JP6166716B2 - 好塩基球分析システムおよび方法 - Google Patents
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Description
本出願は、35合衆国法典.§119(e)に基づき、2011年5月4日出願の「好塩基球の検出および分析方法(Method For Detecting and Analyzing Basophils)」と題する米国特許仮出願第61/482,549号の利益を主張する。この特許の全開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供されるのは、血液試料を分析するシステムおよび方法、さらに具体的には、好塩基球分析を行い、血液試料中の好塩基球を同定、分類、および計数するシステムおよび方法である。一実施形態では、システムおよび方法は、一般的には、(a)血液試料を専用の細胞膜透過性蛍光染料で染色すること;およびその後、(b)光散乱および蛍光発光の測定を使って、他の白血球(WBC)亜集団から好塩基球を識別することを含む。さらに具体的には、例示実施形態は、血液試料内の粒子を励起するように配置された励起源;光散乱および蛍光発光を測定するように配置された複数の検出器;ならびに(a)光散乱および蛍光発光の測定値を受けるように、および(b)受けた測定値に基づいて、血液試料の好塩基球クラスター分析を行うように構成されたプロセッサ、を有する血液分析器を含む。好塩基球クラスター分析は、受けた測定値の「粗(coarse)」クラスタリング、続けて、受けた測定値の「密(fine)」クラスタリングを含むことができる。密クラスタリングは、類似のクラスターを組み合わせるための決定要因として多次元確率距離尺度を利用できる。
一実施形態では、血液試料分析は、蛍光情報を強化した多角偏光散乱分離技術(MAPSS)を使って行われる。フローセルを通過する各血液細胞による光散乱を検出するには、少なくとも1つのフォトダイオード、または少なくとも1つの光電子増倍管、または少なくとも1つのフォトダイオードおよび少なくとも1つの光電子増倍管の両方が、必要である。2つ以上のフォトダイオードを使って、約0°散乱を測定する軸方向光損失(ALL)シグナル、および、低角(例えば、約3°〜約15°)散乱を測定する中間角散乱(IAS)シグナルを測定する。2つ以上の光電子増倍管を使って、90°偏光側方散乱(PSS)シグナルおよび90°偏光解消側方散乱(DSS)シグナルを検出する。適切な波長範囲内の蛍光(FL1)測定のためには、光源の波長の選択に応じて、追加の光電子増倍管が必要である。システムで捕捉された各イベントは、このように、複数の特性情報、例えば、ALL、IAS(1つまたは複数のチャネル)、PSS、DSS、および蛍光(1つまたは複数のチャネル)を示す。これらの検出チャネル由来の情報を使って、さらなる血液細胞の分析を行う。
WBCは、それらの核中に比較的高い濃度のDNAを含む。適切に設計されれば、蛍光染料は、異なるWBCの亜集団の間で識別するために使用できる。例えば、リンパ球および好塩基球は、類似の光散乱特性を有するにも関わらず、異なる蛍光の特色を有する。さらに、成熟RBCは、DNAを含んでいない。従って、蛍光染料は、血液細胞集団の間で識別するように選択できる。染料の目的は、生細胞中に容易に侵入し、高親和性でDNAと結合し、染料が適切な光源により励起される時、適切なストークスシフトを有する強力な蛍光を発光することである。可視バンド中の染料のピーク吸収は、染料を正確に励起し、最適な結果を得るために、実質的に光源の波長に一致させうる(光源の波長の50nm以内、より好ましくは、光源の波長の25nm以内で)。
血液細胞は、光源による蛍光染料の励起時に異なる大きさの蛍光シグナルを発光する。蛍光シグナルの大きさの差異は、細胞内の核酸、すなわち、DNAの量から生じる。DNAの量が大きくなればなるほど、高い蛍光シグナルの可能性が大きくなる。また、細胞膜の浸透、染料の寸法、染料およびDNAの間の結合動力学、染料およびDNAの間の親和性、ならびに他の因子の効力は、蛍光シグナルに影響する。成熟RBCは、最小の蛍光シグナルを発光する。理由は、成熟RBC内にはDNAがないからである。非溶解RBCまたはRBC断片は、蛍光を発光しないが、非常に弱い自己蛍光を発光できる。また、好塩基球は、リンパ球とは違った蛍光発光特性を有することが示された。
Y=0.9375X−0.0435;R2=0.9151
(図8:手作業のゲーティング対.参照)
Y=1.0721X+0.0348;R2=0.9144
(図9:ランダムクラスタリング対.参照)
一実施形態では、システムおよび方法は、(a)界面活性剤、界面活性剤の濃度、WBC安定化薬剤、WBC安定化薬剤の濃度、反応混合物の最終pH、および浸透圧の適切な選択によるWBC試薬の最適化;(b)WBCを染色するためのWBC試薬中に核染色用染料を含めること;および(c)生データファイルの処理後現れる好塩基球を、自動クラスタリングアルゴリズムを使って分析すること、を含む。生データファイルは、時間タグおよび他の関連情報と共に、少なくとも5つの情報の特性;すなわち、ALL、IAS、PSS、DSSおよびFL1を有するイベントを含んでもよい。成分の最適化により、少なくとも1つの光学的特性で、リンパ球からの好塩基球の識別が可能となる。
前出の本発明の説明は、例示および説明のために提示されている。網羅的とする、または本発明を開示された正確な形態に限定する意図はない。上記教示を考慮すると、他の修正および変更が可能であろう。実施形態は、本発明の原理および実際の適用を最良に説明するために、また、それにより他の当業者が種々の実施形態で、および意図された特定の用途に適合するように種々の修正形態で、本発明を最良に利用できるようにするために、選択され、説明された。添付の請求項は、等価構造、成分、方法、および手段を含む他の代替の本発明の実施形態を含むように解釈されるべきであることが意図されている。
他の実施形態が可能である。本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、記載された実施形態に対し修正を行うことができる。従って、詳細説明は、制限を意味しない。さらに、発明の概要および要約セクションは、発明者に意図された1つまたは複数の本発明の、全てではない、代表的実施形態を説明するものであり、従って、本発明および添付請求項を何ら制限する意図はない。
Claims (26)
- 複数の好塩基球およびリンパ球を含む血液試料の好塩基球分析を行うための血液分析器であって、
前記血液試料内の粒子を励起するように配置された励起源;
(1)前記励起血液試料からの軸方向光損失を測定するように配置された軸方向光損失検出器、(2)前記励起血液試料からの中間角散乱を測定するように配置された中間角散乱検出器、(3)前記励起血液試料からの90°側方散乱を測定するように配置された側方散乱検出器、および(4)前記励起血液試料から発光した蛍光を測定するように配置された蛍光検出器、を含む複数の検出器;ならびに
血液分析器に、(a)前記血液試料を、赤血球(RBC)溶解薬剤および細胞膜透過性核酸結合蛍光染料を含む試薬で希釈させ;(b)ステップ(a)の希釈血液試料を、インキュベーション時間、インキュベートさせ;(c)ステップ(b)でインキュベートした試料を、血液分析器のフローセルに送り出させ;(d)インキュベートした試料がフローセルを通過する間に、ステップ(c)でインキュベートした試料を励起源により励起させ;(e)励起試料からの複数の光散乱シグナルおよび蛍光発光シグナルを収集させ;(f)好塩基球分析の実行に先立ち、蛍光発光シグナルに限定し、RBC断片を含むRBCからの蛍光発光シグナルより高く、白血球(WBC)からの蛍光発光シグナルより低い蛍光の大きさに設定した蛍光トリガーのみを使って非核含有イベントを排除させ、および核含有イベントを保持させ;および、(g)ステップ(f)で集めた核含有イベントに対して好塩基球クラスター分析を実行させる指示を実行するように構成されたプロセッサ;
を含む血液分析器。 - 前記好塩基球クラスター分析が、前記核含有イベントの粗クラスタリングを含む、請求項1に記載の血液分析器。
- 前記好塩基球クラスター分析が、類似クラスターを組み合わせるための決定要因として、多次元確率距離尺度を利用した、前記核含有イベントの密クラスタリングをさらに含む、請求項2に記載の血液分析器。
- 前記側方散乱検出器が、前記励起血液試料からの90°偏光側方散乱を測定するように配置された偏光側方散乱検出器である、請求項1に記載の血液分析器。
- 前記プロセッサが、(1)軸方向光損失、(2)中間角散乱、(3)90°偏光側方散乱、および(4)蛍光の測定値に基づいて、前記血液試料内のリンパ球から血液試料内の好塩基球を識別するようにさらに構成される、請求項4に記載の血液分析器。
- 前記励起血液試料からの90°偏光解消側方散乱を測定するように配置された偏光解消側方散乱検出器をさらに含む、請求項4に記載の血液分析器。
- 前記プロセッサが、(1)軸方向光損失、(2)中間角散乱、および(3)90°側方散乱の測定値に基づいて、前記血液試料内の好中球、単球、および好酸球から前記血液試料内の好塩基球を識別するようにさらに構成される、請求項1に記載の血液分析器。
- 前記プロセッサが、(1)軸方向光損失、(2)中間角散乱、(3)90°偏光側方散乱、および(4)蛍光の測定値に基づいて、前記血液試料内の好中球、単球、および好酸球から前記血液試料内の好塩基球を識別するようにさらに構成される、請求項1に記載の血液分析器。
- 前記軸方向光損失検出器が、0°散乱で軸方向光損失を測定する、請求項1に記載の血液分析器。
- 前記中間角散乱検出器が、約3°〜約15°で光角度散乱を測定する、請求項1に記載の血液分析器。
- 前記複数の検出器が、1つまたは複数の光電子増倍管を含む、請求項1に記載の血液分析器。
- 前記励起源が、レーザーである、請求項1に記載の血液分析器。
- 前記血液試料を試薬で希釈するためのインキュベーションサブシステムをさらに含む、請求項1に記載の血液分析器。
- 前記試薬が、(a)少なくとも1つの界面活性剤、(b)少なくとも1つの緩衝液または少なくとも1つの塩、(c)少なくとも1つの抗菌剤、および(d)前記蛍光染料を含む、請求項13に記載の血液分析器。
- 前記インキュベーションサブシステムが、前記血液試料を試薬と共に、約30秒未満の時間、インキュベートするように構成される、請求項13に記載の血液分析器。
- 前記インキュベーションサブシステムが、前記血液試料を試薬と共に、約30℃〜約50℃の温度範囲でインキュベートするように構成される、請求項13に記載の血液分析器。
- 前記インキュベーションサブシステムが、前記血液試料を試薬と共に、約40℃の温度でインキュベートするように構成される、請求項13に記載の血液分析器。
- 自動化血液分析器で好塩基球分析を行う方法であって、
(a)全血試料を、赤血球(RBC)溶解薬剤および細胞膜透過性核酸結合蛍光染料を含む試薬で希釈すること;
(b)ステップ(a)の希釈血液試料を、インキュベーション時間、インキュベートすること;
(c)ステップ(b)でインキュベートした試料を、前記血液分析器のフローセルに送り出すこと;
(d)前記インキュベートした試料が前記フローセルを通過する間に、ステップ(c)でインキュベートした試料を励起源で励起すること;
(e)励起試料からの複数の光散乱シグナルおよび蛍光発光シグナルを収集すること;
(f)好塩基球分析の実行に先立ち、蛍光発光シグナルに限定し、RBC断片を含むRBCからの蛍光発光シグナルより高く、白血球(WBC)からの蛍光発光シグナルより低い蛍光の大きさに設定した蛍光トリガーのみを使って非核含有イベントを排除し、および核含有イベントを保持すること;および
(g)ステップ(e)で集めた全シグナルに基づいて、ステップ(f)で集めたイベントに対する好塩基球クラスター分析を行うこと、
を含む方法。 - 前記好塩基球クラスター分析が、前記核含有イベントの粗クラスタリングを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記好塩基球クラスター分析が、類似のクラスターを組み合わせるための決定要因として多次元確率距離尺度を利用した、前記核含有イベントの密クラスタリングをさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 前記試薬が、(a)少なくとも1つの界面活性剤、(b)少なくとも1つの緩衝液または少なくとも1つの塩、(c)少なくとも1つの抗菌剤、および(d)少なくとも1つの蛍光染料を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記励起源が、約350nm〜約700nmの波長である、請求項18に記載の方法。
- 励前記起源が、約488nmの波長である、請求項18に記載の方法。
- 前記複数の光散乱シグナルが、(1)軸方向光損失、(2)中間角散乱、および(3)90°側方散乱を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記複数の光散乱シグナルが、(1)軸方向光損失、(2)中間角散乱、(3)90°偏光側方散乱、および(4)90°偏光解消側方散乱を含む、請求項18に記載の方法。
- プロセッサが、ステップ(f)で集めた核含有イベントに対する多次元好塩基球クラスター分析を行うように構成されている、請求項1に記載の血液分析器。
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