JP2013079968A - 試料分析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸を含有する第1試薬により、試料中の赤血球を溶血させ、血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与え、核酸を染色可能な蛍光色素を含有する第2試薬により、損傷を受けた血球を染色する工程と前記染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程と、及び、前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球及び有核赤血球を分類して計数する工程を含む、試料分析方法。
【選択図】なし
Description
近年、フローサイトメトリの原理を応用した種々の自動血球計数装置が市販されている。これらの自動血球計数装置を用いると、試料中の血球の分類・計数を自動で行うことができる。
本発明の目的は、試料中の有核赤血球及び好塩基球を他の白血球から、より明確に弁別し、計数することができる試料測定方法を提供することである。
本明細書において、「試料」とは、哺乳動物、好ましくはヒトから採取された血液、骨髄液、尿、アフェレーシスなどで採取した試料などの体液試料をいう。
R13、R14及びR15としての炭素数1〜8のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルなどを挙げることができる。R13、R14及びR15としての炭素数6〜8のアラルキル基としては、ベンジル、フェネチルなどを挙げることができる。好ましくは、R13、R14及びR15は、メチル、エチルなどの炭素数1〜8のアルキル基である。
R16としての炭素数8〜18のアルキル基としては、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシルなどを挙げることができる。R16としての炭素数8〜18のアルケニル基としては、オクテニル、デセニル、オレイルなどを挙げることができる。R16としての炭素数6〜18のアラルキル基としては、ベンジル、フェネチルなどを挙げることができる。好ましくは、R16は、デシル、ドデシル、テトラデシルなどの炭素数10〜18の直鎖のアルキル基である。
アニオンX-としては、F-、Cl-、Br-及びI-のようなハロゲンイオン、CF3SO3 -、BF4 -、ClO4 -などが挙げられる。
なお、炭素数8〜18のアルキル基としては、デシル、ドデシル、テトラデシルなどの炭素数10〜18の直鎖のアルキル基を挙げることができる。アニオンX-としては、F-、Cl-、Br-及びI-のようなハロゲンイオン、CF3SO3 -、BF4 -、ClO4 -などが挙げられる。
なお、カチオン性界面活性剤の濃度が低すぎると、好塩基球と好塩基球以外の白血球との正確な弁別ができなくなる場合がある。これは、カチオン性界面活性剤の濃度が低すぎると白血球に十分な損傷を与えることができず、その結果として、好塩基球と好塩基球以外の白血球との間の大きさや形態の差が小さくなってしまうためと考えられる。一方、カチオン性界面活性剤の濃度が高すぎると、有核赤血球と好塩基球以外の白血球との正確な弁別ができなくなる場合がある。これは、カチオン性界面活性剤の濃度が高すぎると、特に好塩基球以外の白血球及び有核赤血球の細胞膜に過度の損傷が与えられ、その結果として、有核赤血球と好塩基球以外の白血球との正確な弁別ができなくなるためと考えられる。従って、上記の範囲の濃度であれば、白血球や有核赤血球の細胞膜には過度の損傷を与えずに、赤血球を効率よく溶血させることができる。また、カチオン性界面活性剤の溶血力は、その主鎖の長さに依存している。主鎖の長いものは、溶血力が強く、従って主鎖の短いものに比べて少量で効果が得られる。
なお、ノニオン性界面活性剤の濃度が少なすぎると、例えば採血後時間が経過した試料を用いた場合に、カチオン性界面活性剤による白血球及び有核赤血球の細胞膜への過度の損傷が抑えられず、特に有核赤血球と好塩基球以外の白血球とを正確に弁別できない場合がある。一方、ノニオン性界面活性剤の濃度が高すぎると、カチオン性界面活性剤による白血球及び有核赤血球の細胞膜への損傷を阻害して、特に好塩基球と好塩基球以外の白血球とを正確に弁別できない場合がある。従って、上記の範囲の濃度であれば、採血後時間が経過した試料を用いた場合であっても、有核赤血球と好塩基球以外の白血球を正確に弁別することができる。
なお、芳香族カルボン酸を含まない第1試薬を測定に用いた場合、血液試料によっては好塩基球の値が偽高値を示す場合がある。偽高値となる理由は明らかになっていないが、血液試料に含まれる好塩基球以外の血球又はその他の成分が、好塩基球と類似する大きさ、形態又は蛍光強度を示しているからであると考えられる。しかしながら、上記の血液試料を、芳香族カルボン酸を含む第1試薬を用いて測定することによって、偽高値を示す現象を抑えることができる。
第1試薬中の上記の芳香族カルボン酸又はその塩の濃度は、第1試薬中のpHが以下に示した範囲となる濃度であれば特に限定されないが、0.1〜100mMが好ましく、0.5〜50mMがより好ましい。
なお、芳香族カルボン酸の濃度が少なすぎると上述したような効果が十分に得られず、好塩基球を正確に弁別できない場合がある。一方、芳香族カルボン酸の濃度が高すぎると、有核赤血球と好塩基球以外の白血球とを正確に弁別できない場合がある。従って、上記の範囲の濃度であれば、有核赤血球と好塩基球とを他の血球から正確に弁別することができる。
5及びR6は、互いに同一又は異なっている。X-はアニオンである。
びR8は、互いに同一又は異なっている。さらに、
X軸に蛍光強度、Y軸に前方散乱光強度をとってスキャッタグラムを描いた場合、例えば、図1に示すように、有核赤血球、好塩基球及び好塩基球以外の白血球は、それぞれ集団(クラスター)を形成して分布する。なお、図中で、NRBCと示したのは有核赤血球の集団であり、BASOと示したのは好塩基球の集団であり、WBC−BASOと示したのは好塩基球以外の白血球の集団であり、WBCと示したのは白血球の集団である。このようなスキャッタグラムにおいては、有核赤血球は白血球よりも蛍光強度が小さい領域に出現する。このことにより、白血球と有核赤血球とを明確に弁別することができる。また、好塩基球は、好塩基球以外の白血球よりもサイズが大きく、蛍光強度が大きい領域に出現する。このことにより、好塩基球以外の白血球と弁別することができる。しかしながら、白血球数が多い試料や採血後時間が経過した試料を測定した場合、蛍光強度と前方散乱光強度とを利用したスキャッタグラムにおいて、好塩基球と好塩基球以外の白血球とを、正確に弁別できないことがある。その場合は、前方散乱光情報と側方散乱光情報とを利用することができる。X軸に側方散乱光強度、Y軸に前方散乱光強度をとってスキャッタグラムを描いた場合、例えば図2に示すように、好塩基球及び好塩基球以外の白血球は、それぞれ集団(クラスター)を形成して分布する。なお、図中で、BASOと示したのは好塩基球の集団であり、WBC−BASOと示したのは好塩基球以外の白血球の集団である。このようなスキャッタグラムにおいては、好塩基球は、他の白血球よりも側方散乱光強度と前方散乱光強度が大きい領域に出現する。このことにより、好塩基球と他の白血球を弁別することができる。さらに、前述したように、図1から有核赤血球と他の白血球を弁別することができる。ゆえに、図1及び図2のどちらの領域にも含まれる細胞を好塩基球として算出することにより、より精度の高い好塩基球を求めることができる。
ポリオキシエチレン(16)オレイルエーテル(製品名:NIKKOL BO−16)、
ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル(製品名:NIKKOL BC−20TX)、
ポリオキシエチレン(20)ポリオキシプロピレン(8)セチルエーテル(製品名:NIKKOL PBC−44)、
ポリオキシエチレン(30)ポリオキシプロピレン(6)デシルテトラデシルエーテル(製品名:NIKKOL PEN−4630)、
ポリオキシエチレン(20)ヒマシ油(製品名:NIKKOL CO−20TX)、
ポリオキシエチレン(20)硬化ヒマシ油(製品名:NIKKOL HCO−20)、
ポリオキシエチレン(50)硬化ヒマシ油(製品名:NIKKOL HCO−50)、
ポリオキシエチレン(25)フィトスタノール(製品名:NIKKOL BPSH−25)。
いずれも日光ケミカルズ株式会社から購入することができる。
本例では、従来の方法を利用して、採血後約8時間経過した血液試料を測定した。
被験者3名からそれぞれ採取された血液試料を、自動血球計数装置XE−2100(シスメックス製:赤半導体レーザ(633nm)を搭載)を用いて測定し、全白血球数及び好塩基球を計数した。この計数結果に基づいて、好塩基球比率を算出した。なお、試薬としては、ストマトライザ−FBII(シスメックス製)を用いた。また、測定には、採血後約8時間経過した血液試料を用いた。
測定の結果、これら試料の好塩基球の含有量は、正常値以上であることが認められた(以下、この試料をBASO試料1、BASO試料2及びBASO試料3とする)。BASO試料1の好塩基球比率は0.8%、BASO試料2の好塩基球比率は3.4%、BASO試料3の好塩基球比率は1.6%であった。これらの結果を実施例1又は2の対照とした。
測定の結果、これらの試料は有核赤血球が出現していることが認められた(以下、この試料をNRBC試料1、NRBC試料2及びNRBC試料3とする)。NRBC試料1の有核赤血球比率は4.4個/100WBC、NRBC試料2の有核赤血球比率は1.9個/100WBC、NRBC試料3の有核赤血球比率は1.3個/100WBCであった。これらの結果を実施例1又は2の対照とした。
本実施例では、下記の組成の第1試薬及び第2試薬を調製し、各試薬を用いて採血後約8時間経過した血液試料を測定した。
なお、第1試薬のpHは3.0である。
サリチル酸ナトリウム 0.5mM、DL−リンゴ酸 10mM、LTAC 2000ppm、BO−16 1000ppmを含有する水溶液である。
第1試薬B
サリチル酸ナトリウム 0.5mM、DL−リンゴ酸 10mM、LTAC 1500ppm、PBC−44 1000ppmを含有する水溶液である。
第1試薬C
サリチル酸ナトリウム 10mM、LTAC 2000ppm、BO−16 1000ppmを含有する水溶液である。
第1試薬D
サリチル酸ナトリウム 10mM、LTAC 1500ppm、PBC−44 1000ppmを含有する水溶液である。
第1試薬E
フタル酸水素カリウム 0.5mM、DL−リンゴ酸 10mM、LTAC 2000ppm、BO−16 1000ppmを含有する水溶液である。
第1試薬F
フタル酸水素カリウム 2mM、DL−リンゴ酸 10mM、LTAC 1500ppm、PBC−44 1000ppmを含有する水溶液である。
エチレングリコール 100mL中に、NK−3383 15mgを溶解したものである。
なお、測定には、採血後約8時間経過したBASO試料1及び2並びにNRBC試料1及び2を用いた。
さらに、これらスキャッタグラムに基づいて、全白血球、好塩基球及び有核赤血球を計数し、好塩基球比率及び有核赤血球比率を算出した。表2は、比較例1及び本実施例で算出された、採血後8時間経過したBASO試料1又は2の好塩基球比率を示したものである。表3は、比較例1及び本実施例で算出された、採血後8時間経過したNRBC試料1又は2の有核赤血球比率を示したものである。
また、表2及び3より、実施例1で算出された比率と比較例1で算出された比率とは近似した値であった。従って、本実施例の試料分析用試薬を用いると、有核赤血球と好塩基球とをそれぞれ別々の試薬を用いて測定した場合と同程度の精度で測定を行うことができることが確認された。
本実施例では、実施例1の第1試薬及び第2試薬を用いて採血後約50時間経過した血液試料を測定した。測定方法は、血液試料以外は、実施例1と同じである。本例の測定には、採血後約50時間経過したBASO試料2又は3並びにNRBC試料2又は3を用いた。
なお、実施例1の第1試薬A〜Fのうち、BASO試料2及びNRBC試料2の測定には第1試薬A、B、E及びFを用い、BASO試料3及びNRBC試料3の測定には第1試薬C及びDを用いた。
さらに、これらスキャッタグラムに基づいて、全白血球、好塩基球及び有核赤血球を計数し、好塩基球比率及び有核赤血球比率を算出した。表4は、本実施例で算出された、採血後50時間経過したBASO試料2又は3の好塩基球比率を示したものである。なお、表4では、第1スキャッタグラム(前方散乱光強度及び蛍光強度)及び第2スキャッタグラム(前方散乱光強度及び側方散乱光強度)に基づいて算出されたそれぞれの好塩基球比率を示した。表5は、本実施例で算出された、採血後50時間経過したNRBC試料2又は3の有核赤血球比率を示したものである。
比較例1の方法で測定した場合、採血後約8時間経過したBASO試料2の好塩基球比率は3.4%、採血後約8時間経過したBASO試料3の好塩基球比率は1.6%であった。さらに、採血後約8時間経過したNRBC試料2の有核赤血球比率は1.9個/100WBC、採血後約8時間経過したNRBC試料3の有核赤血球比率は1.3個/100WBCであった。これら比較例1の結果並びに表4及び表5の結果から、実施例2で算出された比率と比較例1で算出された比率とは近似した値であった。従って、本実施例の試料分析用試薬を用いると、採血後に時間が経過した試料であっても、有核赤血球と好塩基球とをそれぞれ別々の試薬を用いて測定した場合と同程度の精度で測定を行うことができることが確認された。
また、表2及び表4のBASO試料2の結果から、採血後約50時間経過した試料において算出された好塩基球比率と、採血後約8時間経過した試料において算出された好塩基球比率とは近似した値であった。表3及び表5NRBC試料2の結果から、採血後約50時間経過した試料において算出された有核赤血球比率と、採血後約8時間経過した試料において算出された有核赤血球比率とは近似した値であった。
以上のことから、本実施例の試料分析用試薬を用いると、採血後に時間が経過した試料であっても、高い精度で測定を行うことができることが確認された。
本実施例では、カチオン性界面活性剤であるDTABと各種のノニオン性界面活性剤との組み合わせについて検討した。ここでは、下記の組成の第1試薬及び第2試薬を調製した。なお、第1試薬のpHは3.0である。
サリチル酸ナトリウム 10mM、BO−16 3000ppm及びDTAB 3000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬B
サリチル酸ナトリウム 10mM、BO−16 7000ppm及びDTAB 7000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬C
サリチル酸ナトリウム 10mM、PBC−44 3000ppm及びDTAB 5000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬D
サリチル酸ナトリウム 10mM、PBC−44 7000ppm及びDTAB 7000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬E
サリチル酸ナトリウム 10mM、BC−20TX 2000ppm及びDTAB 3000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬F
サリチル酸ナトリウム 10mM、BC−20TX 2000ppm及びDTAB 5000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬G
サリチル酸ナトリウム 10mM、BPSH−25 3000ppm及びDTAB 7000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬H
サリチル酸ナトリウム 10mM、BPSH−25 7000ppm及びDTAB 7000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬I
サリチル酸ナトリウム 10mM、HCO−50 5000ppm及びDTAB 5000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬J
サリチル酸ナトリウム 10mM、HCO−50 7000ppm及びDTAB 7000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬K
サリチル酸ナトリウム 10mM、HCO−20 3000ppm及びDTAB 5000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬L
サリチル酸ナトリウム 10mM、HCO−20 7000ppm及びDTAB 7000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬M
サリチル酸ナトリウム 10mM、CO−20TX 3000ppm及びDTAB 5000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬N
サリチル酸ナトリウム 10mM、CO−20TX 7000ppm及びDTAB 7000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬O
サリチル酸ナトリウム 10mM、PEN−4630 3000ppm及びDTAB 5000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬P
サリチル酸ナトリウム 10mM、PEN−4630 5000ppm及びDTAB 7000ppmを含有した水溶液である。
NK−3383 300ppmを含有するエチレングリコールである。
また、本実施例で使用したBASO試料4中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第2スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第1スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図7〜10に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
本実施例では、カチオン性界面活性剤であるLTACと各種のノニオン性界面活性剤との組み合わせについて検討した。ここでは、下記の組成の第1試薬及び第2試薬を調製した。なお、第1試薬のpHは3.0である。
サリチル酸ナトリウム 10mM、BO−16 1000ppm及びLTAC 1000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬B
サリチル酸ナトリウム 10mM、BO−16 5000ppm及びLTAC 2000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬C
サリチル酸ナトリウム 10mM、PBC−44 1000ppm及びLTAC 1000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬D
サリチル酸ナトリウム 10mM、PBC−44 5000ppm及びLTAC 2000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬E
サリチル酸ナトリウム 10mM、BC−20TX 1000ppm及びLTAC 1000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬F
サリチル酸ナトリウム 10mM、BC−20TX 5000ppm及びLTAC 2000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬G
サリチル酸ナトリウム 10mM、BPSH−25 1000ppm及びLTAC 1500ppmを含有した水溶液である。
第1試薬H
サリチル酸ナトリウム 10mM、BPSH−25 5000ppm及びLTAC 2000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬I
サリチル酸ナトリウム 10mM、HCO−50 1000ppm及びLTAC 1000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬J
サリチル酸ナトリウム 10mM、HCO−50 7000ppm及びLTAC 2000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬K
サリチル酸ナトリウム 10mM、HCO−20 1000ppm及びLTAC 1000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬L
サリチル酸ナトリウム 10mM、HCO−20 7000ppm及びLTAC 2000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬M
サリチル酸ナトリウム 10mM、PEN−4630 1000ppm及びLTAC 1000ppmを含有した水溶液である。
第1試薬N
サリチル酸ナトリウム 10mM、PEN−4630 5000ppm及びLTAC 1800ppmを含有した水溶液である。
NK−3383 300ppmを含有するエチレングリコールである。
また、本実施例で使用したBASO試料5中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする2スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第1スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図11〜14に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
実施例3及び実施例4より、カチオン性界面活性剤とノニオン性界面活性剤とを組み合わせた試料分析用試薬を用いることにより、血液試料中の有核赤血球及び好塩基球を他の白血球から、明確に弁別し、計数できることが示された。
本実施例では、芳香族カルボン酸と緩衝剤との組み合わせについて検討した。ここでは、下記の組成の第1試薬及び第2試薬を調製した。なお、第1試薬のpHは3.0である。
フタル酸水素カリウム 10mM、DL−リンゴ酸 0mM、BO−16 1000ppm及びLTAC 2000ppmを含有する水溶液である。
第1試薬B
フタル酸水素カリウム 5mM、DL−リンゴ酸 5mM、BO−16 1000ppm及びLTAC 2000ppmを含有する水溶液である。
第1試薬C
フタル酸水素カリウム 1mM、DL−リンゴ酸 9mM、BO−16 1000ppm及びLTAC 2000ppmを含有する水溶液である。
第1試薬D
フタル酸水素カリウム 0.3mM、DL−リンゴ酸 9.7mM、BO−16 1000ppm及びLTAC 2000ppmを含有する水溶液である。
第1試薬E
サリチル酸ナトリウム 5mM、DL−リンゴ酸 5mM、PBC−44 1000ppm及びLTAC 1500ppmを含有する水溶液である。
第1試薬F
サリチル酸ナトリウム 1mM、DL−リンゴ酸 9mM、PBC−44 1000ppm及びLTAC 1500ppmを含有する水溶液である。
第1試薬G
サリチル酸ナトリウム 0.22mM、DL−リンゴ酸 10mM、PBC−44 1000ppm及びLTAC 1500ppmを含有する水溶液である。
第1試薬H
サリチル酸ナトリウム 5mM、DL−リンゴ酸 5mM、BO−16 1000ppm及びLTAC 2000ppmを含有する水溶液である。
第1試薬I
サリチル酸ナトリウム 1mM、DL−リンゴ酸 9mM、BO−16 1000ppm及びLTAC 2000ppmを含有する水溶液である。
第1試薬J
サリチル酸ナトリウム 0.24mM、DL−リンゴ酸 10mM、BO−16 1000ppm及びLTAC 2000ppmを含有する水溶液である。
NK−3383 300ppmを含有するエチレングリコールである。
また、本実施例で使用したBASO試料6中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第2スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第1スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図15〜17に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
このことは、図16及び図17のサリチル酸とリンゴ酸を含む試料分析用試薬(第1試薬E〜J)においても、同様の傾向がみられた。以上のことから、芳香族カルボン酸と緩衝剤とを組み合わせることによって、特に有核赤血球の弁別の性能が向上することがわかった。
本実施例では、第2試薬の蛍光色素として種々の蛍光色素を用いた。ここでは、下記の組成の第1試薬及び第2試薬を調製した。なお、第1試薬のpHは3.0である。
0.5mM フタル酸水素カリウム、10mM DL−リンゴ酸、1000ppm BO−16及び2000ppm LTACを含有する水溶液である。
NK−529 150ppmを含有するエチレングリコールである。
第2試薬B
NK−2670 150ppmを含有するエチレングリコールである。
第2試薬C
NK−3750 150ppmを含有するエチレングリコールである。
第2試薬D
NK−3383 150ppmを含有するエチレングリコールである。
第2試薬E
NK−1840 150ppmを含有するエチレングリコールである。
第2試薬F
NK−9001 150ppmを含有するエチレングリコールである。
第2試薬G
NK−9003 300ppmを含有するエチレングリコールである。
第2試薬H
NK−2929 150ppmを含有するエチレングリコールである。
第2試薬I
NK−3375 150ppmを含有するエチレングリコールである。
第2試薬J
NK−5056 300ppmを含有するエチレングリコールである。
第2試薬K
NK−3266 150ppmを含有するエチレングリコールである。
第2試薬L
NK−3620 150ppmを含有するエチレングリコールである。
なお、測定には、採血後約8時間経過した血液試料を用いた。
また、本実施例で使用したBASO試料7中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第2スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第1スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図18〜20に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
安息香酸類の検討
本実施例では、芳香族カルボン酸として、安息香酸カリウム、4−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、3−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、4−アミノ安息香酸カリウムを用いた。ここでは、下記の組成の第1試薬及び第2試薬を調製した。なお、第1試薬のpHは3.0である。
2mM 安息香酸カリウム、8mM DL−リンゴ酸、1000ppm PBC−44及び2500ppm LTACを含有する水溶液である。
第1試薬B
3mM 安息香酸カリウム、7mM DL−リンゴ酸、1000ppm PBC−44及び2500ppm LTACを含有する水溶液である。
第1試薬C
4mM 安息香酸カリウム、6mM DL−リンゴ酸、1000ppm PBC−44及び2500ppm LTACを含有する水溶液である。
第1試薬D
7mM 4−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、3mM DL−リンゴ酸、1000ppm PBC−44及び2500ppm LTACを含有する水溶液である。
第1試薬E
8mM 4−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、2mM DL−リンゴ酸、1000ppm PBC−44及び2500ppm LTACを含有する水溶液である。
第1試薬F
4mM 3−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、6mM DL−リンゴ酸、1000ppm PBC−44及び2500ppm LTACを含有する水溶液である。
第1試薬G
5mM 3−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、5mM DL−リンゴ酸、1000ppm PBC−44及び2500ppm LTACを含有する水溶液である。
第1試薬H
1mM 安息香酸カリウム、9mM DL−リンゴ酸、2000ppm BO−16及び2800ppm LTACを含有する水溶液である。
第1試薬I
2mM 4−アミノ安息香酸カリウム、8mM DL−リンゴ酸、2000ppm BO−16及び2800ppm LTACを含有する水溶液である。
NK−3383 150ppmを含有するエチレングリコールである。
また、本実施例で使用したBASO試料8及び9中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第2スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第1スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
このように、好塩基球及び有核赤血球がそれぞれ明確に弁別されるため、図21及び22に示すようにしてスキャッタグラム上で所定の領域内に出現する細胞を好塩基球及び有核赤血球として、それらの数や全白血球数に対する比率を正確に求めることが可能である。
フタル酸水素カリウムと安息香酸カリウムの組み合わせ
本実施例では、芳香族カルボン酸として、フタル酸水素カリウムと安息香酸カリウムの組み合わせを検討した。ここでは、下記の組成の第1試薬及び第2試薬を調製した。なお、第1試薬のpHは3.0である。
2mM フタル酸水素カリウム、10mM DL−リンゴ酸、1000ppm PBC−44及び2500ppm LTACを含有する水溶液である。
第1試薬B
1.5mM フタル酸水素カリウム、0.5mM 安息香酸カリウム、10mM DL−リンゴ酸、1000ppm PBC−44及び2500ppm LTACを含有する水溶液である。
第1試薬C
1.33mM フタル酸水素カリウム、0.66mM 安息香酸カリウム、10mM DL−リンゴ酸、1000ppm PBC−44及び2500ppm LTACを含有する水溶液である。
第1試薬D
1mM フタル酸水素カリウム、1mM 安息香酸カリウム、10mM DL−リンゴ酸、1000ppm PBC−44及び2500ppm LTACを含有する水溶液である。
第1試薬E
0.66mM フタル酸水素カリウム、1.33mM 安息香酸カリウム、10mM DL−リンゴ酸、1000ppm PBC−44及び2500ppm LTACを含有する水溶液である。
第1試薬F
0.5mM フタル酸水素カリウム、1.5mM 安息香酸カリウム、10mM DL−リンゴ酸、1000ppm PBC−44及び2500ppm LTACを含有する水溶液である。
第1試薬G
2mM 安息香酸カリウム、10mM DL−リンゴ酸、1000ppm PBC−44及び2500ppm LTACを含有する水溶液である。
NK−3383 150ppmを含有するエチレングリコールである。
また、本実施例で使用したBASO試料10中に含まれる好塩基球は、前方散乱光強度及び側方散乱光を二軸とする第2スキャッタグラム、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第1スキャッタグラムのいずれにおいても、好塩基球以外の白血球成分から明確に弁別されることがわかった。
採血後あまり時間が経過していない血液試料の測定
本実施例では、X軸に蛍光強度、Y軸に前方散乱光強度をとったスキャッタグラムを用い、本発明の試薬で、採血後あまり時間が経過していない血液試料のNRBC及びBASOの両方を測定した。ここでは、下記の組成の第1試薬及び第2試薬を調製した。
2mM フタル酸水素カリウム、10mM DL−リンゴ酸、1000ppm PBC−44及び2000ppm LTACを含有する水溶液である。なお、第1試薬のpHは3.0である。
第2試薬(染色液):
NK−3383 50ppmを含有するエチレングリコールである。
BASOの含有が認められた血液試料(BASO試料)・・・12検体
NRBCの含有が認められた血液試料(NRBC試料)・・・12検体
を用いた。いずれの血液試料も、採血後約2〜7時間経過したものである。
BASO試料又はNRBC試料から調製された測定用試料について、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とするスキャッタグラムを作成した。BASO試料の測定結果から得られたスキャッタグラムの一つを、図25に示す。また、NRBC試料の測定結果から得られたスキャッタグラムの一つを、図26に示す。
Claims (15)
- カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤及び芳香族カルボン酸を含有する第1試薬により、試料中の赤血球を溶血させ、血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷を与え、核酸を染色可能な蛍光色素を含有する第2試薬により、損傷を受けた血球を染色する工程;
前記染色された血球に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程;及び
前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球及び有核赤血球を分類して計数する工程
を含む、試料分析方法。 - 前記蛍光色素が、一般式(I):
R3、R4、R5及びR6は互いに同一又は異なって、水素原子又はアルキル基であり;
X-はアニオンである)
の蛍光色素、及び一般式(II):
R9、R10、R11及びR12は互いに同一又は異なって、水素原子又は酸性基であるが、
但し、R7〜R12のいずれか1つには酸性基が存在し;
R7〜R12に存在し得る酸性基は塩を形成していてもよいが、但し、R7〜R12に存在し得る酸性基のうちいずれか1つは、プロトンを放出した基である)
の蛍光色素からなる群から選択される少なくとも1である請求項1に記載の方法。 - 前記一般式(II)のR7〜R12に存在し得る酸性基が、スルホン酸基である請求項2に記載の方法。
- 前記一般式(II)のR7〜R12に存在し得る塩を形成している酸性基が、アルカリ金属塩の基である請求項2又は3に記載の方法。
- 前記カチオン界面活性剤が、第四級アンモニウム塩又はピリジニウム塩の型である請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ノニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンステロール、ポリオキシエチレン水素添加ステロールからなる群から選択される少なくとも1つである請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記芳香族カルボン酸が、サリチル酸、フタル酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、アミノ安息香酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも1つである請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1試薬のpHが酸性である請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1試薬が、pH2.0〜4.5の範囲にpKaを有する緩衝剤を含む請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記緩衝剤が、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、ジグリコール酸、マロン酸、コハク酸からなる群より選択される少なくとも1つである請求項9に記載の方法。
- 前記散乱光情報が、前方散乱光情報であり、
前記計数工程が、前記前方散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の有核赤血球を計数する請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。 - 前記散乱光情報が、前方散乱光情報であり、
前記計数工程が、前記前方散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球を計数する請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。 - 前記散乱光情報が、前方散乱光情報及び側方散乱光情報であり、
前記計数工程が、前記前方散乱光情報及び前記側方散乱光情報に基づいて、前記試料中の好塩基球を計数する請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 前記計数工程が、前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、さらに前記試料中の白血球を分類して計数する請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記散乱光情報が、前方散乱光情報であり、
前記計数工程が、前記前方散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記試料中の白血球を分類して計数する請求項14に記載の方法。
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