donde n = 1 se pueden sintetizar de esta manera.

Los colorantes de la fórmula (I) en donde n = 2 se pueden sintetizar mediante la misma reacción que para los 20 colorantes en donde n = 1, excepto que, por ejemplo, se utiliza sal de malondialdehído bis(fenilimina) en lugar de formamidina N,N-disustituida.

Además de los colorantes de cianina que tiñen ácidos nucleicos descritos anteriormente, también se conocen colorantes tales como Nuevo Azul de Metileno y Oxazina 750 como colorantes para reticulocitos y se pueden utilizar 25 como segundo colorante.

El colorante para la tinción de plaquetas está contenido en el reactivo de tal manera que la concentración del colorante, aunque varían dependiendo del tipo de colorante o el tipo de reactivo, pasa a ser de 0,01 a 10 ppm cuando se mezcla con una muestra.

30 Por ejemplo, cuando el colorante para la tinción de plaquetas está contenido en el reactivo PLT, el colorante está contenido en el reactivo PLT de manera que la concentración del colorante, aunque varía dependiendo del tipo de colorante, pasa a ser preferiblemente de 0,01 a 5 ppm, más preferiblemente de 0,05 a 2,0 ppm o menos, cuando se mezcla con una muestra. En particular, cuando se utiliza azul Capri GON como colorante para la tinción de

plaquetas para discriminar las plaquetas de partículas lipídicas, el colorante está contenido en el reactivo PLT de manera que la concentración del colorante, cuando se mezcla con una muestra, para a ser preferiblemente de 0,1 a 5,0 ppm, más preferiblemente de 0,2 a 2,0 ppm. Cuando se utiliza azul Capri GON para discriminar las plaquetas de los glóbulos rojos fragmentados, el colorante está contenido en el reactivo PLT de manera que la concentración del colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser de 0,1 a 2. 0 ppm, preferiblemente de 0,2 a 1,0 ppm. Cuando se utiliza azul Nilo para discriminar las plaquetas de las partículas lipídicas, el colorante está contenido en el reactivo PLT de manera que la concentración del colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser preferiblemente de 0,05 a 5,0 ppm, más preferiblemente de 0,1 a 2,0 ppm. Cuando se utiliza azul Nilo para discriminar las plaquetas de los glóbulos rojos fragmentados, el colorante está contenido en el reactivo PLT de manera que la concentración del colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser de 0,05 a 2,0 ppm, preferiblemente de 0,1 a 1,0 ppm. Cuando se utiliza azul cresil brillante ALD para discriminar las plaquetas de las partículas lipídicas, el colorante está contenido en el reactivo PLT de manera que la concentración del colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser preferiblemente de 0,1 a 5,0 ppm, más preferiblemente de 0,5 a 2,0 ppm. Cuando se utiliza azul cresil brillante ALD para discriminar las plaquetas de los glóbulos rojos fragmentados, el colorante está contenido en el reactivo PLT de manera que la concentración del colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser de 0,5 a 5,0 ppm, preferiblemente de 0,5 a 2,0 ppm.

Para una mejora adicional en la discriminación de las plaquetas de otras células y contaminantes de la sangre, la concentración del colorante en el reactivo PLT se encuentra en el intervalo definido anteriormente.

Cuando el colorante para la tinción de plaquetas está contenido como primer colorante en el reactivo RET/PLT, el colorante está contenido en el reactivo de manera que la concentración del primer colorante, aunque variando dependiendo del tipo de colorante, pase a ser preferiblemente de 0,01 a 10 ppm, más preferiblemente de 0,1 a 2,0 ppm o menos, cuando se mezcla con una muestra. En particular, cuando se utiliza azul Capri GON como primer colorante para discriminar las plaquetas de las partículas lipídicas y los glóbulos rojos fragmentados, el primer colorante está contenido en el reactivo RET/PLT de manera que la concentración del primer colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser de 0,2 a 3,0 ppm, más preferiblemente de 0,5 a 2,0 ppm. Cuando se utiliza azul Nilo para discriminar las plaquetas de las partículas lipídicas y los glóbulos rojos fragmentados, el primer colorante está contenido en el reactivo RET/PLT de manera que la concentración del primer colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser preferiblemente de 0,1 a 2,0 ppm. Cuando se utiliza ALD azul brillante para discriminar las plaquetas de las partículas lipídicas y los glóbulos rojos fragmentados, el primer colorante está contenido en el reactivo RET/PLT de manera que la concentración del primera colorante, cuando se mezcla con una muestra, pasa a ser preferiblemente de 0,5 a 3,0 ppm, más preferiblemente de 1,0 a 2,0 ppm.

Para una mejora adicional en la discriminación de las plaquetas de otras células y contaminantes de la sangre, es preferible que la concentración del colorante en el primera reactivo RET/PLT se encuentre en el intervalo definido anteriormente.

El segundo colorante está contenido en el reactivo RET/PLT de manera que la concentración del segundo colorante, aunque varía dependiendo del tipo de colorante, pasa a ser preferiblemente de 0,1 a 50 ppm, más preferiblemente de 0,5 a 10 ppm más o menos, cuando se mezcla con una muestra. Cuando la concentración del segundo colorante en el reactivo RET/PLT está en el intervalo definido anteriormente, los reticulocitos se pueden distinguir de otras células y contaminantes de la sangre.

El segundo colorante para tinción de reticulocitos en la composición del reactivo RET/PLT puede penetrar rápidamente en el reticulocito y teñir el ARN en la célula.

Preferiblemente, el reactivo RET/PLT comprende adicionalmente un anión multivalente para la supresión de la tinción no específica de glóbulos rojos. El anión multivalente incluye un ion sulfato, ion fosfato, ion carbonato e ion carboxilato multivalente. Los compuestos capaces de suministrar estos iones incluyen ácido cítrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, EDTA y sales de metales alcalinos de los mismos. El reactivo RET/PLT puede incluir uno o más de estos compuestos en forma de aniones multivalentes.

La proporción de los aniones multivalentes puede ser al menos 50% de todo el componente aniónico en el reactivo. La proporción de los aniones multivalentes es preferiblemente al menos 70% de todo el componente aniónico en el reactivo.

Mediante la incorporación de los aniones multivalentes, se puede prevenir la tinción no específica de los glóbulos rojos, y se puede facilitar la discriminación entre los reticulocitos, plaquetas y glóbulos rojos.

El reactivo PLC y el reactivo RET/PLT pueden contener un tampón para mantener constante el pH. El tampón puede estar contenido en una concentración de varios mM a aproximadamente 100 mM. El tampón no está particularmente limitado con tal que se utilice usualmente, y por ejemplo, se pueden utilizar un carboxilato, un fosfato, tampón de Good, taurina y trietanolamina dependiendo del pH deseado.

El pH del reactivo PLT y del reactivo RET/PLT se encuentra preferiblemente en el intervalo de 6,0 a 11,0, más preferiblemente de 7,0 a 10,0, aún más preferiblemente de 8,0 a 9,5. Cuando el pH es mucho más bajo que el intervalo anterior, los glóbulos rojos se hacen frágiles y se destruyen fácilmente, por lo que puede aumentar la cantidad de glóbulos rojos fragmentados como contaminantes. Cuando el pH es mucho más alto que el intervalo anterior, los grupos funcionales ácidos de una membrana de los glóbulos rojos se disocian de manera que los glóbulos rojos se pueden unir fácilmente al colorante catiónico, aumentando de este modo la tinción no específica de los glóbulos rojos fragmentados.

Cuando un compuesto capaz de suministrar los iones multivalentes tiene acción tamponadora en el reactivo RET/PLT, el compuesto también puede ser utilizado como un tampón.

La presión osmótica del reactivo PLT y del reactivo RET/PLT es preferiblemente de 150 a 600 mOsm/kg, más preferiblemente de 200 a 300 mOsm/kg. Una presión osmótica en este intervalo está próxima a la presión osmótica fisiológica, y por lo tanto puede evitar la hemólisis hipotónica de los glóbulos rojos.

Para mantener la presión osmótica descrita anteriormente, los reactivos PLT y RET/PLT pueden contener un agente de compensación de la presión osmótica. El agente de compensación de la presión osmótica puede ser un agente utilizado convencionalmente, y los ejemplos incluyen sales de metales alcalinos tales como propionatos y azúcares tales como glucosa y manosa. También se pueden utilizar haluros de metal alcalino tales como NaCl y haluros de metales alcalinotérreos. Estos agentes de compensación de presión osmótica pueden utilizarse solos o en forma de una mezcla de dos o más de los mismos. Cuando el tampón anterior se puede utilizar para regular la presión osmótica del reactivo en el intervalo anterior, el agente de compensación de presión osmótica puede no ser utilizado.

El reactivo PLT y el reactivo RET/PLT contienen un promotor de la tinción para estimular la penetración del colorante en una célula. El promotor de tinción es un tensioactivo catiónico. Un tensioactivo catiónico preferible está

en donde R11 representa un grupo alquilo C8 a C12, R12, R13 y R14 representan independientemente un grupo alquilo C1 a C6, e Y-representa un anión.

El grupo alquilo C8 a C12 representado por R11 en la fórmula (VII) puede ser lineal o ramificado. El grupo alquilo C8 a C12 representado por R11 incluye, por ejemplo, un grupo octilo, un grupo decilo, un grupo laurilo, un grupo cetilo y un grupo miristilo.

El grupo alquilo C1 a C6 representado por cada uno de R12, R13 y R14 en la fórmula (VII) puede ser lineal o ramificado. El grupo alquilo C1 a C6 representado por cada uno de R12, R13 y R14 incluye, por ejemplo, un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo butilo, un grupo isobutilo, grupo sec-butilo, un grupo terc-butilo, un grupo pentilo y un grupo hexilo. Entre estos grupos, es preferible un grupo metilo o etilo.

El anión representado por Y-en la fórmula (VII) es preferiblemente un ion de bromo o un ion de cloro.

Los ejemplos preferibles del tensioactivo catiónico representado por la fórmula (VII) incluyen bromuro de deciltrimetilamonio (DTAB), bromuro de octiltrimetilamonio (OTAB), cloruro de lauriltrimetilamonio (LTAC), cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC) y bromuro de miristiltrimetilamonio (MTAB). Estos tensioactivos catiónicos pueden utilizarse solos o como una mezcla de dos o más de los mismos.

El tensioactivo catiónico anterior está contenido en el reactivo PLT o el reactivo RET/PLT preferiblemente a una concentración tal que cuando el reactivo PLT o el reactivo RET/PLT se mezcla con una muestra, el tensioactivo catiónico puede promover la tinción de plaquetas, o de reticulocitos y plaquetas, y no causa la destrucción de los glóbulos rojos. Dicha concentración varía dependiendo del tipo de tensioactivo catiónico, pero es habitualmente de aproximadamente 50 a 20000 ppm. Por ejemplo, cuando se utiliza DTAB, su concentración en el reactivo es preferiblemente de aproximadamente 500 a 3000 ppm. Cuando se utiliza LTAC por ejemplo, su concentración en el reactivo es preferiblemente de aproximadamente 100 a 500 ppm.

El reactivo PLT y el reactivo RET/PLT pueden contener, por ejemplo, conservantes tales como 2-piridiltio-1-óxido de sodio y alcohol β-fenetílico, además de los componentes descritos anteriormente.

El reactivo PLT se puede producir disolviendo el colorante para la tinción de plaquetas y componentes arbitrarios (un tampón, un agente de compensación de la presión osmótica, un promotor de la tinción, un conservante, etc.), en un

disolvente adecuado a las concentraciones adecuadas descritas anteriormente. El disolvente no está particularmente limitado con tal que pueda disolver de forma estable estos componentes. Los ejemplos del disolvente incluyen agua y disolventes orgánicos solubles en agua. Como disolvente orgánico soluble en agua, es posible utilizar etanol, dimetilsulfóxido, etilenglicol o una mezcla disolvente de los mismos.

Los respectivos componentes pueden disolverse en un orden arbitrario sin limitación al orden de su disolución en el disolvente. Alternativamente, los componentes se disuelven previamente en diferentes disolventes adecuados, respectivamente, y justo antes de su uso, las respectivas soluciones se pueden mezclar para su uso como reactivo PLT. Por ejemplo, si el colorante para la tinción de plaquetas es inestable en una solución acuosa, el colorante puede disolverse en un disolvente orgánico soluble en agua y mezclarse justo antes del uso con una disolución acuosa que contiene los otros componentes para constituir una disolución para uso como reactivo PLT.

El reactivo RET/PLT se puede producir disolviendo el primer colorante para la tinción de plaquetas, el segundo colorante para tinción de reticulocitos, y componentes arbitrarios (aniones multivalentes, un tampón, un agente de compensación de la presión osmótica, un promotor de la tinción, un conservante, etc.), en un disolvente adecuado a las concentraciones adecuadas descritas anteriormente. El disolvente no está particularmente limitado con tal que pueda disolver de forma estable estos componentes. Los ejemplos del disolvente incluyen agua y disolventes orgánicos solubles en agua. Como disolvente orgánico soluble en agua, es posible utilizar etanol, dimetilosulfóxido, etilenglicol o una mezcla disolvente de los mismos.

Los respectivos componentes pueden disolverse en un orden arbitrario sin limitación al orden de su disolución en el disolvente. Alternativamente, los componentes se disuelven previamente en diferentes disolventes adecuados, respectivamente, y justo antes de su uso, las respectivas disoluciones se pueden mezclar para su uso como reactivo RET/PLT. Por ejemplo, si el primer y segundo colorantes son inestables en una disolución acuosa, los colorantes se pueden disolver en un disolvente orgánico soluble en agua y se mezclan justo antes del uso con una disolución acuosa que contiene los otros componentes para constituir una disolución para su uso como reactivo RET/PLT. El primer y segundo colorantes se pueden disolver en el mismo disolvente orgánico soluble en agua o en diferentes disolventes orgánicos solubles en agua.

El reactivo PLT producido de este modo se puede mezclar y hacer reaccionar con una muestra para preparar una muestra de medición, tiñéndose de ese modo las plaquetas que pueden estar contenidas en la muestra, o el reactivo RET/PLT producido de este modo se puede mezclar y hacer reaccionar con una muestra para preparar una muestra de medición, tiñéndose de ese modo los reticulocitos y las plaquetas que puedan estar contenidos en la muestra. En esta memoria descriptiva, la muestra se refiere a la sangre (sangre completa, plasma rico en plaquetas (PRP) etc.) o un producto aspirado de médula ósea obtenido del cuerpo biológico (particularmente mamíferos incluyendo seres humanos), o a una muestra obtenida diluyendo la sangre o producto aspirado de médula en la sangre con una disolución adecuada tal como una solución tampón.

La razón de mezcla (razón en volumen) del reactivo PLT (o el reactivo RET/PLT) con respecto a una muestra se establece preferiblemente de tal manera que reactivo : muestra = 100 : 1 a 1000 : 1. La temperatura a la que el reactivo PLC (o el reactivo RET/PLT) se hace reaccionar con una muestra es preferiblemente de aproximadamente 25 a 50°C, más preferiblemente de aproximadamente 35 a 45°C. El tiempo de reacción, aunque varía dependiendo del tipo de colorante, es preferiblemente de aproximadamente 10 segundos a 5 minutos, más preferiblemente de aproximadamente 20 segundos a 2 minutos, aún más preferiblemente de 20 segundos a 60 segundos.

La muestra de medición preparada como se ha descrito anteriormente es irradiada con luz, y se miden la luz dispersada y la fluorescencia emitida a partir de las células en la muestra de medición. El aparato para la irradiación de luz es preferiblemente un citómetro de flujo. Cuando se utiliza un citómetro de flujo, la muestra de medición se introduce en una celda de flujo del citómetro de flujo, las células en la muestra de medición que fluye en la celda de flujo se irradian con luz.

La fuente de luz del citómetro de flujo utilizado no está particularmente limitada, y se puede utilizar una fuente de luz con longitudes de onda adecuadas (por ejemplo, en las proximidades de 600 a 680 nm) para excitar el colorante para la tinción de plaquetas o el primer colorante para la tinción de las plaquetas y el segundo colorante para tinción de reticulocitos. La fuente de luz incluye, por ejemplo, un láser semiconductor rojo y un láser de He-Ne. En particular, es preferible un láser semiconductor porque es poco costoso en comparación con un láser de gas.

La luz dispersada emitida a partir de células tras la irradiación con luz en el citómetro de flujo puede ser luz dispersada frontalmente (en la vecindad de un ángulo de recepción de luz de 0 a 20°) o luz dispersada lateralmente (en la vecindad de un ángulo de recepción de luz de 90°). La luz dispersada frontalmente puede ser ya sea la luz dispersada frontal de bajo ángulo (en la vecindad de un ángulo de recepción de luz de 1 a 5°) o luz dispersada frontal de alto ángulo (en la vecindad de un ángulo de recepción de luz de 6 a 20°). La luz dispersada es conocido por ser un parámetro que refleja información sobre el tamaño de la célula.

Para la fluorescencia emitida a partir de células tras la irradiación con luz en el citómetro de flujo, se puede seleccionar una longitud de onda adecuada de luz recibida dependiendo del colorante utilizado.

En base a la luz dispersada y la fluorescencia obtenida como se ha descrito anteriormente utilizando el reactivo PLT, se pueden preparar diagramas de dispersión para detectar plaquetas distinguiendo las plaquetas de otras células y contaminantes de la sangre tales como partículas lipídicas. También se pueden contar las plaquetas detectadas de este modo. Preferiblemente se utiliza soporte lógico de análisis adecuado en la detección y el recuento de plaquetas.

Basándose en la luz dispersada y la fluorescencia obtenida como se ha descrito anteriormente utilizando el reactivo RET/PLT, se pueden preparar diagramas de dispersión para detectar reticulocitos y plaquetas distinguiendo los reticulocitos y las plaquetas de otras células y contaminantes de la sangre tales como partículas lipídicas. También se pueden contar los reticulocitos y las plaquetas detectados de este modo. El soporte lógico de análisis adecuado se utiliza preferiblemente en la detección y el recuento de reticulocitos y plaquetas.

La presente solicitud describe un kit de reactivos para el análisis de plaquetas (en lo sucesivo denominado a veces como kit de reactivos PLT) que comprende un primer reactivo que contiene un tampón para mantener constante el pH durante la medición y un segundo reactivo que contiene un colorante para la tinción de plaquetas, en donde el colorante es al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de azul Capri, azul Nilo y azul cresil brillante.

El tampón en el primer reactivo en el kit de reactivos PLT puede ser el mismo que se ha descrito anteriormente.

El primero y segundo reactivos en el kit de reactivos PLT se pueden preparar disolviendo el tampón y el colorante de tinción de plaquetas en un disolvente adecuado, respectivamente.

El kit de reactivos PLT puede contener adicionalmente un agente osmótico de compensación de la presión, un promotor de la tinción, un conservante, etc., que pueden estar contenidos de forma arbitraria en el reactivo PLT. Estos componentes pueden estar contenidos en el primer o segundo reactivo en el kit de reactivos PLT o pueden estar contenidos en otros reactivos en el kit.

Mezclando los reactivos en el kit de reactivos PLT con una muestra, se puede preparar una muestra de medición. El orden de mezcla de los respectivos reactivos en el reactivo PLT con una muestra no está particularmente limitado. La razón de mezcla (razón en volumen) se establece preferiblemente de tal manera que el total de los respectivos reactivos en el kit de reactivos : muestra = 100 : 1 a 1000 : 1.

El método para preparar una muestra de medición utilizando el kit de reactivo PLT, el método para medir la luz dispersada y la fluorescencia de la muestra de medición y el método para la detección de plaquetas basándose en la luz dispersada y la fluorescencia puede ser el mismo que en el reactivo PLT descrito más arriba.

La presente solicitud describe adicionalmente un kit de reactivos para el análisis de reticulocitos y plaquetas (en lo sucesivo denominado a veces como kit de reactivos RET/PLT), que comprende un primer reactivo que contiene un primer colorante para la tinción de plaquetas, que se selecciona del grupo que consiste de azul Capri, azul Nilo y azul cresil brillante, y un segundo reactivo que contiene un segundo colorante de tinción de reticulocitos. El kit de reactivos RET/PLT puede comprender adicionalmente un tercer reactivo que contiene un tampón para mantener constante el pH durante la medición.

El tampón puede ser el mismo que se ha descrito anteriormente.

El primer reactivo, el segundo reactivo y el tercer reactivo en el kit de reactivo RET/PLT se pueden preparar disolviendo el primer colorante, el segundo colorante y el tampón en disolventes adecuados, respectivamente.

La presente solicitud describe adicionalmente un kit de reactivos RET/PLT, que comprende un primer reactivo que contiene un tampón para mantener constante el pH durante la medición y un segundo reactivo que contiene un primer colorante para la tinción de plaquetas, que se selecciona del grupo que consiste de azul Capri, azul Nilo y azul cresil brillante, y un segundo colorante para la tinción de reticulocitos.

El tampón puede ser el mismo que se ha descrito anteriormente.

El primer reactivo y el segundo reactivo en el kit de reactivos RET/PLT se pueden preparar disolviendo el tampón y el primer y segundo colorantes en disolventes adecuados, respectivamente.

El kit de reactivos RET/PLT puede comprender adicionalmente aniones multivalentes, un agente de compensación de la presión osmótica, un promotor de la tinción, un conservante, etc., que pueden estar contenidos arbitrariamente en el reactivo RET/PLT. Estos reactivos pueden estar contenidos en el primer, segundo o tercer reactivos o pueden estar contenidos en otros reactivos en el kit.

Mediante la mezcla de los respectivos reactivos en el kit de reactivos RET/PLT con una muestra, se puede preparar una muestra de medición. El orden de mezcla de los respectivos reactivos en el reactivo PET/PLT con una muestra no está particularmente limitado. La razón de mezcla (razón en volumen) se establece preferiblemente de tal manera que el total de los respectivos reactivos en el kit de reactivos : muestra = 100 : 1 a 1000 : 1.

El método para preparar una muestra de medición utilizando el kit de reactivo RET/PLT, el método para medir la luz dispersada y la fluorescencia de la muestra de medición y el método para la detección de reticulocitos y plaquetas basándose en la luz dispersada y la fluorescencia pueden ser los mismos que en el reactivo RET/PLT descrito anteriormente.

La presente invención también se refiere a un método para el análisis de plaquetas, que comprende las etapas de: preparar una muestra de medición mezclando una muestra y un colorante para la tinción de plaquetas, que se selecciona del grupo que consiste de azul Capri, azul Nilo y azul cresil brillante a una concentración específica como se mencionó anteriormente; medir la luz dispersada y la fluorescencia emitida a partir de células en la muestra de medición irradiando las células con luz; y detectar las plaquetas basándose en la luz dispersada y la fluorescencia medidas. Específicamente, el reactivo PLT descrito anteriormente se puede mezclar con una muestra para preparar una muestra de medición. A continuación, la muestra de medición resultante se analiza con un analizador de sangre conocido equipado con una fuente de luz (por ejemplo, un citómetro de flujo), con lo cual se pueden obtener la intensidad de dispersión de luz y la intensidad de fluorescencia de la muestra de medición. Utilizando el soporte lógico de análisis adecuado, las plaquetas pueden, en función de la intensidad de dispersión de luz y la intensidad de fluorescencia, ser discriminadas de otras células y contaminantes de la sangre tales como partículas lipídicas, clasificando de ese modo las plaquetas. Además, las plaquetas clasificadas se pueden contar con soporte lógico de análisis adecuado. La intensidad de dispersión de luz incluye intensidad de dispersión de luz frontal e intensidad de dispersión de luz lateral.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a un método para el análisis de reticulocitos y plaquetas, que comprende las etapas de: preparar una muestra de medición mezclando una muestra, un primer colorante de tinción de plaquetas, que se ha mencionado anteriormente, y un segundo colorante para medir reticulocitos; medir la luz dispersada y la fluorescencia emitida a partir de las células en la muestra de medición mediante irradiación de las células con luz; y detectar reticulocitos y plaquetas basándose en la luz dispersada y la fluorescencia medida. Específicamente, el reactivo RET/PLT como se ha descrito anteriormente se puede mezclar con una muestra para preparar una muestra de medición. A continuación, la muestra de medición resultante se analiza con un analizador de sangre conocido equipado con una fuente de luz (por ejemplo, un citómetro de flujo), con lo cual se puede obtener la intensidad de dispersión de luz y la intensidad de fluorescencia de la muestra de medición. Utilizando el soporte lógico de análisis adecuado, los reticulocitos y las plaquetas pueden, basándose en la intensidad de dispersión de luz y la intensidad de fluorescencia, ser discriminados de otras células y contaminantes de la sangre tales como partículas lipídicas, clasificando de ese modo las plaquetas los reticulocitos y las plaquetas respectivamente. Adicionalmente, los reticulocitos y las plaquetas clasificados pueden ser contados con soporte lógico de análisis adecuado. La intensidad de dispersión de luz incluye intensidad de dispersión de luz frontal e intensidad de dispersión de luz lateral.

Ejemplos

De aquí en adelante, la presente invención se describe con más detalle por referencia a los Ejemplos, pero no se pretende que estos ejemplos limiten el alcance de la invención.

Ejemplos 1 a 3 y Ejemplos Comparativos 1 a 12

(Reactivo)

Se produjo un reactivo para el análisis de plaquetas que tenía la siguiente composición.

(1) Disolución de colorante

Colorante para la tinción de plaquetas: Concentración se muestra más abajo

Etilenglicol: 1L

(2) Diluyente

Tricina (tampón): 1,8 g

Dihidrato de citrato trisódico (anión multivalente): 29 g

Cloruro de lauriltrimetilamonio (LTAC): 0,15 g

Agua purificada: 1L

(ajustado a pH 9,0 y una presión osmótica de 200 mOsm/kg·H2O)

Como colorante para la tinción de plaquetas, se utilizó cada uno de los colorantes mostrados a continuación a la concentración mostrada a continuación. La concentración final del colorante después de mezclar el reactivo con una muestra se muestra en paréntesis. Las fórmulas químicas de estos colorantes se muestran en la Fig. 1.

Ejemplos:

1.: Azul capri GON (Croma) 20,5 ppm (0,4 ppm)

2.: Cloruro de azul Nilo

: (Tokio Industria Química Co. , Ltd. ) 20,5 ppm (0,4 ppm)

3.: Azul cresil brillante ALD (Sigma) 51,25 ppm (1 ppm)

Ejemplos comparativos:

1.: Azure A (Sigma) 102,5 ppm (2 ppm)

2.: Azure D (Sigma) 102,5 ppm (2 ppm)

3.: Azure C (Sigma) 102,5 ppm (2 ppm)

4.: Azul de metileno NNX (Sigma) 102,5 ppm (2 ppm)

5.: Acetato de cresil-violeta (Sigma) 1025 ppm (20 ppm)

6.: Verde Básico 5

: (Tokio Industria Química Co. , Ltd. ) 1025 ppm (20 ppm)

7.: Azul de metileno (Sigma) 102,5 ppm (2 ppm)

8.: Nuevo azul de metileno (Croma) 1025 ppm (20 ppm)

9.: Azul de toluidina

: (Tokio Industria Química Co. , Ltd. ) 102,5 ppm (2 ppm)

10.: Oxazina 750 (Nacalai Tesque, Inc) 102,5 ppm (2 ppm)

11.: Oxazina 1 (excitón) 1025 ppm (20 ppm)

12.: Oxazina 4 (excitón) 1025 ppm (20 ppm)

(Método) 15 Se pipeteó 1 mL del diluyente a un tubo y se calentó en un baño de agua a 40°C.

Se añadieron 20 µl de la disolución de colorante y 5 µl de sangre completa como una muestra de un ser humano sano al diluyente y después se incubó a 40°C durante 25 segundos para preparar una muestra de medición. 20 Después de eso, la muestra de medición se introdujo en una parte de detección que tenía una fuente de luz de excitación a 633 nm en un citómetro de flujo. En la parte de detección, las células de la muestra de medición se irradiaron con luz de excitación, y se detectaron una señal de de dispersión de la luz y una señal fluorescencia

emitidas por las células. Se analizaron las señales obtenidas para medir plaquetas en la muestra de medición.

(Resultados)

Los diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando las disoluciones de colorantes respectivas descritas anteriormente se muestran en las Figs. 1A, 1B y 1C. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de la luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. En diagrama de dispersión (2) es el mismo que el del diagrama de dispersión (1), excepto que el eje de ordenadas se ha convertido en log. En el diagrama de dispersión (2), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua.

Como se puede observar a partir del resultado en las Figs. 1A a C, azul Capri, Nilo azul o azul cresil brillante pueden distinguir las plaquetas más claramente con una mayor intensidad de la fluorescencia de otras células de la sangre que por los otros colorantes. Cuando una muestra está contaminada con contaminantes tales como partículas lipídicas, aparece un grupo de contaminaciones en una posición de baja intensidad de fluorescencia en el diagrama de dispersión. Por consiguiente, se puede observar que cuando se utilizan azul Capri, azul Nilo o azul cresil brillante como colorante para la tinción de plaquetas, las plaquetas se pueden distinguir de los contaminantes.

Ejemplo 4

Examen de una concentración adecuada de azul Capri en el reactivo para el análisis de plaquetas

En este ejemplo, las plaquetas se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que estaba contenida azul Capri GON como colorante para la tinción de las plaquetas de la disolución de colorante en el Ejemplo 1, y también que estaba contenido azul Capri GON en la disolución de colorante de manera que la concentración final de azul Capri GON pasó a ser de 0,1 a 5,0 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. Como muestra, se utilizaron respectivamente sangre completa de un sujeto sano, sangre que contenía glóbulos rojos fragmentados, y sangre que contenía lípidos.

(Resultados)

Los diagramas de dispersión resultantes se muestran en la Fig. 2. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de la luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. El diagrama de dispersión (2) es el mismo que el del diagrama de dispersión (1), excepto que el eje de ordenadas se ha convertido en log. El diagrama de dispersión (3) es una ampliación de un área que incluye y alrededor de la región en la que las plaquetas aparecen en el diagrama de dispersión (2). En el diagrama de dispersión (3), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua. A partir de este resultado, se encontró que cuando la concentración de azul Capri GON es de 0,1 a 5,0 ppm, de plaquetas se pueden distinguir claramente de los contaminantes, incluso si se producen lípidos como contaminante. También se encontró que cuando la concentración de azul Capri GON es de 0,1 a 2,0 ppm, las plaquetas se pueden distinguir claramente de los contaminantes, incluso si se producen glóbulos rojos fragmentados como contaminante.

Ejemplo 5

Examen de una concentración adecuada de azul Nilo en el reactivo para el análisis de plaquetas

En este ejemplo, las plaquetas se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que el cloruro de azul Nilo estaba contenido como colorante para la tinción de plaquetas en la disolución de colorante en el Ejemplo 2, y también que el cloruro de azul Nilo estaba contenido en la disolución de colorante de tal manera que la concentración final de cloruro de azul Nilo pasó a ser de 0,05 a 5 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. Como muestra, se utilizaron sangre completa de un sujeto sano, sangre que contenía una mayor cantidad de glóbulos rojos fragmentados, y sangre que contenía lípidos respectivamente.

(Resultados)

Los diagramas de dispersión resultantes se muestran en las Figs. 3A y 3B. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. El diagrama de dispersión (2) es el mismo que el diagrama de dispersión 1, excepto que el eje de ordenadas se ha convertido en log. El diagrama de dispersión (3) es una ampliación de un área que incluye y alrededor de la región en la que las plaquetas aparecen en el diagrama de dispersión (2). En el diagrama de dispersión (3), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua. A partir de este resultado, se encontró que cuando la concentración de cloruro de azul Nilo es de 0,05 a 5,0 ppm, las plaquetas pueden distinguirse claramente de los contaminantes, incluso si se producen lípidos como contaminante. También se encontró que cuando la concentración de cloruro de azul Nilo es de 0,05 a 2,0 ppm, las plaquetas pueden distinguirse claramente de los

contaminantes, incluso si se producen glóbulos rojos fragmentados como contaminante. Ejemplo 6

Examen de una concentración adecuada de azul cresil brillante en el reactivo para el análisis de plaquetas

En este ejemplo, las plaquetas se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 3, excepto que el azul cresil brillante ALD estaba contenido como colorante para la tinción de plaquetas en la disolución de colorante en el Ejemplo 3, y también que azul cresil brillante ALD estaba contenido en la disolución de colorante de tal manera que la concentración final de azul cresil brillante ALD pasó a ser de 0,1 a 10 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. Como muestra, se utilizaron sangre completa de un sujeto sano, sangre que contenía glóbulos rojos fragmentados, y sangre que contenía lípidos respectivamente.

(Resultados)

Los diagramas de dispersión resultantes se muestran en las Figs. 4A y 4B. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. El diagrama de dispersión (2) es el mismo que el del diagrama de dispersión (1), excepto que el eje de ordenadas se ha convertido en log. El diagrama de dispersión (3) es una ampliación de un área que incluye y alrededor de la región en la que las plaquetas aparecen en el diagrama de dispersión (2). En el diagrama de dispersión (3), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua. A partir de este resultado, se encontró que cuando la concentración de azul cresil brillante ALD es 0,1 a 10,0 ppm, las plaquetas se pueden distinguir claramente de los contaminantes, incluso si se producen lípidos como contaminante. También se encontró que cuando la concentración de azul cresil brillante ALD es de 0,2 a 2,0 ppm, las plaquetas pueden distinguirse claramente de los contaminantes, incluso si se producen glóbulos rojos fragmentados como contaminante.

Ejemplo 7

Comparación entre el método de medición de la invención y un método convencional (método de inmunotinción)

En este ejemplo se examinó la correlación entre el método de medición de la invención y un método convencional utilizando inmunotinción.

(Medición de plaquetas mediante inmunotinción)

El número de plaquetas se midió de acuerdo con un método estándar recomendado por el International Committee for Standardization of Hematology (ICSH), como método convencional descrito en American Journal of Clinical Pathologists (2001):115, págs. 460-464. Este método se basa en la inmunotinción con un anticuerpo específico para un antígeno de superficie de las plaquetas. Es decir, se pipetearon 5 µl de anticuerpo anti-CD41a humano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (fabricado por Becton Dickinson), 5 l de FITC marcado con anticuerpo anti-CD61 humano (fabricado por Becton Dickinson) y 100 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2 a 7,4, fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en un tubo. Se añadieron a esto 5 µl de una muestra (sangre) y se agitó suavemente. La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad. Se añadieron 4,85 mL de PBS a la mezcla. La mezcla resultante se midió con FACS Canto (fabricado por Becton Dickinson) para proporcionar un resultado de medición de las plaquetas "a" y un resultado de medición de glóbulos rojos "b". La muestra (sangre) que se utiliza en la presente memoria se midió con un contador de células de la sangre automático XE-2100 (fabricado por Sysmex Corporation) para determinar el número de glóbulos rojos "c", y finalmente, se utilizó la siguiente ecuación para calcular el número de plaquetas mediante el método convencional. Número de plaquetas = Número de glóbulos rojos "c" x (resultado de la medición de las plaquetas "a"/resultado de la medición de los glóbulos rojos "b")

(Método de medición de la invención)

El azul Capri GON estaba contenido como colorante para la tinción de plaquetas en la disolución de colorante en el Ejemplo 1. El azul Capri GON estaba contenido en la disolución de colorante de manera que cuando el reactivo se mezcló con una muestra, la concentración final de azul Capri GON pasó a ser de 1,2 ppm. El cloruro de azul Nilo estaba contenido como colorante para teñir de plaquetas en la disolución de colorante en el Ejemplo 2. El cloruro de azul Nilo estaba contenido en la disolución de colorante de manera que cuando el reactivo se mezcló con una muestra, la concentración final de cloruro de azul Nilo pasó a ser de 0,5 ppm. De la misma manera que en los Ejemplos 1 y 2 a excepción de lo anterior, se detectaron las plaquetas y se calculó el número de plaquetas. Como muestra, se utilizó la misma sangre que se utilizó en la inmunotinción.

(Resultados)

Los gráficos en donde el número de plaquetas según se determina por medio del método de medición de la

invención se representa en función del número de plaquetas según se determina por medio del método de inmunotinción se muestra en las Figs. 5A y 5B. La Fig. 5A muestra el resultado del método de la invención utilizando azul Capri GON. La Fig. 5B muestra el resultado del método de la invención utilizando cloruro de azul Nilo.

5 Como se puede observar en la Fig. 5A y 5B, los resultados obtenidos por medio del método de la invención, en comparación con los resultados obtenidos por medio del método convencional utilizando la inmunotinción, muestran una excelente correlación con menos dispersión.

Ejemplo 8

10 En este ejemplo, el reactivo para el análisis de reticulocitos y plaquetas, que comprende un primer colorante para la tinción de las plaquetas y un segundo colorante de tinción de reticulocitos, se preparó para medir reticulocitos y plaquetas.

15 (Reactivo)

La composición del reactivo es la siguiente:

Disolución de colorante

Primer colorante: Concentración mostrada a continuación

Segundo colorante: Concentración mostrada a continuación

Diluyente

Tricina (tampón): 1,8 g

Dihidrato de citrato trisódico (anión multivalente): 29 g

Cloruro de lauriltrimetilamonio (LTAC): 0,15 g

Agua purificada: 1L

(ajustado a pH 9,0 y una presión osmótica de 200 mOsm/kg · H2O)

20 Como segundo colorante para la tinción de reticulocitos, se utilizó un colorante mostrado en la siguiente fórmula. El segundo colorante estaba contenido en la disolución de colorante de tal manera que cuando el reactivo se mezcló con una muestra, la concentración final del segundo colorante pasó a ser de 0,5 ppm, 6 ppm o 10 ppm.

25 Como primer colorante para teñir de plaquetas, se utilizó azul Capri GON, cloruro de azul Nilo o cresil brillante ALD. El primer colorante estaba contenido en la disolución de colorante de manera que cuando el reactivo se mezcló con una muestra, la concentración final del colorante pasó a ser de 1 ppm para azul Capri GON, 0,5 ppm para el cloruro de azul Nilo, o 1,5 ppm para el azul cresil brillante ALD.

30 Como muestra, se utilizaron respectivamente sangre completa de un humano sano, sangre que contenía glóbulos rojos fragmentados, y sangre que contenía lípidos. La medición se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 1.

35 (Resultados)

Los diagramas de dispersión resultantes se muestran en las Figs. 6A, 6B y 6C. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. El diagrama de dispersión (2) es el mismo que el del diagrama de dispersión (1), excepto que el eje de

40 ordenadas se ha convertido en log. El diagrama de dispersión (3) es una ampliación de un área que incluye y alrededor de la región en la que las plaquetas aparecen en el diagrama de dispersión (2). En el diagrama de dispersión (1), la región en la que aparecen los reticulocitos se muestra en la línea continua. En el diagrama de dispersión (3), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua.

Para la comparación, los diagramas de dispersión en los que el primer colorante para la tinción de plaquetas no se añadió a la disolución de colorante también se muestran en las Figs. 6A, 6B y 6C.

A partir de los resultados de las Figs. 6A a 6C, se puede observar que cuando la concentración del segundo colorante se encuentra en el intervalo de 0,5 a 10 ppm, las plaquetas y los reticulocitos se pueden distinguir más claramente incluso en presencia de glóbulos rojos fragmentados y de lípidos mediante el reactivo al que se añadió el primer colorante que por el reactivo al que no se añadió el primer colorante.

Ejemplo 9

En este ejemplo, el segundo colorante para tinción de reticulocitos utilizado en el Ejemplo 8 estaba contenido en la disolución de colorante en el Ejemplo 8. El segundo colorante estaba contenido en la disolución de colorante de manera que la concentración final del segundo colorante pasó a ser de 0,5 ppm, 6 ppm o 10 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. El azul Capri GON estaba contenido como primer colorante para la tinción de plaquetas en esta disolución de colorante. El azul Capri GON estaba contenido en la disolución de colorante de tal manera que la concentración final de azul Capri GON pasó a ser de 0,5 ppm, 1 ppm o 2 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. La muestra utilizada fue la misma que en el Ejemplo 8. La medición se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 8.

(Resultados)

Los diagramas de dispersión resultantes se muestran en las Figs. 7A, 7B y 7C. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. El diagrama de dispersión (2) es el mismo que el del diagrama de dispersión (1), excepto que el eje de ordenadas se ha convertido en log. El diagrama de dispersión (3) es una ampliación de un área que incluye y alrededor de la región en la que las plaquetas aparecen en el diagrama de dispersión (2). En el diagrama de dispersión (1), la región en la que aparecen los reticulocitos se muestra en la línea continua. En el diagrama de dispersión (3), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua. A partir de este resultado, se encontró que cuando la concentración del segundo colorante es de 0,5 ppm a 10 ppm y el azul Capri GON es de 0,5 a 2,0 ppm, los reticulocitos y plaquetas pueden distinguirse claramente de los contaminantes, incluso si se producen lípidos y glóbulos rojos fragmentados como contaminantes.

Ejemplo 10

En este ejemplo, el segundo colorante para tinción de reticulocitos utilizado en el Ejemplo 8 estaba contenido en la disolución de colorante en el Ejemplo 8. El segundo colorante estaba contenido en la disolución de colorante de manera que la concentración final del segundo colorante pasó a ser de 0,5 ppm, 6 ppm o 10 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. El cloruro de azul Nilo también estaba contenido como primer colorante para teñir las plaquetas en esta disolución de colorante. El cloruro de azul Nilo estaba contenido en la disolución de colorante de tal manera que la concentración final de cloruro de azul Nilo pasó a ser de 0,1 ppm, 0,5 ppm o 2 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. La muestra utilizada fue la misma que en el Ejemplo 8. La medición se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 8.

(Resultados)

Los diagramas de dispersión resultantes se muestran en las Figs. 8A, 8B y 8C. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. El diagrama de dispersión (2) es el mismo que el del diagrama de dispersión (1), excepto que el eje de ordenadas se ha convertido en log. El diagrama de dispersión (3) es una ampliación de un área que incluye y alrededor de la región en la que las plaquetas aparecen en el diagrama de dispersión (2). En el diagrama de dispersión (19, la región en la que aparecen los reticulocitos se muestra en la línea continua. En el diagrama de dispersión (3), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua. A partir de este resultado, se encontró que cuando la concentración del segundo colorante es de 0,5 ppm a 10 ppm y el cloruro de azul Nilo es de 0,5 a 2,0 ppm, los reticulocitos y las plaquetas pueden distinguirse claramente de los contaminantes, incluso si se producen lípidos y glóbulos rojos fragmentados como contaminantes.

Ejemplo 11

En este ejemplo, el segundo colorante para la tinción de reticulocitos utilizado en el Ejemplo 8 estaba contenido en la disolución de colorante en el Ejemplo 8. El segundo colorante estaba contenido en la disolución de colorante de manera que la concentración final del segundo colorante pasó a ser de 0,5 ppm, 6 ppm o 10 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. El azul cresil brillante ALD también estaba contenido como primer colorante para la tinción de plaquetas en esta disolución de colorante. El azul cresil brillante ALD estaba contenido en la disolución de

colorante de tal manera que la concentración final de azul cresil brillante ALD pasó a ser de 1 ppm, 1,5 ppm o 2 ppm cuando el reactivo se mezcló con una muestra. La muestra utilizada fue la misma que en el Ejemplo 8. La medición se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 8.

5 (Resultados)

Los diagramas de dispersión resultantes se muestran en las Figs. 9A, 9B y 9C. En estos diagramas de dispersión, "BCB" se refiere a azul cresil brillante ALD. El diagrama de dispersión (1) muestra la intensidad de luz de dispersión frontal en el eje de ordenadas y la intensidad de fluorescencia en el eje de abscisas. El diagrama de dispersión (2) 10 es el mismo que el del diagrama de dispersión (1), excepto que el eje de ordenadas se ha convertido en log. El diagrama de dispersión (3) es una ampliación de un área que incluye y alrededor de la región en la que las plaquetas aparecen en el diagrama de dispersión (2). En el diagrama de dispersión (1), la región en la que aparecen los reticulocitos se muestra en la línea continua. En el diagrama de dispersión (3), la región en la que aparecen las plaquetas se muestra en la línea continua. A partir de este resultado, se encontró que cuando la concentración del

15 segundo colorante es de 0,5 ppm a 10 ppm y el azul cresil brillante ALD es de 1,0 a 2,0 ppm, los reticulocitos y las plaquetas pueden distinguirse claramente de los contaminantes, incluso si se producen lípidos y glóbulos rojos fragmentados como contaminantes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para el análisis de plaquetas mediante la discriminación de las plaquetas de los glóbulos rojos fragmentados, que comprende las etapas de:

5 preparar una muestra de medición mezclando una muestra y un colorante para la tinción de plaquetas, seleccionándose el colorante del grupo que consiste en azul Capri de fórmula (1), azul Nilo de fórmula (2) y azul cresil brillante de fórmula (3); medir la luz dispersada y la fluorescencia emitida a partir de células en la muestra de medición mediante irradiación de las células con luz; y

10 detectar las plaquetas basándose en la luz dispersada y la fluorescencia,

15 en donde la concentración del azul Capri en la muestra de medición es de 0,1 a 2,0 ppm;

la concentración del azul Nilo en la muestra de medición es de 0,05 a 2,0 ppm; y la concentración del azul cresil brillante en la muestra de medición es de 0,5 a 5,0 ppm.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa de preparación comprende mezclar el primer

5 colorante para la tinción de plaquetas, la muestra y un segundo colorante para tinción de reticulocitos para preparar la muestra de medición, y la etapa de detección comprende la detección de plaquetas y reticulocitos en base a la luz dispersada medida y a la fluorescencia medida.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la muestra de medición se introduce en una celda de

10 flujo de un citómetro de flujo, y las células de la muestra de medición que fluyen en la celda de flujo se irradian con luz.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente una etapa de

recuento de las plaquetas detectadas. 15
5. El método de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende adicionalmente una etapa de recuento de las plaquetas detectadas y una etapa de recuento de reticulocitos detectados.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el segundo colorante es un colorante de cianina capaz de 20 teñir un ácido nucleico.