CN114964966A - 一种血液样本分离和冻存的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于血液样本处理技术领域，具体涉及一种血液样本分离和冻存的方法。本发明对待分离血液分别进行抗凝处理和促凝处理，得抗凝血和促凝血；分别对抗凝血和促凝血进行处理，得到全血、血浆、白膜层液体、少浆血、血清和血凝块，包括了全血样本，细胞样本和核酸样本，丰富了样本种类，保证了样本类型的完整。本发明采用不同的冻存方法对多种样本进行冻存，能够保证细胞样本复苏后的活率以及核酸样本的浓度和纯度，样本质量可靠。

Description

一种血液样本分离和冻存的方法
技术领域
本发明属于血液样本处理技术领域，具体涉及一种血液样本分离和冻存的方法。
背景技术
血液是流动在动物血管和心脏中的一种红色不透明的黏稠液体。血液由血浆和血细胞组成，一升血浆中含有900-910克的水，65-85克的蛋白质和20克的低分子物质，低分子物质中有多种电解质和有机化合物，血细胞包括红细胞和白细胞和血小板三类细胞。红细胞平均寿命为120天，白细胞寿命为9-13天，血小板寿命为8-9天。血液的功能包含血细胞功能和血浆功能两部分，有运输、调节人体温度、防御、调节人体渗透压和酸碱平衡四个功能。
随着生物技术的发展，对血液样本分离和冷冻保存，在有需要时进行解冻回输已经成为一种治疗疾病的重要手段。血液样品的分离和冷冻也已经成为一项成熟的技术。但是目前临床研究中，血液样品分离较为单一，通常以分离血清和血浆为主，无法满足实际治疗需要。如何建立高质量的血液样品分离方法仍属于本行业亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血液样本分离和冻存的方法，分离获得多种血液样本，保证样本的质量。
本发明提供了一种血液分离方法，包括如下步骤：
将待分离血液分别进行抗凝处理和促凝处理，得抗凝血和促凝血；
对部分抗凝血进行第一离心，得血浆、白膜层液体和少浆血；
将部分抗凝血与PBS和淋巴细胞分离液混合，第二离心获得单个核细胞；
对所述促凝血进行第三离心，得血清和血凝块。
优选的，所述第一离心的温度为4℃，转速为1200g，时间为10min。
优选的，提取所述单个核细胞时，所述抗凝血与PBS和淋巴细胞分离液的体积比为3:2:1。
优选的，所述第二离心包括升速1～2g，降速0～2g，600g离心20min后，抽取混合液中的白膜层，升速4～6g，降速1～3g，600g离心10min。
优选的，所述第三离心的转速为1600g，时间为10min。
本发明提供了一种血液样本冻存方法，包括如下步骤：
将上述技术方案所述分离方法得到的单个核细胞与冻存液混合，4℃保温10min后进行变温处理；
所述变温处理依次包括：以1℃/min的速率降温至-9℃，以50℃/min的速率降温至-50℃，以25℃/min的速率升温至-25℃，以1℃/min的速率降温至-50℃，以10℃/min的速率降温至-90℃；
将上述技术方案所述血液分离方法得到的血浆、白膜层液体、少浆血、血清层和凝血块层分别放入液氮中浸泡20～30s，-80℃冻存；
将剩余部分的抗凝血放入液氮中浸泡20～30s，-80℃冻存。
优选的，按照体积百分含量计，所述冻存液包括10％二甲基亚砜、70％基础培养基和20％血清。
优选的，按照体积百分含量计，所述冻存液包括70％基础培养基、20％血清、余量的二甲基亚砜和乙二醇。
优选的，所述二甲基亚砜和乙二醇的体积比为5～7：3～5。
本发明提供了一种血液样本分离方法，分别对抗凝血和促凝血进行处理，能够获得抗凝血(即全血)、血浆、白膜层液体、少浆血、血清层和血凝块，包含全血样本，细胞样本和核酸样本，丰富了样本种类。
本发明通过对分离得到的不同血液样品进行冻存，配置冻存液设计冻存程序，保证了血液样品的质量。实施例结果表明，利用复苏后全血提取DNA，OD260/OD280的值在1.7～1.9，无蛋白污染且不会发生降解，DNA纯度好；单个核细胞复苏后活率范围为89％～92％，细胞数的范围是(2.9～4.1)×106个。
具体实施方式
本发明提供了一种血液分离方法，包括如下步骤：
将待分离血液分别进行抗凝处理和促凝处理，得抗凝血和促凝血；
对部分抗凝血进行第一离心，得血浆、白膜层液体和少浆血；
将部分抗凝血与PBS和淋巴细胞分离液混合，第二离心获得单个核细胞；
对所述促凝血进行第三离心，得血清和血凝块。
本发明对所述待分离血液的来源并没有特殊限定，优选包括外周血。本发明优选分别对待分离血液进行抗凝处理和促凝处理，得抗凝血和促凝血。本发明所述抗凝处理优选包括将抽离得到的血液置于抗凝采血管中；所述促凝处理优选包括将抽离得到的血液置于促凝采血管中。本发明所述抗凝采血管购买自碧迪医疗器械(上海)有限公司，促凝采血管购买自碧迪医疗器械(上海)有限公司。本发明经抗凝处理得到的抗凝血可以直接用于血液样品DNA的提取。本发明为方便进行抗凝处理，特将抽离得到的血液分别放置在三组抗凝采血管中，分别命名为第一抗凝血、第二抗凝血和第三抗凝血。本发明所述抗凝采血管的规格优选为5mL。本发明对每组抗凝采血管中放置的血液体积不作严格要求，保证体积足够进行后续分离即可。本发明在具体实施过程中，优选抽取10mL血液，放置在三组抗凝采血管中，第一抗凝血体积优选为3mL，第二抗凝血体积优选为3mL，第三抗凝血体积优选为4mL，进行后续的实验。
在本发明中，所述第一抗凝血用于全血样本中DNA的提取。
得所述第二抗凝血后，本发明对所述第一抗凝血进行第一离心。本发明所述第一离心的温度优选为4℃；所述第一离心的转速优选为1200g；所述第一离心的时间优选为10min。本发明进行所述第一离心后，第二抗凝血分为3层，依次为上层血浆层、中间层白膜层和下层少浆层。本发明优选分别抽取血浆层、白膜层和少浆层的液体，得血浆、白膜层液体和少浆血。本发明对抽取血浆层的方式没有严格要求，保证抽取过程中不接触白膜层即可。本发明所述白膜层液体包含少量的血浆、全部中间白膜层和少量的少浆血。本发明分别得到血浆、白膜层液体和少浆血，所述血浆能够直接用于后续分子检测，所述白薄层液体能够直接用于后续分子检测，所述少浆血能够直接用于后续血液常规检测。
得所述第三抗凝血后，本发明将所述第三抗凝血、PBS和淋巴细胞分离液混合，第二离心获得单个核细胞。本发明所述第三抗凝血和PBS的体积比优选为3:2；所述第三抗凝血和PBS的体积和与所述淋巴细胞分离液的体积比优选为2:1。本发明所述细胞分离液购自Axis-Shield，AS1114546。本发明优选将利用PBS稀释后的第三抗凝血沿着装有淋巴细胞分离液容器的容积壁缓慢加入，确保分层效果。在本发明中，所述第二离心的温度优选为4℃；所述第二离心优选包括升速1～2g，降速0～2g，600g离心20min后，抽取混合液中的白膜层，升速4～6g，降速1～3g，离心10min。本发明优选收集第二离心所得沉淀，所述沉淀中含有所述单个核细胞。本发明优选将所得沉淀与PBS和淋巴细胞分离液混合，重复进行第二离心的步骤，收集沉淀，得所述单个核细胞。本发明得单个核细胞后能够直接用于分子检测。
本发明对所述促凝血进行第三离心，所述第三离心的温度优选为4℃；所述第三离心的转速优选为1600g；所述第三离心的时间优选为10min。本发明进行所述第三离心后，促凝血呈现两层，依次为上层血清层和下层凝血块层。本发明优选抽取上层血清层的液体，夹断凝血块的头部和尾部，得到血清和血凝块。本发明分别得到血清和血凝块，所述血清能够直接用于后续用于分子检测，所述血凝块能够直接用于后续用于分子检测。
本发明提供的血液样本分离方法，分别对抗凝血和促凝血进行处理，能够获得抗凝血(即全血)、血浆、白膜层液体、少浆血、血清和血凝块，包含全血样本，细胞样本和核酸样本，保证了样本类型的完整。
本发明还提供了一种血液样本冻存方法，包括如下步骤：
将上述血液分离方法得到的单个核细胞与冻存液混合，4℃保温10min后进行变温处理；
所述变温处理依次包括：以1℃/min的速率降温至-9℃，以50℃/min的速率降温至-50℃，以25℃/min的速率升温至-25℃，以1℃/min的速率降温至-50℃，以10℃/min的速率降温至-90℃；
将上述血液分离方法得到的血浆、白膜层液体、少浆血、血清层和凝血块层分别放入液氮中浸泡20～30s，-80℃冻存；
将剩余部分的抗凝血放入液氮中浸泡20～30s，-80℃冻存。
在本发明中，按照体积百分含量计，所述冻存液优选包括10％二甲基亚砜、70％基础培养基和20％血清，或者包括70％基础培养基、20％血清、余量的二甲基亚砜和乙二醇。本发明所述二甲基亚砜和乙二醇的体积比优选为5～7:3～5。本发明在具体实施过程中，可选择5～7:3～5中的任意比值作为二甲基亚砜和乙二醇的体积比，例如本发明所述二甲基亚砜和乙二醇的体积比可以为5:3、5:5、5:5、6:3、6:4、6:5、7:3、7:4、7:5。本发明利用乙二醇代替冻存液中的部分二甲基亚砜可以减少冻存液中使用二甲基亚砜造成的细胞毒性，降低对细胞的损害，保证细胞冻存后复苏成活率。本发明对所述变温处理的仪器没有严格要求，优选使用Thermo程序降温仪。
本发明优选还包括将上述血液分离方法得到的剩余部分的第一抗凝血、血浆、白膜层液体、少浆血、血清和血凝块分别放入液氮中浸泡20～30s，-80℃冻存。本发明优选将血液分离得到的不同样本置于2mL冻存管中实现冻存过程。
本发明针对不同的血液样本设置不同的冻存方法，调整单个核细胞冻存液配方，实现了不同类型样本的保存。实施例结果表明，利用复苏后全血提取DNA，OD260/OD280的值在1.7～1.9，无蛋白污染且不会发生降解，DNA纯度好；单个核细胞复苏后活率范围为89％～92％，细胞数的范围是(2.9～4.1)×106个。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、分离：
1.外周血采集：采用3个5mL抗凝采血管，依次标记为1号抗凝采血管，2号抗凝采血管和3号抗凝采血管，共采集10mL外周血(1号抗凝采血管3mL外周血，2号抗凝采血管3mL外周血，3号抗凝采血管4mL外周血)；采用1个5mL促凝采血管，采集3mL外周血，4～8℃冷藏运输至处理间。
2.全血提取：从1号抗凝采血管中取2mL抗凝外周血，上下颠倒5～10次，抽取500μL抗凝外周血(记为全血)分装至2管2mL冻存管中。
3.血浆提取：取2号抗凝采血管中取2mL抗凝外周血放入离心机，4℃，1200g离心10min，离心后抗凝外周血分为3层，包括血浆、白膜层和少浆血。抽取血浆按200μL/管进行分装，抽取过程中不得接触白膜层。
4.白膜层提取：步骤3的抗凝外周血，吸取少量血浆+白膜层+少量少浆血的混合液，装入2mL冻存管中。
5.少浆血提取：步骤3的抗凝外周血，抽取底部的少浆血，分装入2mL冻存管中。
6.血清抽提：将步骤1促凝外周血放入离心机中，4℃，1600g离心10分钟，血液分为2层，血清层和凝血块层，抽取上层血清，分装入2mL冻存管中。
7.血凝块提取：步骤6促凝血外周血，倒出血凝块至医用纱布上，使用一次性取材镊，分别夹断血凝块的头尾，取中间段放入2mL冻存管中。
8.外周血单个核细胞提取：将3号抗凝采血管中的外周血与1～2号抗凝采血管中剩余的外周血混合(共计6mL抗凝外周血)，平均分至2个15mL离心管中，加入PBS，其中每个离心管中抗凝外周血：PBS的比例为3:2，使用移液管吹打混匀10～20次，另取2个15mL离心管，各加入5mL淋巴细胞分离液(Axis-Shield 1114546)，将稀释后的抗凝血沿着管壁缓慢加入装有分离液的15mL离心管中，分离液对稀释后的抗凝血的体积比例为1:2，加入后离心管中液体分为两层：上层红色血液层，下层透明分离液层。放入离心机升速1～2g，降速0～2g，4℃，600g离心20min后，液体分为3层：下层红色血细胞层，中层分离液层，上层血浆和PBS混合液层。抽取分离液层和血浆混合液中之间的白膜层，装入15mL离心管中，使用PBS稀释至10mL，升速4～6g，降速1～3g，室温250g离心10min后，倒掉上清，沉淀转移至另外一支15mL离心管中，重复以上步骤一次，获得单个核细胞。
二、冻存：
步骤一得到的全血放入液氮中浸泡20～30秒后转入-80℃冰箱；
步骤一得到的血浆放入液氮中浸泡20～30秒后转入-80℃冰箱；
步骤一得到的白膜层放入液氮中浸泡20～30秒后转入-80℃冰箱；
步骤一得到的少浆血放入液氮中浸泡20～30秒后转入-80℃冰箱；
步骤一得到的血清放入液氮中浸泡20～30秒后转入-80℃冰箱；
步骤一得到的血凝块放入液氮中浸泡20～30秒后转入-80℃冰箱；
步骤一得到的外周血单个核细胞：配置4mL冻存液，配制比例：7％二甲基亚砜(上海励瑞生物科技MD207-050)+3％乙二醇(中国医药集团10009818)+70％基础培养基(Gbico72400047)+20％血清(Gbico A3161002)，重悬单个核细胞，分装如4个2mL冻存管中，每管分装1mL冻存液。使用程序降温仪，4℃保持10min，1℃/min降至-9℃，50℃/min降至-50℃，25℃/min升至-25℃，1℃/min降至-50℃，10℃/min降至-90℃。降温结束放入液氮罐中。
实施例2
同实施例1，区别在于冻存液，配制比例：5％二甲基亚砜(上海励瑞生物科技MD207-050)+5％乙二醇(中国医药集团10009818)+70％基础培养基(Gbico 72400047)+20％血清(Gbico A3161002)。
实施例3
同实施例1，区别在于冻存液，配制比例：10％二甲基亚砜(上海励瑞生物科技MD207-050)+70％基础培养基(Gbico 72400047)+20％血清(Gbico A3161002)。
测试例1
随机选取3名受试者的外周血，按照实施例1的方法分离得到全血样品并冻存(共计350个样品)，其中随机选择10个样品冻存2个月，随机选择170个样品冻存4个月，随机选择66个样品冻存5个月，随机选择83个样品冻存6个月，剩余21个样品冻存7个月；各个样品冻存后复苏，使用QIAsymphony仪器(QIAGEN公司)提取DNA后，使用分光光度计检验DNA溶液的260nm和280nm波长吸光值，计算OD260/OD280值，结果如下表1。
表1 DNA检测结果
Figure BDA0003660932420000071
Figure BDA0003660932420000081
根据表1可以看出，利用本发明方法得到的外周血全血样本共计350个，其中320个样本的OD260/OD280的值在1.7～1.9，合格率为91.43％，并且DNA浓度在100～300ng/μL，无蛋白污染，并且不存在降解，不会随着冻存时间的增长影响复苏效果，提取得到的DNA纯度和浓度都较高。本发明分离冻存方法制备的样本质量可靠。
测试例2
随机选取3名受试者的外周血，按照实施例1的方法分离得到单个核细胞并冻存，1个月后，使用赛默飞COUNTESS细胞计数仪和与之配套的染色剂染色、计数并测量细胞活率，结果如下表2。
表2单个核细胞数和活率
细胞数(个) 活率
受试者1 3.2×10<sup>6</sup> 90％
受试者2 4.1×10<sup>6</sup> 89％
受试者3 2.9×10<sup>6</sup> 92％
根据表2可以看出，利用本发明方法得到的单个核细胞复苏后活率范围为89％～92％，细胞数的范围是(2.9～4.1)×106个，本发明分离冻存方法制备的样本质量可靠。
测试例3
随机选取3名受试者的外周血，分别按照实施例1、实施例2和实施例3的方法分离得到单个核细胞并冻存，冻存4个月后复苏，使用赛默飞COUNTESS细胞计数仪测量细胞活率，结果如下表3。
表3不同冻存液配方冻存后单个核细胞活率
Figure BDA0003660932420000091
根据表3可以看出，利用本发明冻存液配方及方法得到的单个核细胞复苏后活率范围为85％～91％。复苏后进行贴壁培养，实施例1、实施例2、实施例3在10～16天内贴壁率达到80～90％，但在细胞消化过程中，相比实施例3，实施例1的更易于消化，当以乙二醇替代部分二甲基亚砜时，以二甲基亚砜与乙二醇体积比7:3冻存，复苏效果最好。本发明分离冻存方法制备的样本质量可靠。
本发明所述分离冻存方法能够分离得到多种血液样本，包括全血样本，细胞样本和核酸样本，保证了样本类型的完整，并且采用不同的冻存方法对多种样本进行冻存，能够保证细胞样本复苏后的活率以及核酸样本的浓度和纯度，样本质量可靠。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种血液分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
将待分离血液分别进行抗凝处理和促凝处理，得抗凝血和促凝血；
对部分抗凝血进行第一离心，得血浆、白膜层液体和少浆血；
将部分抗凝血与PBS和淋巴细胞分离液混合，第二离心获得单个核细胞；
对所述促凝血进行第三离心，得血清和血凝块。
2.根据权利要求1所述分离方法，其特征在于，所述第一离心的温度为4℃，转速为1200g，时间为10min。
3.根据权利要求1所述分离方法，其特征在于，提取所述单个核细胞时，所述抗凝血与PBS和淋巴细胞分离液的体积比为3:2:1。
4.根据权利要求1所述分离方法，其特征在于，所述第二离心包括升速1～2g，降速0～2g，600g离心20min后，抽取混合液中的白膜层，升速4～6g，降速1～3g，600g离心10min。
5.根据权利要求1所述分离方法，其特征在于，所述第三离心的转速为1600g，时间为10min。
6.一种血液样本冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1～5任一项所述分离方法得到的单个核细胞与冻存液混合，4℃保温10min后进行变温处理；
所述变温处理依次包括：以1℃/min的速率降温至-9℃，以50℃/min的速率降温至-50℃，以25℃/min的速率升温至-25℃，以1℃/min的速率降温至-50℃，以10℃/min的速率降温至-90℃；
将权利要求1～5任一项所述血液分离方法得到的血浆、白膜层液体、少浆血、血清层和凝血块层分别放入液氮中浸泡20～30s，-80℃冻存；
将剩余部分的抗凝血放入液氮中浸泡20～30s，-80℃冻存。
7.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，按照体积百分含量计，所述冻存液包括10％二甲基亚砜、70％基础培养基和20％血清。
8.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，按照体积百分含量计，所述冻存液包括70％基础培养基、20％血清、余量的二甲基亚砜和乙二醇。
9.根据权利要求8所述的冻存方法，其特征在于，所述二甲基亚砜和乙二醇的体积比为5～7：3～5。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116724992A (zh) * 2023-01-28 2023-09-12 宁波熙宁检测技术有限公司 一种全血冻存液及其制备方法和应用

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