KR20100055382A - 시료 분석용 시약 키트 및 시료 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 방향족 카르본산을 함유하는 제1 시약과 핵산을 염색 가능한 형광 색소를 함유하는 제2 시약을 포함하는 시료 분석용 시약 키트 및 상기 키트를 이용하는 시료 분석 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 생체로부터 채취된 시료 중의 혈구를 분석하기 위한 시료 분석용 시약 키트 및 시료 분석 방법에 관한 것이다.
임상 검사 분야에 있어 시료 중의 혈구 성분의 분석은 피험자의 순환기 등에서의 여러 가지 질환을 진단하는데 있어서 매우 유용하다. 질환에 따라서는 특정 혈구 수가 증가 또는 감소하거나, 통상으로는 존재하지 않는 혈액 세포가 말초혈에 출현하거나 하는 경우가 있다.
최근 플로 사이토메트리(flow cytometry)의 원리를 응용한 여러 가지의 자동 혈구 계수 장치가 시판되고 있다. 이러한 자동 혈구 계수 장치를 이용하면 시료 중의 혈구의 분류·계수를 자동으로 실시할 수 있다.
백혈구는 통상 임파구, 단구, 호중구, 호산구 및 호염기구의 5 종류로 분류된다. 이 중 호염기구는 통상 혈액 시료에 포함되는 수가 적다. 그 때문에 한 번의 측정으로 백혈구를 5 종류로 분류하는 방법으로 호염기구를 측정하는 것보다 혈액 시료에 호염기구 측정 전용의 처리를 실시하여 호염기구를 측정하는 쪽이 보다 정확하게 분류를 실시할 수 있다. 호염기구에는 산성 조건하에서는 다른 백혈구에 비해 파괴되기 어렵다고 하는 특성이 있다. 특허문헌 1 및 특허문헌 2에는 그 특성을 이용한 호염기구 측정 전용 처리를 실시함으로써 호염기구를 다른 백혈구로부터 변별하는 것이 기재되어 있다.
또 백혈구의 측정에 있어서 자주 문제가 되는 것은 유핵적혈구의 출현이다. 유핵적혈구는 핵을 가진다. 이 때문에 백혈구의 측정에 있어서 적혈구를 용해하는 처리를 실시해도 유핵적혈구의 핵이 잔존하여 그것이 백혈구에 가까운 신호를 나타내고, 이것이 백혈구 수의 측정시에 플러스의 오차를 준다. 이 영향을 배제하려면 혈액 시료에 유핵적혈구 측정 전용의 처리를 실시하여 유핵적혈구 수의 측정을 실시하고, 별도의 방법으로 이 혈액 시료의 백혈구 수를 측정하여 얻어지는 백혈구 수로부터 유핵적혈구를 공제해서 정확한 백혈구 수를 얻을 수 있다. 특허문헌 3에는 혈액 시료에 유핵적혈구 측정 전용의 처리를 실시함으로써 유핵적혈구를 백혈구로부터 변별하는 것이 기재되어 있다.
그렇지만 호염기구나 유핵적혈구의 분류를 실시하기 위해서 특허문헌 1∼3에 기재되어 있는 것과 같은 각각의 혈구 전용의 처리가 필요하게 되면 시간이 걸릴 뿐만 아니라, 장치가 복잡화 혹은 대형화할 우려가 있다. 또 각각의 혈구 측정 전용 시약을 복수 사용함으로써 혈액 검사 전체의 비용이 비싸진다. 이러한 관점으로부터 혈구 전용의 처리는 가능한 한 적은 것이 바람직하다.
그런데 호염기구도 유핵적혈구도 혈액 시료를 산성 조건하에서 처리함으로써 측정을 실시할 수 있다. 따라서 혈액 시료를 산성 조건하에서 처리하면 1회의 측정으로 호염기구와 유핵적혈구의 양쪽 모두를 측정할 수 있을 가능성이 있다. 이러한 시도의 하나로서 특허문헌 4에는 백혈구 및 이상 세포를 염색에 매우 적합한 상태로 하는 적혈구 용해제와 계면활성제를 포함한 수용액을 시료와 혼합하고 형광 색소를 포함한 염색액을 더해 염색하여 플로 사이토미터로 측정해서 형광 강도 및 산란광 강도를 측정함으로써 호염기구 및 적아구(유핵적혈구)를 측정할 수 있는 것이 기재되어 있다.
그러나 상기 특허문헌 4에 기재된 방법에서는 채혈 후 시간이 경과한 시료 등에서는 호염기구와 호염기구 이외의 백혈구와의 분리가 양호하지 않은 경우가 있다.
본 발명의 목적은 시료 중의 유핵적혈구 및 호염기구를 다른 백혈구로부터 보다 명확하게 변별하여 계수할 수 있는 시료 측정용 시약 키트 및 시료 측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 시료 중의 호염기구 및/또는 유핵적혈구를 측정하기 위한 시료 분석용 시약 키트로서, 적혈구를 용혈시켜 백혈구의 세포막에 형광 색소를 투과할 수 있는 정도의 손상을 주기 위한 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 방향족 카르본산을 함유하는 제1 시약과, 핵산을 염색 가능한 형광 색소를 함유하는 제2 시약을 포함하는 시료 분석용 시약 키트이다.
또 본 발명은 상기 제1 시약에 의해 시료 중의 적혈구를 용혈시켜 혈구의 세포막에 형광 색소를 투과할 수 있는 정도의 손상을 주고 상기 제2 시약에 의해 손상을 받은 혈구를 염색하는 공정과, 상기 염색된 혈구에 빛을 조사해서 산란광 정보 및 형광 정보를 취득하는 공정과, 상기 산란광 정보 및 상기 형광 정보에 근거하여 상기 시료 중의 호염기구 및/또는 유핵적혈구를 분류하여 계수하는 공정을 포함하는 시료 분석 방법이다.
발명을 실시하기
위한 최선의 형태
호염기구는 염기성 색소에 의해 염색되는 대형의 산성 과립을 가지는 백혈구의 일종이다. 또 유핵적혈구는 일반적으로 적아구라고도 불리며, 전적아구, 호염기성 적아구, 다염성(多染性) 적아구 및 정염성(正染性) 적아구를 포함한다.
본 명세서에 있어서 「시료」란 포유동물, 바람직하게는 사람으로부터 채취된 혈액, 골수액, 뇨, 아페레시스(Apheresis) 등에서 채취한 시료 등의 체액 시료를 말한다.
본 발명자들은 열심히 검토를 거듭한 결과, 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 방향족 카르본산을 함유하는 제1 시약과 핵산을 염색 가능한 형광 색소를 포함하는 제2 시약을 이용함으로써 유핵적혈구 및 호염기구를 다른 백혈구로부터 보다 명확하게 변별하는 것이 가능한 것을 알아내었다.
본 발명의 한 실시 형태인 시료 분석용 시약 키트는 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 방향족 카르본산을 함유하는 제1 시약과 핵산을 염색 가능한 형광 색소를 함유하는 제2 시약을 포함하는 시약 키트이다. 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 방향족 카르본산을 함유하는 제1 시약으로 시료를 처리함으로써 시료 중의 적혈구를 용혈시켜 백혈구 및 유핵적혈구의 세포막에 형광 색소가 통과할 수 있는 정도의 손상을 줄 수 있다. 이것에 의해 호염기구 이외의 백혈구 및 유핵적혈구는 세포막에 손상을 받거나, 수축 또는 맨원자핵화(裸核化)한다. 한편, 호염기구는 세포막에 손상을 받지만 호염기구 이외의 백혈구 및 유핵적혈구에 비해 손상의 정도가 가볍다. 그러므로 호염기구는 호염기구 이외의 백혈구 및 유핵적혈구와 비교해서 수축의 정도가 작다고 생각할 수 있다. 따라서 세포의 크기나 형태의 차이로부터 호염기구와 호염기구 이외의 백혈구나 유핵적혈구를 변별할 수 있다. 또한 핵산을 염색 가능한 형광 색소를 함유하는 제2 시약으로 시료를 처리함으로써 형광 색소의 염색성의 차이로부터 유핵적혈구와 호염기구 이외의 백혈구나 호염기구를 변별할 수 있다.
양이온성 계면활성제는 적혈구를 용혈시켜 백혈구 및 유핵적혈구의 세포막에 손상을 줄 수 있다. 양이온성 계면활성제로는 제4급 암모늄염 또는 피리디늄염 형인 것이 바람직하다. 제4급 암모늄염 형의 양이온성 계면활성제로는 다음의 일반식(III)으로 표시되는 제4급 암모늄염이 보다 바람직하다.
상기 식(III) 중의 R13, R14 및 R15는 동일하거나 또는 달라도 되고, 수소원자, 탄소수 1∼8의 알킬기 또는 탄소수 6∼8의 아랄킬기이다. R16은 탄소수 8∼18의 알킬기, 탄소수 8∼18의 알케닐기 또는 탄소수 6∼18의 아랄킬기이다. X-는 음이온이다.
R13, R14 및 R15로서의 탄소수 1∼8의 알킬기로는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸 등을 들 수 있다. R13, R14 및 R15로서의 탄소수 6∼8의 아랄킬기로는 벤질, 페네틸 등을 들 수 있다. 바람직하게는 R13, R14 및 R15는 메틸, 에틸 등의 탄소수 1∼8의 알킬기이다.
R16으로서의 탄소수 8∼18의 알킬기로는 옥틸, 데실, 도데실, 테트라데실 등을 들 수 있다. R16으로서의 탄소수 8∼18의 알케닐기로는 옥테닐, 데세닐, 올레일 등을 들 수 있다. R16으로서의 탄소수 6∼18의 아랄킬기로는 벤질, 페네틸 등을 들 수 있다. 바람직하게는 R16은 데실, 도데실, 테트라데실 등의 탄소수 10∼18의 직쇄의 알킬기이다.
음이온 X-로는 F-, CI-, Br- 및 I-와 같은 할로겐 이온, CF3SO3 -, BF4 -, CIO4 - 등을 들 수 있다.
피리듐염 형의 양이온성 계면활성제로는 다음의 식(IV)로 표시되는 피리듐염이 보다 바람직하다.
상기 식(IV) 중의 R17은 탄소수 8∼18의 알킬기이다. X-는 음이온이다.
또한 탄소수 8∼18의 알킬기로는 데실, 도데실, 테트라데실 등의 탄소수 10∼18의 직쇄의 알킬기를 들 수 있다. 음이온 X-로는 F-, CI-, Br- 및 I-와 같은 할로겐 이온, CF3SO3 -, BF4 -, CIO4 - 등을 들 수 있다.
상기 양이온성 계면활성제의 구체적인 예로는 데실트리메틸암모늄브로마이드, 도데실트리메틸암모늄클로라이드, 옥틸트리메틸암모늄브로마이드, 옥틸트리메틸암모늄클로라이드, 라우릴트리메틸암모늄브로마이드, 라우릴트리메틸암모늄클로라이드, 미리스틸트리메틸암모늄브로마이드, 미리스틸트리메틸암모늄클로라이드, 라우일피리디늄클로라이드 등을 들 수 있다.
양이온성 계면활성제는 적혈구를 용혈하여 백혈구 및 유핵적혈구의 세포막에 손상을 주는데 충분한 농도로 사용된다. 이 농도는 예를 들면 통상의 광학 현미경으로 세포막 등의 상태를 관찰함으로써, 적합한 농도가 간단하게 결정된다. 양이온성 계면활성제의 농도로는 구체적으로는 300∼9000mg/L가 바람직하고, 400∼8000mg/L가 보다 바람직하며, 500∼7000mg/L가 가장 바람직하지만, 사용하는 양이온성 계면활성제의 종류에 의해 적당히 조제할 수 있다.
또한 양이온성 계면활성제의 농도가 너무 낮으면 호염기구와 호염기구 이외의 백혈구의 정확한 변별을 할 수 없게 되는 경우가 있다. 이것은 양이온성 계면활성제의 농도가 너무 낮으면 백혈구에 충분한 손상을 주지 못하고, 그 결과로서 호염기구와 호염기구 이외의 백혈구 간의 크기나 형태의 차이가 작아져 버리기 때문이라고 생각된다. 한편 양이온성 계면활성제의 농도가 너무 높으면 유핵적혈구와 호염기구 이외의 백혈구의 정확한 변별을 할 수 없게 되는 경우가 있다. 이것은 양이온성 계면활성제의 농도가 너무 높으면, 특히 호염기구 이외의 백혈구 및 유핵적혈구의 세포막에 과도의 손상이 주어져 그 결과로서 유핵적혈구와 호염기구 이외의 백혈구의 정확한 변별을 할 수 없게 되기 때문이라고 생각된다. 따라서 상기 범위의 농도이면 백혈구나 유핵적혈구의 세포막에는 과도한 손상을 주지 않고 적혈구를 효율적으로 용혈 시킬 수 있다. 또 양이온성 계면활성제의 용혈력은 그 주쇄의 길이에 의존하고 있다. 주쇄가 긴 것은 용혈력이 강하고, 따라서 주쇄가 짧은 것에 비하여 소량으로 효과를 얻을 수 있다.
채혈 후 시간이 경과한 시료에서는 백혈구 등의 혈구가 형태 변화 등에 의해 손상을 받기 쉬워진다. 그리고 양이온성 계면활성제를 사용하면 특히 호염기구 이외의 백혈구나 유핵적혈구의 세포막에 과도한 손상이 주어져 유핵적혈구와 호염기구 이외의 백혈구의 정확한 변별을 할 수 없는 경우가 있다. 그렇지만 이러한 경우에 양이온성 계면활성제와 함께 비이온성 계면활성제를 사용하면 백혈구 등에 대한 과도한 손상이 억제되어 유핵적혈구와 호염기구 이외의 백혈구를 보다 정확하게 변별할 수 있다. 비이온성 계면활성제로는 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌피마자유, 폴리옥시에틸렌경화피마자유, 폴리옥시에틸렌스테롤 또는 폴리옥시에틸렌 수소첨가스테롤이 바람직하다.
폴리옥시에틸렌알킬에테르 형의 비이온성 계면활성제로는 이하의 식(V)로 표시되는 것이 바람직하다.
R18-O-(CH2CH2O)n-H (V)
상기 식 중의 R18은 탄소수 12∼22의 알킬기 또는 탄소수 12∼22의 알케닐기이다. n은 10∼30이다.
폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 알킬에테르 형의 비이온성 계면활성제로는 이하의 식(VI)으로 표시되는 바람직하다.
상기 식 중의 R19는 탄소수 10∼30의 알킬기 또는 탄소 수∼알케닐기이다. m은 1∼10 이다. n은 10∼30이다.
폴리옥시에틸렌피마자유 형의 비이온성 계면활성제로는 이하의 식(VII)으로 표시되는 것이 바람직하다.
상기 식 중의 k, n, m, x, y 및 z의 합계는 10∼60이다.
폴리옥시에틸렌경화피마자유 형의 비이온성 계면활성제로는 이하의 식(VIII)으로 표시되는 것이 바람직하다.
상기 식 중의 k, n, m, x, y 및 z의 합계는 10∼60이다.
폴리옥시에틸렌 스테롤 형의 비이온성 계면활성제로는 이하의 식(IX)로 표시되는 것이 바람직하다.
상기 식 중의 n은 10∼30이다.
폴리옥시에틸렌 수소첨가스테롤 형 비이온성 계면활성제로는 이하의 식 (X) 또는 식 (XI)로 표시되는 것이 바람직하다.
상기 식 중의 n은 20∼30이다.
상기 식 중의 n은 20∼30이다.
또 탄소수 12∼22의 알킬기로는 도데실기, 헥사데실기 등을 들 수 있다. 탄소수 12∼22의 알케닐기로는 올레일기 등을 들 수 있다. 또 상기의 식(V), 식(VI), 식(IX)∼식(XI) 중 n이 너무 작으면 혈구의 세포막에 과도한 손상을 주고, 너무 크면 혈구의 세포막에 충분한 손상을 줄 수 없게 되는 경우가 있다. 마찬가지로, 상기 식(VII) 및 식(VIII) 중 k, n, m, x, y 및 z의 합계가 너무 작으면 혈구의 세포막에 과도한 손상을 주고, 너무 크면 혈구의 세포막에 충분한 손상을 줄 수 없게 되는 경우가 있다.
비이온성 계면활성제로는 구체적으로는 폴리옥시에틸렌(16)올레일에테르, 폴리옥시에틸렌(20)세틸에테르, 폴리옥시에틸렌(20)폴리옥시프로필렌(8)세틸에테르, 폴리옥시에틸렌(30)폴리옥시프로필렌(6)데실테트라데실에테르, 폴리옥시에틸렌(20)피마자유, 폴리옥시에틸렌(20)경화피마자유, 폴리옥시에틸렌(50)경화피마자유, 폴리옥시에틸렌(25)피토스타놀 등을 들 수 있다. 이 중에서도 폴리옥시에틸렌(16)올레일에테르, 폴시옥시에틸렌(20)폴리옥시프로필렌(8)세틸에테르가 특히 바람직하다.
비이온성 계면활성제의 농도로는 500∼7000mg/L가 바람직하고, 800∼6000mg/L가 보다 바람직하고, 1000∼5000mg/L가 가장 바람직하지만, 사용하는 비이온성 계면활성제의 종류에 따라 적절히 조제할 수 있다.
또한 비이온성 계면활성제의 농도가 너무 적으면, 예를 들어 채혈 후 시간이 경과한 시료를 이용했을 경우에 양이온성 계면활성제에 의한 백혈구 및 유핵적혈구의 세포막에 대한 과도한 손상이 억제되지 않아서, 특히 유핵적혈구와 호염기구 이외의 백혈구를 정확하게 변별해 내지 못하는 경우가 있다. 한편 비이온성 계면활성제의 농도가 너무 높으면 양이온성 계면활성제에 의한 백혈구 및 유핵적혈구의 세포막에 대한 손상을 저해하여, 특히 호염기구와 호염기구 이외의 백혈구를 정확하게 변별해 내지 못하는 경우가 있다. 따라서 상기 범위의 농도이면 채혈 후 시간이 경과한 시료를 이용했을 경우에도 유핵적혈구와 호염기구 이외의 백혈구를 정확하게 변별할 수 있다.
제1 시약은 분자내에 적어도 하나의 방향환을 가지는 카르본산(이하 「방향족 카르본산」이라 함) 또는 그 염을 적어도 1 종류 함유하는 것이 바람직하다. 방향족 카르본산을 사용함으로써 보다 효율적으로 단시간에 적혈구를 용혈할 수 있다.
또한 방향족 카르본산을 포함하지 않는 제1 시약을 측정에 이용했을 경우 혈액 시료에 따라서는 호염기구의 값이 위고값(僞高値)을 나타내는 경우가 있다. 위고값이 되는 이유는 밝혀지지 않고 있지만 혈액 시료에 포함되는 호염기구 이외의 혈구 또는 그 외의 성분이 호염기구와 유사한 크기, 형태 또는 형광 강도를 나타내고 있기 때문인 것으로 생각할 수 있다. 그렇지만 상기의 혈액 시료를 방향족 카르본산을 포함하는 제1 시약을 이용해 측정함으로써 위고값을 나타내는 현상을 억제할 수 있다.
사용하는 방향족 카르본산으로는 분자 내에 적어도 1개의 방향환을 가지는 유기산 또는 그 염이면 특별히 한정되지 않는다. 바람직한 방향족 카르본산으로는 살리실산, 프탈산, 벤조산, 히드록시벤조산, 아미노벤조산 및 그들의 염 등을 들 수 있다.
제1 시약 중 상기 방향족 카르본산 또는 그 염의 농도는 제1 시약 중 pH가 이하에 나타낸 범위로 되는 농도이면 특별히 한정되지 않으나, 0.1∼100mM가 바람직하고, 0.5∼50mM가 보다 바람직하다.
또한 방향족 카르본산의 농도가 너무 적으면 상술한 바와 같은 효과를 충분히 얻지 못하여 호염기구를 정확하게 변별할 수 없는 경우가 있다. 한편 방향족 카르본산의 농도가 너무 높으면 유핵적혈구와 호염기구 이외의 백혈구를 정확하게 변별해 낼 수 없는 경우가 있다. 따라서 상기 범위의 농도이면 유핵적혈구와 호염기구를 다른 혈구로부터 정확하게 변별할 수 있다.
제1 시약으로 시료를 처리할 때에는 유핵적혈구나 호염기구의 측정에 장해가 되는 적혈구를 용혈시키는 것이 바람직하다. 적혈구는 통상 약 150mOsm/kg 이하의 침투압으로 세포막에 세공을 만들어 적혈구 내부의 헤모글로빈을 용출하여 광학적으로 투명하게 된다(용혈한다). 광학적으로 투명하게 된 적혈구는 실질적으로 플로 사이토메트리를 이용하는 측정의 장해는 되지 않는다. 적혈구의 용혈에는 낮은 침투압 조건 및 낮은 pH 조건이 바람직하다. 이 두 개의 조건을 만족하는 침투압은 20mOsm/kg∼150mOsm/kg이다. 상기 제1 시약의 침투압을 이 범위로 설정함으로써 유핵적혈구나 호염기구의 측정에 장해가 되는 적혈구를 효율적으로 용혈시킬 수 있다.
호염기구에는 산성 조건하에서는 다른 백혈구에 비해 파괴되기 어려운 특성이 있다. 따라서 제1 시약의 pH는 2.0∼4.5가 바람직하고, 2.0∼3.5가 보다 바람직하다. pH가 이 범위내이면 호염기구의 과립이 안정된다. 또 pH가 이 범위내이면 백혈구, 유핵적혈구 등에는 과도한 영향을 주지 않고 적혈구를 효율적으로 용혈 시킬 수 있다. 이에 의해 무핵의 적혈구의 산란광이나 형광은 지극히 작아지므로 적혈구가 유핵적혈구나 백혈구의 측정에 실질적으로 악영향을 미치지 않는다.
제1 시약의 pH는 완충제를 이용하여 조정해도 된다. 바람직한 완충제는 원하는 pH±2.0 부근에 pKa를 가지는 완충제이며, 예를 들면 말산, 주석산, 말론산, 숙신산, 구연산, 디글리콜산 등을 들 수 있다. 제1 시약 중 상기 완충제의 농도는 pH를 상기의 범위로 유지할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다.
또 상기 방향족 카르본산과 상기 완충제를 조합하면 유핵적혈구의 변별 성능이 향상하기 때문에 매우 적합하다. 완충제와 방향족 카르본산의 조합으로서는, 예를 들면 말산과 살리실산 또는 살리실산염, 말산과 프탈산 또는 프탈산염, 구연산과 살리실산 또는 살리실산염, 구연산과 프탈산 또는 프탈산염, 말산과 벤조산 또는 벤조산염, 말산 및 프탈산 또는 프탈산염과 벤조산 또는 벤조산염 등을 들 수 있다.
제1 시약 중 침투압을 적혈구의 용혈에 적당한 범위로 하기 위해서 예를 들면 NaCl, KCl 등의 전해질, 당류 등을 이용할 수 있다. 또 상기의 완충제의 농도에 의해도 침투압을 조정할 수 있다.
제1 시약은 상기 계면활성제 및 방향족 카르본산 또는 그 염과, 원하는 바에 따라 상기 완충제를 상기 농도가 되도록 적절한 용매에 용해하고, 원하는 바에 따라서 NaOH, HCl 등을 이용해서 pH를 조정함으로써 얻을 수 있다. 상기의 적절한 용매로는 상기 성분을 용해시킬 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 물, 유기용매, 이들의 혼합액 등을 들 수 있다. 유기용매로는 알코올, 에틸렌글리콜, 디메틸술폭시드(이하, 「DMSO」라 함) 등을 들 수 있다.
제2 시약은 핵산을 염색 가능한 형광 색소를 함유한다. 상기 제1 시약으로 처리한 시료 중의 혈구를 핵산을 염색 가능한 형광 색소로 염색했을 경우 백혈구는 강하게 염색되어 강한 형광을 발한다. 한편 유핵적혈구는 약하게 염색되어 약한 형광을 발한다. 형광 색소의 염색성의 차이로부터 유핵적혈구와 호염기구 이외의 백혈구나 호염기구를 변별할 수 있다. 이와 같이 백혈구와 유핵적혈구의 형광 강도에 차이가 생기는 작용 메커니즘은 명확하지 않으나 아마도 유핵적혈구의 핵(DNA)이 응축해 있기 때문에 색소의 세포핵으로의 취입이 저해되고 있다고 생각할 수 있다.
형광 색소로는 핵산을 염색하는 것이면 특별히 한정되지 않으나 일반적으로 해당 분야에 있어서 이용되고 있는 것이면 사용할 수 있다. 제2 시약에 함유되는 형광 색소로는 이하의 식(I)의 형광 색소 및 식(II)의 형광 색소를 들 수 있다.
상기 식 중의 R1 및 R2는 알킬기이다. 또한 R1 및 R2는 서로 동일하거나 또는 다르다. 또한
또 
이다.
R3, R4, R5 및 R6은 수소원자 또는 알킬기이다. 또한 R3, R4, R5 및 R6은 서로 동일하거나 또는 다르다. X-는 음이온이다.
상기 식 중의 R7 및 R8은 산성기를 가지고 있어도 되는 알킬기이다. 또한 R7 및 R8은 서로 동일하거나 또는 다르다. 또한
또 
이다.
R9, R10, R11 및 R12는 수소원자 또는 산성기이다. R9, R10, R11 및 R12는 서로 동일하거나 또는 다르다. 단, R7∼R12 중 어느 하나에는 산성기가 존재한다. R7∼R12에 존재할 수 있는 산성기는 염을 형성하고 있어도 된다. 단, R7∼R12에 존재할 수 있는 산성기 중 어느 하나는 프로톤을 방출한 기이다.
본 명세서에 있어서 상기 식(I) 및 식(II)에서 「알킬기」는 직쇄상 또는 분지쇄상 중 어느 것이라도 된다. 알킬기의 탄소수는 통상 1∼20, 바람직하게는 l∼l0이지만, 형광 색소의 수용성의 관점에서 탄소수 1∼6이 보다 바람직하다. 알킬기의 바람직한 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 등을 들 수 있다.
식(I)에서 음이온 X-로는 F-, Cl-, Br- 및 I-와 같은 할로겐 이온, CF3SO3 -, BF4 -, ClO4 - 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 식(II)에 대해 존재할 수 있는 「산성기」란 프로톤을 방출할 수 있는 기 및 프로톤을 방출할 수 있는 기가 프로톤을 방출한 기의 양쪽 모두를 포함한다. 프로톤을 방출할 수 있는 기로는 카르복실기, 술폰산기, 인산기 등을 들 수 있으며, 술폰산기가 바람직하다.
상기 산성기는 염을 형성하고 있어도 된다. 이러한 염으로는 나트륨염, 칼륨염과 같은 알칼리 금속염 등을 들 수 있다. 보다 바람직하게는 나트륨염이다.
상기 식(I) 및 식(II)의 형광 색소는 1종 또는 2종 이상을 이용할 수 있다. 상기 형광 색소는 주식회사 하야시바라 생물화학 연구소로부터 구입할 수 있다.
본 발명의 시료 분석용 시약 중 색소의 농도는 색소의 종류에 의해 적절히 선택할 수 있지만 일반적으로 0.01∼100mg/L, 바람직하게는 0.1∼10mg/L, 보다 바람직하게는 0.2∼6.0mg/L이다.
또 제2 시약에 함유되는 상기 식(I) 및 식(II)의 형광 색소는 유핵적혈구에 대한 친화성보다 백혈구에 대한 친화성이 강하기 때문에 백혈구를 강하게 염색한다. 따라서 이러한 형광 색소를 이용하여 염색된 세포로부터 발생하는 형광의 차이에 근거해서 유핵적혈구와 호염기구 이외의 백혈구나 호염기구를 보다 정확하게 변별할 수 있다.
제2 시약은 상기 형광 색소를 상기 농도가 되도록 적절한 용매에 용해함으로써 얻을 수 있다. 또 적절한 용매로는 상기 형광 색소를 용해시킬 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만 물, 유기용매, 이들의 혼합액 등을 들 수 있다. 유기용매로는 알코올, 에틸렌글리콜, DMSO 등을 들 수 있다. 또한 형광 색소는 수용액 중에서의 장기 보존 안정성이 낮은 경우가 있어, 그 경우는 상기의 유기용매 중에 용해시키는 것이 바람직하다.
시료 분석용 시약 키트는 제1 시약 : 제2 시약 : 시료의 용량비가 10∼500 : 1∼10 : 1, 보다 바람직하게는 20∼100 : 2∼5 : 1이 되는 양으로 시료와 혼합하는 것이 바람직하다. 이러한 비로 제1 시약, 제2 시약 및 시료를 혼합해서 측정용 시료로 함으로써 적혈구의 용해가 신속하게 진행하여 혈구 성분의 염색을 양호하게 실시할 수 있다. 또 시료의 양은 수μl∼100μl 정도이면 측정을 양호하게 실시할 수 있다.
본 발명의 한 실시 형태인 시료 분석 방법은 상기 제1 시약에 의해 시료 중의 적혈구를 용혈시켜 혈구의 세포막에 형광 색소를 투과할 수 있는 정도의 손상을 주고 상기 제2 시약에 의해 손상을 받은 혈구를 염색하는 공정, 염색된 혈구에 빛을 조사하여 산란광 정보 및 형광 정보를 취득하는 공정, 및 얻어지는 산란광 정보 및 얻어지는 형광 정보에 근거해 시료 중의 호염기구 및/또는 유핵적혈구를 분류하여 계수하는 공정을 포함한다.
염색공정에서는 제1 시약과 제2 시약과 시료를 혼합한다. 이 공정에 있어서 제1 시약에 포함되는 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 방향족 카르본산은 시료 중의 적혈구를 용혈시켜 혈구의 세포막에 형광 색소를 투과할 수 있는 정도의 손상을 준다. 따라서 제1 시약과 제2 시약과 시료를 혼합하는 것에 의해서 측정 대상의 혈구를 효율적으로 형광 염색하는 것이 가능해진다.
염색공정에 있어서 제1 시약과 제2 시약과 시료를 혼합하는 순서로는 특별히 한정되지 않는다. 제1 시약과 제2 시약을 먼저 혼합하고, 이 혼합액과 시료를 혼합해도 된다. 또 제1 시약과 시료를 먼저 혼합하고, 이 혼합액과 제2 시약을 혼합해도 된다. 어떤 순서로 혼합해도 동등의 측정 결과를 얻을 수 있다.
염색 공정에서는 제1 시약과 제2 시약과 시료를 혼합한 후에 15∼50℃, 바람직하게는 30∼45℃의 온도로 5∼120초간, 바람직하게는 5∼30초간 반응시키는 것이 바람직하다.
염색 공정에 있어서 염색된 혈구는 플로 사이토미터를 이용함으로써 분석할 수 있다. 이하 플로 사이토미터를 이용한 혈구의 분석에 관련하여 설명한다. 염색된 혈구가 플로 사이토미터의 플로 셀을 통과할 때에 혈구에 빛을 조사함으로써 산란광 정보 및 형광 정보를 얻을 수 있다. 산란광 정보로는 일반적으로 시판되는 플로 사이토 미터로 측정할 수 있는 산란광이면 특별히 한정되지 않고, 전방 산란광(예를 들면 수광 각도 0∼20도 부근), 측방 산란광(수광 각도 90도 부근) 등의 산란광의 펄스 폭, 산란광 강도 등을 들 수 있다. 일반적으로 측방 산란광은 세포의 핵이나 과립 등의 내부 정보를 반영하고, 전방 산란광은 세포의 크기 정보를 반영하는 것으로 알려져 있다. 본 실시 형태의 방법에 대해 산란광 정보로서 전방 산란광 강도 및 측방 산란광 강도를 이용하는 것이 바람직하다.
형광 정보란 적당한 파장의 빛을 측정용 시료에 조사하여 여기된 형광을 측정해 얻을 수 있는 것이다. 사용하는 형광 색소에 따라 적당한 수광 파장을 선택할 수 있다. 형광은 상기 형광 색소에 의해서 염색된 세포 내의 핵산이나 과립 등에서 발생된다.
이용하는 플로 사이토미터의 광원은 특별히 한정되지 않으나, 형광 색소의 여기에 매우 적합한 파장의 광원이 선택된다. 예를 들면 적반도체 레이저, 청반도체 레이저, 아르곤 레이저, He-Ne 레이저 등이 사용된다. 특히 반도체 레이저는 기체 레이저에 비해 매우 염가이므로 매우 적합하다.
상기와 같이 측정한 산란광과 형광에 근거하여 유핵적혈구 및 호염기구를 다른 성분으로부터 변별하여 계수할 수 있다. 이 공정은 예를 들면 (1) 형광 정보와 전방 산란광 정보를 2축으로 하는 스캐터그램을 작성하고, (2) 전방 산란광 정보와 측방 산란광 정보를 2축으로 하는 스캐터그램을 작성하고, (3) 얻어지는 각 스캐터그램을 적당한 해석 소프트로 해석하는 것을 포함하는 것이 바람직하다.
X축에 형광 강도, Y축에 전방 산란광 강도를 취하여 스캐터그램을 그렸을 경우, 예를 들면 도 1에 나타낸 바와 같이 유핵적혈구, 호염기구 및 호염기구 이외의 백혈구는 각각 집단(클러스터)을 형성하여 분포한다. 또한 도면 중에서 NRBC로 나타낸 것은 유핵적혈구 집단이고, BASO로 나타낸 것은 호염기구의 집단이고, WBC-BASO로 나타낸 것은 호염기구 이외의 백혈구의 집단이며, WBC로 나타낸 것은 백혈구의 집단이다. 이러한 스캐터그램에 있어서 유핵적혈구는 백혈구보다 형광 강도가 작은 영역에 출현한다. 이에 의해 백혈구와 유핵적혈구를 명확하게 변별할 수 있다. 또 호염기구는 호염기구 이외의 백혈구보다 사이즈가 크고, 형광 강도가 큰 영역에 출현한다. 이에 의해 호염기구 이외의 백혈구와 변별할 수 있다. 그렇지만 백혈구 수가 많은 시료나 채혈 후 시간이 경과한 시료를 측정했을 경우 형광 강도와 전방 산란광 강도를 이용한 스캐터그램에 있어서 호염기구와 호염기구 이외의 백혈구를 정확하게 변별할 수 없는 경우가 있다. 그 경우는 전방 산란광 정보와 측방 산란광 정보를 이용할 수 있다. X축에 측방 산란광 강도, Y축에 전방 산란광 강도를 취하여 스캐터그램을 그렸을 경우 예를 들면 도 2에 나타내는 바와 같이 호염기구 및 호염기구 이외의 백혈구는 각각 집단(클러스터)을 형성해서 분포한다. 또한 도면 중에서 BASO로 나타낸 것은 호염기구의 집단이고, WBC-BASO로 나타낸 것은 호염기구 이외의 백혈구의 집단이다. 이러한 스캐터그램에 있어서 호염기구는 다른 백혈구보다 측방 산란광 강도와 전방 산란광 강도가 큰 영역에 출현한다. 이에 의해 호염기구와 다른 백혈구를 변별할 수 있다. 또한, 전술한 바와 같이 도 1로부터 유핵적혈구와 다른 백혈구를 변별할 수 있다. 따라서 도 1 및 도 2 중 어느 쪽의 영역에도 포함되는 세포를 호염기구로서 산출함으로써 보다 정밀도가 높은 호염기구를 구할 수 있다.
또 스캐터그램 상의 각 집단이 어떤 혈구에 대응하는가는 각 혈구만을 포함하는 시료를 본 실시 형태의 시약 키트로 처리한 후 측정을 실시해 출현 위치를 확인하는 것에 의해서 특정할 수 있다.
스캐터그램 상의 집단을 적당한 해석 소프트로 해석함으로써 유핵적혈구 및 호염기구의 수와 비율을 산출할 수 있다. 구체적으로는 스캐터그램에 있어서 어떤 소정의 세포가 출현한다고 생각되는 위치에 세포 집단이 확인되었을 경우, 우선 이 집단의 중심을 특정한다. 이 중심으로부터 다른 세포 집단의 출현 영역까지의 사이에 소정의 세포 집단의 세포가 출현하고 있는 부분까지를 이 세포 집단의 경계로 할 수 있다. 설정된 영역 내에 출현하는 세포를 소정의 세포로서 계수할 수 있다. 또 호염기구 이외의 백혈구도 계수함으로써 전체 백혈구에 대한 호염기구의 비율(호염기구/전체 백혈구: 이하 「호염기구 비율」로 함)과 전체 백혈구에 대한 유핵적혈구의 비율(유핵적혈구/전체 백혈구:이하 「유핵적혈구 비율」이라 함)을 산출할 수 있다. 또한 유핵적혈구 비율은 통상 100개의 백혈구 당에 출현하는 유핵적혈구의 백분율로 표시되며 단위는 「개/100 WBC」로 표기된다.
본 실시 형태의 시료 분석용 시약 키트 및 시료 분석 방법을 이용하면 유핵적혈구를 형성하는 집단 및 호염기구를 형성하는 집단이 다른 혈구 세포를 형성하는 집단으로부터 각각 명확하게 분리되므로 보다 정확한 계수를 실시할 수 있다.
본 발명에 의해 채혈 후 시간이 경과한 시료에서도 유핵적혈구와 호염기구를 다른 혈구로부터 보다 명확하게 변별하여 계수하는 것이 가능하게 되어, 질환의 검사·진단을 보다 정확하게 실시하는 것이 가능하게 된다. 본 발명에서는 한 번의 측정으로 유핵적혈구와 호염기구를 계수할 수 있지만, 검사 목적에 따라서는 유핵적혈구와 호염기구 중 어느 한쪽만을 측정하면 되는 경우도 있다. 그와 같은 경우에도 어느 한쪽만을 측정할 수 있다.
도 1은 본 발명의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램의 모식도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램의 모식도를 나타낸다.
도 3은 실시예 1의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 4는 실시예 1의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 5는 실시예 2의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 6은 실시예 2의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 7은 실시예 3의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 8은 실시예 3의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 9는 실시예 3의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 10은 실시예 3의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 11은 실시예 4의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 12는 실시예 4의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 13은 실시예 4의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 14는 실시예 4의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 15는 실시예 5의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 16은 실시예 5의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 17은 실시예 5의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 18은 실시예 6의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 19는 실시예 6의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 20은 실시예 6의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 21은 실시예 7의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 22는 실시예 7의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 23은 실시예 8의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 24는 본 발명의 시약 키트의 한 예를 나타낸 도면이다. 제1 시약은 B, 제2 시약은 A이다.
도 25는 실시예 9의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램의 한 예를 나타낸다.
도 26은 실시예 9의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램의 일례를 나타낸다.
도 27은 실시예 9의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석한 결과와 종래의 시료 분석 방법에 의해 시료를 분석한 결과와의 상관 관계를 나타내는 그래프이다. (A) 전체 백혈구 수의 상관관계; (B) 호염기구 비율의 상관관계; (C) 유핵적혈구 비율의 상관관계.
도 2는 본 발명의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램의 모식도를 나타낸다.
도 3은 실시예 1의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 4는 실시예 1의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 5는 실시예 2의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 6은 실시예 2의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 7은 실시예 3의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 8은 실시예 3의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 9는 실시예 3의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 10은 실시예 3의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 11은 실시예 4의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 12는 실시예 4의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 13은 실시예 4의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 14는 실시예 4의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 15는 실시예 5의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 16은 실시예 5의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 17은 실시예 5의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 18은 실시예 6의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 19는 실시예 6의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 20은 실시예 6의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 21은 실시예 7의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 22는 실시예 7의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 23은 실시예 8의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램을 나타낸다.
도 24는 본 발명의 시약 키트의 한 예를 나타낸 도면이다. 제1 시약은 B, 제2 시약은 A이다.
도 25는 실시예 9의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램의 한 예를 나타낸다.
도 26은 실시예 9의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석할 때의 스캐터그램의 일례를 나타낸다.
도 27은 실시예 9의 시료 분석용 시약을 이용하여 시료를 분석한 결과와 종래의 시료 분석 방법에 의해 시료를 분석한 결과와의 상관 관계를 나타내는 그래프이다. (A) 전체 백혈구 수의 상관관계; (B) 호염기구 비율의 상관관계; (C) 유핵적혈구 비율의 상관관계.
본 발명을 이하의 실시예에 의해서 더욱 상세하게 설명하지만 본 발명에는 여러 가지의 변경 수식이 가능하며, 본 발명의 범위는 이하의 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
이하의 실시예에 있어서 이용한 양이온성 계면활성제는 데실트리메틸 암모늄브로마이드(이후 DTAB로 한다), 도데실트리메틸 암모늄클로라이드(LTAC)이다.
이하의 실시예에 있어서 이용한 비이온성 계면활성제는 이하 대로이다.
폴리옥시에틸렌(16)올레일에테르(제품명: NIKKOL BO-16),
폴리옥시에틸렌(20)세틸에테르(제품명: NIKKOL BC-20TX),
폴리옥시에틸렌(20)폴리옥시프로필렌(8)세틸에테르(제품명: NIKKOL PBC-44),
폴리옥시에틸렌(30)폴리옥시프로필렌(6)데실테트라데실에테르(제품명: NIKKOL PEN-4630),
폴리옥시에틸렌(20)피마자유(제품명: NIKKOL CO-20TX),
폴리옥시에틸렌(20)경화피마자유(제품명: NIKKOL HCO-20),
폴리옥시에틸렌(50)경화피마자유(제품명: NIKKOL HCO-50),
폴리옥시에틸렌(25)피토스타놀(제품명: NIKKOL BPSH-25).
모두 닛코 케미칼즈 주식회사로부터 구입할 수 있다.
이하의 실시예에 있어서 이용한 방향족 카르본산은 살리실산, 프탈산, 벤조산, 히드록시벤조산 및 아미노벤조산이다.
이하의 실시예에 있어서 이용한 형광 색소는 NK-529, NK-2670, NK-3750, NK-3383, NK-1840, NK-9001, NK-9003, NK-2929, NK-3375, NK-5056, NK-3266, NK-3620 이다. 모두 주식회사 하야시바라 생물화학 연구소로부터 구입할 수 있다. 이들 색소의 화학식을 표 1에 나타냈다.
[표 1]
비교예 1
본 예에서는 종래의 방법을 이용하여 채혈 후 약 8시간 경과한 혈액 시료를 측정하였다. 피험자 3명으로부터 각각 채취된 혈액 시료를 자동 혈구 계수 장치 XE-2100(시스멕스제: 적반도체 레이저(633nm)를 탑재)를 이용해 측정하여 전체 백혈구 수 및 호염기구를 계수하였다. 이 계수 결과에 근거하여 호염기구 비율을 산출하였다. 또한 시약으로는 스토마토라이저-FBII(시스멕스제)를 이용했다. 또 측정에는 채혈 후 약 8시간 경과한 혈액 시료를 이용했다.
측정 결과, 이들 시료의 호염기구의 함유량은 정상치 이상인 것이 확인된다(이하, 이 시료를 BASO 시료 1, BASO 시료 2 및 BASO 시료 3으로 한다). BASO 시료 1의 호염기구 비율은 0.8%, BASO 시료 2의 호염기구 비율은 3.4%, BASO 시료 3의 호염기구 비율은 1.6%였다. 이러한 결과를 실시예 1 또는 2의 대조로 하였다.
다음 상기와는 다른 피험자 3명으로부터 각각 채취된 혈액 시료에 포함되는 유핵적혈구를 자동 혈구 계수 장치 XE-2100을 이용해 측정하여 전체 백혈구 수 및 유핵적혈구수를 계수하였다. 이 계수 결과에 근거해 유핵적혈구 비율을 산출하였다. 또한 시약으로는 스토마토라이저-NR(시스멕스제)를 이용하였다. 또 측정에는 채혈 후 약 8시간 경과한 혈액 시료를 이용하였다.
측정 결과, 이들 시료는 유핵적혈구가 출현하고 있는 것이 확인되었다(이하 이 시료를 NRBC 시료 1, NRBC 시료 2 및 NRBC 시료 3으로 한다). NRBC 시료 1의 유핵적혈구 비율은 4.4개/100 WBC, NRBC 시료 2의 유핵적혈구 비율은 1.9개/100 WBC, NRBC 시료 3의 유핵적혈구 비율은 1.3개/100 WBC 였다. 이들 결과를 실시예 1 또는 2의 대조로 하였다.
실시예 1
본 실시예에서는 하기와 같은 조성의 제1 시약 및 제2 시약을 조제하고, 각 시약을 이용해 채혈 후 약 8시간 경과한 혈액 시료를 측정했다.
또한 제1 시약의 pH는 3.0 이다.
제1 시약 A
살리실산나트륨 0.5mM, DL-말산 10mM, LTAC 2000ppm, BO-16 1000ppm을 함유하는 수용액이다.
제1 시약 B
살리실산나트륨 0.5mM, DL-말산 10mM, LTAC 1500ppm, PBC-44 1000ppm을 함유하는 수용액이다.
제1 시약 C
살리실산나트륨 10mM, LTAC 2000ppm, BO-16 1000ppm을 함유하는 수용액이다.
제1 시약 D
살리실산나트륨 10mM, LTAC 1500ppm, PBC-44 1000ppm을 함유하는 수용액이다.
제1 시약 E
프탈산수소칼륨 0.5mM, DL-말산 10mM, LTAC 2000ppm, BO-16 1000ppm을 함유하는 수용액이다.
제1 시약 F
프탈산수소칼륨 2mM, DL-말산 10mM, LTAC 1500ppm, PBC-44 1000ppm을 함유하는 수용액이다.
제2 시약
에틸렌글리콜 100mL 중에 NK-3383 15mg를 용해한 것이다.
상기 제1 시약 1mL, 제2 시약 20μL 및 혈액 시료(BASO 시료 1,2 혹은 3 또는 NRBC 시료 1,2 혹은 3) 20μL를 충분히 혼화하고, 그 혼합액을 40℃에서 10초간 반응시켜 측정용 시료를 조제하였다. 측정용 시료를 633nm의 여기 광원을 가지는 플로 사이토미터의 검출부로 유도하여 측정용 시료 중의 세포에 여기광을 조사하였다. 그리고 이 세포로부터 발생되는 산란광 신호 및 형광 신호를 검출하고, 얻어진 신호를 해석해서 측정용 시료 중의 호염기구, 유핵적혈구 및 전체 백혈구를 측정하였다. 이 측정은 자동 혈구 계수 장치 XE-2100을 이용하여 행해졌다.
또한 측정에는 채혈 후 약 8시간 경과한 BASO 시료 1 및 2 혹은 NRBC 시료 1 및 2를 이용했다.
측정용 시료에 관하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1의 스캐터그램, 전방 산란광 강도 및 측방 산란광을 2축으로 하는 제2의 스캐터그램을 작성했다. 채혈 후 약 8시간 경과한 BASO 시료 1 및 2를 이용한 측정에 의해 얻어지는 제2 스캐터그램을 도 3에, 채혈 후 약 8시간 경과한 NRBC 시료 1 및 2를 이용한 측정에 의해 얻어지는 제1 스캐터그램을 도 4에 나타낸다.
또한 이들 스캐터그램에 근거해 전체 백혈구, 호염기구 및 유핵적혈구를 계수하여 호염기구 비율 및 유핵적혈구 비율을 산출했다. 표 2는 비교예 1 및 본 실시예로 산출된 채혈 후 8시간 경과한 BASO 시료 1 또는 2의 호염기구 비율을 나타낸 것이다. 표 3은 비교예 1 및 본 실시예로 산출된 채혈 후 8시간 경과한 NRBC 시료 1 또는 2의 유핵적혈구 비율을 나타낸 것이다.
[표 2]
[표 3]
도 3에 나타낸 바와 같이 본 실시예의 시료 분석용 시약을 이용했을 경우 호염기구가 호염기구 이외의 백혈구로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다. 도 4에 나타낸 바와 같이 본 실시예의 시료 분석용 시약을 이용했을 경우 유핵적혈구가 호염기구나 호염기구 이외의 백혈구로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다. 이와 같이 호염기구 및 유핵적혈구가 각각 명확하게 변별되기 때문에 도 3 및 4에 나타낸 바와 같이 하여 스캐터그램 상에서 소정의 영역내에 출현하는 세포를 호염기구 및 유핵적혈구로서, 이들의 수나 전체 백혈구 수에 대한 비율을 정확하게 구할 수 있었다.
또 표 2 및 3에서 실시예 1에서 산출된 비율과 비교예 1에서 산출된 비율은 근사 값이었다. 따라서 본 실시예의 시료 분석용 시약을 이용하면 유핵적혈구와 호염기구를 각각 다른 시약을 이용해서 측정했을 경우와 동일한 정도의 정밀도로 측정을 실시할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 2
본 실시예에서는 실시예 1의 제1 시약 및 제2 시약을 이용해 채혈 후 약 50시간 경과한 혈액 시료를 측정했다. 측정 방법은 혈액 시료 이외는 실시예 1과 같다. 본 예의 측정에는 채혈 후 약 50시간 경과한 BASO 시료 2 또는 3 혹은 NRBC 시료 2 또는 3을 이용했다.
또한 실시예 1의 제1 시약 A∼F 중, BASO 시료 2 및 NRBC 시료 2의 측정에는 제1 시약 A, B, E 및 F를 이용하고, BASO 시료 3 및 NRBC 시료 3의 측정에는 제1 시약 C 및 D를 이용했다.
실시예 1과 마찬가지로 측정용 시료와 관련하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1의 스캐터그램, 전방 산란광 강도 및 측방산란광을 2축으로 하는 제2의 스캐터그램을 작성했다. 채혈 후 약 50시간 경과한 BASO 시료 2를 이용한 측정에 의해 얻어진 제1 스캐터그램 및 제2 스캐터그램 및 채혈 후 약 50시간 경과한 NRBC 시료 2를 이용한 측정에 의해 얻어진 제1 스캐터그램을 도 5에 나타낸다. 또 채혈 후 약 50시간 경과한 BASO 시료 3을 이용한 측정에 의해 얻어진 제1 스캐터그램 및 제2 스캐터그램, 및 채혈 후 약 50시간 경과한 NRBC 시료 3을 이용한 측정에 의해 얻어진 제1 스캐터그램을 도 6에 나타낸다.
또한 이들 스캐터그램에 근거해 전체 백혈구, 호염기구 및 유핵적혈구를 계수하여 호염기구 비율 및 유핵적혈구 비율을 산출했다. 표 4는 본 실시예로 산출된 채혈 후 50시간 경과한 BASO 시료 2 또는 3의 호염기구 비율을 나타낸 것이다. 또한 표 4에서는 제1 스캐터그램(전방 산란광 강도 및 형광 강도) 및 제2 스캐터그램(전방 산란광 강도 및 측방 산란광 강도)에 근거해 산출된 각각의 호염기구 비율을 나타냈다. 표 5는 본 실시예로 산출된 채혈 후 50시간 경과한 NRBC 시료 2 또는 3의 유핵적혈구 비율을 나타낸 것이다.
[표 4]
[표 5]
도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이 본 실시예의 시료 분석용 시약을 이용했을 경우 채혈 후 약 50시간 경과한 시료 중의 호염기구가 호염기구 이외의 백혈구로부터 명확하게 분획되는 것을 알 수 있다. 또 본 실시예의 시료 분석용 시약을 이용했을 경우 채혈 후 약 50시간 경과한 시료 중의 유핵적혈구가 호염기구나 호염기구 이외의 백혈구로부터 명확하게 분획되는 것을 알 수 있다. 이와 같이 채혈 후에 시간이 경과한 시료라도 호염기구 및 유핵적혈구가 각각 명확하게 변별되기 때문에 도 5 및 6에 나타낸 바와 같이 스캐터그램 상에서 소정의 영역 내에 출현하는 세포를 호염기구 및 유핵적혈구로서, 이들의 수나 전체 백혈구 수에 대한 비율을 정확하게 구할 수 있었다.
비교예 1의 방법으로 측정했을 경우 채혈 후 약 8시간 경과한 BASO 시료 2의 호염기구 비율은 3.4%, 채혈 후 약 8시간 경과한 BASO 시료 3의 호염기구 비율은 1.6%였다. 또한 채혈 후 약 8시간 경과한 NRBC 시료 2의 유핵적혈구 비율은 1.9개/l00WBC, 채혈 후 약 8시간 경과한 NRBC 시료 3의 유핵적혈구 비율은 1.3개/l00WBC였다. 이들 비교예 1의 결과 및 표 4 및 표 5의 결과로부터 실시예 2로 산출된 비율과 비교예 1로 산출된 비율은 근사값이었다. 따라서 본 실시예의 시료 분석용 시약을 이용하면 채혈 후에 시간이 경과한 시료라도 유핵적혈구와 호염기구를 각각 다른 시약을 이용해 측정했을 경우와 동일한 정도의 정밀도로 측정을 실시할 수 있는 것이 확인되었다.
또 표 2 및 표 4의 BASO 시료 2의 결과로부터 채혈 후 약 50시간 경과한 시료에 대해 산출된 호염기구 비율과 채혈 후 약 8시간 경과한 시료에 대해 산출된 호염기구 비율은 근사 값이었다. 표 3 및 표 5의 NRBC 시료 2의 결과로부터 채혈 후 약 50시간 경과한 시료에 있어서 산출된 유핵적혈구 비율과 채혈 후 약 8시간 경과한 시료에 있어서 산출된 유핵적혈구 비율은 근사 값이었다.
이상으로부터 본 실시예의 시료 분석용 시약을 이용하면 채혈 후에 시간이 경과한 시료라도 높은 정밀도로 측정을 실시할 수 있는 것이 확인되었다.
실시예 3
본 실시예에서는 양이온성 계면활성제인 DTAB와 각종 비이온성 계면활성제의 조합에 관하여 검토했다. 여기서는 하기와 같은 조성의 제1 시약 및 제2 시약을 조제했다. 또한 제1 시약의 pH는 3.0이다.
제1 시약 A
살리실산나트륨 10mM, BO-16 3000ppm 및 DTAB 3000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 B
살리실산나트륨 10mM, BO-16 7000ppm 및 DTAB 7000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 C
살리실산나트륨 10mM, PBC-44 3000ppm 및 DTAB 5000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 D
살리실산나트륨 10mM, PBC-44 7000ppm 및 DTAB 7000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 E
살리실산나트륨 10mM, BC-20TX 2000ppm 및 DTAB 3000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 F
살리실산나트륨 10mM, BC-20TX 2000ppm 및 DTAB 5000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 G
살리실산나트륨 10mM, BPSH-25 3000ppm 및 DTAB 7000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 H
살리실산나트륨 10mM, BPSH-25 7000ppm 및 DTAB 7000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 I
살리실산나트륨 10mM, HCO-50 5000ppm 및 DTAB 5000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 J
살리실산나트륨 10mM, HCO-50 7000ppm 및 DTAB 7000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 K
살리실산나트륨 10mM, HCO-20 3000ppm 및 DTAB 5000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 L
살리실산나트륨 10mM, HCO-20 7000ppm 및 DTAB 7000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 M
살리실산나트륨 10mM, CO-20TX 3000ppm 및 DTAB 5000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 N
살리실산나트륨 10mM, CO-20TX 7000ppm 및 DTAB 7000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 O
살리실산나트륨 10mM, PEN-4630 3000ppm 및 DTAB 5000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 P
살리실산나트륨 10mM, PEN-4630 5000ppm 및 DTAB 7000ppm을 함유한 수용액이다.
제2 시약
NK-3383 300ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
상기의 제1 시약 1 mL, 제2 시약 20μL 및 BASO 또는 NRBC의 함유가 확인된 혈액 시료(BASO 시료 4 또는 NRBC 시료 4) 20μL를 충분히 혼화하고, 그 혼합액을 41℃로 10초간 반응시켜 측정용 시료를 조제했다. 실시예 1과 마찬가지로 자동 혈구 계수 장치 XE-2100을 이용해 측정용 시료 중의 호염기구, 유핵적혈구 및 전체 백혈구를 측정했다. 또한 측정에는 채혈 후 약 8시간 경과한 혈액 시료를 이용했다.
BASO 시료 4로부터 조제된 측정용 시료에 관하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1의 스캐터그램, 전방 산란광 강도 및 측방 산란광을 2축으로 하는 제2의 스캐터그램을 작성했다. NRBC 시료 4로부터 조제된 측정용 시료에 관하여 전방 산란광강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 스캐터그램을 작성했다. 각 스캐터그램은 도 7, 8, 9 및 10에 나타냈다.
도 7∼10에 나타낸 바와 같이 DTAB와 비이온성 계면활성제를 조합한 시료 분석용 시약을 이용했을 경우 호염기구가 호염기구 이외의 백혈구 성분으로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다. 또한 DTAB와 비이온성 계면활성제를 조합한 시료 분석용 시약을 이용했을 경우 유핵적혈구가 호염기구나 호염기구 이외의 백혈구로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다.
또 본 실시예에서 사용한 BASO 시료 4 중에 포함되는 호염기구는 전방 산란광 강도 및 측방 산란광을 2축으로 하는 제2 스캐터그램, 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1 스캐터그램 중 어느 것에 있어도 호염기구 이외의 백혈구 성분으로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다.
이와 같이 호염기구 및 유핵적혈구가 각각 명확하게 변별되기 때문에 도 7∼10에 나타내는 바와 같이 스캐터그램 상에서 소정의 영역 내에 출현하는 세포를 호염기구 및 유핵적혈구로서 이들의 수나 전체 백혈구 수에 대한 비율을 정확하게 구하는 것이 가능하다.
실시예 4
본 실시예에서는 양이온성 계면활성제인 LTAC와 각종 비이온성 계면활성제의 조합에 관하여 검토했다. 여기서는 하기와 같은 조성의 제1 시약 및 제2 시약을 조제했다. 또한 제1 시약의 pH는 3.0이다.
제1 시약 A
살리실산나트륨 l0mM, BO-16 l000ppm 및 LTAC l000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 B
살리실산나트륨 l0mM, BO-16 5000ppm 및 LTAC 2000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 C
살리실산나트륨 l0mM, PBC-44 l000ppm 및 LTAC l000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 D
살리실산나트륨 l0mM, PBC-44 5000ppm 및 LTAC 2000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 E
살리실산나트륨 l0mM, BC-20TX l000ppm 및 LTAC l000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 F
살리실산나트륨 l0mM, BC-20TX, 5000ppm 및 LTAC 2000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 G
살리실산나트륨 l0mM, BPSH-25 l000ppm 및 LTAC 1500ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 H
살리실산나트륨 10mM, BPSH-25 5000ppm 및 LTAC 2000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 I
살리실산나트륨 10mM, HCO-50 1000ppm 및 LTAC 1000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 J
살리실산나트륨 10mM, HCO-50 7000ppm 및 LTAC 2000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 K
살리실산나트륨 10mM, HCO-20 1000ppm 및 LTAC 1000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 L
살리실산나트륨 10mM, HCO-20 7000ppm 및 LTAC 2000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 M
살리실산나트륨 10mM, PEN-4630 1000ppm 및 LTAC 1000ppm을 함유한 수용액이다.
제1 시약 N
살리실산나트륨 10mM, PEN-4630 5000ppm 및 LTAC 1800ppm을 함유한 수용액이다.
제2 시약
NK-3383 300ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
상기 제1 시약 1mL, 제2 시약 20μL 및 BASO 또는 NRBC의 함유가 확인된 혈액 시료(BASO 시료 5 또는 NRBC 시료 5) 20μL를 충분히 혼화하고, 그 혼합액을 41℃에서 10초간 반응시켜 측정용 시료를 조제했다. 실시예 1과 마찬가지로 자동 혈구 계수 장치 XE-2100을 이용해 측정용 시료 중의 호염기구, 유핵적혈구 및 전체 백혈구를 측정했다. 또한 측정에는 채혈 후 약 8시간 경과한 혈액 시료를 이용했다.
BASO 시료 5로부터 조제된 측정용 시료에 관하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1의 스캐터그램, 전방 산란광 강도 및 측방 산란광을 2축으로 하는 제2의 스캐터그램을 작성했다. NRBC 시료 5로부터 조제된 측정용 시료에 관하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 스캐터그램을 작성했다. 각 스캐터그램은 도 11, 12, 13및 14에 나타냈다.
도11∼14에 나타낸 바와 같이 LTAC와 비이온성 계면활성제를 조합한 시료 분석용 시약을 이용했을 경우 호염기구가 호염기구 이외의 백혈구 성분으로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다. 또한 LTAC와 비이온성 계면활성제를 조합한 시료 분석용 시약을 이용했을 경우 유핵적혈구가 호염기구나 호염기구 이외의 백혈구로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다.
또 본 실시예로 사용한 BASO 시료 5 중에 포함되는 호염기구는 전방 산란광 강도 및 측방 산란광을 2축으로 하는 2 스캐터그램, 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1 스캐터그램 중 어느 것에 있어도 호염기구 이외의 백혈구 성분으로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다.
이와 같이 호염기구 및 유핵적혈구가 각각 명확하게 변별되기 때문에 도 11∼14에 나타내는 바와 같이 스캐터그램 상에서 소정의 영역 내에 출현하는 세포를 호염기구 및 유핵적혈구로서 이들의 수나 전체 백혈구 수에 대한 비율을 정확하게 요구하는 것이 가능하다.
실시예 3 및 실시예 4에서 양이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 조합한 시료 분석용 시약을 이용함으로써 혈액 시료 중의 유핵적혈구 및 호염기구를 다른 백혈구로부터 명확하게 변별하여 계수할 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 5
본 실시예에서는 방향족 카르본산과 완충제의 조합에 관하여 검토했다. 여기서는 하기와 같은 조성의 제1 시약 및 제2 시약을 조제했다. 또한 제1 시약의 pH는 3.0 이다.
제1 시약 A
프탈산수소칼륨 10mM, DL-말산 0mM, BO-16 1000 ppm 및 LTAC 2000ppm을 함유하는 수용액이다.
제1 시약 B
프탈산수소칼륨 5mM, DL-말산 5mM, BO-16 l000ppm 및 LTAC 2000ppm을 함유하는 수용액이다.
제1 시약 C
프탈산수소칼륨 1mM, DL-말산 9mM, BO-16 l000ppm 및 LTAC 2000ppm을 함유하는 수용액이다.
제1 시약 D
프탈산수소칼륨 0.3mM, DL-말산 9.7mM, BO-16 l000ppm 및 LTAC 2000ppm을 함유하는 수용액이다.
제1 시약 E
살리실산나트륨 5mM, DL-말산 5mM, PBC-44 l000ppm 및 LTAC 1500ppm을 함유하는 수용액이다.
제1 시약 F
살리실산나트륨 1mM, DL-말산 9mM, PBC-44 l000ppm 및 LTAC 1500ppm을 함유하는 수용액이다.
제1 시약 G
살리실산나트륨 0.22mM, DL-말산 l0mM, PBC-44 l000ppm 및 LTAC 1500ppm을 함유하는 수용액이다.
제1 시약 H
살리실산나트륨 5mM, DL-말산 5mM, BO-16 l000ppm 및 LTAC 2000ppm을 함유하는 수용액이다.
제1 시약 I
살리실산나트륨 lmM, DL-말산 9mM, BO-16 l000ppm 및 LTAC 2000ppm을 함유하는 수용액이다.
제1 시약 J
살리실산나트륨 0.24mM, DL-말산 l0mM, BO-16 l000ppm 및 LTAC 2000ppm을 함유하는 수용액이다.
제2 시약
NK-3383 300ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
상기 제1 시약 1mL 제2 시약 20μL 및 BASO 또는 NRBC의 함유가 확인된 혈액 시료(BASO 시료 6 또는 NRBC 시료 6) 20μL를 충분히 혼화하고, 그 혼합액을 41℃에서 10초간 반응시켜 측정용 시료를 조제했다. 실시예 1과 마찬가지로 자동 혈구 계수 장치 XE-2100을 이용해 측정용 시료 중의 호염기구, 유핵적혈구 및 전체 백혈구를 측정했다. 또한 측정에는 채혈 후 약 8시간 경과한 혈액 시료를 이용했다.
BASO 시료 6으로부터 조제된 측정용 시료에 관하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1의 스캐터그램, 전방 산란광 강도 및 측방 산란광을 2축으로 하는 제2의 스캐터그램을 작성하였다. NRBC 시료 6으로부터 조제된 측정용 시료에 관하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 스캐터그램을 작성하였다. 각 스캐터그램은 도 15, 16 및 17에 나타냈다.
도 15∼17에 나타낸 바와 같이 방향족 카르본산과 완충제를 조합한 시료 분석용 시약을 이용했을 경우 호염기구가 호염기구 이외의 백혈구 성분으로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다. 또한, 방향족 카르본산과 완충제를 조합한 시료 분석용 시약을 이용했을 경우 유핵적혈구가 호염기구나 호염기구 이외의 백혈구로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다.
또 본 실시예에서 사용한 BASO 시료 6 중에 포함되는 호염기구는 전방 산란광 강도 및 측방 산란광을 2축으로 하는 제2 스캐터그램, 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1 스캐터그램 중 어느 것에 있어도 호염기구 이외의 백혈구 성분으로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다.
이와 같이 호염기구 및 유핵적혈구가 각각 명확하게 변별되기 때문에 도 15∼17에 나타내는 바와 같이 스캐터그램 상에서 소정의 영역 내에 출현하는 세포를 호염기구 및 유핵적혈구로서, 이들의 수나 전체 백혈구 수에 대한 비율을 정확하게 구하는 것이 가능하다.
또 도 15에 있어서 유핵적혈구의 집단의 중심, 호염기구의 집단의 중심 및 호염기구 이외의 백혈구의 집단의 중심을 특정하고, 각 중심에 대응하는 형광 강도 값을 구하여 각 값을 비교하였다(데이터로는 나타나 있지 않음). 각 집단의 중심을 구하는 방법은 공지의 방법을 이용하였다(특개 평5-149863호 공보). 이에 의해 프탈산만을 포함한 시료 분석용 시약(제1 시약 A)보다 프탈산과 말산 양쪽을 모두를 포함한 시료 분석용 시약(제1 시약 B∼D)을 이용하는 편이 유핵적혈구의 형광 강도와 호염기구나 호염기구 이외의 백혈구와의 형광 강도의 차이가 커지는 것을 알 수 있었다. 또한 프탈산과 말산의 양쪽 방법을 포함한 시료 분석용 시약(제1 시약 B∼D) 중 말산의 농도가 높은 편(제1 시약 C 및 D)이 유핵적혈구의 형광 강도와 호염기구나 호염기구 이외의 백혈구와의 형광 강도의 차이가 커지는 것을 알 수 있었다.
이것은 도 16 및 도 17의 살리실산과 말산을 포함하는 시료 분석용 시약(제1 시약 E∼J)에 있어서도 동일한 경향이 보였다. 이상으로부터 방향족 카르본산과 완충제를 조합함으로써 특히 유핵적혈구의 변별의 성능이 향상하는 것을 알 수 있었다.
실시예 6
본 실시예에서는 제2 시약의 형광 색소로서 여러 가지의 형광 색소를 이용했다. 여기에서는 하기와 같은 조성의 제1 시약 및 제2 시약을 조제했다. 또한 제1 시약의 pH는 3.0이다.
제1 시약
0.5mM 프탈산수소칼륨, 10mM DL-말산, 1000ppm BO-16 및 2000ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제2 시약 A
NK-529 150ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
제2 시약 B
NK-2670 150ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
제2 시약 C
NK-3750 150ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
제2 시약 D
NK-3383 150ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
제2 시약 E
NK-1840 150ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
제2 시약 F
NK-9001 150ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
제2 시약 G
NK-9003 300ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
제2 시약 H
NK-2929 150ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
제2 시약 I
NK-3375 150ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
제2 시약 J
NK-5056 300ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
제2 시약 K
NK-3266 150ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
제2 시약 L
NK-3620 150ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
상기 제1 시약 1mL, 제2 시약 20μL 및 BASO 또는 NRBC의 함유가 확인된 혈액 시료(BASO 시료 7 또는 NRBC 시료 7) 20μL를 충분히 혼화하고, 그 혼합액을 41℃에서 10초간 반응시켜 측정용 시료를 조제했다. 실시예 1과 마찬가지로 자동 혈구 계수 장치 XE-2100을 이용해 측정용 시료 중의 호염기구, 유핵적혈구 및 전체 백혈구를 측정했다.
또한 측정에는 채혈 후 약 8시간 경과한 혈액 시료를 이용했다.
BASO 시료 7로부터 조제된 측정용 시료에 관하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1의 스캐터그램, 전방 산란광 강도 및 측방 산란광을 2축으로 하는 제2의 스캐터그램을 작성하였다. NRBC 시료 7로부터 조제된 측정용 시료에 관하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 스캐터그램을 작성했다. 각 스캐터그램은 도 18, 19 및 20에 나타냈다.
도 18∼20에 나타내는 바와 같이 어느 것의 형광 색소를 포함한 시료 분석용 시약을 이용했을 경우에도 호염기구가 호염기구 이외의 백혈구 성분으로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다. 또한 어느 것의 형광 색소를 포함한 시료 분석용 시약을 이용했을 경우에서도 유핵적혈구가 호염기구나 호염기구 이외의 백혈구로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다.
또 본 실시예에서 사용한 BASO 시료 7 중에 포함되는 호염기구는 전방 산란광 강도 및 측방 산란광을 2축으로 하는 제2 스캐터그램, 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1 스캐터그램 중 어느 것에 있어도 호염기구 이외의 백혈구 성분으로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다.
이와 같이 호염기구 및 유핵적혈구가 각각 명확하게 변별되기 때문에 도 18∼20에 나타낸 바와 같이 스캐터그램 상에서 소정의 영역 내에 출현하는 세포를 호염기구 및 유핵적혈구로서, 이들의 수나 전체 백혈구 수에 대한 비율을 정확하게 구하는 것이 가능하다.
실시예 7
벤조산류의 검토
본 실시예에서는 방향족 카르본산으로서 벤조산칼륨, 4-히드록시벤조산나트륨, 3-히드록시벤조산나트륨, 4-아미노벤조산칼륨을 이용했다. 여기서는 하기와 같은 조성의 제1 시약 및 제2 시약을 조제했다. 또한 제1 시약의 pH는 3.0이다.
제1 시약 A
2mM 벤조산칼륨, 8mM DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2500ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제1 시약 B
3mM 벤조산칼륨 7mM, DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2500ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제1 시약 C
4mM 벤조산칼륨, 6mM DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2500ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제1 시약 D
7mM 4-히드록시벤조산나트륨, 3mM DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2500ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제1 시약 E
8mM 4-히드록시벤조산나트륨, 2mM DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2500ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제1 시약 F
4mM 3-히드록시벤조산나트륨, 6mM DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2500ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제1 시약 G
5mM 3-히드록시벤조산나트륨, 5mM DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2500ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제1 시약 H
1mM 벤조산칼륨, 9mM DL-말산, 2000ppm BO-16 및 2800ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제1 시약 I
2mM 4-아미노벤조산칼륨, 8mM DL-말산, 2000ppm BO-16 및 2800ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
또 제1 시약 A∼G까지는 2mM 프탈산수소칼륨, 10mM DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2500ppm LTAC를 함유하는 수용액을 대조로 하고, 제1 시약 H 및 I는 0.5mM 프탈산수소칼륨, 10mM DL-말산, 2000ppm BO-16 및 2800ppm LTAC를 함유하는 수용액을 대조로 했다.
제2 시약
NK-3383 150ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
상기 제1 시약 1mL, 제2 시약 20μL 및 BASO 또는 NRBC의 함유가 확인된 혈액 시료(BASO 시료 8 및 9 또는 NRBC 시료 8 및 9) 20μL를 충분히 혼화하고, 그 혼합액을 41℃에서 7초간 반응시켜 측정용 시료를 조제했다. 실시예 1과 마찬가지로 자동 혈구 계수 장치 XE-2100을 이용해 측정용 시료 중의 호염기구, 유핵적혈구 및 전체 백혈구를 측정했다. 또한 측정에는 채혈 후 약 8시간 경과한 혈액 시료를 이용했다
BASO 시료 8 및 9로부터 조제된 측정용 시료에 관하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1의 스캐터그램, 전방 산란광 강도 및 측방 산란광을 2축으로 하는 제2의 스캐터그램을 작성하였다. NRBC 시료 8 및 9로부터 조제된 측정용 시료에 관하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 스캐터그램을 작성했다. 각 스캐터그램은 도 21 및 22에 나타냈다.
도 21 및 22에 나타낸 바와 같이 어떤 경우에서도 호염기구가 호염기구 이외의 백혈구 성분으로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다. 또한 어떤 경우에서도 유핵적혈구가 호염기구나 호염기구 이외의 백혈구로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다.
또 본 실시예에서 사용한 BASO 시료 8 및 9 중에 포함되는 호염기구는 전방 산란광 강도 및 측방 산란광 강도를 2축으로 하는 제2 스캐터그램, 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1 스캐터그램의 어느 것에 있어도 호염기구 이외의 백혈구 성분으로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다.
이와 같이 호염기구 및 유핵적혈구가 각각 명확하게 변별되기 때문에 도 21 및 22에 나타내는 바와 같이 스캐터그램 상에서 소정의 영역 내에 출현하는 세포를 호염기구 및 유핵적혈구로서, 이러한 수나 전체 백혈구 수에 대한 비율을 정확하게 구하는 것이 가능하다.
실시예 8
프탈산수소칼륨과 벤조산칼륨의 조합
본 실시예에서는 방향족 카르본산으로서 프탈산수소칼륨과 벤조산칼륨의 조합을 검토했다. 여기에서는 하기와 같은 조성의 제1 시약 및 제2 시약을 조제했다. 또한 제1 시약의 pH는 3.0이다.
제1 시약 A
2mM 프탈산수소칼륨, 10mM DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2500ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제1 시약 B
1.5mM 프탈산수소칼륨, 0.5mM 벤조산칼륨, 10mM DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2500ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제1 시약 C
1.33mM 프탈산수소칼륨, 0.66mM 벤조산칼륨, 10mM DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2500ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제1 시약 D
1mM 프탈산수소칼륨, 1mM 벤조산칼륨, 10mM DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2500ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제1 시약 E
0.66mM 프탈산수소칼륨, 1.33mM 벤조산칼륨, 10mM DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2500ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제1 시약 F
0.5mM 프탈산수소칼륨, 1.5mM 벤조산칼륨, 10mM DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2500ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제1 시약 G
2mM 벤조산칼륨, 10mM DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2500ppm LTAC를 함유하는 수용액이다.
제2 시약
NK-3383 150ppm를 함유하는 에틸렌글리콜이다.
상기 제1 시약 1mL, 제2 시약 20μL 및 BASO 또는 NRBC의 함유가 확인된 혈액 시료(BASO 시료 10 또는 NRBC 시료 10) 20μL를 충분히 혼화하고, 그 혼합액을 41℃에서 7초간 반응시켜 측정용 시료를 조제했다. 실시예 1과 마찬가지로 자동 혈구 계수 장치 XE-2100을 이용하여 측정용 시료 중 호염기구, 유핵적혈구 및 전체 백혈구를 측정했다. 또한 측정에는 채혈 후 약 8시간 경과한 혈액 시료를 이용했다.
BASO 시료 10으로부터 조제된 측정용 시료에 관하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1 스캐터그램, 전방 산란광 강도 및 측방 산란광을 2축으로 하는 제2 스캐터그램을 작성하였다. NRBC 시료 10으로부터 조제된 측정용 시료에 대해 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 스캐터그램을 작성했다. 각 스캐터그램은 도 23에 나타냈다.
도 23에 나타낸 바와 같이 어떤 경우에서도 호염기구가 호염기구 이외의 백혈구 성분으로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다. 또한 어떤 경우에서도 유핵적혈구가 호염기구나 호염기구 이외의 백혈구로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다.
또 본 실시예에서 사용한 BASO 시료 10 중에 포함되는 호염기구는 전방 산란광 강도 및 측방 산란광을 2축으로 하는 제2 스캐터그램, 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1 스캐터그램 중 어느 것에 있어도 호염기구 이외의 백혈구 성분으로부터 명확하게 변별되는 것을 알 수 있었다.
프탈산수소칼륨을 이용했을 경우는 고스트 양이 적어진다고 하는 장점이 있고, 벤조산칼륨은 WBC 분획과 NRBC 분획이 명확하게 변별되어 양호하게 되는 장점이 있다. 이들을 혼합해 사용함으로써 호염기구 및 유핵적혈구가 각각 보다 명확하게 변별되게 된다.
이와 같이 호염기구 및 유핵적혈구가 각각 명확하게 변별되기 때문에 도 23에 나타내는 바와 같이하여 스캐터그램 상에서 소정의 영역 내에 출현하는 세포를 호염기구 및 유핵적혈구로서, 그들의 수나 전체 백혈구 수에 대한 비율을 정확하게 구하는 것이 가능하다.
실시예 9
채혈 후 그다지 시간이 경과하지 않은 혈액 시료의 측정
본 실시예에서는 X축에 형광 강도, Y축에 전방 산란광 강도를 취한 스캐터그램을 이용해 본 발명의 시약으로 채혈 후 그다지 시간이 경과하지 않은 혈액 시료의 NRBC 및 BASO의 양쪽 모두를 측정했다. 여기에서는 하기와 같은 조성의 제1 시약 및 제2 시약을 조제했다.
제1 시약(용혈제):
2mM 프탈산수소칼륨, 10mM DL-말산, 1000ppm PBC-44 및 2000ppm LTAC을 함유하는 수용액이다. 또한 제1 시약의 pH는 3.0이다.
제2 시약(염색액):
NK-3383 50ppm을 함유하는 에틸렌글리콜이다.
또 혈액 시료로는
BASO의 함유가 확인된 혈액 시료(BASO 시료)…12 검체
NRBC의 함유가 확인된 혈액 시료(NRBC 시료)…12 검체를 이용했다. 어떤 혈액 시료도 채혈 후 약 2∼7시간 경과한 것이다.
제1 시약 1mL, 제2 시약 20μL 및 혈액 시료(BAS0 시료 또는 NRBC 시료) 20μL를 충분히 혼화하고, 그 혼합액을 41℃에서 7초간 반응시켜 측정용 시료를 조제했다. 실시예 1과 마찬가지로 자동 혈구 계수 장치 XE-2100을 이용해 측정용 시료 중의 호염기구, 유핵적혈구 및 전체 백혈구를 측정했다.
BASO 시료 또는 NRBC 시료로부터 조제된 측정용 시료에 관하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 스캐터그램을 작성했다. BASO 시료의 측정 결과로부터 얻어지는 스캐터그램 중 하나를 도 25에 나타낸다. 또 NRBC 시료의 측정 결과로부터 얻어진 스캐터그램 중 하나를 도 26에 나타낸다.
도 25 및 도 26으로부터 본 발명의 시약은 채혈 후 그다지 시간이 경과하지 않은 혈액 시료에 관해서도 마찬가지로 NRBC 및 BASO의 분별이 가능한 것이 분명해졌다.
상기 스캐터그램에 있어서 소정의 영역 내에 출현하는 세포를 전체 백혈구, 호염기구, 유핵적혈구로서, 그들의 수를 구하였다. 또 얻어지는 각 세포의 수로부터 전체 백혈구 수에 대한 호염기구 또는 유핵적혈구의 비율을 구했다.
또한 마찬가지로 혈액 시료에 대해 비교예 1과 동일한 조작에 의해 전체 백혈구, 호염기구 및 유핵적혈구의 수 및 전체 백혈구 수에 대한 호염기구 또는 유핵적혈구의 비율을 대조군(control)으로서 구했다.
그리고 상기 시약(제1 시약, 제2 시약)을 이용한 측정에 의해 얻어진 결과와 상기 대조군의 전체 백혈구 수, 호염기구 비율, 유핵적혈구 비율의 상관을 확인한 결과를 도 27에 나타낸다. 또한 도 27에 있어서 실시예 9 및 대조군의 전체 백혈구 수는 BASO 시료를 측정했을 경우의 결과이다.
도 27로부터 본 발명의 시약을 이용해 측정한 결과 및 대조군은 전체 백혈구 수, 호염기구 비율 및 유핵적혈구 비율 중 어떤 것에 있어서도 상관계수(r)가 0.9 이상이 되어 높은 상관관계가 있는 것이 분명해졌다. 이로부터 본 발명의 시약은 채혈 후 여분의 시간이 경과하지 않은 혈액 시료에 관하여도 마찬가지로 NRBC 및 BASO의 측정이 가능하다는 것을 알았다.
본 출원은 2007년 9월 27일에 출원된 일본 특허 출원 특원2007-252666호 및 2008년 3월 24일에 출원된 일본 특허 출원 특원2008-76606호에 관련하고, 이러한 특허 청구의 범위, 명세서, 도면 및 요약7서의 모두는 본 명세서 중에 참조하여 넣는다.
Claims (19)
- 시료 중의 호염기구 및/또는 유핵적혈구를 측정하기 위한 시료 분석용 시약 키트로서,
적혈구를 용혈시켜 백혈구의 세포막에 형광 색소를 투과할 수 있는 정도의 손상을 주기 위한 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 방향족 카르본산을 함유하는 제1 시약과,
핵산을 염색 가능한 형광 색소를 함유하는 제2 시약을 포함하는 시료 분석용 시약 키트. - 청구항 1에 있어서,
상기 형광 색소가 일반식(I):
(상기 식 중의 R1 및 R2는 서로 동일하거나 또는 다른 알킬기이고;
이고,
이며,
R3, R4, R5 및 R6은 서로 동일하거나 또는 다르고, 수소원자 또는 알킬기고;
X-는 음이온이다.)의 형광 색소 및 일반식 (II):
(상기 식 중 R7 및 R8은 서로 동일하거나 또는 다르며 산성기를 가지고 있어도 되는 알킬기이고;
이고,
이며;
R9, R10, R11 및 R12는 서로 동일하거나 또는 다르고, 수소원자 또는 산성기이지만, 단 R7∼R12 중 어느 하나에는 산성기가 존재하고;
R7∼R12에 존재할 수 있는 산성기는 염을 형성하고 있어도 되지만, 단, R7∼R12에 존재할 수 있는 산성기 중 어느 하나는 프로톤을 방출한 기이다.)
의 형광 색소로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 시료 분석용 시약 키트. - 청구항 2에 있어서,
상기 일반식(II)의 R7∼R12에 존재할 수 있는 산성기가 술폰산기인 시료 분석용 시약 키트. - 청구항 2 또는 3에 있어서,
상기 일반식(II)의 R7∼R12에 존재할 수 있는 염을 형성하고 있는 산성기가 알칼리 금속염 기인 시료 분석용 시약 키트. - 청구항 1에 있어서,
상기 양이온 계면활성제가 제4급 암모늄염 또는 피리디늄염의 형태인 시료 분석용 시약 키트. - 청구항 1에 있어서,
상기 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌피마자유, 폴리옥시에틸렌경화피마자유, 폴리옥시에틸렌스테롤, 폴리옥시에틸렌 수소첨가스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개인 시료 분석용 시약 키트. - 청구항 1에 있어서,
상기 방향족 카르본산이 살리실산, 프탈산, 벤조산, 히드록시벤조산, 아미노벤조산 및 이들의 염으로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개인 시료 분석용 시약 키트. - 청구항 1에 있어서,
상기 제1 시약의 pH가 산성인 시료 분석용 시약 키트. - 청구항 1에 있어서,
상기 제1 시약이 pH 2.0∼4.5 범위에 pKa를 가지는 완충제를 포함하는 시료 분석용 시약 키트. - 청구항 9에 있어서,
상기 완충제가 말산, 구연산, 주석산, 디글리콜산, 말론산, 숙신산으로부터 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개인 시료 분석용 시약 키트. - 청구항 1의 제1 시약에 의해 시료 중의 적혈구를 용혈시켜 혈구의 세포막에 형광 색소를 투과할 수 있는 정도의 손상을 주고, 청구항 1의 제2 시약에 의해 손상을 받은 혈구를 염색하는 공정;
상기 염색된 혈구에 빛을 조사해 산란광 정보 및 형광 정보를 취득하는 공정; 및
상기 산란광 정보 및 상기 형광 정보에 근거해 상기 시료 중의 호염기구 및/또는 유핵적혈구를 분류하여 계수하는 공정을 포함하는 시료 분석 방법. - 청구항 11에 있어서,
상기 산란광 정보가 전방 산란광 정보이고,
상기 계수 공정이 상기 전방 산란광 정보 및 상기 형광 정보에 근거해 상기 시료 중의 유핵적혈구를 계수하는 시료 분석 방법. - 청구항 11 또는 12에 있어서,
상기 산란광 정보가 전방 산란광 정보이며,
상기 계수 공정이 상기 전방 산란광 정보 및 상기 형광 정보에 근거해 상기 시료 중의 호염기구를 계수하는 시료 분석 방법. - 청구항 11에 있어서,
상기 산란광 정보가 전방 산란광 정보 및 측방 산란광 정보이며,
상기 계수 공정이 상기 전방 산란광 정보 및 상기 측방 산란광 정보에 근거해 상기 시료 중의 호염기구를 계수하는 시료 분석 방법. - 청구항 11에 있어서,
상기 계수 공정이 상기 산란광 정보 및 상기 형광 정보에 근거해서 추가로 상기 시료 중의 백혈구를 분류해 계수하는 시료 분석 방법. - 청구항 15에 있어서,
상기 산란광 정보가 전방 산란광 정보이며,
상기 계수 공정이 상기 전방 산란광 정보 및 상기 형광 정보에 근거해 상기 시료 중의 백혈구를 분류해 계수하는 시료 분석 방법. - 시료 중의 백혈구 및 유핵적혈구를 측정하기 위한 시료 분석용 시약 키트로서,
적혈구를 용혈시키기 위한 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 방향족 카르본산을 함유하는 제1 시약과,
핵산을 염색 가능한 형광 색소를 함유하는 제2 시약을 포함하고,
제1 시약 및 제2 시약으로 처리된 시료로부터 취득되는 형광 정보에 근거해 백혈구와 유핵적혈구가 구별 가능한 시료 분석용 시약 키트. - 시료 중의 호염기구 및 호염기구 이외의 백혈구를 측정하기 위한 시료 분석용 시약 키트로서,
적혈구를 용혈시키기 위한 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 방향족 카르본산을 함유하는 제1 시약과,
핵산을 염색 가능한 형광 색소를 함유하는 제2 시약을 포함하고,
제1 시약 및 제2 시약으로 처리된 시료로부터 취득되는 산란광 정보에 근거해 호염기구와 호염기구 이외의 백혈구가 구별 가능한 시료 분석용 시약 키트. - 시료 중의 호염기구, 호염기구 이외의 백혈구, 유핵적혈구 및 백혈구를 측정하기 위한 시료 분석용 시약 키트로서,
적혈구를 용혈시키기 위한 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및 방향족 카르본산을 함유하는 제1 시약과,
핵산을 염색 가능한 형광 색소를 함유하는 제2 시약을 포함하며,
제1 시약 및 제2 시약으로 처리된 시료로부터 취득되는 형광 정보 및 산란광 정보에 근거해 호염기구와 호염기구 이외의 백혈구와 유핵적혈구와 백혈구가 구별 가능한 시료 분석용 시약 키트.
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