ES2490865T3 - Kit de reactivos para análisis de muestras y método de análisis de muestras - Google Patents
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Abstract
Un kit de reactivos para el análisis de una muestra para medir basófilos y eritrocitos nucleados en la muestra, que comprende: un primer reactivo que contiene un agente tensioactivo catiónico, un tensioactivo no iónico y un ácido carboxílico aromático, que puede lisar los eritrocitos y dañar la membrana celular de los leucocitos de manera que un colorante fluorescente puede penetrar a través de la misma, en donde dicho tensioactivo catiónico es una sal de amonio cuaternario o una sal de piridinio, y dicho tensioactivo no iónico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un polioxietilenalquiléter, polioxietilenpolioxipropilenalquiléter, un aceite de ricino polioxietilenado, un aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado, un esterol polioxietilenado y un esterol hidrogenado polioxietilenado, y un segundo reactivo que contiene el colorante fluorescente capaz de teñir ácido nucleico, en donde dicho colorante fluorescente es al menos un colorante seleccionado del grupo que consiste en un colorante fluorescente que tiene la fórmula general (I): en donde: R1 y R2 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo; R3, R4, R5 y R6 son, iguales o diferentes entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo; y X- es un anión; y un colorante fluorescente que tiene la fórmula general (II): en donde: R7 y R8 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo que contiene opcionalmente un grupo ácido.
Description
DESCRIPCIÓN
Kit de reactivos para análisis de muestras y método de análisis de muestras.
Campo técnico 5
La presente invención se refiere a un kit de reactivos y a un método para el análisis de células sanguíneas en una muestra biológica.
Técnica anterior 10
En el campo de los ensayos clínicos, el análisis de componentes de la sangre en muestras es muy importante cuando se diagnostican diversas enfermedades de los órganos circulatorios o similares de los sujetos. Dependiendo del tipo de enfermedad, el número de células sanguíneas concretas puede aumentar o disminuir, o en algunos casos aparecerán en la sangre periférica células de la sangre que normalmente no existen allí. 15
Recientemente, se han comercializado diversos contadores automáticos de células de la sangre en los que se aplican los principios de la citometría de flujo. Mediante el uso de tales contadores automáticos de células de la sangre, se pueden clasificar y contar automáticamente las células de la sangre de las muestras.
20 Normalmente, los leucocitos se pueden clasificar en cinco especies, a saber, linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Entre éstos, el número de basófilos contenidos en las muestras de sangre es pequeño. Por lo tanto, la exactitud de la clasificación se puede mejorar mediante la comparación de la medición de los basófilos de muestras de sangre obtenidas usando un método que implica un tratamiento exclusivo para los basófilos con la medición de los basófilos obtenidos utilizando un método en el que los leucocitos se clasifican en cinco especies y 25 en la que los basófilos se miden en una medición. Los basófilos tienen la característica específica de que resultan menos dañados en comparación con otros tipos de leucocitos en condiciones ácidas. Mediante la utilización de esta característica, los basófilos se pueden distinguir de otros tipos de leucocitos mediante un tratamiento exclusivo para los basófilos, como se describe en la Publicación de Patente Japonesa No Examinada JP 61088896 (Documento de Patente 1) y en la Publicación de Patente Japonesa No Examinada JP 7294518 (Documento de Patente 2). 30
La existencia de eritrocitos nucleados a veces causa problemas en la medición de los leucocitos. Los eritrocitos nucleados tienen núcleos. En la medición de los leucocitos, incluso cuando los eritrocitos son tratados para ser lisados, los núcleos de los eritrocitos nucleados continúan causando una señal similar a la generada por los leucocitos, produciendo errores por falsos positivos en la medición del número de leucocitos. Con el fin de eliminar 35 este efecto y para obtener el número exacto de leucocitos, se somete una muestra de sangre a un tratamiento, exclusivo para los eritrocitos nucleados, con el fin de medir el número de eritrocitos nucleados; el número de leucocitos en la misma muestra de sangre se mide por un método diferente; y a continuación se resta el número de eritrocitos nucleados del número de leucocitos obtenidos. La Publicación de Patente Japonesa No Examinada JP 10339729 (Documento de Patente 3) da a conocer la discriminación de los eritrocitos nucleados de los leucocitos 40 mediante la aplicación de un tratamiento exclusivo para eritrocitos nucleados a muestras de sangre.
Sin embargo, la necesidad de tratamientos exclusivos para los respectivos tipos de células de la sangre como se describe en los Documentos de Patente 1 a 3 anteriores para la clasificación de los basófilos o eritrocitos nucleados, requiere una gran cantidad de tiempo y además hace que los aparatos de medición sean complicados o de gran tamaño. Además, el requisito de múltiples reactivos exclusivos para los respectivos tipos de células sanguíneas da 45 como resultado un elevado coste global para el análisis de sangre. Por consiguiente, es preferible reducir el número de tratamientos exclusivos para determinados tipos específicos de células de la sangre.
Tanto los basófilos como los eritrocitos nucleados se pueden medir mediante el tratamiento de las muestras de sangre en condiciones ácidas. Por lo tanto, tanto los basófilos como los eritrocitos nucleados pueden ser medidos en 50 una medición cuando la muestra de sangre se trata en condiciones ácidas. La Publicación de Patente Japonesa No Examinada JP 2002148261 (Documento de Patente 4) describe un método en el que los basófilos y los eritroblastos (eritrocitos nucleados) se pueden medir mezclando una muestra con una solución acuosa que contiene un tensioactivo y un agente de lisis de los eritrocitos, lo que permite que los leucocitos y las células anormales estén en un estado adecuado para la tinción, añadiendo un agente de tinción que contiene un colorante fluorescente para 55 teñir las células y, posteriormente, midiendo la intensidad de fluorescencia y la intensidad de la luz dispersada con un citómetro de flujo.
Descripción de la invención
60
Problemas que va a resolver la invención
Sin embargo, utilizando el método descrito en el documento JP 2002148261 (Documento de Patente 4), los basófilos no se separan bien de los otros tipos de leucocitos, es decir, distintos de los basófilos, especialmente en una muestra de sangre para la cual ha transcurrido un lapso de tiempo después de su recogida, como ocurrirá en 65 algunos casos.
Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar un kit de reactivos y un método para la medición de una muestra que permiten una discriminación más clara y un recuento de eritrocitos nucleados y basófilos de otros tipos de leucocitos de la muestra.
5
Medios para resolver los problemas
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un kit de reactivos para el análisis de una muestra para medir basófilos y eritrocitos nucleados en la muestra, que comprende:
un primer reactivo que contiene un tensioactivo catiónico, un tensioactivo no iónico y un ácido carboxílico 10 aromático, que pueden lisar los eritrocitos y dañar la membrana celular de los leucocitos de manera que un colorante fluorescente puede penetrar a través de la misma,
en donde el tensioactivo catiónico es un tipo de una sal de amonio cuaternario o una sal de piridinio, y el tensioactivo no iónico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un polioxietilenalquiléter, un polioxietilenpolioxipropilenalquiléter, un aceite de ricino polioxietilenado, un aceite de ricino hidrogenado 15 polioxietilenado, un esterol polioxietilenado y un esterol hidrogenado polioxietilenado, y
un segundo reactivo que contiene el colorante fluorescente capaz de teñir el ácido nucleico, en donde el colorante fluorescente es al menos un colorante seleccionado del grupo que consiste en un colorante fluorescente que tiene la fórmula general (I):
20
en donde:
R1 y R2 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo; 25
R3, R4, R5 y R6 son, iguales o diferentes entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo; y X- es un anión; y
un colorante fluorescente que tiene la fórmula general (II): 30
en donde:
35
R7 y R8 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo que contiene opcionalmente un grupo ácido;
y R9, R10, R11 y R12 son, iguales o diferentes entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo ácido, siempre que uno de R7 a R12 sea/tenga un grupo ácido; y el grupo ácido que puede estar presente en R7 a R12 puede formar una sal, siempre que cualquiera de los grupos ácido que pueden estar presentes en R7 a R12 sea un grupo del que se haya liberado un protón. 5
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para analizar una muestra que comprende las siguientes etapas:
lisis de los eritrocitos de la muestra y dañado de la membrana celular de las células de la sangre de manera que un colorante fluorescente pueda penetrar a través de la misma, en virtud del primer reactivo anterior, y la 10 tinción de las células dañadas en virtud del segundo reactivo anterior,
aplicación de luz a las células teñidas para obtener información de la luz dispersada e información de la fluorescencia, y
clasificación y recuento de los basófilos y/o eritrocitos nucleados en la muestra basándose en la información de la luz dispersada y la información de la fluorescencia. 15
Efecto de la invención
De acuerdo con la presente invención, los eritrocitos nucleados y los basófilos pueden ser más claramente discriminados de otras células de la sangre y se pueden contar incluso en la muestra de sangre para la cual ha 20 transcurrido un lapso de tiempo desde su recogida, lo que permite ensayos y diagnósticos más precisos de las enfermedades. La presente invención hace que sea posible contar eritrocitos nucleados y basófilos en una medición.
Breve descripción de los dibujos
25
La Fig. 1 representa una forma esquemática de un diagrama de dispersión cuando se analiza una muestra usando el reactivo de análisis de la muestra de la presente invención.
La Fig. 2 representa una forma esquemática de un diagrama de dispersión cuando se analiza una muestra usando el reactivo de análisis de la muestra de la presente invención.
La Fig. 3 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de 30 análisis de muestras del Ejemplo 1.
La Fig. 4 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 1.
La Fig. 5 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 2. 35
La Fig. 6 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 2.
La Fig. 7 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 3.
La Fig. 8 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de 40 análisis de muestras del Ejemplo 3.
La Fig. 9 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 3.
La Fig. 10 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 3. 45
La Fig. 11 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 4.
La Fig. 12 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 4.
La Fig. 13 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 4.
La Fig. 14 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 4.
La Fig. 15 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de 5 análisis de muestras del Ejemplo 5.
La Fig. 16 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 5.
La Fig. 17 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 5. 10
La Fig. 18 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 6.
La Fig. 19 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 6.
La Fig. 20 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de 15 análisis de muestras del Ejemplo 6.
La Fig. 21 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 7.
La Fig. 22 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 7. 20
La Fig. 23 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 8.
La Fig. 24 muestra una vista de un kit de reactivos ilustrativo de la presente invención. A: el segundo reactivo; y B: el primer reactivo.
La Fig. 25 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de 25 análisis de muestras del Ejemplo 9.
La Fig. 26 representa diagramas de dispersión cuando se analizan las muestras utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 9.
La Fig. 27 muestra gráficos que presentan las correlaciones entre los resultados del análisis de una muestra utilizando los reactivos de análisis de muestras del Ejemplo 9 y los resultados del análisis de la muestra 30 utilizando un método convencional para el análisis de la muestra. (A) Correlación del número de leucocitos totales; (B) Correlación de la relación de los basófilos; y (C) Correlación de la relación de los eritrocitos nucleados.
Mejor modo de llevar a cabo la invención 35
Los basófilos son una especie de leucocitos y tienen grandes gránulos ácidos que se tiñen con colorantes alcalinos. Los eritrocitos nucleados también se denominan eritroblastos e incluyen proeritroblastos, eritroblastos basófilos, eritroblastos policromatófilos y eritroblastos ortocromatófilos.
40
Según se utiliza en la presente memoria, una "muestra" se refiere a una muestra de fluido corporal tomada de mamíferos, preferiblemente seres humanos, incluyendo sangre, fluido de médula ósea, urea, una muestra tomada en aféresis y similares.
Los autores de la presente invención, como resultado de un amplio estudio, han encontrado que los eritrocitos 45 nucleados y basófilos pueden ser más claramente discriminados de otros tipos de leucocitos mediante el uso del primer reactivo que contiene un tensioactivo catiónico, un tensioactivo no iónico y un ácido carboxílico aromático y del segundo reactivo que contiene un colorante fluorescente capaz de teñir ácido nucleico.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el kit de reactivos para el análisis de muestras es un kit de 50 reactivos que comprende un primer reactivo que contiene un tensioactivo catiónico, que es un tipo de una sal de amonio cuaternario o una sal de piridinio, un tensioactivo no iónico, que es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un polioxietilenalquiléter, un polioxietilenpolioxipropilenalquiléter, un aceite de ricino polioxietilenado, un aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado, un esterol polioxietilenado y un esterol hidrogenado polioxietilenado, y un ácido carboxílico aromático y un segundo reactivo que contiene un colorante fluorescente capaz de teñir ácido 55 nucleico, en donde el colorante fluorescente es al menos un colorante seleccionado del grupo que consiste en un colorante fluorescente que tiene la fórmula general (I):
60
en donde:
R1 y R2 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo;
5
R3, R4, R5 y R6 son, iguales o diferentes entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo; y X- es un anión; y
un colorante fluorescente que tiene la fórmula general (II): 10
en donde:
15
R7 y R8 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo que contiene opcionalmente un grupo ácido;
y R9, R10, R11 y R12 son, iguales o diferentes entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo ácido, siempre que 20 uno de R7 a R12 sea/tenga un grupo ácido; y el grupo ácido que puede estar presente en R7 a R12 pueda formar una sal, siempre que uno de los grupos ácido que pueden estar presentes en R7 a R12 sea un grupo del cual ha sido liberado un protón. Por tratamiento de la muestra con el primer reactivo que contiene el tensioactivo catiónico, el tensioactivo no iónico y el ácido carboxílico aromático, los eritrocitos de la muestra pueden ser lisadas y las membranas celulares de los leucocitos y los eritrocitos nucleados se pueden dañar 25 en una medida tal que el colorante fluorescente pueda penetrar a través de las membranas. Debido a esto, las membranas celulares de los leucocitos distintos de los basófilos y eritrocitos nucleados se dañan y se contraen o generan núcleos desnudos, mientras que las membranas celulares de los basófilos resultan
menos dañadas. Por lo tanto, se considera que los basófilos se encogen menos en comparación con los leucocitos distintos de los basófilos y los eritrocitos nucleados. En consecuencia, los basófilos pueden ser discriminados de los leucocitos distintos de los basófilos y los eritrocitos nucleados basándose en las diferencias en el tamaño celular o la forma. Además, mediante el tratamiento de la muestra con el segundo reactivo que contiene el colorante fluorescente capaz de teñir ácidos nucleicos, los eritrocitos nucleados 5 pueden ser discriminados de los leucocitos distintos de los basófilos y los basófilos basándose en la diferencia en las propiedades de tinción con el colorante fluorescente.
El tensioactivo catiónico puede lisar eritrocitos y dañar las membranas celulares de los leucocitos y eritrocitos nucleados. El tensioactivo catiónico es un tipo de una sal de amonio cuaternario o sal de piridinio. El tensioactivo 10 catiónico de tipo sal de amonio cuaternario es preferiblemente una sal de amonio cuaternario que tiene la siguiente fórmula general (III):
15 En la fórmula (III) anterior, R13, R14 y R15 pueden ser iguales o diferentes, y son un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1-8 o un grupo aralquilo C6-8. R16 es un grupo alquilo C8-18, un grupo alquenilo C8-18 o un grupo aralquilo C6-18. X- es un anión.
El grupo alquilo C1-8 para R13, R14 y R15 incluye, pero no se limita a, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo y similares. El grupo aralquilo C6-8 de R13, R14 y R15 incluye pero no se limita a, bencilo, fenetilo y 20 similares. Preferiblemente, R13, R14 y R15 son un grupo alquilo C1-8 tal como metilo, etilo y similares.
El grupo alquilo C8-18 para R16 incluye, pero no se limita a, octilo, decilo, dodecilo, tetradecilo y similares. El grupo alquenilo C8-18 de R16 incluye, pero no se limita a, octenilo, decenilo, oleilo y similares. El grupo aralquilo C6-18 de R16 incluye, pero no se limita a, bencilo, fenetilo y similares. Preferiblemente, R16 es un grupo alquilo C10-18 de cadena 25 lineal tal como decilo, dodecilo, tetradecilo y similares.
El anión X- incluye, pero no se limita a, iones de halógenos, tales como F-, CI-, Br- y I-, CF3SO3-, BF4-, ClO4- y similares.
30 El tensioactivo catiónico de tipo sal de piridinio es preferiblemente una sal de piridinio que tiene la siguiente fórmula (IV):
35 En la fórmula (IV) anterior, R17 es un grupo alquilo C8-18. X- es un anión.
El grupo alquilo C8-18 incluye un grupo alquilo C10-18 de cadena lineal tal como decilo, dodecilo, tetradecilo y similares. El anión X- incluye iones de halógenos, tales como F-, CI-, Br- y I-, CF3SO3-, BF4-, ClO4- y similares.
40 Los ejemplos específicos no limitantes del tensioactivo catiónico incluyen bromuro de deciltrimetilamonio, cloruro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de octiltrimetilamonio, cloruro de octiltrimetilamonio, bromuro de lauriltrimetilamonio, cloruro de lauriltrimetilamonio, bromuro de miristiltrimetilamonio, cloruro de miristiltrimetilamonio, cloruro de laurilpiridinio, y similares.
45
El tensioactivo catiónico se utiliza a una concentración que es suficiente para lisar los eritrocitos y dañar las membranas celulares de leucocitos y eritrocitos nucleados. Semejante concentración preferible se puede determinar fácilmente, por ejemplo, observando el estado de las membranas celulares o similares bajo un microscopio óptico convencional. Específicamente, la concentración del tensioactivo catiónico es preferiblemente de 300 a 9000 mg/L, más preferiblemente de 400 a 8000 mg/L, y lo más preferiblemente de 500 a 7000 mg/L. Sin embargo, la 50 concentración puede ajustarse de manera apropiada de acuerdo con el tipo de agente tensioactivo catiónico utilizado.
Cuando la concentración del tensioactivo catiónico es demasiado baja, la discriminación exacta entre los basófilos y los leucocitos distintos de los basófilos puede no ser posible en algunos casos. Se considera que la razón de esto es 55 que los leucocitos no están suficientemente dañados cuando la concentración del tensioactivo catiónico es demasiado baja, de manera que la diferencia de tamaño o forma entre los basófilos y los leucocitos distintos de los basófilos es pequeña. Por otro lado, cuando la concentración del tensioactivo catiónico es demasiado alta, la discriminación exacta entre los eritrocitos nucleados y los leucocitos distintos de los basófilos puede no ser posible
en algunos casos. Se considera que la razón de esto es que las membranas celulares, en particular, de los eritrocitos nucleados y los leucocitos distintos de los basófilos están excesivamente dañadas cuando la concentración del tensioactivo catiónico es demasiado alta, de modo que la discriminación exacta entre los eritrocitos nucleados y los leucocitos distintos de los basófilos no es posible. Por consiguiente, cuando la concentración está dentro del intervalo anterior, los eritrocitos se pueden lisar eficazmente sin dañar excesivamente 5 las membranas celulares de los leucocitos y los eritrocitos nucleados. El poder de hemólisis de la tensioactivo catiónico depende de la longitud de la cadena principal. Los tensioactivos catiónicos que tienen una cadena principal larga tienen un mayor poder de hemólisis, proporcionando así un efecto suficiente con una cantidad más pequeña en comparación con los que tienen una cadena corta.
10
En la muestra de sangre para la que ha transcurrido un lapso de tiempo desde su recogida, las células de la sangre tales como los leucocitos son propensas a sufrir daños debido a su cambio morfológico. Cuando se utiliza el tensioactivo catiónico para tal muestra, las membranas celulares, en particular, de eritrocitos nucleados y leucocitos distintos de los basófilos son excesivamente dañadas, de modo que la discriminación exacta entre los eritrocitos nucleados y los leucocitos distintos de los basófilos no es posible en algunos casos. En tales casos, el uso del 15 tensioactivo no iónico junto con el tensioactivo catiónico permite una discriminación más exacta entre los eritrocitos nucleados y los leucocitos distintos de los basófilos por la supresión de los daños excesivos en los leucocitos y similares. El tensioactivo no iónico es al menos uno seleccionado entre un polioxietilenalquiléter, un polioxietilen- polioxipropilenalquiléter, un aceite de ricino polioxietilenado, un aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado, un esterol polioxietilenado o un esterol hidrogenado polioxietilenado. 20
El tensioactivo no iónico de tipo polioxietilenalquiléter es preferiblemente el que tiene la siguiente fórmula (V): R18-O-(CH2CH2O)n-H (V)
25
En la fórmula anterior, R18 es un grupo alquilo C12-22 o un grupo alquenilo C12-22, en el que n es de 10 a 30.
El tensioactivo no iónico de tipo polioxietilen polioxipropilenalquiléter es preferiblemente el que tiene la siguiente fórmula (VI):
30
En la fórmula anterior, R19 es un grupo alquilo C10-30 o un grupo C-alquenilo, en el que m es de 1 a 10 y n es de 10 a 30.
35
El tensioactivo no iónico de tipo aceite de ricino polioxietilenado es preferiblemente el que tiene la siguiente fórmula (VII):
40
En la fórmula anterior, la suma de k, n, m, x, y, y z es de 10 a 60.
El tensioactivo no iónico de tipo aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado es preferiblemente el que tiene la siguiente fórmula (VIII):
45
En la fórmula anterior, la suma de k, n, m, x, y, y z es de 10 a 60.
El tensioactivo no iónico de tipo esterol polioxietilenado es preferiblemente el que tiene la siguiente fórmula (IX):
En la fórmula anterior, n es de 10 a 30. 5
El tensioactivo no iónico de tipo esterol hidrogenado polioxietilenado es preferiblemente el que tiene la siguiente fórmula (X) o (XI):
10
en la que n es de 20 a 30;
15
en la que n es de 20 a 30.
El grupo alquilo C12-22 incluye dodecilo, hexadecilo y grupos similares. El grupo alquenilo C12-22 incluye oleílo y grupos similares. Cuando n en las fórmulas (V), (VI) y (IX) a (XI) anteriores es demasiado bajo, las membranas de las células de la sangre resultan excesivamente dañadas; y cuando n es demasiado alto, las membranas de células 20 de la sangre no son suficientemente dañadas. Del mismo modo, cuando la suma de k, n, m, x, y y z en las fórmulas (VII) y (VIII) anteriores es demasiado baja, las membranas de las células de la sangre resultan excesivamente dañadas; y cuando es demasiado alta, las membranas de las células de la sangre no son suficientemente dañadas.
El tensioactivo no iónico incluye específicamente polioxietilen(16)oleiléter, polioxietilen(20)cetiléter, 25 polioxietilen(20)polioxipropilen(8)cetiléter, polioxietilen(30)polioxipropilen(6)deciltetradeciléter, aceite de ricino polioxietilenado (20), aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado (20), aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado (50), fitostanol polioxietilenado (25) y similares. Entre éstos, se prefieren particularmente el polioxietilen(16)oleiléter y el polioxietilen(20)polioxipropilen(8)cetiléter.
30
La concentración del tensioactivo no iónico es preferiblemente de 500 a 7000 mg/L, más preferiblemente de 800 a 6.000 mg/L, y lo más preferiblemente de 1.000 a 5.000 mg/L. Sin embargo, la concentración puede ajustarse de manera apropiada de acuerdo con el tipo de tensioactivo no iónico utilizado.
Cuando la concentración del tensioactivo no iónico es demasiado baja, la discriminación exacta entre, 35 concretamente, los eritrocitos nucleados y los leucocitos distintos de basófilos puede no ser posible en algunos casos, debido a que el daño excesivo de las membranas celulares de los leucocitos y los eritrocitos nucleados por el tensioactivo catiónico no puede ser suprimido. Por otro lado, cuando la concentración del tensioactivo no iónico es demasiado alta, la discriminación exacta entre, concretamente, los basófilos y los leucocitos distintos de los basófilos puede no ser posible en algunos casos, debido a que el daño por el tensioactivo catiónico en las membranas 40 celulares de los leucocitos y los eritrocitos nucleados se suprime. Por consiguiente, cuando la concentración está dentro del intervalo anterior, los eritrocitos nucleados y los leucocitos distintos de basófilos se pueden discriminar
con precisión incluso cuando se utiliza una muestra de sangre para la que ha transcurrido un lapso de tiempo desde su recogida. El primer reactivo comprende preferiblemente al menos un ácido carboxílico que tiene al menos un anillo aromático en la molécula (de aquí en adelante referido como "ácido carboxílico aromático") o una sal del mismo. Al utilizar el ácido carboxílico aromático, los eritrocitos pueden ser lisados eficazmente en un corto período de tiempo. 5
En algunos casos, dependiendo de las muestras de sangre, cuando se utiliza el primer reactivo sin el ácido carboxílico aromático en las mediciones, los basófilos se detectan en una cantidad equívocamente elevada. La razón de este valor equívocamente elevado no se conoce. Sin embargo, se puede teorizar que las células de la sangre distintas de los basófilos u otros componentes de las muestras de sangre presentan un tamaño, forma o 10 intensidad de fluorescencia similares a los de los basófilos. Al someter a ensayo las muestras de sangre con el primer reactivo que contiene el ácido carboxílico aromático, tales fenómenos de valores equívocamente elevados se pueden evitar.
El ácido carboxílico aromático utilizado se selecciona arbitrariamente entre los ácidos orgánicos que tienen al menos 15 un anillo aromático en la molécula o las sales de los mismos. El ácido carboxílico aromático preferido incluye ácido salicílico, ácido ftálico, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, ácido aminobenzoico y sales de los mismos.
La concentración del ácido carboxílico aromático o una sal del mismo en el primer reactivo no está específicamente limitada siempre y cuando el pH del primer reactivo esté dentro del intervalo descrito a continuación, y es 20 preferiblemente de 0,1 a 100 mM y más preferiblemente de 0,5 a 50 mM.
Cuando la concentración del ácido carboxílico aromático es demasiado baja, la discriminación exacta de los basófilos puede no ser posible debido a que el efecto anterior no es ejercido suficientemente. Por otro lado, cuando la concentración del ácido carboxílico aromático es demasiado alta, la discriminación exacta entre los eritrocitos 25 nucleados y los leucocitos distintos de los basófilos puede no ser posible en algunos casos. Por consiguiente, cuando la concentración está dentro del intervalo anterior, los eritrocitos nucleados y los basófilos son discriminados con precisión de otras células de la sangre.
Cuando la muestra se trata con el primer reactivo, los eritrocitos, que perturban la medición de los eritrocitos 30 nucleados y los basófilos son preferiblemente lisados. Generalmente, los eritrocitos son perforados en su membrana celular a una presión osmótica de aproximadamente 150 mOsm/kg o inferior y se vuelven ópticamente transparentes después de la salida de la hemoglobina desde el interior de los eritrocitos (hemólisis). Los eritrocitos ópticamente transparentes no perturban considerablemente la medición mediante citometría de flujo. Las condiciones de baja presión osmótica y bajo pH son preferibles para la lisis de los eritrocitos. La presión osmótica que satisface estos dos 35 requisitos es de 20 mOsm/kg a 150 mOsm/kg. Mediante el ajuste de la presión osmótica del primer reactivo en este intervalo, los eritrocitos, que perturban la medición de los eritrocitos nucleados y los basófilos, se pueden lisar eficazmente.
Los basófilos tienen la característica de ser difíciles de destruir en comparación con otros leucocitos en condiciones 40 ácidas. En consecuencia, el pH del primer reactivo es preferiblemente ácido, por ejemplo preferiblemente de 2,0 a 4,5, más preferiblemente de 2,0 a 3,5. Dentro de este intervalo de pH, los gránulos de los basófilos son estables. Además, dentro de este intervalo de pH, los eritrocitos se pueden lisar eficazmente sin afectar excesivamente a leucocitos, eritrocitos nucleados y similares. Debido a esto, la luz dispersada y la fluorescencia de los eritrocitos sin núcleo son bajas, por lo que los eritrocitos no afectan sustancialmente a la medición de los eritrocitos nucleados y 45 los leucocitos.
El pH del primer reactivo se puede ajustar con un agente tamponador. Los agentes tamponadores preferidos son los que tienen un pKa en el intervalo de pH de 2,0 a 4,5 o que tiene un pKa a ± 2,0 del pH deseado, e incluyen, por ejemplo, ácido málico, ácido tartárico, ácido malónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido diglicólico y similares. La 50 concentración del agente tamponador en el primer reactivo no está limitada específicamente siempre y cuando se pueda mantener el intervalo de pH anterior.
Además, es adecuado combinar el ácido carboxílico aromático y el agente tamponador, porque de esta manera se puede mejorar el rendimiento para la discriminación de los eritrocitos nucleados. La combinación del agente 55 tamponador y el ácido carboxílico aromático incluye, por ejemplo, ácido málico y ácido salicílico o una sal del mismo, ácido málico y ácido ftálico o una sal del mismo, ácido cítrico y ácido salicílico o una sal del mismo, ácido cítrico y ácido ftálico o una sal del mismo, ácido málico y ácido benzoico o una sal del mismo, ácido málico y ácido ftálico o una sal del mismo y ácido benzoico o una sal del mismo.
60 Con el fin de ajustar la presión osmótica del primer reactivo en un intervalo adecuado para la lisis de los eritrocitos, se puede utilizar un electrolito tal como NaCl, KCl, o un sacárido. La presión osmótica también se puede ajustar por medio de la concentración del agente tamponador.
El primer reactivo se puede obtener por disolución de los tensioactivos y el ácido carboxílico aromático o una sal del 65 mismo, así como el agente tamponador opcional en un disolvente apropiado de manera que se puedan obtener las
concentraciones anteriores, y opcionalmente ajustando el pH con NaOH, HCl o similares. El disolvente apropiado no está limitado específicamente siempre y cuando pueda disolver los componentes anteriores, e incluye, por ejemplo, agua, disolventes orgánicos, mezclas de los mismos y similares. Los disolventes orgánicos incluyen, pero no se limitan a, alcoholes, etilenglicol y dimetilsulfóxido (denominado en lo sucesivo "DMSO"). El segundo reactivo comprende el colorante fluorescente capaz de teñir ácido nucleico. Cuando las células de la sangre tratadas con el 5 primer reactivo se tiñen con el colorante fluorescente capaz de teñir ácido nucleico, los leucocitos se tiñen intensamente y emiten una intensa fluorescencia. Por otro lado, los eritrocitos nucleados son ligeramente teñidos y emiten una fluorescencia débil. Debido a la diferencia en la capacidad de ser teñidos con el colorante fluorescente, los eritrocitos nucleados pueden ser discriminados de los basófilos o leucocitos distintos de los basófilos. El mecanismo para la producción de la diferencia en la intensidad de fluorescencia entre los leucocitos y los eritrocitos 10 nucleados no se ha averiguado; sin embargo, puede ser debido a que la incorporación del colorante al núcleo celular se inhibe debido a la condensación del núcleo (ADN) de los eritrocitos nucleados.
El colorante fluorescente contenido en el segundo reactivo incluye los colorantes fluorescentes de las siguientes fórmulas (I) y (II): 15
en la que R1 y R2 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo;
20 R3, R4, R5 y R6 son, iguales o diferentes entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo; y X- es un anión; 25
en la que R7 y R8 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo que contiene opcionalmente un grupo ácido;
y R9, R10, R11 y R12 son, iguales o diferentes entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo ácido, a condición de que uno de R7 a R12 sea/tenga un grupo ácido; y el grupo ácido que puede estar presente en R7 a R12 puede formar una sal, siempre que uno de los grupos ácido que pueden estar presentes en R7 a R12 sea un grupo del que haya sido liberado un protón. 5
En la presente memoria descriptiva, el grupo alquilo en las fórmulas (I) y (II) anteriores puede ser de cadena lineal o de cadena ramificada. El número de átomos de carbono del grupo alquilo es generalmente de 1 a 20 y preferiblemente de 1 a 10. El número de átomos de carbono del grupo alquilo es más preferiblemente de 1 a 6 en vista de la solubilidad en agua del colorante fluorescente. Los ejemplos preferidos del grupo alquilo incluyen metilo, 10 etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo y similares.
X- en la fórmula (I) incluye iones de halógeno, tales como F-, Cl-, Br- y I-, CF3SO3-, BF4-, ClO4- y similares.
Según se utiliza en la presente memoria, el grupo ácido que puede estar presente en la fórmula (II) incluye tanto un 15 grupo capaz de liberar un protón como un grupo capaz de liberar un protón a partir del cual se ha liberado el protón. El grupo capaz de liberar un protón incluye, pero no se limita a, un grupo carboxilo, sulfónico, fosfórico o similar, y es preferiblemente un grupo sulfónico.
El grupo ácido puede formar una sal. La sal incluye, pero no está limitada a, una sal de metal alcalino tal como una 20 sal de sodio, de potasio o similar. Es preferiblemente una sal de sodio.
El colorante fluorescente de las fórmulas (I) y (II) utilizado puede ser un colorante (tipo de colorante) o una mezcla de dos o más colorantes (o tipos de colorantes). El colorante fluorescente se puede obtener de Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc. 25
La concentración del colorante en el reactivo de análisis de la muestra de la presente invención se puede seleccionar apropiadamente de acuerdo con el tipo de colorante, y generalmente es de 0,01 a 100 mg/L, preferiblemente de 0,1 a 10 mg/L y más preferiblemente de 0,2 a 6,0 mg/L.
30
El colorante fluorescente de las fórmulas (I) y (II) comprendido en el segundo reactivos colorea los leucocitos intensamente debido a que tiene una mayor afinidad hacia los leucocitos que hacia los eritrocitos nucleados. Por consiguiente, basándose en la diferencia en la fluorescencia emitida a partir de células teñidas con el colorante fluorescente, los eritrocitos nucleados se pueden discriminar con más precisión de los leucocitos distintos de los basófilos y los basófilos. 35
El segundo reactivo se puede obtener disolviendo el colorante fluorescente en un disolvente apropiado de manera que se pueda obtener la concentración anterior. El disolvente apropiado no está limitado específicamente siempre y cuando pueda disolver el colorante fluorescente, e incluye agua, disolventes orgánicos, mezclas de los mismos y similares. Los disolventes orgánicos incluyen, pero no se limitan a, alcoholes, etilenglicol, DMSO y similares. Algunos 40 colorantes fluorescentes tienen una baja estabilidad a largo plazo en soluciones acuosas, y en tales casos, se disuelven preferiblemente en disolventes orgánicos.
El kit de reactivos para el análisis de muestras se mezcla preferiblemente con la muestra en una cantidad tal que se obtenga una proporción en volumen de primer reactivo:segundo reactivo:muestra es de 10 a 500: de 1 a 10: de 1, 45 más preferiblemente de 20 a 100: de 2 a 5: 1. Mediante la aplicación de esta proporción de mezcla del primer reactivo, el segundo reactivo y la muestra para obtener una muestra de medición, los eritrocitos se lisan suavemente y los componentes celulares de la sangre se tiñen satisfactoriamente. Una cantidad de muestra de unos pocos microlitros a 100 µl permite mediciones finas.
50 El método para el análisis de muestras de acuerdo con una realización de la presente invención comprende las etapas de:
lisar los eritrocitos en la muestra y dañar la membrana celular de las células de la sangre de modo que el colorante fluorescente puede penetrar a través de la misma, en virtud del primer reactivo anterior, y teñir las células sanguíneas dañadas en virtud del segundo reactivo anterior, 55
aplicar luz a las células de la sangre teñidas para obtener información de la luz dispersada e información de la fluorescencia y
clasificar y contar los basófilos y/o eritrocitos nucleados en la muestra basándose en la información de la luz
dispersada y la información de la fluorescencia.
En la etapa de tinción, el primer reactivo, el segundo reactivo y la muestra se mezclan. En esta etapa, el tensioactivo catiónico, el tensioactivo no iónico y el ácido carboxílico aromático del primer reactivo lisan los eritrocitos de la muestra de células y dañan las membranas de las células de la sangre de manera que un colorante fluorescente 5 pueda penetrar a través de la misma. En consecuencia, mezclando el primer reactivo, el segundo reactivo y la muestra, las células de la sangre diana pueden ser teñidas efectivamente con el colorante fluorescente.
En la etapa de tinción, se puede emplear cualquier orden para la mezcla del primer reactivo, el segundo reactivo y la muestra. El primer reactivo y el segundo reactivo se pueden mezclar primero, y luego esta mezcla se pueden 10 mezclar con la muestra. Alternativamente, el primer reactivo y la muestra se pueden mezclar primero, y luego esta mezcla se pueden mezclar con el segundo reactivo. Se pueden obtener resultados de medición similares con cualquier orden de mezcla. En la etapa de tinción, la mezcla del primer reactivo, el segundo reactivo y la muestra se hace reaccionar preferiblemente de 15 a 50°C, preferiblemente de 30 a 45°C durante 5 a 120 segundos, preferiblemente durante 5 a 30 segundos. 15
Las células de sangre teñidas en la etapa de tinción se pueden analizar con un citómetro de flujo. El análisis de las células de la sangre utilizando un citómetro de flujo se explica a continuación. A las células de sangre teñidas se les aplica luz cuando pasan a través de una celda de flujo del citómetro de flujo, permitiendo así obtener la información de la luz dispersada y la información de la fluorescencia. La información de la luz dispersada no está 20 específicamente limitada, siempre y cuando sea luz dispersada medible por los citómetros de flujo comerciales convencionales, e incluye el ancho de pulso, la intensidad y similares de la luz dispersada tal como la luz dispersada frontal (por ejemplo, ángulo de recepción de luz de aproximadamente 0 a 20 grados) o luz dispersada lateral (por ejemplo, ángulo de recepción de luz de aproximadamente 90 grados). En general, la luz dispersada lateral refleja la información interna tal como los núcleos y gránulos de las células, y la luz dispersada frontal refleja la información 25 del tamaño de las células. En el método de la presente realización, es preferible que la información de la luz dispersada incluya la intensidad de la luz dispersada frontal y la intensidad de la luz dispersada lateral.
La información de la fluorescencia se obtiene mediante la aplicación de luz que tiene una longitud de onda apropiada a la muestra de medición y la medición de la fluorescencia excitada. Dependiendo del colorante fluorescente usado, 30 se puede seleccionar una longitud de onda de recepción apropiada. La fluorescencia se emite a partir del ácido nucleico y los gránulos de las células que se tiñen con el colorante fluorescente.
La fuente de luz del citómetro de flujo utilizado no está específicamente limitada, y se selecciona entre las fuentes de luz que tienen una longitud de onda adecuada para la excitación del colorante fluorescente. Por ejemplo, se pueden 35 utilizar el láser semiconductor rojo, el láser semiconductor azul, el láser de argón, el láser de He-Ne. Concretamente, los láseres semiconductores son de bajo coste en comparación con los láseres de gas, y por lo tanto son preferibles.
Basándose en la luz dispersada y la fluorescencia medidas de ese modo, se pueden discriminar y contar los eritrocitos nucleados y los basófilos de otros componentes. Esta etapa comprende preferiblemente, por ejemplo, (1) 40 la obtención de un diagrama de dispersión que tiene dos ejes de la información de fluorescencia y la información de la luz dispersada frontal, (2) la obtención de un diagrama de dispersión que tiene dos ejes de la información de luz dispersada frontal y la información de la luz dispersada lateral, y (3) el análisis de los respectivos diagramas de dispersión obtenidos con un soporte lógico analítico apropiado.
45 En el diagrama de dispersión que tiene el eje de las x para la intensidad de fluorescencia y el eje de las y para la luz dispersada frontal, como se muestra en la Fig. 1 por ejemplo, los eritrocitos nucleados, los basófilos y los leucocitos distintos de los basófilos se distribuyen para formar agrupaciones respectivamente. En esta figura, NRBC representa la agrupación de eritrocitos nucleados, BASO representa la agrupación de basófilos, WBC-BASO representa la agrupación de leucocitos distintos de basófilos y WBC representa la agrupación de leucocitos. En semejante 50 diagrama de dispersión, los eritrocitos nucleados aparecen en la región que representa las partículas cuya intensidad de fluorescencia es menor que la de los leucocitos. De este modo, de acuerdo con una realización específica del método de la presente invención, la información de la luz dispersada es la información de la luz dispersada frontal, y los eritrocitos nucleados de la muestra se cuentan basándose en la información de la luz dispersada frontal y la información de fluorescencia en la etapa de clasificación y recuento. 55
Por consiguiente, los leucocitos pueden ser claramente discriminados de los eritrocitos nucleados. Además, los basófilos aparecen en la región que representa partículas cuyo tamaño es más grande, es decir, cuya intensidad de fluorescencia es mayor que la de los leucocitos distintos de los basófilos. De este modo, de acuerdo con una realización específica del método de la presente invención, la información de la luz dispersada es la información de 60 la luz dispersada frontal, y los basófilos de la muestra se cuentan basándose en la información de la luz dispersada frontal y la información de la fluorescencia en la etapa de clasificación y recuento.
Por consiguiente, los basófilos se pueden discriminar de los leucocitos distintos de los basófilos. Cuando se miden muestras de sangre que contienen una gran cantidad de leucocitos o muestras de sangre para las cuales ha 65 transcurrido un lapso de tiempo desde su recogida, los basófilos y los leucocitos distintos de los basófilos pueden no
discriminarse con exactitud en los diagramas de dispersión que emplean la intensidad de fluorescencia y la intensidad de luz dispersada frontal. En tales casos, se pueden utilizar la información de la luz dispersada frontal y la información de la luz dispersada lateral. De este modo, de acuerdo con otra realización específica del método de la presente invención, la información de la luz dispersada es la información de la luz dispersada frontal y la información de la luz dispersada lateral, y los basófilos de la muestra se cuentan basándose en la información de la luz 5 dispersada frontal y la información de la luz dispersada lateral en la etapa de clasificación y recuento.
En el diagrama de dispersión que tiene el eje de las x para la intensidad de la luz dispersada lateral y el eje de las y para la intensidad de la luz dispersada frontal, como se muestra en la Fig. 2 por ejemplo, los basófilos y los leucocitos distintos de los basófilos se distribuyen para formar agrupaciones respectivamente. En esta figura, BASO 10 representa la agrupación de basófilos y WBC-BASO representa la agrupación de leucocitos distintos de basófilos. En semejante diagrama de dispersión, los basófilos aparecen en la región que representa partículas cuya intensidad de luz dispersada lateral e intensidad dispersada frontal son mayores que las de otros leucocitos. Por consiguiente, los basófilos se pueden discriminar de otros leucocitos. Además, como se ha descrito anteriormente, los eritrocitos nucleados se pueden discriminar de otros leucocitos de acuerdo con la Fig. 1. Por lo tanto, las células que están 15 incluidas en ambas regiones en las Figs. 1 y 2 se pueden calcular como basófilos, de manera que se pueda llevar a cabo una medición más precisa de los basófilos.
Las posiciones de las agrupaciones para cada tipo de célula de la sangre que aparece en los diagramas de dispersión se pueden identificar tratando las muestras que contienen cada una un tipo de célula de la sangre 20 concreto con el kit de reactivos de la presente realización y llevando a cabo las mediciones.
El número y la proporción de eritrocitos nucleados y basófilos se pueden calcular analizando las agrupaciones de los diagramas de dispersión con un soporte lógico analítico apropiado. Específicamente, cuando se identifica una agrupación celular en un diagrama de dispersión en una posición en la que se supone que aparecen ciertas células, 25 se identifica el centro de esta agrupación. El límite de esta agrupación celular se puede identificar como un área que está localizada entre el centro y un área en la que aparece otra agrupación celular y se extiende hasta donde aparece esa cierta agrupación celular involucrada. Las células que aparecen en esta área identificada se pueden contar como las células involucradas. Además, por el recuento de leucocitos distintos de los basófilos, se puede calcular la proporción de basófilos con respecto a leucocitos totales (basófilos/leucocitos totales; en adelante referido 30 como "proporción de basófilos") y la proporción de eritrocitos nucleados con respecto a leucocitos totales (eritrocitos nucleados/leucocitos totales; en adelante referido como "proporción de eritrocitos nucleados"). De este modo, de acuerdo con una realización específica del método de la presente invención, los leucocitos de la muestra se clasifican adicionalmente y se cuentan basándose en la información de la luz dispersada y la información de fluorescencia en la etapa de clasificación y recuento. Asimismo, de acuerdo con otra realización específica del 35 método de la presente invención, la información de la luz dispersada es la información de la luz dispersada frontal, y los leucocitos de la muestra se clasifican y se cuentan basándose en la información de la luz dispersada frontal y la información de la fluorescencia en la etapa de clasificación y recuento.
La proporción de eritrocitos nucleados se representa generalmente como un porcentaje de los eritrocitos nucleados 40 que han aparecido por 100 leucocitos, y se expresa con la unidad "células/100 WBC".
Utilizando el kit de reactivos y el método para el análisis de muestras de acuerdo con las presentes realizaciones, las agrupaciones formadas por eritrocitos nucleados y basófilos, respectivamente, son claramente separadas de las agrupaciones formadas por otras células de la sangre, de manera que se puede llevar a cabo un recuento más preciso. 45
La presente invención se explica adicionalmente por medio de los siguientes Ejemplos. Sin embargo, se debe reconocer que se pueden efectuar varias alteraciones y modificaciones en la presente invención y el alcance de la misma no está limitado a los siguientes Ejemplos.
50
Ejemplos
Los tensioactivos catiónicos utilizados en los siguientes Ejemplos son bromuro de deciltrimetilamonio (DTAB) y cloruro de dodeciltrimetilamonio (LTAC).
55 Los tensioactivos no iónicos utilizados en los siguientes Ejemplos son los siguientes:
Polioxietilen(16) oleill éter (nombre del producto: NIKKOL BO-16);
Polioxietilen(20) cetil éter (nombre del producto: NIKKOL BC-20TX);
Polioxietilen(20) polioxipropilen(8) cetil éter (nombre del producto: NIKKOL PBC-44); 60
Polioxietilen(30) polioxipropilen(6) deciltetradecil éter (nombre del producto: NIKKOL PEN-4630);
Aceite de ricino polioxietilenado(20) (nombre del producto: NIKKOL CO-20TX);
Aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado (20) (nombre del producto: NIKKOL HCO-20);
Aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado(50) (nombre del producto: NIKKOL HCO-50);
Fitostanol polioxietilenado(25) (nombre del producto: NIKKOL BPSH-25). 65
Todos los anteriores se pueden obtener de Nikko Chemicals Co., Ltd.
Los ácidos carboxílicos aromáticos utilizados en los siguientes Ejemplos son ácido salicílico, ácido ftálico, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico y ácido aminobenzoico.
5 Los colorantes fluorescentes utilizados en los siguientes Ejemplos con NK-529, NK-2670, NK-3750, NK-3383, NK-1840, NK-9001, NK-9003, NK-2929, NK-3375, NK-5056, NK-3266 y NK-3620. Todos estos se pueden obtener de Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc. Las fórmulas químicas de estos colorantes se presentan en la Tabla 1.
Tabla 1 10
- Fórmulas generales
- Nombre del colorante Estructura
- R1
- R2 R3 R4 X
- NK-529 CH3 CH3 H H I-
- NK-2670
- CH3 CH3 H H ClO4-
- NK-3750
- CH3 CH3 H H BF4-
- NK-3383
- C4H9 C4H9 H H ClO4-
- NK-1840
- (CH2)3SO3- (CH2)3SO3Na H H -
- NK-9001
- (CH2)4SO3- (CH2)4SO3Na H H -
- NK-9003
- C4H3 C4H9 SO3Na SO3- -
- NK-2929 CH3 CH3 H H ClO4-
- NK-3375
- CH3 CH3 H H I-
- NK-5056
- (CH2)4SO3- (CH2)4SO3-N(H)(C2H5)3 H H -
- NK-3266 CH3 CH3 H H ClO4-
- NK-3620
- C4H9 C4H9 H H ClO4-
Ejemplo Comparativo 1
En este Ejemplo Comparativo, las muestras de sangre, para las cuales habían transcurrido aproximadamente 8 horas desde su recogida, se analizaron utilizando el método convencional. 15
Las muestras de sangre, tomadas respectivamente de tres sujetos, se midieron en el contador de células sanguíneas automático XE-2100 (Sysmex Corporation: equipado con un láser semiconductor rojo (633 nm)) para el recuento del número de leucocitos totales y el número de basófilos. Basándose en los resultados de estos recuentos, se calculó la proporción de basófilos. Se utilizó Stromatolyser-FBII (Sysmex Corporation) como reactivo. 20 Se midieron muestras de sangre para las cuales habían transcurrido aproximadamente 8 horas desde su recogida.
Como resultado, se confirmó que los contenidos de basófilos en estas muestras eran superiores al valor normal (en adelante estas muestras son referidas como muestras BASO 1, 2 y 3, respectivamente). La proporción de basófilos en las muestras BASO 1, 2 y 3 fueron de 0,8%, 3,4 % y 1,6%, respectivamente. Estos resultados se utilizaron como 25 referencia para los Ejemplos 1 y 2.
Los eritrocitos nucleados contenidos en las muestras de sangre tomadas de tres sujetos diferentes de los sujetos anteriormente descritos se midieron con un contador de células sanguíneas automático XE-2100 para contar el número de leucocitos totales y el número de eritrocitos nucleados. Basándose en los resultados del recuento, se 30 calculó la proporción de eritrocitos nucleados. Se utilizó Stromatolyser-NR (Sysmex Corporation) como reactivo. Se midieron las muestras de sangre para las cuales habían transcurrido aproximadamente 8 horas desde su recogida.
Como resultado, se confirmó que los eritrocitos nucleados estaban presentes en estas muestras (en adelante estas
muestras son referidas como muestras NRBC 1, 2 y 3, respectivamente). La proporción de eritrocitos nucleados en las muestras NRBC 1, 2 y 3 fue de 4,4 células/100 WBC, 1,9 células/100 WBC y 1,3 células/100 WBC, respectivamente. Estos resultados se utilizaron como referencia para los Ejemplos 1 y 2.
Ejemplo 1 5
En este Ejemplo, se prepararon el primer y segundo reactivos que tenían las siguientes composiciones y se midieron con estos reactivos las muestras de sangre para las cuales habían transcurrido aproximadamente 8 horas desde su recogida.
10 El pH del primer reactivo es de 3,0.
Primer reactivo A:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 0,5 mM, ácido DL-málico 10 mM, 2000 ppm de LTAC, y 1000 15 ppm de BO-16.
Primer reactivo B:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 0,5 mM, ácido DL-málico 10 mM, 1500 ppm de LTAC, y 1000 20 ppm de PBC-44.
Primer reactivo C:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 2000 ppm de LTAC, y 1000 ppm de BO-16. 25
Primer reactivo D:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 1500 ppm de LTAC, y 1000 ppm de PBC-44.
Primer reactivo E: 30
Es la solución acuosa que contiene ftalato ácido de potasio 0,5 mM, ácido DL-málico 10 mM, 2000 ppm de LTAC, y 1000 ppm de BO-16.
Primer reactivo F: 35
Es la solución acuosa que contiene ftalato ácido de potasio 2 mM, ácido DL-málico 10 mM, 1500 ppm de LTAC, y 1000 ppm de PBC-44.
Segundo reactivo: 40
Es aquél en el que se disolvieron 15 mg de NK-3383 en 100 ml de etileno glicol.
Se mezclaron cuidadosamente el primer reactivo (1 ml), 20 μL del segundo reactivo y 20 μL de la muestra de sangre (muestra BASO 1, 2 o 3 o muestra NRBC 1, 2 o 3), y mezcla obtenida de ese modo se dejó reaccionar a 40°C 45 durante 10 segundos para obtener la muestra de medición. La muestra de medición se introdujo la parte de detección del citómetro de flujo que tiene una fuente de luz de excitación con 633 nm, y se aplicó una luz de excitación a las células de la muestra de medición. La señal de luz dispersada y la señal fluorescente emitida a partir de las células se detectaron y analizaron para medir los basófilos, los eritrocitos nucleados y los leucocitos totales en la muestra de medición. Esta medición se llevó a cabo con el contador de células sanguíneas automático XE-2100. 50
Se examinaron muestras BASO 1 y 2 y las muestras NRBC 1 y 2 para las que han pasado aproximadamente 8 horas desde su recogida.
Se obtuvieron un primer diagrama de dispersión que tiene dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la 55 intensidad de fluorescencia y un segundo diagrama de dispersión que tiene dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y intensidad de luz dispersada lateral para la muestra de medición. La Fig. muestra los segundos diagramas de dispersión obtenidos en las mediciones de las muestras BASO 1 y 2 para las que han pasado aproximadamente 8 horas desde su recogida, y la Fig. La figura 4 muestra los primeros diagramas de dispersión obtenidos en las mediciones de las muestras NRBC 1 y 2 para las que han pasado aproximadamente 8 horas desde 60 su recogida.
Basándose en estos diagramas de dispersión, se contaron los leucocitos totales, los basófilos y los eritrocitos nucleados y se calcularon la proporción de basófilos y la proporción de eritrocitos nucleados. La Tabla 2 muestra las proporciones de basófilos de las muestras BASO 1 y 2 para las que han pasado 8 horas desde su recogida, que se 65 calcularon en el Ejemplo Comparativo 1 y en el presente Ejemplo. La Tabla 3 muestra las proporciones de eritrocitos
nucleados de las muestras NRBC 1 y 2 para las cuales han pasado 8 horas desde su recogida, que se calcularon en el Ejemplo Comparativo 1 y en el presente Ejemplo.
Tabla 2
- Muestras utilizadas
- Ejemplo Proporción de basófilos en el ejemplo comparativo (%)
- Reactivos utilizados
- Proporción de basófilos (%)
- Muestra BASO 1 (8 horas desde la recogida de sangre)
- Primer reactivo A y segundo reactivo 1,1 0,8
- Primer reactivo B y segundo reactivo
- 1,1
- Primer reactivo C y segundo reactivo
- 1,2
- Primer reactivo D y segundo reactivo 1,1
- Primer reactivo E y segundo reactivo
- 1,2
- Primer reactivo F y segundo reactivo
- 1,2
- Muestra BASO 2 (8 horas desde la recogida de sangre)
- Primer reactivo A y segundo reactivo 3,5 3,4
- Primer reactivo B y segundo reactivo
- 3,8
- Primer reactivo C y segundo reactivo
- 3,5
- Primer reactivo D y segundo reactivo
- 3,6
- Primer reactivo E y segundo reactivo
- 3,7
- Primer reactivo F y segundo reactivo
- 3,7
Tabla 3
- Muestras utilizadas
- Ejemplo Proporción de eritrocitos nucleados en el ejemplo comparativo (células/100 glóbulos blancos)
- Reactivos utilizados
- Proporción de eritrocitos nucleados (células/100 glóbulos blancos)
- Muestra de NRBC 1 (8 horas desde la recogida de sangre)
- Primer reactivo A y segundo reactivo 5,3 4,4
- Primer reactivo B y segundo reactivo
- 4,6
- Primer reactivo C y segundo reactivo
- 4,2
- Primer reactivo D y segundo reactivo
- 4,5
- Primer reactivo E y segundo reactivo
- 4
- Primer reactivo F
- 4,2
- Muestras utilizadas
- Ejemplo Proporción de eritrocitos nucleados en el ejemplo comparativo (células/100 glóbulos blancos)
- Reactivos utilizados
- Proporción de eritrocitos nucleados (células/100 glóbulos blancos)
- y segundo reactivo
- Muestra NRBC 2 (8 horas desde la recogida de sangre)
- Primer reactivo A y segundo reactivo 1,8 1,9
- Primer reactivo B y segundo reactivo
- 1,8
- Primer reactivo C y segundo reactivo
- 2,1
- Primer reactivo D y segundo reactivo
- 1,8
- Primer reactivo E y segundo reactivo
- 2
- Primer reactivo F y segundo reactivo
- 2
La Fig. La figura 3 demuestra que los basófilos están claramente discriminados de los leucocitos distintos de los basófilos cuando se utilizan los reactivos de análisis de muestras de acuerdo con la presente realización. La Fig. 4 demuestra que los eritrocitos nucleados están claramente discriminados de los basófilos y los leucocitos distintos de los basófilos cuando se utilizan los reactivos de análisis de muestras de acuerdo con la presente realización. Por lo 5 tanto, debido a que los basófilos y eritrocitos nucleados están claramente discriminados, respectivamente, se obtuvieron de forma precisa el número y la proporción de los mismos con respecto a los leucocitos totales mediante la identificación de las células que aparecen en ciertas áreas en los diagramas de dispersión como se muestra en las Figs. 3 y 4 como basófilos y eritrocitos nucleados.
10
Las Tablas 2 y 3 demuestran que las proporciones calculadas en el Ejemplo 1 eran estrechamente análogas a las proporciones calculadas en el Ejemplo Comparativo 1. Por lo tanto, se confirmó que los eritrocitos nucleados y basófilos se pueden medir con los reactivos de análisis de muestras del presente Ejemplo con tanta precisión como en el caso en el que se utilizó otro reactivo para las mediciones.
15
Ejemplo 2
En este Ejemplo, se utilizaron los primeros y segundos reactivos del Ejemplo 1 para medir las muestras de sangre para las que han pasado alrededor de 50 horas desde su recogida. El método para la medición fue el mismo que en el Ejemplo 1 a excepción de las muestras de sangre usadas. En este Ejemplo se midieron las muestras BASO 2 o 3 20 y las muestras NRBC 2 o 3 para las que han pasado aproximadamente 50 horas desde su recogida.
Entre los primeros reactivos A a F del Ejemplo 1, se utilizaron los primeros reactivos A, B, E y F para las mediciones de la muestra BASO 2 y la muestra NRBC 2, y se utilizaron los primeros reactivos C y D para las mediciones de la muestra BASO 3 y la muestra NRBC 3. 25
Al igual que en el Ejemplo 1, se obtuvieron un primer diagrama de dispersión que tiene dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia y un segundo diagrama de dispersión que tiene dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de luz dispersada lateral para la muestra de medición. La Fig. muestra el primer y segundo diagramas de dispersión obtenidos por las mediciones en las muestras BASO 2 para 30 las cuales han pasado aproximadamente 50 horas desde su recogida, y el primer diagrama de dispersión obtenido por las mediciones sobre las muestras NRBC 2 para las cuales han transcurrido aproximadamente 50 horas desde su recogida. La Fig. muestra el primer y segundo diagramas de dispersión obtenidos por las mediciones en las muestras BASO 3 para las cuales han transcurrido aproximadamente 50 horas desde su recogida, y el primer diagrama de dispersión obtenido por las mediciones sobre las muestras NRBC 3 para las cuales han transcurrido 35 alrededor de 50 horas desde su recogida.
Basándose en estos diagramas de dispersión, se sometieron a recuento los leucocitos totales, los basófilos y los eritrocitos nucleados y se calcularon la proporción de basófilos y la proporción de eritrocitos nucleados. La Tabla 4 muestra las proporciones de los basófilos de las muestras BASO 2 y 3 para las cuales han transcurrido aproximadamente 50 horas desde su recogida, que se calcularon en este Ejemplo. La Tabla 4 representa las 5 respectivas proporciones de basófilos calculadas de acuerdo con el primer diagrama de dispersión (la intensidad de luz dispersada emitida y la intensidad de fluorescencia) y el segundo diagrama de dispersión (la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de luz dispersada lateral). La Tabla 5 muestra las proporciones de eritrocitos nucleados de las muestras NRBC 2 y 3 para las cuales han transcurrido aproximadamente de 50 horas desde su recogida, que se calcularon en este Ejemplo. 10
Tabla 4
- Muestras utilizadas
- Reactivos utilizados Proporción de basófilos (%)
- Intensidad de luz dispersada frontal Intensidad de luz dispersada lateral
- Intensidad de luz dispersada frontal intensidad de fluorescencia
- Muestra BASO 2 (50 horas desde la recogida de sangre)
- Primer reactivo A y segundo reactivo 3,6 3,3
- Primer reactivo B y segundo reactivo
- 3,6 3,6
- Primer reactivo E y segundo reactivo
- 3,6 3,5
- Primer reactivo F y segundo reactivo
- 3,4 3,4
- Muestra BASO 3 (50 horas desde la recogida de sangre)
- Primer reactivo C y segundo reactivo 1,6 1,6
- Primer reactivo D y segundo reactivo
- 1,8 1,9
Tabla 5
- Muestras utilizadas
- Reactivos utilizados Proporción de eritrocitos nucleados (células/100 glóbulos blancos)
- Muestra NRBC 2 (50 horas desde la recogida de sangre)
- Primer reactivo A y segundo reactivo 1,9
- Primer reactivo B y segundo reactivo
- 1,8
- Primer reactivo E y segundo reactivo
- 1,8
- Primer reactivo F y segundo reactivo
- 1,8
- Muestra NRBC 3 (50 horas desde la recogida de sangre)
- Primer reactivo C y segundo reactivo 1,1
- Primer reactivo D y segundo reactivo
- 1,2
15
Las Figs. 5 y 6 de muestran que los basófilos de las muestras para las cuales han transcurrido aproximadamente 50 horas desde su recogida son claramente discriminados de los leucocitos distintos de los basófilos cuando se utilizan los reactivos de análisis de muestras de acuerdo con este Ejemplo. Además, se demuestra que los eritrocitos nucleados de las muestras para las cuales las cuales han transcurrido aproximadamente 50 horas desde su recogida son claramente discriminados de los basófilos y los leucocitos distintos de los basófilos cuando se utilizan 20 los reactivos de análisis de muestras de acuerdo con la presente realización. Por lo tanto, debido a que los basófilos y eritrocitos nucleados son claramente discriminados respectivamente incluso en las muestras para las cuales ha transcurrido un lapso de tiempo desde su recogida, el número y la proporción de los mismos con respecto a los leucocitos totales se obtuvieron con precisión mediante la identificación de las células que aparecen en ciertas áreas en los diagramas de dispersión como se muestra en las Figs. 5 y 6 como basófilos y eritrocitos nucleados. 25
Cuando se llevaron a cabo las mediciones por el método del Ejemplo Comparativo 1, las proporciones de los
basófilos en las muestras BASO 2 y 3 para las cuales han transcurrido aproximadamente 8 horas desde su recogida eran de 3,4% y 1,6%, respectivamente. Las proporciones de eritrocitos nucleados de las muestras NRBC 2 y 3 para las cuales han transcurrido aproximadamente 8 horas desde su recogida eran de 1,9 y 1,3 células/100 glóbulos blancos, respectivamente. Basándose en estos resultados en el Ejemplo Comparativo 1 y en las Tablas 4 y 5, las proporciones calculadas en el Ejemplo 2 fueron muy análogas a las proporciones calculadas en el Ejemplo 5 Comparativo 1. Por lo tanto, se confirmó que los eritrocitos nucleados y los basófilos se pueden medir, incluso en las muestras de sangre para las cuales ha transcurrido un lapso de tiempo desde su recogida, con los reactivos de análisis de muestras del presente ejemplo con tanta precisión como en el caso en el que se utilizó otro reactivo para las mediciones.
10
Además, de acuerdo a los resultados de la muestra BASO 2 en las Tablas 2 y 4, la proporción de basófilos calculada para la muestra para la cual han transcurrido aproximadamente 50 horas desde su recogida era muy análoga a la proporción de basófilos calculada para la muestra para la cual han transcurrido aproximadamente 8 desde su recogida. De acuerdo con los resultados de la muestra NRBC 2 en las Tablas 3 y 5, la proporción de eritrocitos nucleados calculada para la muestra para la cual han transcurrido aproximadamente 50 horas desde su recogida era 15 muy análoga a la proporción de eritrocitos nucleados calculada para la muestra para la cual han transcurrido aproximadamente 8 desde su recogida.
Por consiguiente, se confirmó que se pueden realizar mediciones de alta precisión con los reactivos de análisis de muestras de este Ejemplo, incluso cuando se utiliza la muestra para la cual ha transcurrido un lapso de tiempo 20 desde su recogida.
Ejemplo 3
En este Ejemplo, se estudiaron las combinaciones del tensioactivo catiónico, DTAB, y diversos tensioactivos no 25 iónicos. Se prepararon los primeros y segundos reactivos que tenían las siguientes composiciones. El pH del primer reactivo es 3,0.
Primer reactivo A:
30
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 3000 ppm de BO-16 y 3000 ppm de DTAB.
Primer reactivo B:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 7000 ppm de BO-16 y 7000 ppm de DTAB. 35
Primer reactivo C:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 3000 ppm de PBC-44 y 5000 ppm de DTAB.
40
Primer reactivo D:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 7000 ppm de PBC-44 y 7000 ppm de DTAB.
Primer reactivo E: 45
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 2000 ppm de BC-20TX y 3000 ppm de DTAB.
Primer reactivo F:
50 Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 2000 ppm de BC-20TX y 5000 ppm de DTAB.
Primer reactivo G:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 3000 ppm de BPSH-25 y 7000 ppm de DTAB. 55
Primer reactivo H:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 7000 ppm de BPSH-25 y 7000 ppm de DTAB.
60
Primer reactivo I:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 5000 ppm de HCO-50 y 5000 ppm de DTAB.
Primer reactivo J:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 7000 ppm de HCO-50 y 7000 ppm de DTAB.
Primer reactivo K:
5 Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 3000 ppm de HCO-20 y 5000 ppm de DTAB.
Primer reactivo L:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 7000 ppm de HCO-20 y 7000 ppm de DTAB. 10
Primer reactivo M:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 3000 ppm de CO-20TX y 5000 ppm de DTAB.
15
Primer reactivo N:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 7000 ppm de CO-20TX y 7000 ppm de DTAB.
Primer reactivo de O: 20
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 3000 ppm de PEN-4630 y 5000 ppm de DTAB.
Primer reactivo P:
25 Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 5000 ppm de PEN-4630 y 7000 ppm de DTAB.
Segundo reactivo:
Es etilenglicol que contiene 300 ppm de NK-3383. 30
Se mezclaron cuidadosamente el primer reactivo (1 ml), 20 μL del segundo reactivo y 20 μl de la muestra de sangre para la cual se ha confirmado la presencia de BASO o NRBC (muestra BASO 4 o muestra NRBC 4), y la mezcla así obtenida se dejó reaccionar a 41°C durante 10 segundos para obtener la muestra de medición. De un modo similar al Ejemplo 1, se midieron los basófilos, los eritrocitos nucleados y los leucocitos totales de la muestra de medición 35 utilizando un contador de células sanguíneas automático XE-2100. Se examinaron las muestras de sangre para las cuales han transcurrido aproximadamente 8 horas desde su recogida.
Para la muestra de medición preparada a partir de la muestra BASO 4, se obtuvieron un primer diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia y un 40 segundo diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de luz dispersada lateral. Para la muestra de medición preparada a partir de la muestra NRBC 4, se obtuvo un diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia. Las Figs. 7 a 10 muestran los respectivos diagramas de dispersión.
45
Las Figs. 7 a 10 demuestran que los basófilos son claramente discriminados de los leucocitos distintos de los basófilos cuando se utilizan los reactivos de análisis de muestras en los que se combinan DTAB y el tensioactivo no iónico. Además, se demuestra que los eritrocitos nucleados son claramente discriminados de los basófilos y los leucocitos distintos de los basófilos cuando se utilizan los reactivos de análisis de muestras en los que se combinan DTAB y el tensioactivo no iónico. 50
También se demostró que los basófilos contenidos en la muestra BASO 4 utilizada en este Ejemplo fueron claramente discriminados de los leucocitos distintos de los basófilos en el segundo y en el primer diagrama de dispersión que tenían dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de la luz dispersada lateral, y dos ejes de la intensidad de la luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia, respectivamente. 55
Por lo tanto, debido a que los basófilos y los eritrocitos nucleados son claramente discriminados, respectivamente, se pueden obtener con precisión el número y la proporción de los mismos con respecto a los leucocitos totales mediante la identificación de las células que aparecen en ciertas áreas en los diagramas de dispersión, como se muestra en las Figs. 7 a 10, como basófilos y eritrocitos nucleados. 60
Ejemplo 4
En este Ejemplo, se estudiaron las combinaciones de tensioactivo catiónico, LTAC, y diversos tensioactivos no iónicos. Se prepararon los primeros y segundos reactivos que tenían las siguientes composiciones. El pH del primer 65
reactivo es 3,0.
Primer reactivo A:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 1000 ppm de BO-16 y 1000 ppm de LTAC. 5
Primer reactivo B:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 5000 ppm de BO-16 y 2000 ppm de LTAC.
10
Primer reactivo C:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 1000 ppm de LTAC.
Primer reactivo D: 15
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 5000 ppm de PBC-44 y 2000 ppm de LTAC.
Primer reactivo E:
20 Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 1000 ppm de BC-20TX y 1000 ppm de LTAC.
Primer reactivo F:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 5000 ppm de BC-20TX y 2000 ppm de LTAC. 25
Primer reactivo G:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 1000 ppm de BPSH-25 y 1500 ppm de LTAC.
30
Primer reactivo H:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 5000 ppm de BPSH-25 y 2000 ppm de LTAC.
Primer reactivo I: 35
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 1000 ppm de HCO-50 y 1000 ppm de LTAC.
Primer reactivo J:
40 Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 7000 ppm de HCO-50 y 2000 ppm de LTAC.
Primer reactivo K:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 1000 ppm de HCO-20 y 1000 ppm de LTAC. 45
Primer reactivo L:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 7000 ppm de HCO-20 y 2000 ppm de LTAC.
50
Primer reactivo M:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 1000 ppm de PEN-4630 y 1000 ppm de LTAC.
Primer reactivo N: 55
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 10 mM, 5000 ppm de PEN-4630 y 1800 ppm de LTAC.
Segundo reactivo:
60
Es etilenglicol que contiene 300 ppm de NK-3383.
Se mezclaron cuidadosamente el primer reactivo (1 ml), 20 μL del segundo reactivo y 20 μl de la muestra de sangre para la que se había confirmado la presencia de BASO o NRBC (muestra BASO 5 o muestra NRBC 5), y la mezcla así obtenida se dejó reaccionar a 41°C durante 10 segundos para obtener la muestra de medición. De un modo 65 similar al Ejemplo 1, se midieron los basófilos, los eritrocitos nucleados y los leucocitos totales en la muestra de
medición utilizando el contador automático de células sanguíneas XE-2100. Se midieron las muestras de sangre para las cuales habían transcurrido aproximadamente 8 horas desde su recogida.
Para la muestra de medición preparada a partir de la muestra BASO 5, se obtuvieron un primer diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia y un segundo diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de luz 5 dispersada lateral. Para la muestra de medición preparada a partir de la muestra NRBC 5, se obtuvo un diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de la luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia. Las Figs. 11 a 14 muestran los respectivos diagramas de dispersión.
Las Figs. 11 a 14 demuestran que los basófilos son claramente discriminados de los leucocitos distintos de los 10 basófilos cuando se utilizan los reactivos de análisis de muestras en los que se combinan LTAC y el tensioactivo no iónico. Además, se demuestra que los eritrocitos nucleados son claramente discriminados de los basófilos y los leucocitos distintos de los basófilos cuando se utilizan los reactivos de análisis de muestras en los que se combinan LTAC y el tensioactivo no iónico.
15
También se demostró que los basófilos contenidos en la muestra BASO 5 utilizada en este Ejemplo fueron claramente discriminados de los leucocitos distintos de los basófilos en cualquiera del segundo y el primer diagramas de dispersión que tenían dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de luz dispersada lateral, y dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia, respectivamente. 20
Por lo tanto, debido a que los basófilos y los eritrocitos nucleados son claramente discriminados, respectivamente, se pueden obtener con precisión el número y la proporción de los mismos con respecto a los leucocitos totales mediante la identificación de las células que aparecen en ciertas áreas en los diagramas de dispersión, como se muestra en las Figs. 11 a 14, como basófilos y eritrocitos nucleados. 25
Los Ejemplos 3 y 4 demuestran que los eritrocitos nucleados y los basófilos de las muestras de sangre pueden ser claramente discriminados de otros leucocitos y sometidos a recuento mediante el uso de los reactivos de análisis de muestras en las que se combinan tensioactivos catiónicos y tensioactivos no iónicos.
30
Ejemplo 5
En este Ejemplo, se estudiaron las combinaciones de ácidos carboxílicos aromáticos y agentes de tamponamiento. Se prepararon los primeros y segundos reactivos que tenían las siguientes composiciones. El pH del primer reactivo es 3,0. 35
Primer reactivo A:
Es la solución acuosa que contiene ftalato ácido de potasio 10 mM, ácido DL-málico 0 mM, 1000 ppm de BO-16, y 2000 ppm de LTAC. 40
Primer reactivo B:
Es la solución acuosa que contiene ftalato ácido de potasio 5 mM, ácido DL-málico 5 mM, 1000 ppm de BO-16 y 2000 ppm de LTAC. 45
Primer reactivo C:
Es la solución acuosa que contiene ftalato ácido de potasio 1 mM, ácido DL-málico 9 mM, 1000 ppm de BO-16 y 2000 ppm de LTAC. 50
Primer reactivo D:
Es la solución acuosa que contiene ftalato ácido de potasio 0,3 mM, ácido DL-málico 9,7 mM, 1000 ppm de BO-16 y 2000 ppm de LTAC. 55
Primer reactivo E:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 5 mM, ácido DL-málico 5 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 1500 ppm de LTAC. 60
Primer reactivo F:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 1 mM, ácido DL-málico 9 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 1500 ppm de LTAC. 65
Primer reactivo G:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 0,22 mM, ácido DL-málico 10 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 1500 ppm de LTAC.
5
Primer reactivo H:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 5 mM, ácido DL-málico 5 mM, 1000 ppm de BO-16 y 2000 ppm de LTAC.
10
Primer reactivo I:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 1 mM, ácido DL-málico 9 mM, 1000 ppm de BO-16 y 2000 ppm de LTAC.
15
Primer reactivo J:
Es la solución acuosa que contiene salicilato de sodio 0,24 mM, ácido DL-málico 10 mM, 1000 ppm de BO-16 y 2000 ppm de LTAC.
20
Segundo reactivo:
Es etilenglicol que contiene 300 ppm de NK-3383.
Se mezclaron cuidadosamente el primer reactivo (1 ml), 20μL del segundo reactivo y 20 μl de la muestra de sangre 25 para la que se había confirmado la presencia de BASO o NRBC (muestra BASO 6 o muestra NRBC 6), y mezcla obtenida de ese modo se dejó reaccionar a 41°C durante 10 segundos para obtener la muestra de medición. De un modo similar al Ejemplo 1, los basófilos, los eritrocitos nucleados y los leucocitos totales de la muestra de medición se midieron utilizando el contador automático de células sanguíneas XE-2100. Se midieron las muestras de sangre para las cuales habían transcurrido aproximadamente 8 horas desde su recogida. 30
Para la muestra de medición preparada a partir de la muestra BASO 6, se obtuvieron un primer diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia y un segundo diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de luz dispersada lateral. Para la muestra de medición preparada a partir de la muestra NRBC 6, se obtuvo un diagrama de 35 dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia. Las Figs. 15 a 17 muestran los respectivos diagramas de dispersión.
Las Figs. 15 a 17 demuestran que los basófilos son claramente discriminados de los leucocitos distintos de los basófilos cuando se utilizan los reactivos de análisis de muestras en los que se combinan el ácido carboxílico 40 aromático y el agente tamponador. Además, se demuestra que los eritrocitos nucleados son claramente discriminados de los basófilos y los leucocitos distintos de los basófilos cuando se utilizan los reactivos de análisis de muestras en los que se combinan el ácido carboxílico aromático y el agente tamponador.
También se demostró que los basófilos contenidos en la muestra BASO 6 utilizada en este Ejemplo fueron 45 claramente discriminados de los leucocitos distintos de los basófilos en cualquiera del segundo y primer diagramas de dispersión que tenían dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de la luz dispersada lateral, y dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia, respectivamente.
Por lo tanto, debido a que los basófilos y los eritrocitos nucleados son claramente discriminados, respectivamente, 50 se pueden obtener con precisión el número y la proporción de los mismos con respecto a los leucocitos totales mediante la identificación de las células que aparecen en ciertas áreas en los diagramas de dispersión, como se muestra en las Figs. 15 a 17, como los basófilos y eritrocitos nucleados.
En la figura. 15, se identificaron los baricentros de las agrupaciones de eritrocitos nucleados, basófilos y leucocitos 55 distintos de los basófilos, se obtuvieron los valores de la intensidad de fluorescencia correspondientes a los respectivos baricentros, y se compararon los valores obtenidos (datos no mostrados). Los baricentros de las respectivas agrupaciones se obtuvieron mediante un método conocido (véase la Publicación de Patente Japonesa No Examinada HEI 5(1993)-149863). Como resultado, se demostró que la diferencia entre la intensidad de fluorescencia de los eritrocitos nucleados y la intensidad de fluorescencia de los basófilos o leucocitos distintos de 60 los basófilos es más grande cuando se utilizaron los reactivos de análisis de muestras que contienen solamente ácido ftálico y ácido málico (primeros reactivos B a D) en comparación con los reactivos de análisis de muestras que contienen sólo ácido ftálico (primer reactivo A). Se demostró también que, entre los reactivos de análisis de muestras que contienen tanto ácido ftálico como ácido málico (primeros reactivos B a D), la diferencia entre la intensidad de fluorescencia de los eritrocitos nucleados y la intensidad de fluorescencia de los basófilos o leucocitos distintos de 65 los basófilos es más grande para el reactivo con mayor concentración de ácido málico (primeros reactivos C y D).
Se observó una tendencia similar en las Figs. 16 y 17 para los reactivos de análisis de muestras que contenían ácido salicílico y ácido málico (primeros reactivos E a J). Como resultado, se demostró que el rendimiento de la discriminación, en particular, de los eritrocitos nucleados se mejora mediante la combinación del ácido carboxílico aromático y el agente tamponador. 5
Ejemplo 6
En este ejemplo, se utilizaron diversos colorantes como colorante fluorescente en el segundo reactivo. Se prepararon los primeros y segundos reactivos que tenían las siguientes composiciones. El pH del primer reactivo es 10 3,0.
Primer reactivo:
Es la solución acuosa que contiene ftalato ácido de potasio 0,5 mM, ácido DL-málico 10 mM, 1000 ppm de BO-16 y 15 2000 ppm de LTAC.
Segundo reactivo A:
Es etilenglicol que contiene 150 ppm de NK-529. 20
Segundo reactivo B:
Es etilenglicol que contiene 150 ppm de NK-2670.
25
Segundo reactivo C:
Es etilenglicol que contiene 150 ppm de NK-3750.
Segundo reactivo D: 30
Es etilenglicol que contiene 150 ppm de NK-3383.
Segundo reactivo E:
35 Es etilenglicol que contiene 150 ppm de NK-1840.
Segundo reactivo F:
Es etilenglicol que contiene 150 ppm de NK-9001. 40
Segundo reactivo G:
Es etilenglicol que contiene 300 ppm de NK-9003.
45
Segundo reactivo H:
Es etilenglicol que contiene 150 ppm de NK-2929.
Segundo reactivo I: 50
Es etilenglicol que contiene 150 ppm de NK-3375.
Segundo J reactivo:
55 Es etilenglicol que contiene 300 ppm de NK-5056.
Segundo reactivo K:
Es etilenglicol que contiene 150 ppm de NK-3266. 60
Segundo reactivo L:
Es etilenglicol que contiene 150 ppm de NK-3620.
Se mezclaron cuidadosamente el primer reactivo (1 ml), 20 μL del segundo reactivo y 20 μl de la muestra de sangre 65 para la que se había confirmado la presencia de BASO o NRBC (muestra BASO 7 o muestra NRBC 7), la mezcla
obtenida de ese modo se dejó reaccionar a 41°C durante 10 segundos para obtener la muestra de medición. De un modo similar al Ejemplo 1, los basófilos, los eritrocitos nucleados y los leucocitos totales de la muestra de medición se midieron utilizando el contador automático de células sanguíneas XE-2100.
Se examinaron las muestras de sangre para las cuales habían transcurrido aproximadamente 8 horas desde su 5 recogida.
Para la muestra de medición preparada a partir de la muestra BASO 7, se obtuvieron un primer diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia y un segundo diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de luz 10 dispersada lateral. Para la muestra de medición preparada a partir de la muestra NRBC 7, se obtuvo un diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia. Las Figs. 18 a 20 muestran los respectivos diagramas de dispersión.
Las Figs. 18 a 20 demuestran que los basófilos son claramente discriminados de los leucocitos distintos de los 15 basófilos mediante el uso de los reactivos de análisis de muestras que contienen cualquiera de los colorantes fluorescentes.
Además, se demuestra que los eritrocitos nucleados son claramente discriminados de los basófilos y los leucocitos distintos de los basófilos mediante el uso de los reactivos de análisis de muestras que contienen cualquiera de los 20 colorantes fluorescentes.
También se demostró que los basófilos contenidos en la muestra BASO 7 utilizada en este Ejemplo fueron claramente discriminados de los leucocitos distintos de los basófilos en cualquiera de los segundos y primeros diagramas de dispersión que tienen dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de luz 25 dispersada lateral, y dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia, respectivamente.
Por lo tanto, debido a que los basófilos y los eritrocitos nucleados son claramente discriminados, respectivamente, se pueden obtener con precisión el número y la proporción de los mismos con respecto a los leucocitos totales 30 mediante la identificación de las células que aparecen en ciertas áreas en los diagramas de dispersión, como se muestra en las Figs. 18 a 20, como basófilos y eritrocitos nucleados.
Ejemplo 7
35
Estudio sobre el tipo de ácidos benzoicos
En este Ejemplo, se utilizaron benzoato de potasio, 4-hidroxibenzoato de sodio, 3-hidroxibenzoato de sodio y 4-aminobenzoato de potasio como ácidos carboxílicos aromáticos. Se prepararon los primeros y segundos reactivos que tenían las siguientes composiciones. El pH del primer reactivo es 3,0. 40
Primer reactivo A:
Es la solución acuosa que contiene benzoato de potasio 2 mM, ácido DL-málico 8 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 2500 ppm de LTAC. 45
Primer reactivo B:
Es la solución acuosa que contiene benzoato de potasio 3 mM, ácido DL-málico 7 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 2500 ppm de LTAC. 50
Primer reactivo C:
Es la solución acuosa que contiene benzoato de potasio 4 mM, ácido DL-málico 6 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 2500 ppm de LTAC. 55
Primer reactivo D:
Es la solución acuosa que contiene 4-hidroxibenzoato de sodio 7 mM, ácido DL-málico 3 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 2500 ppm de LTAC. 60
Primer reactivo E:
Es la solución acuosa que contiene 4-hidroxibenzoato de sodio 8 mM, ácido DL-málico 2 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 2500 ppm de LTAC.
Primer reactivo F:
Es la solución acuosa que contiene 3-hidroxibenzoato de sodio 4 mM, ácido DL-málico 6 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 2500 ppm de LTAC.
Primer reactivo G: 5
Es la solución acuosa que contiene 3-hidroxibenzoato de sodio 5 mM, ácido DL-málico 5 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 2500 ppm de LTAC.
Primer reactivo H: 10
Es la solución acuosa que contiene benzoato de potasio 1 mM, ácido DL-málico 9 mM, 2000 ppm de BO-16 y 2800 ppm de LTAC.
Primer reactivo I: 15
Es la solución acuosa que contiene 4-aminobenzoato de potasio 2 mM, ácido DL-málico 8 mM, 2000 ppm de BO-16 y 2800 ppm de LTAC.
La solución acuosa que contiene ftalato ácido de potasio 2 mM, ácido DL-málico 10 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 20 2500 ppm de LTAC se utilizó como referencia para los primeros reactivos A a G, y la solución acuosa que contiene ftalato ácido de potasio 0,5 mM, ácido DL-málico 10 mM, 2000 ppm de BO-16 y 2800 ppm de LTAC se utilizó como referencia para los primeros reactivos H e I.
Segundo reactivo: 25
Es etilenglicol que contiene 150 ppm de NK-3383.
Se mezclaron cuidadosamente el primer reactivo (1 ml), 20 μl del segundo reactivo y 20 μl de la muestra de sangre para la cual se había confirmado la presencia de BASO o NRBC (muestras BASO 8 y 9 o muestras NRBC 8 y 9), y 30 mezcla así obtenida se dejó reaccionar a 41°C durante 7 segundos para obtener la muestra de medición. De un modo similar al Ejemplo 1, se midieron los basófilos, los eritrocitos nucleados y los leucocitos totales de la muestra de medición utilizando el contador automático de células sanguíneas XE-2100. Se examinaron las muestras de sangre para las cuales habían transcurrido aproximadamente 8 horas desde su recogida.
35 Para las muestras de medición elaboradas a partir de las muestras BASO 8 y 9, se obtuvieron un primer diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia y un segundo diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de luz dispersada lateral. Para las muestras preparadas a partir de muestras de medición de NRBC 8 y 9, se obtuvo un diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia. 40 Las Figs. 21 y 22 muestran los respectivos diagramas de dispersión.
Las Figs. 21 y 22 demuestran que los basófilos son claramente discriminados de los leucocitos distintos de los basófilos en cualquier caso. Además, se demuestra que los eritrocitos nucleados son claramente discriminados de los basófilos y los leucocitos distintos de los basófilos en cualquier caso. 45
También se demostró que los basófilos contenidos en las muestras BASO 8 y 9 utilizadas en este Ejemplo fueron claramente discriminados de los leucocitos distintos de los basófilos en cualquiera de los segundos y primeros diagramas de dispersión que tenían dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de luz dispersada lateral, y dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia, 50 respectivamente.
Por lo tanto, debido a que los basófilos y los eritrocitos nucleados son claramente discriminados, respectivamente, se pueden obtener con precisión el número y la proporción de los mismos con respecto a los leucocitos totales mediante la identificación de las células que aparecen en ciertas áreas en los diagramas de dispersión, como se 55 muestra en las Figs. 21 a 22, como basófilos y eritrocitos nucleados.
Ejemplo 8
Combinación de ftalato ácido de potasio y benzoato de potasio
60 En este Ejemplo, se estudiaron las combinaciones de ftalato ácido de potasio y benzoato de potasio como ácidos carboxílicos aromáticos. Se prepararon los primeros y segundos reactivos que tenían las siguientes composiciones. El pH del primer reactivo es 3,0.
Primer reactivo A:
Es la solución acuosa que contiene ftalato ácido de potasio 2 mM, ácido DL-málico 10 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 2500 ppm de LTAC.
Primer reactivo B: 5
Es la solución acuosa que contiene hidrogenoftalato ácido de potasio 1,5 mM, benzoato de potasio 0,5 mM, ácido DL-málico 10 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 2500 ppm de LTAC.
Primer reactivo C: 10
Es la solución acuosa que contiene ftalato ácido de potasio 1,33 mM, benzoato de potasio 0,66 mM, ácido DL-málico 10 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 2500 ppm de LTAC.
Primer reactivo D: 15
Es la solución acuosa que contiene ftalato ácido de potasio 1 mM, benzoato de potasio 1 mM, ácido DL-málico 10 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 2500 ppm de LTAC.
Primer reactivo E: 20
Es la solución acuosa que contiene ftalato ácido de potasio 0,66 mM, benzoato de potasio 1,33 mM, ácido DL-málico 10 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 2500 ppm de LTAC.
Primer reactivo F: 25
Es la solución acuosa que contiene ftalato ácido de potasio 0,5 mM, benzoato de potasio 1,5 mM, ácido DL-málico 10 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 2500 ppm de LTAC.
Primer reactivo G: 30
Es la solución acuosa que contiene benzoato de potasio 2 mM, ácido DL-málico 10 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 2500 ppm de LTAC.
Segundo reactivo: 35
Es etilenglicol que contiene 150 ppm de NK-3383.
Se mezclaron cuidadosamente el primer reactivo (1 ml), 20 μL del segundo reactivo y 20 μl de la muestra de sangre para la que se había confirmado la presencia de BASO o NRBC (muestra BASO 10 o muestra NRBC 10), y mezcla 40 obtenida de ese modo se dejó reaccionar a 41°C durante 7 segundos para obtener la muestra de medición. De un modo similar al Ejemplo 1, se midieron los basófilos, los eritrocitos nucleados y los leucocitos totales de la muestra de medición el contador automático de células sanguíneas XE-2100. Se examinaron las muestras de sangre para las cuales habían transcurrido aproximadamente 8 horas desde su recogida.
45 Para la muestra de medición preparada a partir de la muestra BASO 10, se obtuvieron un primer diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia y un segundo diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de luz dispersada lateral. Para la muestra de medición preparadas a partir de la muestra NRBC 10, se obtuvo un diagrama de dispersión que tenía dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia. La Fig. 50 23 muestra los respectivos diagramas de dispersión. La Fig. 23 demuestra que los basófilos son claramente discriminados de los leucocitos distintos de los basófilos en cualquier caso. Además, se demuestra que los eritrocitos nucleados están claramente discriminados de los basófilos y los leucocitos distintos de los basófilos en cualquier caso.
55 También se demostró que los basófilos contenidos en la muestra BASO 10 utilizada en este Ejemplo fueron claramente discriminados de los leucocitos distintos de los basófilos en cualquiera de los segundos y primeros diagramas de dispersión que tenían dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de luz dispersada lateral, y dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia, respectivamente. 60
Se ha encontrado que la cantidad de fantasmas se reduce ventajosamente cuando se utiliza hidrogenoftalato de potasio y que la fracción de WBC y la fracción de NRBC son claramente discriminadas con benzoato de potasio. Mediante el uso de los mismos combinados, los basófilos y los eritrocitos nucleados son más claramente discriminados, respectivamente. 65
Por lo tanto, debido a que los basófilos y los eritrocitos nucleados son claramente discriminados, respectivamente, se pueden obtener con precisión el número y la proporción de los mismos con respecto a los leucocitos totales mediante la identificación de las células que aparecen en ciertas áreas de los diagramas de dispersión, como se muestra en la Fig. 23, como basófilos y eritrocitos nucleados. 5
Ejemplo 9
Medición de la muestra de sangre para la cual ha transcurrido poco tiempo desde su recogida
10
En este ejemplo, se midieron tanto NRBC como BASO en muestras de sangre para las cuales había transcurrido poco tiempo desde su recogida con los reactivos de la presente invención, mediante el uso de un diagrama de dispersión que tenía el eje x de la intensidad de fluorescencia y el eje y de la intensidad de luz dispersada frontal. Se prepararon los primeros y segundos reactivos que tenían las siguientes composiciones.
15
Primer reactivo (agente de hemólisis):
Es la solución acuosa que contiene ftalato ácido de potasio 2 mM, ácido DL-málico 10 mM, 1000 ppm de PBC-44 y 2000 ppm de LTAC. El pH del primer reactivo es 3,0.
20
Segundo reactivo (solución de tinción):
Es etilenglicol que contiene 50 ppm de NK-3383.
Las muestras de sangre utilizadas fueron: 25
Muestras de sangre para las que se había confirmado la presencia de BASO (muestras BASO): 12 muestras; y
Muestras de sangre para las que se había confirmado la presencia de NRBC (muestras NRBQ): 12 muestras.
Todas las muestras de sangre son aquellas para las cuales han transcurrido cerca de 2 a 7 horas desde su recogida. 30
Se mezclaron cuidadosamente el primer reactivo (1 ml), 20 μL del segundo reactivo y 20 μl de la muestra de sangre (muestra BASO o NRBC), y la mezcla así obtenida se dejó reaccionar a 41°C durante 7 segundos para obtener la muestra de medición. De un modo similar al Ejemplo 1, los basófilos, los eritrocitos nucleados y los leucocitos totales de la muestra de medición se midieron utilizando el contador de células sanguíneas automático XE-21 00. 35
Para las muestras de medición elaboradas a partir de muestras BASO o NRBC, se obtuvieron los diagramas de dispersión que tenían dos ejes de la intensidad de luz dispersada frontal y la intensidad de fluorescencia. La Fig. 25 muestra uno de los diagramas de dispersión de la medición de muestras BASO. La Fig. 26 muestra uno de los diagramas de dispersión de la medición de muestras NRBC. 40
Las Figs. 25 y 26 demuestran que los presentes reactivos permiten la separación de NRBC y BASO en las muestras de sangre para la que ha transcurrido poco tiempo después de su recogida.
En los diagramas de dispersión anteriores, los leucocitos totales, los basófilos y los eritrocitos nucleados se 45 identificaron como las células que aparecen en ciertas regiones y se contaron. Las proporciones de los basófilos y los eritrocitos nucleados con respecto a los leucocitos totales se obtuvieron a partir de los números de células obtenidos.
Los números de leucocitos totales, los basófilos y los eritrocitos nucleados y las proporciones de los basófilos y 50 eritrocitos nucleados con respecto a los leucocitos totales se obtuvieron como referencia para las mismas muestras de sangre por el mismo procedimiento que en el Ejemplo Comparativo 1.
La Fig. 27 muestra las correlaciones del número de leucocitos totales, la proporción de basófilos y la proporción de eritrocitos nucleados entre los resultados de las mediciones con los reactivos anteriores (primer reactivo y segundo 55 reactivo) y las de la referencia. Los resultados del número de leucocitos totales para el Ejemplo 9 y la referencia mostrada en la Fig. 27 se obtuvieron a partir de la medición de la muestra BASO.
La Fig. 27 demuestra que los coeficientes de correlación (r) entre los resultados obtenidos con los presentes reactivos y la referencia en cualquiera de los números de leucocitos totales, la proporción de basófilos y la 60 proporción de eritrocitos nucleados eran de 0,9 o más, lo de que demuestra la fuerte correlación entre ellos. Por consiguiente, se encontró que NRBC y BASO se pueden medir con los presentes reactivos en muestras de sangre para las cuales ha transcurrido poco tiempo desde su recogida.
Claims (13)
- REIVINDICACIONES1. Un kit de reactivos para el análisis de una muestra para medir basófilos y eritrocitos nucleados en la muestra, que comprende:un primer reactivo que contiene un agente tensioactivo catiónico, un tensioactivo no iónico y un ácido 5 carboxílico aromático, que puede lisar los eritrocitos y dañar la membrana celular de los leucocitos de manera que un colorante fluorescente puede penetrar a través de la misma, en donde dicho tensioactivo catiónico es una sal de amonio cuaternario o una sal de piridinio, y dicho tensioactivo no iónico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un polioxietilenalquiléter, polioxietilenpolioxipropilenalquiléter, un aceite de ricino polioxietilenado, un aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado, un esterol polioxietilenado y 10 un esterol hidrogenado polioxietilenado, yun segundo reactivo que contiene el colorante fluorescente capaz de teñir ácido nucleico, en donde dicho colorante fluorescente es al menos un colorante seleccionado del grupo que consiste en un colorante fluorescente que tiene la fórmula general (I):15en donde:R1 y R2 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo; 20R3, R4, R5 y R6 son, iguales o diferentes entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo; y X- es un anión; yun colorante fluorescente que tiene la fórmula general (II): 25en donde:30R7 y R8 son, iguales o diferentes entre sí, un grupo alquilo que contiene opcionalmente un grupo ácido;y R9, R10, R11 y R12 son, iguales o diferentes entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo ácido, a condición de que uno cualquiera de R7 a R12 sea/tenga un grupo ácido; y el grupo ácido que puede estar presente en R7 a R12 puede formar una sal, siempre que cualquiera de los grupos ácido que puede presente en R7 a R12 sea 5 un grupo del que se haya liberado un protón.
- 2. El kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el grupo ácido que puede estar presente en R7 a R12 en la fórmula general (II) es un grupo sulfónico.10
- 3. El kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el grupo ácido que puede estar presente en R7 a R12 en la fórmula general (II) es un grupo de una sal de metal alcalino.
- 4. El kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ácido carboxílico aromático es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido salicílico, ácido ftálico, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, ácido 15 aminobenzoico y una sal del mismo.
- 5. El kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el pH del primer reactivo es ácido.
- 6. El kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer reactivo comprende un agente 20 tamponador que tiene un pKa en el intervalo de pH 2,0 a 4,5.
- 7. El kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el agente tamponador es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido málico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido diglicólico, ácido malónico y ácido succínico. 25
- 8. Un método para analizar una muestra que comprende los siguientes pasos:lisar los eritrocitos de la muestra y dañar la membrana celular de las células de la sangre de manera que un colorante fluorescente pueda penetrar a través de la misma, en virtud del primer reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, y teñir las células dañadas en virtud del segundo reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, 30aplicar la luz a las células teñidas para obtener información de la luz dispersada e información de la fluorescencia yclasificar y contar los basófilos y eritrocitos nucleados de la muestra basándose en la información de la luz dispersada y la información de la fluorescencia.35
- 9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la información de la luz dispersada es la información de la luz dispersada frontal y los eritrocitos nucleados de la muestra se cuentan basándose en la información de la luz dispersada frontal y la información de la fluorescencia en la etapa de clasificación y recuento.
- 10. El método de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en donde la información de la luz dispersada es la información 40 de la luz dispersada frontal, y los basófilos de la muestra se cuentan basándose en la información de la luz dispersada frontal y la información de la fluorescencia en la etapa de clasificación y recuento.
- 11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la información de la luz dispersada es la información de la luz información dispersada frontal y la información de la luz dispersada lateral, y los basófilos de la muestra se 45 cuentan basándose en la información de la luz dispersada frontal y la información de la luz dispersada lateral en la etapa de clasificación y recuento.
- 12. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde los leucocitos de la muestra se clasifican y se cuentanadicionalmente basándose en la información de la luz dispersada y la información de la fluorescencia en la etapa de clasificación y recuento.
- 13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la información de la luz dispersada es la información de la luz dispersada frontal y los leucocitos de la muestra se clasifican y se cuentan basándose en la información de la 5 luz dispersada frontal y la información de la fluorescencia en la etapa de clasificación y recuento.
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