JP2013507931A - 再生医療用途のための接着性骨髄幹細胞の閉鎖系統分離システム - Google Patents
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Abstract
(a)細胞接着性基質でコートされた内壁を有する容器中で接着性骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取する工程と、(b)前記接着性基質上で前記骨髄細胞をインキュベートして、前記基質に接着性骨髄幹細胞の層を接着する工程と、(c)前記基質から任意の非接着性細胞を洗浄する工程と、(d)前記骨髄幹細胞層を採取する工程と、を含む、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法。細胞治療のために採取された骨髄細胞の単離キットおよびその使用についも開示される。
Description
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づき、2009年10月16日に出願された、米国仮特許出願第61/252,389号の優先権を主張するものであり、その全体の内容が本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づき、2009年10月16日に出願された、米国仮特許出願第61/252,389号の優先権を主張するものであり、その全体の内容が本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は、新規な幹細胞誘導性骨髄の単離方法、前記新規な単離に有用なキット、および前記新規な単離方法で採取された骨髄細胞の細胞療法のための使用。
本発明は、新規な幹細胞誘導性骨髄の単離方法、前記新規な単離に有用なキット、および前記新規な単離方法で採取された骨髄細胞の細胞療法のための使用。
幹細胞は、強力な増殖能、無限の自己再生能、および多能性を有することから、幹細胞の研究は、薬物毒性学とともに、分子学、細胞学、および臨床生物学の研究において重要な研究領域になっている。中枢神経系の外側の前駆細胞、特に骨髄細胞が、in vivoでニューロンまたは神経膠のいずれかを発生する能力を有しうるという証拠が提出されている。Toma et al , Nat. Cell Biol. 3:778-783 (2001); Mezey, E. et al , Science 290: 1779-1782 (2000); Brazleton, T. R. et al, Science 290: 1775-1779 (2000); and Eglitis, M. A. et al , Proc Natl. Acad. Sci. 94:4080-4085 (1997).
成体骨髄間質細胞は、多能性間葉間質細胞(MSC)、外膜細網細胞、血管周皮細胞、および骨芽細胞を含む希有な不均一細胞である (Jones, E. & McGonagle, D. Rheumatology (Oxford) 47, 126-31 (2008); Prockop, D. J. Mol. Ther. 17, 939-46 (2009))。これらの細胞は、自己再生能があり、複合胚性生殖層のための遺伝子転写をすることができる(Labat, M. L. et al, Biomed. Pharmacother. 54, 146-62 (2000); Woodbury, D. et al, J. N euros ci. Res. 69, 908-17 (2002))。in vitroと同様に、in vivoの研究においても、成体骨髄間質細胞と筋肉細胞、脂肪細胞、心筋細胞、神経外胚葉細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞等との差異が確認された。近年、好適な培養条件下において、成体骨髄間質細胞は、薬物毒性学の研究および試験用の幹細胞の非限定的な起源として使用される、成体骨髄間質細胞の高い可能性を示す肝細胞様細胞とも異なりうることが示された。Snykers. S. et al, Methods in Molecular Biology (2006)。
成体骨髄間質細胞は、多能性間葉間質細胞(MSC)、外膜細網細胞、血管周皮細胞、および骨芽細胞を含む希有な不均一細胞である (Jones, E. & McGonagle, D. Rheumatology (Oxford) 47, 126-31 (2008); Prockop, D. J. Mol. Ther. 17, 939-46 (2009))。これらの細胞は、自己再生能があり、複合胚性生殖層のための遺伝子転写をすることができる(Labat, M. L. et al, Biomed. Pharmacother. 54, 146-62 (2000); Woodbury, D. et al, J. N euros ci. Res. 69, 908-17 (2002))。in vitroと同様に、in vivoの研究においても、成体骨髄間質細胞と筋肉細胞、脂肪細胞、心筋細胞、神経外胚葉細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞等との差異が確認された。近年、好適な培養条件下において、成体骨髄間質細胞は、薬物毒性学の研究および試験用の幹細胞の非限定的な起源として使用される、成体骨髄間質細胞の高い可能性を示す肝細胞様細胞とも異なりうることが示された。Snykers. S. et al, Methods in Molecular Biology (2006)。
しかしながら、主として2つの理由により、幹細胞の同定および単離が試みられている。第1に、幹細胞は希有である。骨髄において、例えば、血液産生は、数百万の骨髄細胞にたった1つの細胞でしか行われない。Vogel, G. Science, 287, 1418-1419 (2000)。第2に、幹細胞に特有の分子マーカーを同定するのは困難である。特に、原始幹細胞は休止状態中に存在し、そのため分子マーカーをほとんど発現しない。Gage, F. H. Science, 287, 1433-1488 (2000)。
骨髄幹細胞を同定するいくつかの方法が、近年報告されている。例えば、骨髄に存在する幹細胞能およびアルデヒド脱水素酵素活性等の機能特性に基づく、マウス造血幹細胞の単離に密度勾配遠心分離法が用いられる。本方法に必須な要素は、通常の洗浄に代えて、向流洗浄を行うことによって小さなサイズの細胞から骨髄全体を分離することである。Juopperi, T. A. et al., Exp Hematol. 2007 Feb; 35(2):335-41。近年、新規な骨髄由来肝幹細胞(BDLSC)の単離方法が報告された。前記方法は、骨髄細胞から直接BDLSCを精製するための培養システムの選択として、胆汁うっ滞性血清の使用を含む。Cai, Y. F. et al. World J. Gastroenterol 2009; 15(13): 1630-1635。前記結果は、BDLSCが精製および継代されうることを示す。本明細書中に引用されたすべての文献は、その全体の内容が本明細書に組み込まれる。
限られた成功が報告されているが、骨髄幹細胞の単離がいまだ試みられている。そのため、新規な骨髄幹細胞を単離する方法の開発が、急速な幹細胞研究および発展、特に、細胞療法への適用のために、よりいっそう必要とされている。
米国特許第6733433号明細書には、血液分離方法、特に、造血幹細胞の濃縮が開示されている。米国特許出願公開第5879318号明細書には、同様に、臍帯血の単離および処理をするための方法および閉鎖システムが開示されている。そして、米国特許第7279331号明細書には、同様に、臍帯断片から臍帯複合間葉幹細胞の単離方法が開示されている。しかしながら、前記3つの方法は、同一の血管またはバッグ中で接着性骨髄または臍帯血細胞の分離を可能にするものではない。
米国特許第6733433号明細書には、血液分離方法、特に、造血幹細胞の濃縮が開示されている。米国特許出願公開第5879318号明細書には、同様に、臍帯血の単離および処理をするための方法および閉鎖システムが開示されている。そして、米国特許第7279331号明細書には、同様に、臍帯断片から臍帯複合間葉幹細胞の単離方法が開示されている。しかしながら、前記3つの方法は、同一の血管またはバッグ中で接着性骨髄または臍帯血細胞の分離を可能にするものではない。
本発明は、新規な骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供することにより、上述の要望を実現する。本発明は、また、幹細胞の単離、および細胞療法において採取される骨髄細胞の使用に有用な新規なキットを含む。
第1の態様において、本開示は、同じ血管内で骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供し、前記方法は、
(a)細胞接着性基質でコートされた内壁を有する容器中で接着性骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取する工程と、
(b)前記接着性基質上で前記骨髄細胞をインキュベートして、前記基質に接着性骨髄幹細胞の層を接着する工程と、
(c)前記接着性基質から任意の非接着性細胞を洗浄する工程と、
(d)前記接着性骨髄幹細胞層を含む細胞層を採取する工程と、
を含む。
(a)細胞接着性基質でコートされた内壁を有する容器中で接着性骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取する工程と、
(b)前記接着性基質上で前記骨髄細胞をインキュベートして、前記基質に接着性骨髄幹細胞の層を接着する工程と、
(c)前記接着性基質から任意の非接着性細胞を洗浄する工程と、
(d)前記接着性骨髄幹細胞層を含む細胞層を採取する工程と、
を含む。
第2の態様において、本開示は、骨髄幹細胞を前記幹細胞によって再生が誘導される組織に投与することにより、再生療法を提供し、この際、前記改善は、上記の第1の態様に記載の方法により採取される接着性骨髄細胞を投与する。
第3の態様において、本開示は、以下の要素:
(a)所定量の血漿増量剤を含む第1の細胞採取バッグと、
(b)細胞接着性表面層でコートされた内壁および所定量の成長培地を含む第2の細胞収集バッグと、
(c)前記第1のバッグを前記第2のバッグに輸送するための無菌性接続手段と、
を含む、幹細胞単離キット提供する。
(a)所定量の血漿増量剤を含む第1の細胞採取バッグと、
(b)細胞接着性表面層でコートされた内壁および所定量の成長培地を含む第2の細胞収集バッグと、
(c)前記第1のバッグを前記第2のバッグに輸送するための無菌性接続手段と、
を含む、幹細胞単離キット提供する。
本明細書で開示される第2の細胞採取バッグは、外来処置であらかじめ形成されうる簡易な方法における再生療法のための自己(患者自身)の成体骨髄間質細胞を使用するための新規な治療戦略を示す。実施例で示されるように、本発明者は、脊髄損傷(SCI)において、髄膜注射による自己細胞療法のための骨髄を選択するために、接着性能が利用できる。直接髄膜注射は、ニューロンまたは星状細胞への分化を誘導するために十分な幹細胞を脳および脊髄に提供することができる。
他の態様において、開示された実施形態は、生物療法の使用についてのアメリカ食品医薬品局(FDA)の要件を満たすように設計される。本戦略は広範に適応があり、神経変性、外傷、および臓器不全疾患を含むヒトの病気の再生および修復のすべての要素を含みうる。そのため、本明細書で開示される幹細胞−バッグ治療戦略を用いた利点は、とりわけ、(1)患者自身の細胞を使用することから安全である;(2)免疫抑制または免疫調整を必要とすることなく耐容性がありうる;(3)脊髄損傷(SCI)の治療に成果を挙げているように、効果的である;(4)局所注射であり低侵襲である;(5)成体幹細胞が実質的に全ての組織において多様な再生能を発揮することから、適応が広い;(6)同一目的において、胎生幹細胞を使用する場合よりも倫理的に許容される;(7)FDAの現在のGood Manufacture Practice (GMP)に適合し、臨床における準備または臨床試験に好適である:ことを含む。
好ましい実施形態の説明
本発明は、成体骨髄幹細胞は類似の表面表現型を示すが、異なる潜在性を有する幹細胞を分離できる組織培養のためのポリマー基質への選択的な接着性を有するとの発見に基づくものである。
本発明は、成体骨髄幹細胞は類似の表面表現型を示すが、異なる潜在性を有する幹細胞を分離できる組織培養のためのポリマー基質への選択的な接着性を有するとの発見に基づくものである。
第1の態様において、本開示は、生物サンプルから骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。
第1の態様の第1の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。前記方法は、
(a)細胞接着性基質でコートされた内壁を有する容器中で接着性骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取する工程と、
(b)前記接着性基質上で前記骨髄細胞をインキュベートして、前記基質に骨髄幹細胞の層を接着する工程と、
(c)前記接着性基質から任意の非接着性細胞を洗浄する工程と、
(d)前記接着性骨髄幹細胞層を採取する工程と、
を含む。
(a)細胞接着性基質でコートされた内壁を有する容器中で接着性骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取する工程と、
(b)前記接着性基質上で前記骨髄細胞をインキュベートして、前記基質に骨髄幹細胞の層を接着する工程と、
(c)前記接着性基質から任意の非接着性細胞を洗浄する工程と、
(d)前記接着性骨髄幹細胞層を採取する工程と、
を含む。
第1の態様の第2の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、前記生物サンプルが赤血球を含み、第1の実施形態における前記生物サンプルを採取する工程が、被験者から赤血球および骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取する工程と、骨髄幹細胞をインキュベートする前に、生物サンプルから赤血球を分離する工程と、をさらに含む。
第1の態様の第3の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第1の実施形態に記載の工程を含み、前記サンプルが、自己のものである。
第1の態様の第4の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第1の実施形態に記載の工程を含み、前記生物サンプルが、臍帯血または骨髄穿刺液を含む。
第1の態様の第5の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第1の実施形態に記載の工程を含み、前記細胞接着性基質が、細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、または多糖でコートされたポリマー基質である。
第1の態様の第6の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第4の実施形態に記載の工程を含み、前記ポリマー基質が、前記細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、または多糖でコーティングする前にコロナ放電されたものである
第1の態様の第7の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第4の実施形態に記載の工程を含み、前記細胞接着性表面コーティングが、1またはそれ以上の基底膜タンパク質のコーティングである。
第1の態様の第7の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第4の実施形態に記載の工程を含み、前記細胞接着性表面コーティングが、1またはそれ以上の基底膜タンパク質のコーティングである。
第1の態様の第8の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第6の実施形態に記載の工程を含み、前記基底膜タンパク質が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、およびフィブリノーゲンから選択される。
第1の態様の第9の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第4の実施形態に記載の工程を含み、前記基質が、ゼラチンでコートされる。
第1の態様の第10の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第4の実施形態に記載の工程を含み、前記細胞接着性表面コーティングが、1または2以上のヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびアガロースから選択される多糖のコーティングである。
第1の態様の第11の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第4の実施形態に記載の工程を含み、前記基質が、ポリ−L−リシンまたはポリ−D−リシンでコートされる。
第1の態様の第12の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第1の実施形態に記載の工程を含み、前記赤血球が、前記サンプルを成長培地で混合し、前記混合物を前記赤血球の分離に有効な量の血漿増量剤で希釈することで分離される。
第1の態様の第13の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第11の実施形態に記載の工程を含み、前記サンプルが、ex vivoで10成長培地と約1:1で混合される。
第1の態様の第14の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第11の実施形態に記載の工程を含み、成長培地と混合された前記サンプルが、第1の細胞採取バッグ中の前記血漿増量剤とさらに混合される。
第1の態様の第15の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第1の実施形態に記載の工程を含み、前記細胞を細胞接着性基質に接触させる工程が、前記細胞を第2の細胞採取バッグに輸送することを含み、前記内壁表面が、細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、または多糖でコートされる。
第1の態様の第16の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第14の実施形態に記載の工程を含み、前記細胞が、第2のバッグ中の成長培地と混合される。
第1の態様の第17の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第1の実施形態に記載の工程を含み、前記細胞が、前記基質上で、約2時間〜約5日の間インキュベートされる。より具体的な実施形態において、前記細胞は、約3時間〜約72時間の間インキュベートされる。
第1の態様の第18の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第1の実施形態に記載の工程を含み、非接着性細胞が、前記基質を前記成長培地に交換することで洗浄される。
第1の態様の第19の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第17の実施形態に記載の工程を含み、前記交換が、2回以上行われる。
第1の態様の第20の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第1の実施形態に記載の工程を含み、前記骨髄幹細胞が、細胞分離液中で前記接着性細胞層をインキュベートすることで採取される。
第1の態様の第21の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第1の実施形態に記載の工程を含み、薬学的に許容される食塩水中で前記採取された骨髄幹細胞を懸濁する工程をさらに含む。
第1の態様の第22の実施形態において、本開示は、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法を提供する。この際、第1の実施形態に記載の工程を含み、前記採取された骨髄幹細胞の細胞表現型、生存、および無菌性の少なくとも1つを検査する工程をさらに含む。
第2の態様において、本開示は、再生療法を提供する。この際、前記方法は、幹細胞を前記幹細胞によって再生が誘導される組織に投与することを含み、前記改善は、上記の本開示の第1の態様に記載のいずれかの形態に記載の方法により採取される幹細胞を投与する。
第3の態様において、本開示は、幹細胞単離キットを提供する。
第3の態様の第1の実施形態において、本開示は、
(a)所定量の血漿増量剤を含む第1の細胞採取バッグと、
(b)細胞接着性表面層でコートされた内壁および所定量の成長培地を含む第2の細胞収集バッグと、
(c)前記第1のバッグを前記第2のバッグに輸送するための無菌性接続手段と、
を含む、幹細胞単離キットを提供する。
(a)所定量の血漿増量剤を含む第1の細胞採取バッグと、
(b)細胞接着性表面層でコートされた内壁および所定量の成長培地を含む第2の細胞収集バッグと、
(c)前記第1のバッグを前記第2のバッグに輸送するための無菌性接続手段と、
を含む、幹細胞単離キットを提供する。
第3の態様の第2の実施形態において、本開示は、上記第1の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記幹細胞単離キットは、少なくとも1つの所定量の成長培地を有する、赤血球および骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取するための容器をさらに含む。
第3の態様の第3の実施形態において、本開示は、上記第2の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記容器中の成長培地は、X−vivoである。
第3の態様の第4の実施形態において、本開示は、上記第1の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記幹細胞単離キットは、第2の容器のための1または2以上の置換の成長培地の容器をさらに含む。
第3の態様の第5の実施形態において、本開示は、上記第1の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記幹細胞単離キットは、細胞分離液の容器をさらに含む。
第3の態様の第6の実施形態において、本開示は、上記第1の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記幹細胞単離キットは、骨髄穿刺液を採取するための吸引手段をさらに含む。
第3の態様の第7の実施形態において、本開示は、上記第1の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記採取バッグの内壁が、前記細胞接着性表面層でコートされる前にコロナ放電処理される。
第3の態様の第8の実施形態において、本開示は、上記第1の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記細胞接着性表面層が、天然または合成細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、または多糖を含む。
第3の態様の第9の実施形態において、本開示は、上記第8の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記細胞接着性表面が、1または2以上の基底膜タンパク質を含む。
第3の態様の第10の実施形態において、本開示は、上記第9の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記基底膜タンパク質が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、およびフィブリノーゲンからなる群から選択される。
第3の態様の第11の実施形態において、本開示は、上記第8の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記細胞接着性層が、1または2以上のヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびアガロースから選択される多糖を含む。
第3の態様の第12の実施形態において、本開示は、上記第8の実施形態に記載の幹細胞単離キットを提供する。この際、前記細胞接着性表面層が、ポリ−L−リシンまたはポリ−D−リシンを含む。
さらに他の態様において、本発明は、任意の状態または疾患を治療するための、当該治療に応じた前駆幹細胞由来の骨髄の使用を包含する。
本発明は、例えば、哺乳類の骨髄、脂肪組織、または任意の好適な胎生組織等からの任意の組織再生幹細胞の単離および処理に使用されうる。前記幹細胞は、好ましくは非胎児の哺乳類の骨髄、最も好ましくはヒトから得られる。
本発明の好ましい実施形態において、細胞塊が採取され、または好適な起源から得られうる。前記細胞塊は、その後、培養で成長し、さらに細胞塊が生成することによって、望ましい場所でさらに継代培養されうる。当該分離は、臨床上有効な量の幹細胞が生成するまで任意に好ましい回数で繰り返されうる。
本発明を実施するための好ましい実施形態は、FDAの現在のGood Manufacture Practice (GMP)に従って、BM前駆幹細胞を単離することである。
本発明によって単離された前記骨髄前駆幹細胞は、医学的研究に於ける用途だけでなく、臨床的および治療的用途におけるホストの可能性を有する。2つの考えられる治療メカニズムは、(1)それが有する移動能の利点を利用する、遺伝子産物の輸送手段としての細胞の使用、および(2)損傷した組織の修復のための細胞の使用、例えば、ニューロンの再生、これによる組織機能の修復または増進を含む。
本発明の方法により採取された前記細胞は、原理上、疾病もしくは疾患、または幹細胞の起源にかかわらず、任意の幹細胞治療に使用されうる。かような疾病または疾患の治療の例示される例としては、脊髄損傷(SCI)の治療のための細胞治療戦略を含む。この際、低侵襲性の自己の最低限に処理された接着性BM由来細胞(ABMC)は髄膜注射により移植される。
成体幹細胞を使用する前記自己移植の利点は、特に制限されないが、胎児細胞の使用よりも優れた安全性プロファイルを含む。本明細書に開示された方法は、幹細胞のin vivoの特徴を保持することから、臓器移植の増大または置換のための組織治療の研究および開発を通じて、前記方法は、成体幹細胞の単離の治療的応用を促す可能性を有する。この技術は、ほとんどの組織の治療または置換のための3次元構造および組織の再生のための足場となる使用を与えうる。
定義
本明細書で使用される用語「基底膜」は、臓器の腔および表面に配置する上皮、または血管内表面に配置する内皮の基礎となる繊維の薄膜を意味する。
本明細書で使用される用語「基底膜」は、臓器の腔および表面に配置する上皮、または血管内表面に配置する内皮の基礎となる繊維の薄膜を意味する。
本明細書で使用される用語「基底膜タンパク質」は、基底膜の組織上に表現されるタンパク質を意味し、特に制限されないが、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、およびフィブリノーゲンを含む。
本明細書で使用される用語「生物サンプル」は、分化転換または補修能を有する細胞を含む成体または胎児哺乳類の体液を意味し、特に制限されないが、血清、胸膜液、脳脊髄液、羊水、胎盤組織および脂肪組織の吸引物、末梢血、臍帯血、骨髄の吸引物等の吸引物が挙げられる。
本明細書で使用される用語「バイオポリマー」は、合成ポリマーまたは生物が生成するポリマーを意味し、特に制限されないが、タンパク質、ポリペプチド、および多糖を含む。多糖の例としては、セルロース、でんぷん、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびアガロースを含む。
本明細書で使用される用語「骨髄吸引物」は、吸引によって髄腔から取り出された物質を意味し、特に制限されないが、BM吸引およびBM生検を含む。
本明細書で使用される用語「細胞接着性表面層」は、細胞接着性を付与するように処理された表面を意味し、特に制限されないが、コロナ処理されたバッグまたはフラスコを含む。
本明細書で使用される用語「細胞分離液」は、前記表面への細胞の接着を防止するために用いられる物質を意味し、特に制限されないが、アキュターゼ(Accutase)、EDTA、EGTA、およびトリプシンを含む。
本明細書で使用される用語「細胞表現型」は、分化の群または細胞表面に発現するCDマーカーを意味し、特に制限されないが、CD14、CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166、およびCD271を含む。
本明細書で使用される用語「コロナ放電」は、ポリマー表面に細胞接着性を付与する周知の処理を意味し、特に制限されないが、接着性細胞を採取するためのコロナ処理されたバッグ、フラスコ、または血管を含む。
本明細書で使用される用語「状態または疾患」は、異常機能をもたらす病理学的な変化を意味し、特に制限されないが、組織損傷、組織変性、組織萎縮、または組織喪失を含む。
本明細書で使用される用語「成長培地」は、細胞の成長に必要な栄養を供給できる液体物質を意味し、特に制限されないが、X−vivo、RPMI−1640、DMEM、ccMEMを含む。
本明細書で使用される用語「インキュベート」は、所定の期間、一定の温度で成分を混合することを意味する。
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される」は、化合物、物質、組成物、および/または剤形を意味し、これらは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、もしくは他の問題、または合併症を起こすことなく、かつ、妥当なリスク・ベネフィット比に応じて、ヒトおよび動物の組織に接触して好適に使用される。
本明細書で使用される用語「血漿増量剤」は、赤血球を含む成分を分離するために血中に添加される液体を意味し、特に制限されないが、ヒドロキシエチル澱粉、およびポリコハク酸ゼラチンを含む。
本明細書で使用される用語「前駆幹細胞」は、自己再生能および他の成熟または未成熟表現型に分化する能力を有する細胞を意味し、特に制限されないが、多能性間葉間質細胞(MSC)、外膜細網細胞、血管周皮細胞、線維芽細胞、および偏平な骨芽細胞(bone lining cell)を含む。
本明細書で使用される用語「X−vivo」は、ヒト臨床試験の使用に適した、化学的に定義される非動物起源の培地を意味し、特に制限されないが、X−vivo10、X−vivo15、およびX−vivo20を含む。
本明細書で使用される用語「治療する」または「治療」は、特に制限されないが、疾患の改善、疾患の合併症による重症化の緩和、疾患の兆候の防止、疾患の再発の防止、単なる疾患の悪化、好ましくない生体反応(例えば、炎症)の軽減の防止を含み、または最終的に成功しない場合であっても、任意の上記効果を得るための治療努力を含む。
前記システムの詳細な説明
図1は、つり金具2、バーコード標識領域を有し、任意の動物産物を含まない3つのバッグ1、3、および4の使い捨てのセットを示す。これらのバッグは、栓9、11、13、および14を介してチューブのライン10を有する幹細胞単離バッグ(幹バッグ)5と連結されている。前記幹バッグ5は、幹細胞との接着性を付与するためにコロナ処理19され、ポリ−L−リシン(神経分化用)、ラミニン(上皮分化用)、フィブロネクチン(間葉分化用)等の表面接着性物質20でプレコートされ、ヒト臨床試験に適するX−vivo培地(Cambrex)21を含む。バッグ1は、バッグ3中の抗凝固骨髄または生物液体サンプル11とヒドロキシエチル澱粉(HES)7を一定の比率で混合し、最終HES濃度が1.2%とするために、階級がつけられている。前記サンプルバッグ3は、骨髄(BM)または生物液体サンプル25を導入するための注入部17、細菌をろ過する空気部16、バッグ4中の沈降赤血球(RBC)を除去するための栓13、および血漿、または幹バッグ5からチューブ18を介して採取される前記サンプルが遠心分離された血清を得るための栓14を有し、その結果、接着性幹細胞の単離に動物血清の使用を回避している。バッグ3は、ACD、CPD、CPDA、ヘパリン、またはクエン酸ナトリウム等の抗凝固剤を有する。任意のバッグ6は、接着性幹細胞の庁期保存のために、ジメチルスルホキシド、グリセロール、エチレングリコール、またはポリエチレングリコール等の防腐剤24を含み、チューブ23により幹バッグに連結される。
図1は、つり金具2、バーコード標識領域を有し、任意の動物産物を含まない3つのバッグ1、3、および4の使い捨てのセットを示す。これらのバッグは、栓9、11、13、および14を介してチューブのライン10を有する幹細胞単離バッグ(幹バッグ)5と連結されている。前記幹バッグ5は、幹細胞との接着性を付与するためにコロナ処理19され、ポリ−L−リシン(神経分化用)、ラミニン(上皮分化用)、フィブロネクチン(間葉分化用)等の表面接着性物質20でプレコートされ、ヒト臨床試験に適するX−vivo培地(Cambrex)21を含む。バッグ1は、バッグ3中の抗凝固骨髄または生物液体サンプル11とヒドロキシエチル澱粉(HES)7を一定の比率で混合し、最終HES濃度が1.2%とするために、階級がつけられている。前記サンプルバッグ3は、骨髄(BM)または生物液体サンプル25を導入するための注入部17、細菌をろ過する空気部16、バッグ4中の沈降赤血球(RBC)を除去するための栓13、および血漿、または幹バッグ5からチューブ18を介して採取される前記サンプルが遠心分離された血清を得るための栓14を有し、その結果、接着性幹細胞の単離に動物血清の使用を回避している。バッグ3は、ACD、CPD、CPDA、ヘパリン、またはクエン酸ナトリウム等の抗凝固剤を有する。任意のバッグ6は、接着性幹細胞の庁期保存のために、ジメチルスルホキシド、グリセロール、エチレングリコール、またはポリエチレングリコール等の防腐剤24を含み、チューブ23により幹バッグに連結される。
図2は、つり金具2、バーコード標識領域を有し、任意の動物産物を含まない3つのバッグ1、3、および4の使い捨てのセットを示す。これらのバッグは、栓9、11、13、および14を介してチューブのライン10を有する幹細胞単離バッグ5と連結されている。前記幹バッグ5は、幹細胞22との接着性を付与するためにコロナ処理19され、ポリ−L−リシン(神経分化用)、ラミニン(上皮分化用)、フィブロネクチン(間葉分化用)等の表面接着性物質20でプレコートされ、ヒト臨床試験に適する、接着細胞22を単離するためのX−vivo培地(Cambrex)21を含む。バッグ1は、バッグ3中の抗凝固骨髄または生物液体サンプル11とヒドロキシエチル澱粉(HES)7を一定の比率で混合し、最終HES濃度が1.2%とするために、階級がつけられている。前記サンプルバッグ3は、BMまたは生物液体サンプル25を導入するための注入部17、細菌をろ過する空気部16、バッグ4中の沈降RBCを除去するための栓13、および血漿、または幹バッグ5からチューブ18を介して採取される前記サンプルが遠心分離された血清を得るための栓14を有し、その結果、接着性幹細胞の単離に動物血清の使用を回避している。バッグ3は、ACD、CPD、CPDA、ヘパリン、またはクエン酸ナトリウム等の抗凝固剤を有する。任意のバッグ6は、接着性幹細胞の庁期保存のために、ジメチルスルホキシド、グリセロール、エチレングリコール、またはポリエチレングリコール等の防腐剤24を含み、チューブ23により幹バッグに連結される。
図3は、つり金具2、バーコード標識領域を有し、任意の動物産物を含まない4つのバッグ1、3、4、および19の使い捨てのセットを示す。これらのバッグは、栓9、11、13、および14を介してチューブのライン10を有する幹細胞単離バッグ5と連結されている。前記幹バッグ5は、幹細胞との接着性を付与するためにコロナ処理21され、ポリ−L−リシン(神経分化用)、ラミニン(上皮分化用)、フィブロネクチン(間葉分化用)等の表面接着性物質20でプレコートされ、ヒト臨床試験に適するX−vivo培地(Cambrex)22を含む。バッグ1は、バッグ3中の抗凝固骨髄または生物液体サンプル11とヒドロキシエチル澱粉(HES)7を一定の比率で混合し、最終HES濃度が1.2%とするために、階級がつけられている。前記サンプルバッグ3は、BMまたは生物液体サンプル27を導入するための注入部17、細菌をろ過する空気部16、バッグ4中の沈降RBCを除去するための栓13、および血漿、または血漿採取バッグ19(幹バッグ5からチューブ20を介して採取される)からチューブ14を介して採取される前記サンプルが遠心分離された血清を得るための栓14を有し、その結果、幹細胞の単離に動物血清の使用を回避し、さらなる細胞培養のための血漿または血清の保存を可能としている。バッグ3は、ACD、CPD、CPDA、ヘパリン、またはクエン酸ナトリウム等の抗凝固剤を有する。任意のバッグ6は、接着性幹細胞の庁期保存のために、ジメチルスルホキシド、グリセロール、エチレングリコール、またはポリエチレングリコール等の防腐剤26を含み、チューブ25により幹バッグに連結される。
図4は、つり金具2、バーコード標識領域を有し、任意の動物産物を含まない3つのバッグ1、3、4、および19の使い捨てのセットを示す。これらのバッグは、栓9、11、13、および14を介してチューブのライン10を有する幹細胞単離バッグ5と連結されている。前記幹バッグ5は、幹細胞25との接着性を付与するためにコロナ処理22され、ポリ−L−リシン(神経分化用)、ラミニン(上皮分化用)、フィブロネクチン(間葉分化用)等の表面接着性物質23でプレコートされ、接着性細胞25を分離するためのヒト臨床試験に適するX−vivo培地(Cambrex)24を含む。バッグ1は、バッグ3中の抗凝固骨髄または生物液体サンプル11とヒドロキシエチル澱粉(HES)7を一定の比率で混合し、最終HES濃度が1.2%とするために、階級がつけられている。前記サンプルバッグ3は、BMまたは生物液体サンプル28を導入するための注入部17、細菌をろ過する空気部16、バッグ4中の沈降RBCを除去するための栓13、および血漿、または血漿採取バッグ19(さらに幹細胞豊富な血漿を分離でき、幹バッグ5からチューブ21を介して採取される)からチューブ14を介して採取される前記サンプルが遠心分離された血清を得るための栓14を有し、その結果、幹細胞の単離に動物血清の使用を回避し、さらなる細胞培養のための血漿または血清の保存を可能としている。バッグ3は、ACD、CPD、CPDA、ヘパリン、またはクエン酸ナトリウム等の抗凝固剤を有する。任意のバッグ6は、接着性幹細胞の庁期保存のために、ジメチルスルホキシド、グリセロール、エチレングリコール、またはポリエチレングリコール等の防腐剤27を含み、チューブ26により幹バッグに連結される。
実施例
本発明は、下記の非限定的な実施例により、より十分に説明される。これらの実施例の変更は、当該技術分野における当業者には明らかである。
本発明は、下記の非限定的な実施例により、より十分に説明される。これらの実施例の変更は、当該技術分野における当業者には明らかである。
脊髄損傷患者の腸骨稜の骨髄吸引物を用いて、ヒト接着性骨髄細胞(AMBC)を単離する。ポリ−L−リシンで内壁をコートされ、標準的なX−vivo培地および患者の血清または血漿を含む血液採取バッグ中で細胞を採取する。前記細胞を3日間インキュベートし、培地の交換の洗浄工程を3回行うことによって、非接着性細胞を除去する。37℃で5分間、アキュターゼ(Accutase)とともにインキュベーションすることで前記接着性細胞を引き上げる。単離されたABMCを移植する前に、前記サンプルの細胞表現型、生存、および無菌性を検査する。驚くべきことに、前記バッグから分離された前記細胞が、CD90、CD105、CD166、およびCD271に対して陽性であったが、CD34、CD45、およびCD13の発現がなかったことが本発明により判明した。
前記幹細胞バッグは、脊髄損傷(SCI)を治療するための細胞治療戦略において、細胞治療戦略における使用を目的として開発され、この際、前記低侵襲性の自己の最低限に処理されたABMCは、髄膜注射により移植される。脊髄損傷は、腰椎穿刺を介した髄膜移植し、約104〜約107骨髄細胞/kg間の累積標的細胞を受け取り、
および標的線量が達成されるまで毎月前記工程が繰り返されることにより自己ABMC治療を用いて治療される。ABMCは、食塩水150μL中に懸濁され、腰椎穿刺によりCSFに注射される。好ましい実施形態に係る前述の実施例および説明は、例示として理解されるべきであり、特許請求の範囲によって定義された発明により定められるべきである。容易に評価されるように、多くの変更、および上述の特徴の組み合わせは、特許請求の範囲に記載された本発明を逸脱することなく、利用することができる。かような変更は、本発明の思想および記載から逸脱するものとはみなされず。すべての変形は、添付の特許請求の範囲の技術的思想に含まれる。
および標的線量が達成されるまで毎月前記工程が繰り返されることにより自己ABMC治療を用いて治療される。ABMCは、食塩水150μL中に懸濁され、腰椎穿刺によりCSFに注射される。好ましい実施形態に係る前述の実施例および説明は、例示として理解されるべきであり、特許請求の範囲によって定義された発明により定められるべきである。容易に評価されるように、多くの変更、および上述の特徴の組み合わせは、特許請求の範囲に記載された本発明を逸脱することなく、利用することができる。かような変更は、本発明の思想および記載から逸脱するものとはみなされず。すべての変形は、添付の特許請求の範囲の技術的思想に含まれる。
Claims (34)
- (a)細胞接着性基質でコートされた内壁を有する容器中で接着性骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取する工程と、
(b)前記接着性基質上で前記骨髄細胞をインキュベートして、前記基質に接着性骨髄幹細胞の層を接着する工程と、
(c)前記基質から任意の非接着性細胞を洗浄する工程と、
(d)前記骨髄幹細胞層を採取する工程と、
を含む、骨髄誘導幹細胞を単離および処理する方法。 - 前記生物サンプルが赤血球を含み、前記生物サンプルを採取する工程が、
被験者から赤血球および骨髄幹細胞を含む生物サンプルを採取する工程と、骨髄幹細胞をインキュベートする前に、生物サンプルから赤血球を分離する工程と、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記サンプルが、自己のものである、請求項1に記載の方法。
- 前記生物サンプルが、臍帯血または骨髄穿刺液を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞接着性基質が、細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、または多糖でコートされたポリマー基質を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリマーが、前記細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、または多糖でコーティングする前にコロナ放電されたものである、請求項5に記載の方法。
- 前記細胞接着性表面コーティングが、1またはそれ以上の基底膜タンパク質のコーティングを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記基底膜タンパク質が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、およびフィブリノーゲンからなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記基質が、ゼラチンでコートされた、請求項5に記載の方法。
- 前記細胞接着性表面コーティングが、1または2以上のヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびアガロースからなる群から選択される多糖のコーティングを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記基質が、ポリ−L−リシンまたはポリ−D−リシンでコートされた、請求項5に記載の方法。
- 前記赤血球が、前記サンプルを成長培地で混合し、前記混合物を前記赤血球の分離に有効な量の血漿増量剤で希釈することで分離される、請求項2に記載の方法。
- 前記サンプルが、ex vivoで10成長培地と約1:1で混合される、請求項12に記載の方法。
- 成長培地と混合された前記サンプルが、前記容器から分離された第1の細胞採取バッグ中の前記血漿増量剤と混合される、請求項12に記載の方法。
- 前記細胞接着性基質が、細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、および多糖からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、前記容器中の成長培地と混合される、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞が、前記基質上で、約2時間〜約5日の間インキュベートされる、請求項1に記載の方法。
- 前記非接着性細胞が、前記基質を前記成長培地に交換することで洗浄される、請求項1に記載の方法。
- 前記交換が、2回以上行われる、請求項18に記載の方法。
- 前記骨髄幹細胞が、細胞分離液中で前記接着性細胞層をインキュベートすることで採取される、請求項1に記載の方法。
- 薬学的に許容される食塩水中で前記採取された骨髄幹細胞を懸濁する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記採取された骨髄幹細胞の細胞表現型、生存、および無菌性の少なくとも1つを検査する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 骨髄幹細胞を前記幹細胞によって再生が誘導される組織に投与することを含み、この際、前記改善が、請求項1に記載の方法により採取される接着性骨髄細胞の投与を含む、再生療法。
- (a)所定量の血漿増量剤を含む第1の細胞採取バッグと、
(b)細胞接着性表面層でコートされた内壁および所定量の成長培地を含む第2の細胞収集バッグと、
(c)前記第1のバッグを前記第2のバッグに輸送するための無菌性接続手段と、
を含む、幹細胞単離キット。 - 少なくとも1つの所定量の成長培地を有する容器をさらに含む、請求項24に記載のキット。
- 前記容器中の前記成長培地が、RPMI−1640を含む、請求項25に記載のキット。
- 細胞分離液の容器をさらに含む、請求項24に記載のキット。
- 骨髄穿刺液を採取するための吸引手段をさらに含む、請求項24に記載のキット。
- 前記採取バッグの内壁が、前記細胞接着性表面層でコートされる前にコロナ放電処理された、請求項24に記載のキット。
- 前記細胞接着性表面層が、細胞接着性バイオポリマー、ポリペプチド、タンパク質、または多糖を含む、請求項24に記載のキット。
- 前記細胞接着性表面が、1または2以上の基底膜タンパク質のコーティングを含む、請求項30に記載のキット。
- 前記基底膜タンパク質が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、およびフィブリノーゲンからなる群から選択される、請求項31に記載のキット。
- 前記細胞接着性層が、1または2以上のヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびアガロースからなる群から選択される多糖のコーティングを含む、請求クオ30に記載のキット。
- 前記細胞接着性表面層が、ポリ−L−リシンを含む、請求項30に記載のキット。
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