CN111265548A - 一种富血小板细胞因子血浆冻干粉的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种富血小板细胞因子血浆冻干粉的制备方法：先将富血小板血浆置于液氮中反复冻融，获得富细胞因子血浆；再于‑80℃预冻；然后放入‑45℃预冷的真空冷冻干燥机内，按照设定冻干程序进行冻干，获得冻干粉。本发明提供的的激活血小板释放细胞因子的方法为液氮反复冻融法，血小板激活彻底，释放的细胞因子量大；本发明获得冻干粉中细胞因子含量与冻干前样本中细胞因子含量基本相同，本发明提供的冻干方法可以最大程度保证细胞因子的活性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学与生物医药领域，具体涉及一种富血小板血浆的分离、血小板的激活及富血小板细胞因子血浆冻干粉的制备方法。
背景技术
创伤的修复与愈合是生物延续生命的必要手段。修复愈合的过程、方式与方法较为复杂，涉及许多细胞生长因子。目前已知的参与创伤愈合过程并起重要作用的有血小板衍生生长因子(PDGFs)、转化生长因子(TGF-β)和血管内表皮细胞生长因子(VEGF)等。过去十几年里，为加速创伤愈合，提高临床治疗效果，各种生长因子被广泛应用于口腔颌面外科、整形外科、骨科等医学领域。但以往多采用单一生长因子进行治疗研究，而创伤愈合是一个包括多种细胞因子参与的复杂的网络调控过程，故往往难以达到良好的修复效果。近年来，血液系统不同成分在骨再生和修复过程中所发挥的重要作用引起越来越多的关注。因此，作为一种多种生长因子重要来源的富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)引起了国内外学者的广泛关注。
富血小板血浆（PRP)是通过离心从新鲜全血中分离出的含有高浓度血小板的血浆，其血小板浓度是全血中血小板浓度的3-5倍，激活后有很高的生物活性，对促进组织的再生修复具有重要作用。近年来，随着相关研究的深入，由激活的PRP分泌的具生物活性的细胞因子的类型和确切作用被逐一阐明。这些因子主要包括血小板衍生因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growthfactor，VEGF）、转化生长因子（Transforming growth factor，TGF）、胰岛素样生长因子（Insulin growth factor，IGF）、表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）、血小板衍生内皮生长因子（Platelet-derived endothelial growth factor，PDEGF）、骨钙素（Osteocalcin）和骨黏连蛋白（Osteonectin）等，这些细胞因子可与含有其受体的靶细胞，如间充质干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、表皮细胞和成骨细胞等结合，发挥生物学作用。有关PRP实验研究表明，不但血小板及其细胞成分具有促丝裂原作用，而且血小板裂解后的上清液同样可显著促进成骨细胞的增殖作用。
血小板裂解液（platelet lysate，PL）是PRP经细胞裂解后进一步提纯的产物，不仅去除了残余细胞结构，降低了免疫原性，而且还保留了其中的多种生长因子，各生长因子的比例与体内正常比例相似，并具有最佳的协同作用，有助于创伤组织的修复。血小板裂解液中富含大量的细胞因子，细胞因子活性的保持比较局限，-80℃能够得到长期保存，但是，这种保存方法受到条件的限制。冷冻干燥的血小板因子冻干粉能够打破低温保存条件的限制，并且能够最大程度的保证细胞因子活性。
冷冻干燥技术在医药工业、食品工业、科研和其他部门均得到广泛的应用。此技术就是把含有大量水分的物质预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸气直接升华出来，而物质本身留在冻结时的框架中，因此干燥后体积不变。恰当的冷冻和干燥过程能够最大限度的保证样品活性。
综上所述，探索血浆血小板富集方法、血小板激活方法、富血小板释放细胞因子血浆的冻干方法，最大限度的保存血浆及血小板中细胞因子的活性是需要解决的问题。
发明内容
针对现有富血小板血浆冻干粉复溶后细胞因子活性低的问题，本发明提供一种富血小板细胞因子血浆冻干粉的制备方法，操作简单、得率高，而且获得的冻干粉活性好。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种富血小板细胞因子血浆冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
（1）将富血小板血浆置于液氮中反复冻融，获得富细胞因子血浆；
（2）将富细胞因子血浆于-80℃预冻；
（3）将步骤（2）预冻的血浆放入-45℃预冷的真空冷冻干燥机内，设定冻干参数：在真空度为1000mPa时，温度-45℃维持240min；真空度以33.3mPa/min的速度降为0.224mPa，温度-45℃；在真空度为0.224mPa下，搁板温度以5℃/150min的速度升温至-35℃，维持150min；搁板温度以5℃/360min的速度升温至-30℃、-25℃，分别维持150min；维持真空度为0.224mPa下，搁板温度以5℃/240min的速度升温至-20℃，维持150min；搁板温度以5℃/150min的速度升温至-15℃，维持150min；维持真空度0.224mPa，分别以15℃/300min升温至0℃，10℃/600min升温至10℃，10℃/300min升温至20℃，并维持300min；维持温度为20℃，冻干机真空度以0.0217mPa/min的速度降为0.007mPa；最终真空度为0.007mPa，温度25℃维持240min，最后冻干机压力恢复正常完成冻干。
步骤（1）中，富血小板血浆为外周血或脐血来源的。优选为脐血来源的。
优选的，步骤（1）中，富血小板血浆制备方法如下：
将血液在离心力400g下离心时间10min，分为三层，取上层血浆和中间层总量的2/3标记为A，取与剩余中间层标记为B；将A部分在离心力800g下离心时间10min，将上层血浆弃除后，重悬底部血小板沉淀，标记为C；将B与C合并，即为富血小板血浆。
步骤（1）中，所述液氮中反复冻融过程为：冷冻30min，37℃水浴至完全融解。优选的，反复3个循环。
步骤（2）中，预冻时间为12-24h。
一种如上述方法制备的富血小板细胞因子血浆冻干粉。
本发明具有以下优点：
本发明提供的二步离心法富集血小板的得率高达67%，方法简单得率高；本发明提供的激活血小板释放细胞因子的方法为液氮反复冻融法，血小板激活彻底，释放的细胞因子量大；本发明获得冻干粉中细胞因子含量与冻干前样本中细胞因子含量基本相同，本发明提供的冻干方法可以最大程度保证细胞因子的活性。
附图说明
图1为真空冷冻干燥冻干富血小板细胞因子血浆的冻干曲线；
图2为富血小板细胞因子血浆冻干粉及复溶样本；
图3为富血小板细胞因子血浆冻干粉细胞因子含量检测。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 富含血小板的血浆的制备
将100 mL脐血从血液转移带或者采血管中分装到50 mL离心管，标记为0，并且将全血混匀后留1 mL血样，全血分析仪计数血小板浓度。将离心管配平，进行第一步低速离心，离心力400g，离心时间10min。离心后，管内细胞分为三部分，最上面部分为澄清的血浆，最下面部分为深红色的红细胞沉淀，中间为白细胞与血小板富集层，颜色发白，且此处血浆浑浊。先将上层血浆及中间富血小板层的总体积定为1，收集上方2/3的血浆放入新的离心管中，标记为2，注意此过程尽量不收集中间层。收集中间层的白膜层到另一个新的离心管中，标记为3，将白膜层及上方所有的血浆收集到管3，尽量不收红细胞。将标记为2的离心管进行第二步离心，离心力为800g，离心时间10min。离心完的离心管2中，上层为血浆，底部沉淀为血小板，将上层血浆弃除，只留下1-2 mL，重悬底部的血小板，与3号离心管混合，此时3号离心管内为富血小板血浆。
血小板富集系数和血小板获得率的计算：全血血样和PRP均在血球计数仪上计数，用于计算血小板获得率。按照以下公式计算血小板富集系数和血小板获得率：
血小板富集系数% =（PRP中血小板浓度/全血中血小板浓度）×100%
血小板获得率% =（PRP中血小板总数/全血中血小板总数）×100%。
表1 二步离心法富集血小板的获得率及富集系数的3例实验数据
实施例2 激活血小板释放细胞因子的方法
按照实施例1制备富血小板血浆；然后按照下列方案激活血小板，再将不同处理后的富血小板血浆样品进行低温高速离心，离心力4000g，温度4℃，离心时间30min。离心后，取上清进行PRP细胞因子浓度检测：将PRP细胞因子样本中TGF-β1浓度用夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定，按试剂盒说明书操作，所有标准品、样本均做3个复孔：
处理1
液氮反复冻融：将样品置于液氮中冷冻处理，冷冻30min，37℃水浴至完全融解，反复3个循环；
处理2
-80℃反复冻融：将样品置于-80℃冰箱中冷冻处理，冷冻60min，37℃水浴至完全融解，反复3个循环；
处理3
-20℃反复冻融：将样品置于-20℃冰箱中冷冻处理，冷冻60min，37℃水浴至完全融解，反复3个循环；
处理4
10% CaCl2激活：10% CaCl2溶液与富血小板血浆按照体积比1:20(V/V)混匀，37℃孵育1h后为10%氯化钙激活血小板组；
处理5
10%CaCl2+凝血酶激活：将1000U牛凝血酶溶于l mL10% CaCl2溶液，混匀，使用前1h配置，4℃保存。10%CaCl2+凝血酶溶液与富血小板血浆按照体积比1:20(V/V)混匀，37℃孵育1h后为10%氯化钙+凝血酶激活血小板组。
结果如表2所示，采用本发明的激活条件液氮激活血小板释放细胞因子，细胞因子TGF-β1的浓度为116.333±2.294 ng/mL；处理2、3为-80℃、-20℃冷冻激活血小板，处理4、5分别用CaCl2、CaCl2和凝血酶激活血小板；本发明使用的激活方法获得细胞因子浓度均高于处理2-5的方法，且均有显著性差异。
表2 不同方法激活血小板后血浆中细胞因子TGF-β1的浓度
注：与本发明相比，*p<0.05，**p<0.001。
实施例3 富含血小板细胞因子血浆冻干粉的制备
（1）按照实施例1制备富血小板血浆；
（2）按照实施例1处理1的方法激活血小板；
（3）将步骤（2）中的富细胞因子血浆分装到无菌西林瓶中，每瓶血浆体积为500 μL，于-80℃冰箱预冻过夜（16h）；
（4）冻干过程：预冷真空冷冻干燥机（德国CHRIST /ALPHA 2-4/LSCplus），将冻干机冷凝器和搁板的温度调整到-45℃，进行预冷半小时。在完成冷冻过程后，迅速将样品放入预冷的真空冷冻干燥机内，设定冻干参数：在真空度为1000mPa时，温度-45℃维持240min；真空度以33.3mPa/min的速度降为0.224mPa，温度-45℃；在真空度为0.224mPa下，搁板温度以5℃/150min的速度升温至-35℃，维持150min；搁板温度以5℃/360min的速度升温至-30℃、-25℃，分别维持150min；维持真空度为0.224mPa下，搁板温度以5℃/240min的速度升温至-20℃，维持150min；搁板温度以5℃/150min的速度升温至-15℃，维持150min；维持真空度0.224mPa，分别以15℃/300min升温至0℃，10℃/600min升温至10℃，10℃/300min升温至20℃，并维持300min；维持温度为20℃，冻干机真空度以0.0217mPa/min的速度降为0.007mPa；最终真空度为0.007mPa，温度25℃维持240min，最后冻干机压力恢复正常完成冻干。真空冷冻干燥冻干富血小板细胞因子血浆的冻干曲线如图1所示；详细冻干参数如下表3所示：
表3 冻干参数
表3（续表）
冻干后将样品取出，盖上无菌丁基胶塞，用西林瓶轧盖机将铝塑盖固定。
按照上述方法获得三批次冻干粉，获得的富血小板细胞因子血浆冻干粉外观无缺损，表面平整，体积与冻结时的体积基本相等，颜色均匀一致，内部疏松多孔。进行复溶时复水迅速而完全，获得的复溶液为淡黄色透明澄清液体。用蛋白芯片法检测40种细胞因子，与冻干前样本相比，冻干后复融样本中细胞因子含量变化不大，结果如图3和表4所示。
表4 冻存前和复溶后的细胞因子含量
Claims (7)
1.一种富血小板细胞因子血浆冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将富血小板血浆置于液氮中反复冻融，获得富细胞因子血浆；
（2）将富细胞因子血浆于-80℃预冻；
（3）将步骤（2）预冻的血浆放入-45℃预冷的真空冷冻干燥机内，设定冻干参数：在真空度为1000mPa时，温度-45℃维持240min；真空度以33.3mPa/min的速度降为0.224mPa，温度-45℃；在真空度为0.224mPa下，搁板温度以5℃/150min的速度升温至-35℃，维持150min；搁板温度以5℃/360min的速度升温至-30℃、-25℃，分别维持150min；维持真空度为0.224mPa下，搁板温度以5℃/240min的速度升温至-20℃，维持150min；搁板温度以5℃/150min的速度升温至-15℃，维持150min；维持真空度0.224mPa，分别以15℃/300min升温至0℃，10℃/600min升温至10℃，10℃/300min升温至20℃，并维持300min；维持温度为20℃，冻干机真空度以0.0217mPa/min的速度降为0.007mPa；最终真空度为0.007mPa，温度25℃维持240min，最后冻干机压力恢复正常完成冻干。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，富血小板血浆为外周血或脐血来源的。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，富血小板血浆制备方法如下：
将血液在离心力400g下离心时间10min，分为三层，取上层血浆和中间层总量的2/3标记为A，取与剩余中间层标记为B；将A部分在离心力800g下离心时间10min，将上层血浆弃除后，重悬底部血小板沉淀，标记为C；将B与C合并，即为富血小板血浆。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述液氮中反复冻融过程为：冷冻30min，37℃水浴至完全融解。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，反复冻融为3个循环。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，预冻时间为12-24h。
7.一种如权利要求1-6任一所述的制备方法获得的富血小板细胞因子血浆冻干粉。
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