CN114404348A - 一种高效焕活溶液及其制备方法、保存方法和应用 - Google Patents

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CN114404348A CN202210066462.8A CN202210066462A CN114404348A CN 114404348 A CN114404348 A CN 114404348A CN 202210066462 A CN202210066462 A CN 202210066462A CN 114404348 A CN114404348 A CN 114404348A
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左艳丽
刘欣然
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Abstract

本申请涉及临床医疗美容的技术领域，具体公开了一种高效焕活溶液及其制备方法、保存方法和应用。一种高效焕活溶液的制备方法，包括以下步骤：将抗凝剂和离体全血样品按照体积比为1：（9‑10）的比例混合均匀后，经过血细胞分离机进行离心分离，离心后提取出富血小板血浆，备用作为高效焕活溶液；本申请的高效焕活溶液该组合物可用于皮肤真皮层，其具有良好的修复效果，能够促进细胞的繁殖和分化、增加胶原合成能力，促进基质合成和组织再生的优点。

Description

一种高效焕活溶液及其制备方法、保存方法和应用
技术领域
本申请涉及临床医疗美容的技术领域，更具体地说，它涉及一种高效焕活溶液及其制备方法、保存方法和应用。
背景技术
富血小板血浆是通过离心自体全血而得到的高浓度血小板血浆，其中包括血小板、白细胞和血浆蛋白、肽类物质（血小板生长因子家族）等活性成分，对促进细胞的繁殖和分化、增加胶原合成能力，促进基质合成和组织再生有重要作用，此外生长因子之间有良好的协调作用，故富血小板血浆常用于组织修复及美容抗衰领域。
目前，相关的富血小板血浆的提取技术已经在欧洲、北美、南非、中东地区、澳洲、日本、新加坡等发达国家和地区得到了广泛的临床应用。
但相关的富血小板血浆的提取过程存在着提取量少，纯度不高，富血小板血浆浓度低的问题，提取出的富血小板血浆生长因子分泌活跃性差，保存时间短，同时还带有外源的感染风险。
发明内容
为了提高富血小板血浆的提取效果，延长保存时间，本申请提供一种高效焕活溶液及其制备方法、保存方法和应用。
第一方面，本申请提供一种高效焕活溶液的制备方法，采用如下的技术方案：
一种高效焕活溶液的制备方法，包括以下步骤：
将抗凝剂和离体全血样品按照体积比为1：（9-10）的比例混合均匀后，经过血细胞分离机进行离心分离，离心后提取出富血小板血浆，备用作为高效焕活溶液；所述抗凝剂包括枸橼酸钠；
所述离体全血样品和抗凝剂进入血细胞分离机内时均在封闭管路中流动，一次离心后出现界面分层，先将红细胞等重组分分离出后，剩余的轻组分进行二次离心，二次离心后分离出的较重组分即为富血小板血浆。
通过采用上述技术方案，全血样品先和抗凝剂在1：（9-10）的体积比下进行混合，在此范围内取值对混合效果影响在可预期范围内，保证全血样品在进行离心时不易因为血凝而造成离心效果不佳的问题；枸橼酸钠作抗凝剂，由于全血中的钙离子是凝血过程中所需的物质之一，枸橼酸根能够与全血中的钙离子形成难解离的络合物，从而使全血中的钙离子减少，起到阻止血液凝固的效果，保证全血样品的流动性，使其能够在离心后更好的分层。
一方面，全血样品在血细胞分离机内先经过一次分离，使红细胞等重组分先分离出去，然后再对剩下的轻组分进行二次分离，二次分离后分离处的较重组分即为富血小板血浆，保证了富血小板血浆的提取量，同时提高了富血小板血浆的浓度和纯度；另一方面，全血样品进入血细胞分离机内始终在封闭的管路中流动，有效降低了外源的感染风险。
优选的，所述抗凝剂包括枸橼酸钠8-12份和甘氨酸4-6份。
通过采用上述技术方案，抗凝剂的加入虽然能够起到减少血液凝固的效果，但由于枸橼酸钠的pH值为8，而血小板的适宜保存环境的pH值为6.5-7.2，故单一采用枸橼酸钠作抗凝剂时容易造成血小板的破损，影响富血小板血浆的性能，不利于富血小板血浆的持续保存；因此加入甘氨酸使得抗凝剂的整体pH值处于适合血小板保存的条件，减少血小板在提取或保存时出现破裂的情况，使得富血小板血浆能够分泌大量的生长因子，促进组织再生。
另外甘氨酸还具有络合钙离子的能力，加入甘氨酸能够起到辅助抗凝的效果，减少血液凝固，使全血样品能够更好的进入血细胞分离机进行分离。
优选的，所述抗凝剂还包括维生素E3-6份。
通过采用上述技术方案，维生素E的加入能提高全血样品的抗氧化性，同时维生素E能够为血小板提供微量元素，减少血小板的破损，有助于富血小板血浆的保存，促进富血小板血浆释放更多的生长因子。
第二方面，本申请提供一种高效焕活溶液，采用如下的技术方案：
一种高效焕活溶液，根据上述所述的一种高效焕活溶液的制备方法制备得到。
通过采用上述技术方案，本申请的高效焕活溶液在制备过程中，加入抗凝剂减少全血凝固，从而能够更好的分离出富血小板血浆，且分离出富血小板血浆中含有部分抗凝剂，有助于延长对富血小板血浆的保存。
第三方面，本申请提供一种高效焕活溶液的保存方法，采用如下的技术方案：
一种高效焕活溶液的保存方法，包括以下步骤，
冻存：将提取出的高效焕活溶液混匀后，快速分装于冻存管中，并存放于超低温环境中冻存；
复溶：将冻存的高效焕活溶液取出后进行复溶处理，在37-42℃的水浴环境下轻摇，促进融化，直至完全溶解。
通过采用上述技术方案，高效焕活溶液单次提取完成后，进行分装冻存，方便多次使用，在超低温环境下，其生化反应及其缓慢甚至停止，有效延长了高效焕活溶液的使用时限。
冻存处理后的高效焕活溶液进行复溶后，仍能保存正常的结构和功能，且复溶后能激活血小板功能，促进生长因子释放，更好的作用于皮肤，促进组织修复；复溶时的水浴温度在此范围内取值对效果影响在可预期范围内。
优选的，所述冻存管先存放于-80℃的环境中冻存24h后再转移至-196℃的环境中冻存。
通过采用上述技术方案，提取出的高效焕活溶液先在-80℃的环境中冻存24h再转移至-196℃的环境中冻存，多级冻存的方式有助于延长高效焕活溶液的冻存时间，保证高效焕活溶液的保存效果。
第四方面，本申请提供一种高效焕活溶液的应用，采用如下的技术方案：
一种高效焕活溶液的应用，包括以下步骤：
取高效焕活溶液涂抹于皮肤表面，并通过压力作用使高效焕活溶液渗入皮肤。
通过采用上述技术方案，通过涂抹高效焕活溶液作用于受到损伤的皮肤能够加速修复过程，缩短愈合时间，提高愈合质量。
优选的，抽取高效焕活溶液对皮肤真皮层进行无针注射或穿刺注射。
通过采用上述技术方案，高效焕活溶液作用于皮肤真皮层，具有良好的修复效果，能够促进细胞的繁殖和分化、增加胶原合成能力，促进基质合成和组织再生。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、由于本申请采用血细胞分离机使全血样品和抗凝剂始终在封闭管路中流动，抗凝剂减少全血样品的凝固，从而能够高效分离出高纯度的富血小板血浆，富血小板血浆的浓度为全血浓度的10倍，且无外源的感染风险。
2、本申请中的抗凝剂优选采用维生素E和甘氨酸加入甘氨酸使得抗凝剂的整体pH值处于适合血小板保存的条件，保证富血小板血浆的纯度和浓度，使得富血小板血浆能够分泌大量的生长因子，促进组织再生；另外甘氨酸还具有络合钙离子的能力，加入甘氨酸能够起到辅助抗凝的效果，减少血液凝固，使全血样品能够更好经过血细胞分离机进行分离；维生素E的加入能提高全血样品的抗氧化性，同时维生素E能够为血小板提供微量元素，有助于富血小板血浆的保存，促进富血小板血浆释放更多的生长因子。
3、本申请高效焕活溶液的保存方法，单次提取完成后，进行分装冻存，方便多次使用，在超低温环境下，其生化反应及其缓慢甚至停止，有效延长了高效焕活溶液的使用时限。
4.本申请的高效焕活溶液的应用，将冻存的高效焕活溶液取出后进行复溶处理，复溶后，仍能保存正常的结构和功能，且复溶后能激活血小板功能，促进生长因子释放，更好的作用于皮肤，促进组织修复。
具体实施方式
原料来源：
厂家 牌号
血细胞分离机 费森尤斯卡比股份有限公司 -
枸橼酸钠 上海源叶生物科技有限公司 6132-04-3
甘氨酸 上海联硕生物科技有限公司 56-40-6
维生素E 上海吉至生化科技有限公司 1406-66-2
以上公开原料来源仅是为了公开充分，不应对本申请对保护范围造成限制。
实施例1
将100ml离体全血样品和10ml的抗凝剂放入无菌瓶内混匀，混匀后被抽进血细胞分离机的离心仓进行离心，离体全血样品和抗凝剂进入血细胞分离机内时均在封闭管路中流动，离心仓内设有离心盘，抗凝剂和全血样品在离心盘内先进行一次离心，离心分离转速为2000r/min，离心时间10min，出现界面分层，血浆中的红细胞等重组分被分离出后，然后剩余的轻组分进行二次离心，离心分离转速为2000r/min，离心时间10min，二次离心后离心盘远离中心的位置为较重组分，此时较重组分为富血小板血浆，抽取富血小板血浆备用，作为高效焕活溶液；
其中，抗凝剂为枸橼酸钠。
实施例2
重复实施例1的相同步骤，其区别在于，抗凝剂包括8ml的枸橼酸钠和4ml的甘氨酸配制而成。
实施例3
重复实施例1的相同步骤，其区别在于，抗凝剂包括10ml的枸橼酸钠和5ml的甘氨酸配制而成。
实施例4
重复实施例1的相同步骤，其区别在于，抗凝剂包括12ml的枸橼酸钠和6ml的甘氨酸配制而成。
实施例5
重复实施例3的相同步骤，其区别在于，抗凝剂包括10ml的枸橼酸钠、5ml的甘氨酸和3ml的维生素E配制而成。
实施例6
重复实施例3的相同步骤，其区别在于，抗凝剂包括10ml的枸橼酸钠、5ml的甘氨酸和5ml的维生素E配制而成。
实施例7
重复实施例3的相同步骤，其区别在于，抗凝剂包括10ml的枸橼酸钠、5ml的甘氨酸和6ml的维生素E配制而成。
对比例1
按照公开号为CN106727700B中实施例1的提取方式进行制备富血小板血浆。
对实施例1-7的高效焕活溶液进行检测，检测结果如下表。
表1 实施例1-7的高效焕活溶液的检测结果
分离前全血中血小板浓度/ml 全血中血小板数量 提取出的富血小板血浆中血小板浓度/ml 浓缩倍数 富血小板血浆中的血小板数量 回收率/%
实施例1 180×10<sup>6</sup> 1.8×10<sup>10</sup> 1794×10<sup>6</sup> 9.97 1.52×10<sup>10</sup> 84.4
实施例2 192×10<sup>6</sup> 1.92×10<sup>10</sup> 1929×10<sup>6</sup> 10.04 1.66×10<sup>10</sup> 86.4
实施例3 186×10<sup>6</sup> 1.86×10<sup>10</sup> 1874×10<sup>6</sup> 10.07 1.63×10<sup>10</sup> 87.6
实施例4 178×10<sup>6</sup> 1.78×10<sup>10</sup> 1789×10<sup>6</sup> 10.05 1.52×10<sup>10</sup> 85.4
实施例5 184×10<sup>6</sup> 1.84×10<sup>10</sup> 1864×10<sup>6</sup> 10.13 1.62×10<sup>10</sup> 88.0
实施例6 189×10<sup>6</sup> 1.89×10<sup>10</sup> 1924×10<sup>6</sup> 10.18 1.67×10<sup>10</sup> 88.4
实施例7 179×10<sup>6</sup> 1.79×10<sup>10</sup> 1819×10<sup>6</sup> 10.16 1.58×10<sup>10</sup> 88.3
对比例1 250×10<sup>6</sup> 2.5×10<sup>9</sup> 1680×10<sup>6</sup> 6.72 2.016×10<sup>9</sup> 80.6
（浓缩倍数=分离前全血中血小板浓度÷提取出的富血小板血浆中血小板浓度；回收率=富血小板血浆中的血小板数量÷全血中血小板数量）
结合实施例1和对比例1可以看出，实施例1的回收率和浓缩倍数优于对比例1，故说明本申请中枸橼酸钠作抗凝剂，由于全血中的钙离子是凝血过程中所需的物质之一，枸橼酸根能够与全血中的钙离子形成难解离的络合物，从而使全血中的钙离子减少，起到阻止血液凝固的效果，保证全血样品的流动性，使其能够在离心后更好的分层；一方面，全血样品在血细胞分离机内先经过一次分离，使红细胞等重组分先分离出去，然后再对剩下的轻组分进行二次分离，二次分离后分离处的较重组分即为富血小板血浆，保证了富血小板血浆的提取量，同时提高了富血小板血浆的浓度和纯度；另一方面，全血样品进入血细胞分离机内始终在封闭的管路中流动，有效降低了外源的感染风险。
结合实施例1-4可以看出，实施例2-4的回收率和浓缩倍数均优于实施例1，故说明本申请中加入甘氨酸使得抗凝剂的整体pH值处于适合血小板保存的条件，减少血小板在提取或保存时出现破裂的情况，使得富血小板血浆能够分泌大量的生长因子，促进组织再生；另外甘氨酸还具有络合钙离子的能力，加入甘氨酸能够起到辅助抗凝的效果，减少血液凝固，使全血样品能够更好的进入血细胞分离机进行分离。实施例3的回收率和浓缩倍数较优于实施例2和实施例4，说明实施例3为较优实施例。
结合实施例5-7和实施例3可以看出，实施例5-7的回收率和浓缩倍数优于实施例3，说明本申请中维生素E的加入能提高全血样品的抗氧化性，同时维生素E能够为血小板提供微量元素，减少血小板的破损，有助于富血小板血浆的保存，促进富血小板血浆释放更多的生长因子。实施例6较优于实施例5和实施例7，说明实施例6为较优实施例。
实施例8
重复实施例6的相同步骤得到高效焕活溶液，将提取出的高效焕活溶液，快速分装于多个冻存管中，每支冻存管保存5ml的高效焕活溶液，冻存管先存放于-80℃的环境中冻存24h后再转移至-196℃的环境中冻存。
将冻存2周的高效焕活溶液取出后进行复溶处理，在40℃的水浴环境下轻摇，促进融化，直至完全溶解。
取复溶后的高效焕活溶液涂抹于志愿者的术后创口处，每间隔3天取出一瓶冻存的高效焕活溶液复溶后，涂抹创口，并封闭负压覆盖创口处。
取志愿者另一术后创口处不涂覆高效焕活溶液作为对比组，对比组为自然恢复。
高效焕活溶液的使用效果如表2所示
表2 实施例8的创口恢复情况
志愿者年龄/岁 使用冻存的高效焕活溶液的恢复天数 自然恢复天数
志愿者1 28 16 31
志愿者2 36 19 36
志愿者3 48 22 42
实施例9
重复实施例6的相同步骤得到高效焕活溶液，将提取出的高效焕活溶液，快速分装于多个冻存管中，每支冻存管保存5ml的高效焕活溶液，冻存管直接放置在-196℃的环境中冻存。
将冻存2周的高效焕活溶液取出后进行复溶处理，在40℃的水浴环境下轻摇，促进融化，直至完全溶解。
取复溶后的高效焕活溶液涂抹于志愿者的术后创口处，每间隔3天取出一瓶冻存的高效焕活溶液复溶后，涂抹创口，并封闭负压覆盖创口处。
取志愿者另一术后创口处不涂覆高效焕活溶液作为对比组，对比组为自然恢复。
高效焕活溶液的使用效果如表3所示
表3 实施例9的创口恢复情况
志愿者年龄/岁 使用冻存的高效焕活溶液的恢复天数 自然恢复天数
志愿者4 26 21 32
志愿者5 34 25 36
志愿者6 53 27 41
实施例10
重复实施例6的相同步骤得到高效焕活溶液，将提取出的高效焕活溶液，快速分装于多个冻存管中，每支冻存管保存5ml的高效焕活溶液，冻存管先存放于-80℃的环境中冻存24h后再转移至-196℃的环境中冻存。
将冻存10周的高效焕活溶液取出后进行复溶处理，在40℃的水浴环境下轻摇，促进融化，直至完全溶解。
取复溶后的高效焕活溶液涂抹于志愿者的术后创口处，每间隔3天取出一支冻存的高效焕活溶液复溶后，涂抹创口，并封闭负压覆盖创口处。
取志愿者另一术后创口处不涂覆高效焕活溶液作为对比组，对比组为自然恢复。
高效焕活溶液的使用效果如表4所示
表4 实施例10的创口恢复情况
志愿者年龄/岁 使用冻存的高效焕活溶液的恢复天数 自然恢复天数
志愿者7 24 20 33
志愿者8 32 23 35
志愿者9 37 25 39
实施例11
重复实施例6的相同步骤得到高效焕活溶液，将提取出的高效焕活溶液，快速分装于多个冻存管中，每支冻存管保存5ml的高效焕活溶液，冻存管先存放于-80℃的环境中冻存24h后再转移至-196℃的环境中冻存。
将冻存10周的高效焕活溶液取出后进行复溶处理，在40℃的水浴环境下轻摇，促进融化，直至完全溶解。
取复溶后的高效焕活溶液注射于志愿者的术后创口处的真皮层, 每间隔3天取出一支冻存的高效焕活溶液复溶后，再进行注射一次，直至创口完全恢复。
取志愿者另一术后创口处不涂覆高效焕活溶液作为对比组，对比组为自然恢复。
高效焕活溶液的使用效果如表5所示
表5 实施例11的创口恢复情况
志愿者年龄/岁 使用冻存的高效焕活溶液的恢复天数 自然恢复天数
志愿者10 26 13 35
志愿者11 35 15 37
志愿者12 46 18 41
结合实施例8和实施例9可以看出，使用高效焕活溶液的恢复天数均短于自然恢复天数，说明高效焕活溶液单次提取完成后，进行分装冻存，方便多次使用，在超低温环境下，其生化反应及其缓慢甚至停止，有效延长了高效焕活溶液的使用时限。冻存处理后的高效焕活溶液进行复溶后，仍能保存正常的结构和功能，且复溶后能激活血小板功能，促进生长因子释放，更好的作用于皮肤，促进组织修复。
结合实施例8-10可以看出，实施例8和实施例10使用冻存的高效焕活溶液的恢复天数较优于实施例9，故说明本申请中提取出的高效焕活溶液先在-80℃的环境中冻存24h再转移至-196℃的环境中冻存，多级冻存的方式有助于延长高效焕活溶液的冻存时间，保证高效焕活溶液的保存效果。通过涂抹高效焕活溶液作用于受到损伤的皮肤能够加速修复过程，缩短愈合时间，提高愈合质量。
结合实施例10和实施例11可以看出，实施例11恢复效果优于实施例10，故说明本申请中的高效焕活溶液作用于皮肤真皮层，具有良好的修复效果，能够促进细胞的繁殖和分化、增加胶原合成能力，促进基质合成和组织再生。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种高效焕活溶液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将抗凝剂和离体全血样品按照体积比为1：（9-10）的比例混合均匀后，经过血细胞分离机进行离心分离，离心后提取出富血小板血浆，备用作为高效焕活溶液；所述抗凝剂包括枸橼酸钠；
所述离体全血样品和抗凝剂进入血细胞分离机内时均在封闭管路中流动，一次离心后出现界面分层，先将红细胞等重组分分离出后，剩余的轻组分进行二次离心，二次离心后分离出的较重组分即为富血小板血浆。
2.根据权利要求1所述的高效焕活溶液的制备方法，其特征在于：所述抗凝剂包括枸橼酸钠8-12份和甘氨酸4-6份。
3.根据权利要求2所述的高效焕活溶液的制备方法，其特征在于：所述抗凝剂还包括维生素E3-6份。
4.一种高效焕活溶液，其特征在于，根据权利要求1-3任意一项所述的一种高效焕活溶液的制备方法制备得到。
5.一种高效焕活溶液的保存方法，其特征在于，包括以下步骤，
冻存：将提取出的高效焕活溶液混匀后，快速分装于冻存管中，并存放于超低温环境中冻存；
复溶：将冻存的高效焕活溶液取出后进行复溶处理，在37-42℃的水浴环境下轻摇，促进融化，直至完全溶解。
6.根据权利要求5所述的一种高效焕活溶液的保存方法，其特征在于，所述冻存步骤中，冻存管先存放于-80℃的环境中冻存24h后再转移至-196℃的环境中冻存。
7.一种高效焕活溶液的应用，其特征在于，包括以下步骤：
取高效焕活溶液涂抹于皮肤表面，并通过压力作用使高效焕活溶液渗入皮肤。
8.一种高效焕活溶液的应用，其特征在于，包括以下步骤：抽取高效焕活溶液对皮肤真皮层进行无针注射或穿刺注射。
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