JP3076118B2 - 粒子計数方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、粒子数を計数する方法
に関し、特に同一検体内の複数の異なる種類の粒子の数
をそれぞれ計数する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】異なる種類の粒子がそれぞれ検体内にど
の位の数だけ存在しているかを検査することは、例えば
白血球中にリンパ球、単球、顆粒球がそれぞれ何個ずつ
存在している検査する血球分類として行われている。

【０００３】従来、このような血球分類は、次のように
して行われていた。まず人体から採取した血液を測定用
に前処理して検体を得て、この検体を粒子検出器にかけ
て、１つの血球に対してそれぞれ２つの異なる測定デー
タを得ることを、各血球に対して行う。そして、一方の
測定データに対応してＸ座標軸を設定し、他方の測定デ
ータに対応してＹ座標軸を設定して、これらＸ、Ｙ座標
軸によって規定される空間に両測定データをプロットし
て、各血球の分布図（スキャタグラム）を得る。この分
布図上にリンパ球、単球、顆粒球に各血球を分画する境
界線を引き、これら境界線内の血球の数をそれぞれ計数
し、リンパ球、単球、顆粒球の数をそれぞれ求める。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記のような方法は、
リンパ球、単球、顆粒球とに、血球の分布が分布図上で
明確に離れて分布している場合には、分類（クラスタリ
ング）は容易であり、かつ測定精度も高くなる。しか
し、現実に得られる分布図では、リンパ球、単球、顆粒
球の境界は不明瞭であり、分類の精度がそのまま各血球
の計数値の精度に影響を与える。

【０００５】分類の方法としては、予め設定された多く
の設定値、多くの条件により細かい場合分けを行い、そ
の条件に適した場所を境界線として選ぶ方法もあった。
この方法では、設定値や条件の決定は、試行錯誤により
経験的に行わざるを得ず、そのため良好な値や条件が見
つかるまで、多大の労力や時間を必要としていた。さら
に、汎用性がなく、先に設定値や条件を決定したのとは
異なる分布パターンを対象とする場合には、この異なる
分布パターンに適合するように設定値や条件を再び設定
しなければならなかった。また、各血球は必ずいずれか
１つの血球に属させるため、分画に無理が伴っていた。

【０００６】このような問題点を解決するために、いず
れのクラスタに属するか明確に確定できない血球に対し
ては、複数のクラスタに少しずつ属するようにするファ
ジィクラスタリング手法が提案されている。ファジィク
ラスタリング手法は、曖昧さを自然に表現できるので、
分布解析には適した方法であるが、血球等の粒子の分析
分野において汎用のファジィクラスタリングをそのまま
用いると、演算時間が長くなり、例えば３２ビットＣＰ
Ｕのパーソナルコンピュータでも１分以上もかかるとい
う問題点があった。

【０００７】本発明は、多大の時間や労力をかける必要
がなく、即ち、開発コストが安く、汎用性があり、しか
も最適な分画位置を決定することができ、しかも粒子の
分布の重なりにも対応でき、処理速度の速い粒子計数方
法を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに、本発明は、複数の種類の粒子が混在する検体を検
査し、同一粒子に対して複数種類のデータを各粒子ごと
に得て、粒子の分布図データを得る工程と、分布図デー
タに、各種類ごとに固定領域を、その固定領域に対応す
る種類の粒子であれば、必ずその固定領域内に分布する
ように設定し、これら固定領域内の粒子の当該固定領域
に対するクラスタへの帰属度を１とする工程と、各クラ
スタ内の粒子の分布を基に各クラスタごとに分布の初期
重心の位置を求める工程と、当初には前回の各クラスタ
の重心位置を各初期重心位置として、各固定領域外の粒
子について、前回の各クラスタの重心位置までの距離を
算出し、この距離に基づいて各クラスタへの帰属度を求
める工程と、各粒子は各クラスタへの帰属度に応じて各
クラスタに属するものとして各クラスタごとに今回の重
心位置を求める工程と、前回の重心位置と今回の重心位
置との差が所定量以下であるか否か判断する工程と、上
記差が所定量以下でなかったとき、前回の各クラスタの
重心位置として今回の重心位置を用いて、上記差が所定
量になるまで、上記の帰属度を求める工程、今回の重心
位置を求める工程、前回の重心位置と今回の重心位置と
の差を判定する工程、を繰り返し、上記差が所定量以下
になったとき、そのとき得られている各粒子の各クラス
タへの帰属度を基に各クラスタに属する粒子数を算出す
る工程と、を具備するものである。

【０００９】各固定領域外の粒子についての上記前回の
各クラスタの重心位置までの距離の算出を、前回の各ク
ラスタの重心位置を中心とし、粒子を境界上に含み、長
径と短径の比、分布図の座標軸に対する傾きが、それぞ
れ所定の値である楕円を設定し、その短径長を境界上の
粒子と前回の各クラスタの重心位置との距離として行う
こともできる。

【００１０】各クラスタへの帰属度を基に各クラスタに
属する粒子数の算出を、各粒子は各クラスタへの帰属度
のうち、最大の帰属度のクラスタに帰属とするとして行
うこともでき、または各粒子は各クラスタへの帰属度に
応じて各クラスタへ帰属とするものとして行うこともで
きる。

【００１１】

【作用】本発明によれば、まず分布図データに、各種類
ごとに固定領域が設定される。各固定領域は、その固定
領域に対応する種類の粒子であれば、必ずその固定領域
内に分布するように設定される。これら固定領域内の粒
子の当該固定領域に対するクラスタへの帰属度は１とし
てある。各クラスタ内の粒子の分布を基に各クラスタご
とに分布の初期重心の位置を求める。これによって各固
定領域内の帰属度１の各粒子がその重心位置に集中して
いると見なすことができる。

【００１２】各固定領域外の或る粒子について、各クラ
スタの初期重心位置までの距離が算出され、この距離に
基づいて、この粒子の各クラスタへの帰属度が求められ
る。無論、この帰属度は１以下の値である。この様にし
て、各固定領域外の粒子の全てについて帰属度を決定す
る。各粒子は各クラスタへの帰属度に応じて各クラスタ
に属するものとして、各クラスタごとに新たに重心位置
を求める。即ち、固定領域外のどの粒子も、先に求めた
各クラスタへの帰属度に応じた割合で各クラスタに所属
していると見なしているので、その帰属度も考慮して、
各クラスタに属する粒子がどのような重心位置に集中し
ていると見なせるかを、新たに求めている。

【００１３】この新たな重心位置と初期重心位置との差
が所定量以下であるか否か判断する。この差が所定量以
下でなければ、まだ各粒子の各クラスタへの帰属度は一
意的に決定されていないので、今回求めた各クラスタの
重心位置から各固定領域外の粒子までの距離を再び算出
し、再び各クラスタへの帰属度を求める。そして、この
求めた帰属度を基に各クラスタの重心位置を求め、この
重心位置と前回の重心位置との差が、所定量か判断す
る。ここでも所定量以下でないと、まだ各粒子の各クラ
スタへの帰属度は一意的に決定されていないので、今回
求めた各重心位置を基礎に、固定領域外の粒子の帰属度
を求め、この帰属度を基に新たな重心位置を求める。こ
れを繰り返し、差が所定量以下になると、各粒子の各ク
ラスタへの帰属度が一意的に求められたので、その各粒
子の各クラスタへの帰属度を基に各クラスタに属する粒
子数を算出する。

【００１４】

【実施例】本実施例は、粒子分析装置、特に白血球の分
析装置に本発明を実施したもので、図２に示すように粒
子検出器、例えば血球検出器１０を有している。この血
球検出器１０は、測定のために、希釈、溶血剤の添加等
の前処理が施され、白血球だけとされた検体である懸濁
液をサンプルとして各血球を測定するものである。この
血球検出器１０では、各血球が個々に測定され、個々の
血球に対してそれぞれ異なる種類のデータが検出され
る。

【００１５】血球検出器１０としては、例えば、細孔に
直流電流と高周波電流とを同時に供給し、この細孔を各
血球に通過させ、各血球ごとに直流インピーダンスの変
化に基づく信号と、高周波インピーダンスの変化に基づ
く信号とを得るものを使用している。図３（ａ）に示す
ように、直流電流を細孔に流しておいた場合、この細孔
を、溶血剤の添加後の血球が通過すると、その細胞質１
２の大きさに比例した信号が得られる。また、同図
（ｂ）に示すように、高周波電流を細孔に流しておいた
場合、血球の細胞質１２のような密度の低い物質のイン
ピーダンスは小さくなり、核や顆粒１４のような密度の
高い物質のインピーダンスは高くなるので、細孔を通過
した血球の核や顆粒１４の密度と大きさを総合した信号
が得られる。

【００１６】血球検出器１０からの２種類の信号は、増
幅器１６で増幅された後、Ａ／Ｄ変換器１８でディジタ
ル信号に変換される。即ち量子化が行われる。この量子
化によって、血球の細胞質１２の大きさを表している直
流インピーダンスの変化に基づく信号は、例えば０から
２５５までの合計２５６個のチャンネルのいずれか（以
下これをｉチャンネルと称する。）に分類され、同様に
血球の核や顆粒１４の密度と大きさを総合した信号も０
から２５５までの合計２５６個のチャンネルのいずれか
（以下これをｊチャンネルと称する。）に分類される。

【００１７】これらディジタル信号は、解析回路２０に
供給される。なお、解析回路２０は、パーソナルコンピ
ュータまたはマイクロコンピュータによって構成され、
表示装置２２やキーボード（図示せず）が付属している
ものである。

【００１８】解析回路２０は、白血球をリンパ球、単球
及び顆粒球に分類し、計数を行うために、まず、これら
ディジタル信号に基づいて、図４に示すように、ｉチャ
ンネルをＸ軸とし、ｊチャンネルをＹ軸とするスキャッ
タグラム（分布図）を得る。この分布図は、Ｘ軸、Ｙ軸
が共に２５６のチャンネルを持つので、合計２５６×２
５６の血球の状態を表す基本要素からなり、各基本要素
には、その基本要素に該当する血球の数が記憶されてい
る。例えばＸ軸が１チャンネルで、Ｙ軸が２チャンネル
の基本要素の値が６であるとすると、血球の細胞質１２
の大きさの信号が１で、核や顆粒１４の密度と大きさを
総合した信号の大きさが２である血球が６個存在するこ
とを表している。

【００１９】この分布図データに基づいて図１にフロー
チャートで示すような処理を解析回路２０が行って分
類、計数を行う。まず初期分割を行う（ステップＳ
２）。この初期分割では、図４に示した分布図のうち各
基本要素における血球数を無視して、基本要素の分布
を、リンパ球であれば、明らかにそこに分布すると想定
される固定領域Ａ１、単球であれば明らかにそこに分布
すると想定される固定領域Ａ２、顆粒球であれば明らか
にそこに分布すると想定される固定領域Ａ３、血小板や
赤血球からなるゴーストであれば明らかにそこに分布す
ると想定される固定領域Ａ４の４つの固定領域で分割す
る。各固定領域は予め設定されている。

【００２０】そして、固定領域Ａ１内に存在する血球
は、リンパ球のクラスタへの帰属度を１とし、固定領域
Ａ２内に存在する血球は、単球のクラスタへの帰属度を
１とし、固定領域Ａ３内に存在する血球は、顆粒球のク
ラスタへの帰属度を１とし、固定領域Ａ４内に存在する
血球は、ゴーストのクラスタへの帰属度を１とする。な
お、図５に示すＡ５の領域は、リンパ球、単球、顆粒
球、ゴーストいずれとも帰属が未定の血球の存在する領
域である。

【００２１】次に、各クラスタの初期重心の計算を行う
（ステップＳ４）。これによって各クラスタの重心位置
にそのクラスタ内の全血球が集中していると見なすこと
ができる。この重心位置の計算は、例えばリンパ球のク
ラスタの場合、数１、数２によって求められる。

【００２２】

【数１】

【数２】 ここでＮ_ijは、基本要素ｉ、ｊにおける血球数である。
他の単球、顆粒球、ゴーストについても同様にして重心
位置を求める。このようにして求めたリンパ球、単球、
顆粒球、ゴーストのクラスタの重心位置（Ｘ_G1、
Ｙ_G1）、（Ｘ_G2、Ｙ_G2）、（Ｘ_G3、Ｙ_G3）、（Ｘ_G4、Ｙ
_G4）を図６に示す。

【００２３】そして、帰属度の算出を行う（ステップＳ
６）。これは、Ａ１乃至Ａ４のいずれの固定領域にも属
さない血球、即ち図５における領域Ａ５に分布した各血
球の各クラスタへの帰属度を求めるものである。そのた
め、領域Ａ５の各血球に対して各クラスタの重心位置ま
での距離を求め、この距離に応じて各クラスタへの帰属
度を求める。例えば、図６に符号２４で示すＡ５の領域
の血球からの各クラスタの重心位置（Ｘ_G1、Ｙ_G2）、
（Ｘ_G2、Ｙ_G2）、（Ｘ_G3、Ｙ_G3）、（Ｘ_G4、Ｙ_G4）まで
の距離を求め、この血球２４の各クラスタへの帰属度
は、距離の短いクラスタほど帰属度を大きく定める。こ
のような作業を領域Ａ５の各血球に対して行う。

【００２４】ここで、各血球の各クラスタの重心位置ま
での距離は、ユークリッド距離ではなく、図７に示すよ
うに対象となるクラスタの重心位置、例えばリンパ球の
場合（Ｘ_G1、Ｙ_G1）を中心とし、予めそのクラスタに応
じて定めた特定の傾きθ、例えばリンパ球の場合θ⁽¹⁾
を持ち、対象となる血球２６がその弧上に位置する楕円
を描き、その楕円の短径長を距離としている。このよう
にして距離を定めているのは、リンパ球、単球、顆粒球
等の実際の分布がほぼ楕円状に分布しているからであ
り、同じ楕円の弧上に位置する血球、例えば図７におけ
る血球２６、２８は、同じ帰属度で各クラスタに属する
ことになり、クラスタリングを行った後の各クラスタを
楕円にまとめるという効果がある。

【００２５】ここで、リンパ球の場合、楕円の短径を
ａ、長径をａｋ（ｋは比例定数）とすると、楕円の方程
式は数３によって表され、

【数３】 これを変形すると、数４が得られ、

【数４】 数４をさらに数５のように変形することによって、短径
ａが求められる。

【数５】 ただし、Ｘ”、Ｙ”は、数６、数７によって求められ、
ここでＸ、Ｙは対象となる血球２６の座標である。な
お、楕円の傾きθ⁽¹⁾ 、長短径比ｋは、実際の分布に合
うように定められる。このようにして、血球２６の各ク
ラスタの重心位置（Ｘ_G1、Ｙ_G1）、（Ｘ_G2、Ｙ_G2）、
（Ｘ_G3、Ｙ_G3）、（Ｘ_G4、Ｙ_G4）までの距離を求める。

【数６】

【数７】

【００２６】例えば、このようにして血球２４の各クラ
スタへの距離Ｌ１乃至Ｌ４が求められると、この血球の
リンパ球のクラスタへの帰属度は、数８によって求めら
れる。無論、これら帰属度は、いずれも１より小さい値
である。

【数８】 他の単球、顆粒球、ゴーストのクラスタに対する帰属度
も同様にして求める。このような処理を領域Ａ５の全て
の血球に対して行い、領域Ａ５の全ての血球の各クラス
タへの帰属度を求める。

【００２７】なお、数４、数５、数６、数７より明らか
なように、距離計算は、各重心からの各血球の相対位
置、例えばリンパ球の場合、Ｘ’（＝Ｘ−Ｘ_G1）、Ｙ’
（＝Ｙ−Ｙ_G1）が定まれば、算出できるので、各血球の
リンパ球の重心位置からの相対位置、各血球の単球の重
心位置からの相対位置、各血球の顆粒球の重心位置から
の相対位置、各血球のゴーストの重心位置からの相対位
置を予めルック・アップテーブル化しておけば、距離計
算に要する時間を短縮することができる。

【００２８】このようにして領域Ａ５の各血球の各クラ
スタへの帰属度を求めたので、全ての血球は、各クラス
タにその帰属度に応じた割合で所属している。従って、
その重みを考慮して、各クラスタの重み付き重心の計算
を行う（ステップＳ８）。この重み付き重心は、例えば
リンパ球のクラスの重心Ｇ’₁ （Ｘ’_G1、Ｙ’_G1）の場
合、数９、数１０によって求められる。

【数９】

【数１０】

【００２９】ここで、Ｕ_ij ⁽¹⁾ は、基本要素ｉ、ｊにあ
る血球のリンパ球のクラスタへの帰属度を表している。
他のクラスタに対しても、同様にして重み付き重心がそ
れぞれ求められる。

【００３０】このようにして各クラスタの重み付き重心
を求めた後、ステップＳ４で求めた各クラスタの初期重
心位置のうち対応するものと比較し、その変化量が所定
量、例えば０であるか判断する（ステップＳ１０）。も
し、どのクラスタにおいても変化量が０でなければ、ま
だ各血球の各クラスタへの重心位置までの距離が確定さ
れてなく、各血球の各クラスタへの帰属度が一意的に決
定されていないことになる。

【００３１】そのような場合、今回求めた各クラスタの
重み付き重心の位置を各クラスタの初期重心に置き換え
て、ステップＳ６、Ｓ８、Ｓ１０を繰り返す。即ち、血
球の各クラスタの重み付き重心の位置までの距離を求
め、この距離に基づいて各血球の各クラスタへの帰属度
を求め、これら帰属度を基に新たに各クラスタの重み付
き重心位置を求め、これら新たな各クラスタの重み付き
重心位置と先の各クラスタの重み付き重心位置との変化
量が所定量であるか判断し、再び所定量でなければ、今
回求めた各クラスタの重み付き重心位置を初期重心位置
としてステップＳ６、Ｓ８、Ｓ１０を繰り返す。

【００３２】ただし、予め定めた回数だけステップＳ
６、Ｓ８、Ｓ１０を繰り返しても、所定量にならない場
合を考慮して、ステップＳ１０の判断がノーの場合、ス
テップＳ６、Ｓ８、Ｓ１０の実行回数が所定回数か判断
し（ステップＳ１２）、所定回数になった場合、解析不
能表示を表示装置２２に行い（ステップＳ１４）、処理
を終了する。

【００３３】また、各クラスタの重心の変化がいずれも
所定量となると、各血球の各クラスタへの最終的な帰属
が決定されたので、これに基づいて各クラスタの血球数
を決定する（ステップＳ１６）。この最終的な帰属の決
定方法としては２つあり、そのうちの１つは、各血球の
帰属は、最終的に得られた帰属度のうち、最大の値を示
すクラスタに属するとするものである。例えば、或る基
本要素に１０個の血球があり、これら血球のリンパ球の
クラスタに対する帰属度が０．９５、単球のクラスタに
対する帰属度が０．０３、顆粒球のクラスタに対する帰
属度が０．０２、ゴーストのクラスタに対する帰属度が
０となったような場合、これら１０個の血球は、最大の
帰属度を示すリンパ球のクラスタに属するとする。これ
は、帰属度の特定のクラスタ、この場合、リンパ球のク
ラスタへの帰属度が大きく、各クラスタの分離が良い場
合に適している。

【００３４】もう１つの決定方法は、各血球の帰属は、
最終的に得られた帰属度に応じて確率的に分配するもの
である。例えば或る基本要素に血球が１０個存在し、こ
れら血球のリンパ球のクラスタへの帰属度が０．２、単
球のクラスタへの帰属度が０．５、顆粒球のクラスタへ
の帰属度が０．３、ゴーストのクラスタへの帰属度が０
であるとした場合、各クラスタへの帰属度はゴーストの
クラスタを除いて、比較的接近している。即ち、この基
本要素におけるリンパ球、単球、顆粒球のクラスタのパ
ターンは重なりあっている。このような場合に、最も最
大の帰属度である単球に、この基本要素の全ての血球を
割り当てると、誤差が大きくなる。

【００３５】そこで、この１０個の血球を各クラスタへ
の帰属度に応じて割り当てると、単球には５個、リンパ
球には２個、顆粒球には３個、ゴーストには０個を割り
当てることになり、誤差が少なくなり、各クラスタのパ
ターンが重なりあっている場合に有効である。

【００３６】このように各クラスタへの帰属を上記２つ
の方法のうちいずれで行うかは、対象となるパターンの
性質に応じて定める。

【００３７】このようにして、各血球の最終的な帰属度
を定め、これを利用して各クラスタに属する血球の数を
計数する。

【００３８】さらに、この実施例では、各クラスタの最
終的な重心位置、分布の広がり（最終的に設定した楕円
の長径及び短径）等を計算するので、これらを利用し
て、正常でないパターン（例えば病気をもつ患者の血液
を検査した場合、健康な人の血液を検査した場合の重心
位置、分布の広がりとは異なったものとなる）であるか
否かの判定を行うこともできる。

【００３９】なお、解析回路２０に市販されている３２
ビットのパーソナルコンピュータを用いて、実際にこの
実施例を実行した場合、分布図の分布パターンにほとん
ど関係なく、処理時間は１０秒程度であり（ステップＳ
６、Ｓ８、Ｓ１０の繰り返し回数３回の場合）、実用上
充分に満足できるものであった。

【００４０】上記の実施例は、血球の分類、計数に本発
明を実施したが、血球に限ったものではなく、他の粒子
の分類、計数に使用できることはいうまでもない。ま
た、他の粒子を分類、計数する場合には、各クラスタの
重心位置からの粒子の距離を求める場合、この実施例と
は異なり、ユークリッド距離を用いることができる場合
もある。また、血球の検出には、インピーダンスの変化
を利用するもの以外、フローサイトメータによって１つ
の粒子に対して散乱光や各種蛍光信号を得るものを用い
てもよい。

【００４１】

【発明の効果】以上のように、本発明によれば、分布図
データに、各種類ごとに固定領域を、その固定領域に対
応する種類の粒子であれば、必ずその固定領域内に分布
するように設定し、これら固定領域内の粒子の当該固定
領域に対するクラスタへの帰属度を１としてあるので、
これら固定領域内の粒子の帰属度を決定する必要がな
く、短時間で精度良く、分類、計数することができる。
さらに、各クラスタの重心位置までの各粒子の距離計算
に実際の粒子の分布パターンを考慮した楕円を用いてい
るので、さらに短時間で精度良く、分類、計数すること
ができる。また、異なる分布をする粒子を分類、計数す
る場合でも、固定領域の設定、帰属度計算の距離計算方
法を変更するだけでよいので、従来の分類、計数方法よ
りも汎用性がある。また、最終的な帰属度に応じて各血
球を各クラスタに割り当てる際に、各クラスタへの帰属
度に応じて割り振って場合には、各クラスタのパターン
に重なりがあっても対応できるし、重なりのない場合に
は、最大の帰属度のクラスタに血球を割り当てることに
よって、速やかな処理が行える。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による粒子計数方法の１実施例のフロー
チャートである。

【図２】同実施例のブロック図である。

【図３】同実施例での血球の検出の説明図である。

【図４】同実施例において使用する血球の分布を示す図
である。

【図５】同実施例における固定領域の設定の説明図であ
る。

【図６】同実施例における各固定領域の重心位置の説明
図である。

【図７】同実施例における固定領域外の血球のクラスタ
への距離計算の説明図である。

【符号の説明】

１０ 血球検出器 ２０ 解析回路 ２２ 表示回路

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 複数の種類の粒子が混在する検体をそれ
   ぞれ検査し同一粒子に対して複数種類のデータを各粒子
   ごとに得て粒子の分布図データを得る第１の工程と、 上記分布図データに、上記各種類ごとに固定領域を、そ
   の固定領域に対応する種類の上記粒子であれば、必ずそ
   の固定領域内に分布するように設定し、これら固定領域
   内の上記粒子の当該固定領域に対するクラスタへの帰属
   度を１とする第２の工程と、 上記各クラスタ内の粒子の分布を基に上記各クラスタご
   とに分布の初期重心の位置を求める第３の工程と、 当初には前回の各クラスタの重心位置を上記各初期重心
   位置として、上記各固定領域外の粒子について、上記前
   回の各クラスタの重心位置までの距離を算出し、この距
   離に基づいて上記各クラスタへの帰属度を求める第４の
   工程と、 上記各粒子は上記各クラスタへの帰属度に応じて上記各
   クラスタに属するものとして上記各クラスタごとに今回
   の重心位置を求める第５の工程と、 上記前回の重心位置と上記今回の重心位置との差が所定
   量以下であるか否か判断する第６の工程と、 第６の工程において上記差が所定量以下でなかったと
   き、上記前回の各クラスタの重心位置として今回の重心
   位置を用いて、上記差が所定量になるまで第４乃至第６
   の工程を繰り返す第７の工程と、 上記第６の工程において上記差が所定量以下になったと
   き、そのとき得られている上記各粒子の上記各クラスタ
   への帰属度を基に上記各クラスタに属する粒子数を算出
   する第８の工程と、を具備する粒子計数方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の粒子計数方法において、
   第４の工程の上記各固定領域外の粒子についての上記前
   回の各クラスタの重心位置までの距離の算出を、上記前
   回の各クラスタの重心位置を中心とし、上記粒子を境界
   上に含み、長径と短径の比、上記分布図の座標軸に対す
   る傾きが、それぞれ所定の値である楕円を設定し、その
   短径長を上記境界上の粒子と上記前回の各クラスタの重
   心位置との距離として行うことを特徴とする粒子計数方
   法。
3. 【請求項３】 請求項１記載の粒子計数方法において、
   第７の工程での上記各クラスタへの帰属度を基に上記各
   クラスタに属する粒子数の算出を、各粒子は各クラスタ
   への帰属度のうち、最大の帰属度のクラスタに帰属とす
   るとして行うことを特徴とする粒子計数方法。
4. 【請求項４】 請求項１記載の粒子計数方法において、
   第７の工程での上記各クラスタへの帰属度を基に上記各
   クラスタに属する粒子数の算出を、各粒子は各クラスタ
   への帰属度に応じて各クラスタへ帰属とするものとして
   行うことを特徴とする粒子計数方法。