WO2023149291A1 - 培養容器の製造方法、及び培養容器 - Google Patents
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- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
Definitions
- the present invention relates to cell culture technology, and particularly to a method for manufacturing a culture vessel for adherent cells.
- a multistage culture vessel is commercially available in which a plurality of culture sections are stacked in multiple stages to form a culture vessel, and a medium can be passed between the culture sections. (Corning (R) Cell Stack, etc.).
- R Corning
- adherent cells By using such a culture vessel, a large amount of adherent cells can be cultured.
- a culture unit with such a three-dimensional structure can secure a larger culture area with a similar footprint compared to a normal flat culture unit, so it can be used in an incubator with limited space. Excellent considering.
- the spin coating method which is known as a general coating method
- it is difficult to uniformly apply the coating agent to the culture part with a three-dimensional structure and there is a problem that the culture performance is not stable.
- the loss of the coating agent is large, and if an expensive coating agent is used, the cultivation cost increases.
- the present inventors have made intensive studies, applied a cell-adhesive material to a culture substrate, then processed the culture substrate to obtain a culture surface having a three-dimensional structure capable of culturing adherent cells at high density.
- a culture vessel By manufacturing a culture vessel with, it is possible to obtain the culture surface uniformly and stably coated with the cell-adhesive material, and reduce the amount of cell-adhesive material required for coating made it possible to
- a substantially V-shaped groove as a three-dimensional structure that allows the adherent cells to be cultured at high density, it is possible to efficiently culture the adherent cells in the resulting culture vessel. . Furthermore, by such a culture vessel manufacturing method, it has become possible to reliably prevent the formation of material pools in the substantially V-shaped grooves.
- a culture substrate is coated with a low-cell-adhesive polymer, and then the culture substrate is processed to prepare a culture vessel whose culture surface is the surface of the coated culture substrate.
- a method for manufacturing a forming culture vessel is described.
- this culture vessel is for floating and culturing spheres, the culture surface is coated with a low-cell-adhesive polymer instead of a cell-adhesive material.
- this culture vessel does not have a culture surface with substantially V-shaped grooves, but has a culture surface with a large number of wells for culturing spheres and the like. Although such wells can increase the culture area, they are not suitable for culturing adherent cells, as will be described later. Furthermore, since this culture vessel is coated with a low cell adhesion polymer for use in suspension culture, cytotoxicity due to coating unevenness is unlikely to occur. Prevention of the formation of is neither described nor suggested.
- the present invention has been made in view of the above circumstances. It is an object of the present invention to provide a method for producing a culture vessel that can reduce the amount of cell adhesive material required for , and that can be suitably used for large-scale culture of adherent cells, and the culture vessel.
- the method for producing a culture vessel of the present invention comprises coating a cell adhesive material as a coating agent on a culture substrate in advance, and then coating the surface of the culture substrate coated with the coating agent. and forming a culture vessel using the surface of the processed culture substrate as a culture surface.
- the culture substrate is a film or a sheet, and the culture vessel is bag-shaped.
- the method for producing a culture vessel of the present invention is a method in which the cell adhesive material is at least one of collagen, gelatin, polylysine, polyethyleneimine, laminin, and fibronectin.
- the method for manufacturing a culture vessel of the present invention in the processing, a plurality of grooves having mountain-like portions and valley-like portions on the surface side of the culture substrate coated with the coating agent, the grooves It is preferable to form a groove having a substantially V-shaped cross section perpendicular to the direction in which the groove extends, and use the surface of the culture substrate with the groove formed as the culture surface of the culture vessel. Further, it is preferable that the method of manufacturing a culture vessel of the present invention is a method of processing the inclination angle of the substantially V-shaped side surface of the groove to 80 degrees or less. Furthermore, in the method of manufacturing a culture vessel of the present invention, the surface area of the groove is 2 to 5.67 times the surface area of the culture substrate before processing after coating with the cell adhesive material. is preferred.
- the method for manufacturing a culture vessel of the present invention is a method that does not form a material reservoir made of the cell adhesive material in the groove. Further, in the method for manufacturing a culture vessel of the present invention, in the processing, after forming the culture substrate into a bag shape, the formation of the substantially V-shaped groove is performed by at least one of blow molding, vacuum molding, and pressure molding. It is preferable to set it as the method of performing according to.
- the method for manufacturing a culture vessel of the present invention is a method in which, in the processing, the uneven processing is performed by thermal transfer, and then the culture substrate is formed into a bag shape.
- the method for manufacturing a culture vessel of the present invention is a method of applying a mold release agent to a mold used in the heat transfer, and then performing the uneven processing.
- the culture vessel of the present invention is a culture vessel provided with at least one port, wherein the culture surface of the culture vessel is provided with a plurality of grooves consisting of mountain-shaped portions and valley-shaped portions, and the grooves extend in the direction in which the grooves extend.
- the groove has a substantially V-shaped vertical cross section, and the surface of the groove is provided with a coating layer of a cell-adhesive material having a uniform thickness.
- the culture vessel of the present invention has a configuration in which the groove does not have a material reservoir made of the cell adhesive material.
- a culture vessel in manufacturing a culture vessel, it is possible to obtain a culture vessel having a culture surface uniformly and stably coated with a cell adhesive material, and use the cell adhesive material necessary for coating. It is possible to provide a method for manufacturing a culture vessel that can reduce the amount and can be suitably used for mass culture of adherent cells, and a culture vessel.
- FIG. 10 is an explanatory diagram showing the coating state of the cell-adhesive material when a culture surface is applied.
- FIG. 4 is an explanatory view showing the state of substantially V-shaped grooves formed in the culture substrate by vacuum forming or pressure forming in the culture vessel manufacturing method according to the embodiment of the present invention.
- the manufacturing method of the culture container of this invention and embodiment of a culture container are described in detail.
- the present invention is not limited to the specific contents of the following embodiments.
- the culture substrate is coated with a cell adhesive material as a coating agent in advance, and then the surface of the culture substrate coated with the coating agent is processed.
- the method is characterized by forming a culture vessel having a surface of a culture substrate as a culture surface.
- FIG. 1 shows the difference between the coating result of the cell-adhesive material obtained by the culture vessel manufacturing method of the present embodiment and the coating result when the cell-adhesive material is applied after processing the culture substrate.
- a culture substrate 100 such as a film is first subjected to processing such as transfer molding, vacuum molding, and air pressure molding to expand the surface area of the culture substrate 100, and then culture.
- processing such as transfer molding, vacuum molding, and air pressure molding to expand the surface area of the culture substrate 100, and then culture.
- grooves composed of mountain-like portions and valley-like portions and having a substantially V-shaped cross section perpendicular to the direction in which the grooves extend are formed on one surface side of the culture substrate 100 by processing. example is shown.
- the cell adhesive material 200 cannot be uniformly applied to the surface of the culture substrate 100, and cannot be applied stably.
- the amount of the cell adhesive material required for coating is increased, and uneven coating may cause toxicity to adherent cells.
- a material pool 201 made of the cell adhesive material 200 is formed at the bottom of the substantially V-shaped groove.
- the material pool means a portion where the cell adhesive material is thickly accumulated at the bottom of the substantially V-shaped groove. For this reason, there was a possibility that toxicity to adherent cells would occur at the bottom of the groove.
- the coating layer made of the cell adhesive material 200 on the side surface of the substantially V-shaped groove becomes thin. Therefore, there is a possibility that adherent cells cannot be sufficiently adhered to the side surfaces of the groove.
- a cell adhesive material 20 is first applied to a culture substrate 10 .
- a coating layer made of the cell adhesive material 20 is formed on the surface of the culture substrate 10 .
- the surface area of the culture substrate 10 is expanded by subjecting the obtained culture substrate 10 to processing such as transfer molding, vacuum molding, and pressure molding.
- the figure shows an example in which substantially V-shaped grooves are formed by processing on the surface side of the culture substrate 10 on which the coating layer is applied.
- the cell adhesive material 20 can be uniformly applied to the surface of the culture substrate 10, and can be stably applied. Moreover, since the coating is performed before the surface area of the culture substrate 10 is expanded, the amount of the cell adhesive material 20 required for coating can be reduced.
- the coating layer made of the cell adhesive material 20 is uniformly formed on the side surface of the groove without forming a material pool of the cell adhesive material 20 at the bottom of the substantially V-shaped groove. can be formed. Therefore, according to the culture vessel manufacturing method of the present embodiment, the problem of cytotoxicity of the culture vessel to adherent cells can be resolved. In addition, since the coating layer made of the cell adhesive material 20 can be formed with a uniform thickness on the surface of the approximately V-shaped groove, the problem that adherent cells cannot sufficiently adhere to the side surfaces of the groove can be resolved. It is possible.
- a film or a sheet as the culture substrate.
- Olefin-based resins such as polyethylene and polypropylene can be suitably used as the material for the culture substrate.
- Other usable materials include polymethylpentene, cyclic olefin polymer, cyclic olefin copolymer, polyvinyl chloride, polyurethane, polymethyl methacrylate, polyester, polyamide, ionomer, ethylene- ⁇ -olefin copolymer, and ethylene-vinyl acetate copolymer.
- Polymer ethylene-vinyl alcohol copolymer, ethylene-acrylic acid copolymer, ethylene-methacrylic acid copolymer, ethylene-methyl methacrylate copolymer, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polymethyl acrylate, poly Examples include methyl methacrylate, polydimethylsiloxane, fluorine resin, silicone resin, polybutadiene resin, and polyethylene chloride.
- Thermoplastic elastomers such as olefinic thermoplastic elastomers, vinyl chloride thermoplastic elastomers, styrene thermoplastic elastomers, urethane thermoplastic elastomers, ester thermoplastic elastomers, and nylon thermoplastic elastomers can also be used.
- Thermosetting elastomers such as urethane rubber, silicone rubber, and fluororubber; Resins can also be used.
- the initial surface of the culture substrate is preferably smooth in order to uniformly coat the cell adhesive material on the culture substrate and process the surface.
- the culture substrate is surface-treated (hydrophilic treatment), and then the surface is coated with the cell adhesive material.
- the surface treatment corona treatment, excimer treatment, or the like can be suitably performed. Thereby, the adhesiveness of the cell adhesive material to the surface of the culture substrate can be improved.
- the culture vessel to be formed is preferably a bag-like culture vessel (culture bag) made of a soft packaging material.
- the culture bag can be formed by bonding the peripheral portions of the lower film (bottom side film) and the upper film (top plate side film) by heat sealing or the like.
- the surface of the culture substrate coated with the cell-adhesive material is formed as a culture surface, and adherent cells are cultured by adhering to this culture surface.
- the culture bag is provided with at least one port.
- a tube is connected to this port, and a liquid delivery means such as a pump provided in the tube transfers the medium, such as injecting the medium into the culture bag and discharging the medium from the culture bag, through the port.
- a liquid delivery means such as a pump provided in the tube transfers the medium, such as injecting the medium into the culture bag and discharging the medium from the culture bag, through the port.
- Thermoplastic resins such as polyethylene, polypropylene, vinyl chloride, polystyrene elastomer, and FEP (perfluoroethylene propene copolymer) can be used as materials for the port.
- the cell adhesive material used in this embodiment is not limited to these, and other materials may be used as long as they allow adherent cells to adhere to the culture surface.
- cell adhesion proteins that can be used as cell adhesion materials include, in addition to those described above, vitronectin, entactin, osteopontin, thrombospondin, netrin, tenascin, nidogen, fibrinogen, elastin, proteoglycan, and laminin.
- the fragment Nippi Co., Ltd. iMatrix-511) and the like are included.
- cell-adhesive polymers that can be used as cell-adhesive materials include, in addition to those described above, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyvinylsulfuric acid, polystyrenesulfonic acid, polyallylamine, polyethyleneimine, polyvinyl Acetal, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, dextran sulfate, keratan sulfate, heparan sulfate, hyaluronic acid, chitin and the like.
- poly-N-isopropylacrylamide which is a temperature-responsive polymer
- other stimulation-responsive polymers such as pH-responsive polymers and photo-responsive polymers may be used. may be used in combination.
- the cell-adhesive material can be suitably applied to the surface of the culture substrate using, for example, a bar coater, a gravure coater, a spray coater, a spin coater, or the like. .
- a plurality of grooves having mountain-like portions and valley-like portions are formed on the surface side of the culture substrate coated with the coating agent, It is preferable to form grooves having a substantially V-shaped cross section perpendicular to the direction in which the grooves extend, and use the surface of the culture substrate on which the grooves are formed as the culture surface of the culture vessel.
- a substantially V-shaped groove may be formed on the opposite side of the surface of the culture substrate coated with the coating agent.
- a culture vessel is produced by vacuum forming or pressure forming, molding is performed while the culture substrate is pressed against a mold, so the culture substrate is coated with a coating agent.
- Approximately V-shaped grooves are formed on both the surface side and the opposite side.
- the inclination angle of the substantially V-shaped side surface of the groove it is preferable to process the inclination angle of the substantially V-shaped side surface of the groove to 80 degrees or less.
- the surface area of the groove is double the surface area of the corresponding region without the groove.
- the surface area of the groove is 2.37 times larger
- the surface area of the groove is 2.92 times larger.
- the surface area of the groove becomes 3.86 times
- the surface area of the groove becomes 5.67 times.
- the relationship between the inclination angle and the surface area of the groove is the same whether or not the coating layer is formed on the surface of the groove.
- the surface area of the grooves is preferably 2 to 5.67 times the surface area of the culture substrate before processing after coating with the cell adhesive material.
- the depth of the substantially V-shaped groove (vertical distance from the apex of the mountain-like portion to the plane passing through the lowest point of the valley-like portion) is 10 ⁇ m to 1000 ⁇ m. About 50 ⁇ m to 500 ⁇ m is more preferable.
- FIG. 2 shows an explanatory cross-sectional view of the culture substrate 10 coated with the cell adhesive material 20 .
- an explanatory cross-sectional view showing a state in which wells composed of a plurality of quadrangular prisms and quadrangular pyramids are formed on the surface side coated with the cell adhesive material 20 is shown in the upper right, and the cell adhesive material 20 is coated.
- An explanatory cross-sectional view showing a state in which a plurality of substantially V-shaped grooves are formed on the front surface side is shown in the lower right.
- FIG. 3(A) is a micrograph of the surface of the culture substrate in which wells composed of a plurality of quadrangular prisms and quadrangular pyramids are formed
- FIG. Figure 2 shows a photomicrograph of the surface of the culture substrate. Although no coating layer is formed on the surface of the culture substrate in these photographs, the shape of each well and the shape of the approximately V-shaped groove are generally the same as those with a coating layer. .
- a plurality of grooves can be processed in parallel and linearly on the surface of the culture substrate, and the apex portions of the mountain-like portions can be formed linearly. That is, as shown in the photograph of FIG. 3(B), it is possible to form a line-shaped substantially V-shaped groove on the surface of the culture substrate. Therefore, according to the culture vessel manufacturing method of the present embodiment, it is possible to obtain a culture vessel in which adherent cells grow along the line-shaped grooves, so that the culture area can be effectively increased.
- the adherent cells do not spread and proliferate on the downward slope, so the adherent cells cultured in one recess spread and proliferate in the adjacent recess. never. Also, it is not desirable from the viewpoint of growth efficiency to seed cells in each of the recesses. Therefore, when culturing adherent cells, it is not preferable to form a plurality of wells on the surface of the culture substrate.
- substantially V-shaped grooves by at least one of blow molding, vacuum molding, and pressure molding. Particular preference is given to carrying out by molding.
- the vacuum pressure molding for example, a culture bag is placed in a mold in which convex portions having a size corresponding to a plurality of substantially V-shaped grooves are formed, and the culture bag is sandwiched between jigs for performing vacuum pressure molding and pressurized to culture.
- a plurality of substantially V-shaped grooves can be formed in the culture bag by blowing high-pressure air into the bag, vacuuming from the outside of the mold, and heating the mold.
- the heating temperature at this time is preferably set to a temperature at which the cell adhesive material does not dissolve, for example, it is preferably room temperature to about 100.degree.
- a substantially V-shaped groove may be formed by thermal transfer, and then the culture substrate may be formed into a bag shape. good.
- a cushioning material is placed on the base material, and a film or sheet as a culture substrate is placed on the cushioning material.
- a mold having protrusions corresponding to a plurality of substantially V-shaped grooves is placed on the culture substrate, and a heating plate is used to press the culture substrate from above the mold while applying pressure. By heating, a plurality of substantially V-shaped grooves can be formed in the culture substrate.
- a silicon mold, a metal mold such as nickel, or the like can be preferably used.
- a release agent is applied to the surface of the mold facing the culture substrate, and then a substantially V-shaped groove is processed.
- a fluorine-based mold release agent or a silicon-based mold release agent can be preferably used.
- the culture vessel obtained by the method for manufacturing a culture vessel of the present embodiment can be suitably used for culturing adherent cells.
- adherent cells to be cultured include iPS cells, neural stem cells, embryonic stem cells, hepatocytes, pancreatic islet cells, cardiomyocytes, corneal endothelial cells and the like.
- the culture vessel of the present embodiment is a culture vessel having at least one port, a groove formed of peaks and valleys on the culture surface of the culture vessel, and a cross section perpendicular to the direction in which the groove extends.
- a substantially V-shaped groove is provided, and a coating layer of a cell-adhesive material is provided on the surface of the groove with a uniform thickness.
- the groove is characterized by not having a material reservoir made of a cell-adhesive material.
- the culture vessel manufacturing method of the present embodiment after coating the culture substrate with a coating layer made of a cell adhesive material, the surface side of the culture substrate coated with the coating layer In order to form a culture vessel whose surface serves as a culture surface by processing a substantially V-shaped groove on the surface, the culture vessel of this embodiment has a cell adhesive material on the surface of the substantially V-shaped groove on the culture surface is provided with a coating layer of uniform thickness.
- the culture vessel of the present embodiment has the cell adhesive material coated evenly on the culture surface, so that adherent cells can be favorably cultured. Furthermore, according to the culture vessel manufacturing method of the present embodiment, it is possible to reliably prevent the formation of material pools made of the cell adhesive material in the substantially V-shaped grooves. Therefore, the culture vessel of the present embodiment has no risk of cytotoxicity when culturing adherent cells.
- the present invention can be suitably used for the efficient production of a large amount of adherent cells.
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Abstract
培養容器の製造において、細胞接着性材料が均一かつ安定的に塗工された培養面を備えた培養容器を得ることができ、塗工に必要な細胞接着性材料の使用量を低減することができ、接着細胞の大量培養に好適に用いることの可能な培養容器の製造方法の提供を可能とする。培養基材に予めコーティング剤として細胞接着性材料を塗工し、その後、コーティング剤が塗工された培養基材の表面に加工を行い、加工された培養基材の表面を培養面とする培養容器を形成する。また、その加工において、培養基材のコーティング剤が塗工された表面側に山状部と谷状部からなる複数の溝であって、溝が延びる方向に垂直な断面が略Ｖ字形状の溝を形成し、溝が形成された培養基材の表面を培養容器の培養面とする。
Description
本発明は、細胞培養技術に関し、特に接着細胞用の培養容器の製造方法に関する。
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
ｉＰＳ細胞などの接着細胞を、培養容器内の細胞を培養するための培養部に接着させて大量に培養する場合、その収量は培養部の表面積の制約を受ける。このため、培養部の表面積が大きい培養容器を製造することによって、接着細胞の収量を増加することができれば有益である。
ｉＰＳ細胞などの接着細胞を、培養容器内の細胞を培養するための培養部に接着させて大量に培養する場合、その収量は培養部の表面積の制約を受ける。このため、培養部の表面積が大きい培養容器を製造することによって、接着細胞の収量を増加することができれば有益である。
このような培養部の表面積が大きい培養容器としては、例えば、複数の培養部を多段階に積層させて培養容器を形成し、培養部間で培地を通液可能にした多段式培養容器が市販されている（Corning(R)社 セルスタック等）。このような培養容器を用いれば、接着細胞を大量に培養することが可能となる。
また、培養容器における培養部に立体構造を形成することによって、培養部の表面積を拡大させることも提案されている。このような立体構造を備えた培養部は、通常の平坦な培養部と比較して、同様のフットプリントでより広い培養面積を確保することができるため、限られたスペースのインキュベーター内での運用を考えると優れている。
ところで、近年、細胞接着性を持つタンパク質やポリマーがあらかじめコートされた培養容器が市販されている（Corning社 ラミニンコートカルチャーディッシュ等）。このような培養容器を用いる場合、コートされている材料ごとに細胞の接着性が異なることから、培養する細胞に合わせて、その培養容器内の培養部にコーティング剤を別途塗工することが必要であった。
しかしながら、一般的なコート法として知られるスピンコート法などを用いる場合、立体構造を備えた培養部にコーティング剤を均一に塗工することは難しく、培養性能が安定しないという問題があった。また、コーティング剤のロスが多く、高価なコーティング剤を用いる場合には、培養コストが上がってしまうという問題もあった。
また、省スペースで大量の細胞を培養するためには、上記のとおり、細胞を高密度に培養可能な立体構造を有する培養部を備えた培養容器を製造することが望ましい。しかし、このような立体構造を有する培養部に細胞接着性材料を適切に塗工することは非常に困難であるという問題があった。
すなわち、接着細胞を培養部に十分に接着可能にするためには、細胞接着性材料を培養部に均一に安定的に塗工することが重要である。しかし、立体構造を有する培養部に細胞接着性材料を塗工すると、均一に塗工することが難しく、安定的に塗工を行えないという問題があった。また、塗工に必要な細胞接着性材料の使用量が多くなるという問題もあった。さらに、塗工ムラが生じる結果、培養容器に細胞毒性が生じる場合があるという問題もあった。
そこで、本発明者らは鋭意研究して、培養基材に細胞接着性材料を塗工し、次いでその培養基材を加工して、接着細胞を高密度に培養可能な立体構造を有する培養面を備えた培養容器を製造することによって、細胞接着性材料が均一かつ安定的に塗工された該培養面を得ることを可能とし、また塗工に必要な細胞接着性材料の使用量を低減することを可能とした。
また、その加工において、接着細胞を高密度に培養可能な立体構造として略Ｖ字形状の溝を形成することにより、得られた培養容器において、接着細胞を効率的に培養することを可能とした。
さらに、このような培養容器の製造方法により、略Ｖ字形状の溝において、材料だまり部を確実に形成させないことを可能とした。
さらに、このような培養容器の製造方法により、略Ｖ字形状の溝において、材料だまり部を確実に形成させないことを可能とした。
ここで、特許文献１には、培養基材に細胞低接着性ポリマーを塗工し、その後、培養基材に加工を行い、塗工された培養基材の表面を培養面とする培養容器を形成する培養容器の製造方法が記載されている。
しかしながら、この培養容器は、スフェアなどを浮遊させて培養させるためのものであるため、培養面に細胞接着性材料ではなく、細胞低接着性ポリマーを塗工させるものとなっている。
しかしながら、この培養容器は、スフェアなどを浮遊させて培養させるためのものであるため、培養面に細胞接着性材料ではなく、細胞低接着性ポリマーを塗工させるものとなっている。
また、この培養容器は、略Ｖ字形状の溝が形成された培養面を備えておらず、スフェアなどを培養させるための多数のウェルを有する培養面が備えられている。このようなウェルによれば、培養面積を大きくすることは可能であるが、後述するように接着細胞の培養には適さない。
さらに、この培養容器は、浮遊培養に用いるために細胞低接着性ポリマーを塗工するものであるため、塗工ムラによる細胞毒性などは生じ難いものであり、特許文献１には、材料だまり部の形成防止については記載も示唆もされていない。
さらに、この培養容器は、浮遊培養に用いるために細胞低接着性ポリマーを塗工するものであるため、塗工ムラによる細胞毒性などは生じ難いものであり、特許文献１には、材料だまり部の形成防止については記載も示唆もされていない。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、培養容器の製造において、細胞接着性材料が均一かつ安定的に塗工された培養面を備えた培養容器を得ることができ、塗工に必要な細胞接着性材料の使用量を低減することができ、接着細胞の大量培養に好適に用いることの可能な培養容器の製造方法、及び培養容器の提供を目的とする。
上記目的を達成するため、本発明の培養容器の製造方法は、培養基材に予めコーティング剤として細胞接着性材料を塗工し、その後、前記コーティング剤が塗工された前記培養基材の表面に加工を行い、加工された前記培養基材の表面を培養面とする培養容器を形成する方法としてある。
また、本発明の培養容器の製造方法を、前記培養基材がフィルム又はシートであり、前記培養容器が袋状である方法とすることが好ましい。
さらに、本発明の培養容器の製造方法を、前記細胞接着性材料が、コラーゲン、ゼラチン、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ラミニン、又はフィブロネクチンの少なくともいずれかである方法とすることが好ましい。
また、本発明の培養容器の製造方法を、前記培養基材がフィルム又はシートであり、前記培養容器が袋状である方法とすることが好ましい。
さらに、本発明の培養容器の製造方法を、前記細胞接着性材料が、コラーゲン、ゼラチン、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ラミニン、又はフィブロネクチンの少なくともいずれかである方法とすることが好ましい。
また、本発明の培養容器の製造方法を、前記加工において、前記培養基材の前記コーティング剤が塗工された表面側に山状部と谷状部からなる複数の溝であって、前記溝が延びる方向に垂直な断面が略Ｖ字形状の溝を形成し、溝が形成された前記培養基材の表面を前記培養容器の培養面とする方法とすることが好ましい。
また、本発明の培養容器の製造方法を、前記溝における略Ｖ字形状の側面の傾斜角を、８０度以下に加工する方法とすることが好ましい。
さらに、本発明の培養容器の製造方法を、前記溝の表面積を、前記細胞接着性材料の塗工後で加工前の前記培養基材の表面積の２～５．６７倍にする方法とすることが好ましい。
また、本発明の培養容器の製造方法を、前記溝における略Ｖ字形状の側面の傾斜角を、８０度以下に加工する方法とすることが好ましい。
さらに、本発明の培養容器の製造方法を、前記溝の表面積を、前記細胞接着性材料の塗工後で加工前の前記培養基材の表面積の２～５．６７倍にする方法とすることが好ましい。
また、本発明の培養容器の製造方法を、前記溝に、前記細胞接着性材料からなる材料だまり部を形成させない方法とすることが好ましい。
また、本発明の培養容器の製造方法を、前記加工において、前記培養基材を袋状に形成した後、前記略Ｖ字形状の溝の形成をブロー成形、真空成形、及び圧空成形の少なくともいずれかにより行う方法とすることが好ましい。
また、本発明の培養容器の製造方法を、前記加工において、前記培養基材を袋状に形成した後、前記略Ｖ字形状の溝の形成をブロー成形、真空成形、及び圧空成形の少なくともいずれかにより行う方法とすることが好ましい。
また、本発明の培養容器の製造方法を、前記加工において、前記凹凸加工を加熱転写により行い、次いで、前記培養基材を袋状に形成する方法とすることが好ましい。
また、本発明の培養容器の製造方法を、前記加熱転写において用いる型に離型剤を塗布した後、前記凹凸加工を行う方法とすることが好ましい。
また、本発明の培養容器の製造方法を、前記加熱転写において用いる型に離型剤を塗布した後、前記凹凸加工を行う方法とすることが好ましい。
また、本発明の培養容器は、少なくとも一つのポートを備えた培養容器であって、前記培養容器の培養面に山状部と谷状部からなる複数の溝で、かつ前記溝が延びる方向に垂直な断面が略Ｖ字形状の溝を備え、前記溝の表面に細胞接着性材料のコーティング層が均一な厚みで備えられた構成としてある。
また、本発明の培養容器を、前記溝に、前記細胞接着性材料からなる材料だまり部を有さない構成とすることが好ましい。
また、本発明の培養容器を、前記溝に、前記細胞接着性材料からなる材料だまり部を有さない構成とすることが好ましい。
本発明によれば、培養容器の製造において、細胞接着性材料が均一かつ安定的に塗工された培養面を備えた培養容器を得ることができ、塗工に必要な細胞接着性材料の使用量を低減することができ、接着細胞の大量培養に好適に用いることの可能な培養容器の製造方法、及び培養容器の提供が可能となる。
以下、本発明の培養容器の製造方法、及び培養容器の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態の具体的な内容に限定されるものではない。
本実施形態の培養容器の製造方法は、培養基材に予めコーティング剤として細胞接着性材料を塗工し、その後、コーティング剤が塗工された培養基材の表面に加工を行い、加工された培養基材の表面を培養面とする培養容器を形成することを特徴とする。
本実施形態の培養容器の製造方法は、培養基材に予めコーティング剤として細胞接着性材料を塗工し、その後、コーティング剤が塗工された培養基材の表面に加工を行い、加工された培養基材の表面を培養面とする培養容器を形成することを特徴とする。
まず、本実施形態の培養容器の製造方法による細胞接着性材料の塗工結果と、培養基材を加工した後に細胞接着性材料の塗工を行う場合の塗工結果との相違について、図１を参照して説明する。
図１（Ａ）に示すように、フィルムなどの培養基材１００に対して、まず、転写成形、真空成形、圧空成形などの加工を行うことによって培養基材１００の表面積を拡大した後、培養基材１００の表面に細胞接着性材料２００を塗工する方法がある。
同図には、加工により、山状部と谷状部からなる溝であって、溝が延びる方向に垂直な断面が略Ｖ字形状のものが、培養基材１００の一方の表面側に形成される例が示されている。
図１（Ａ）に示すように、フィルムなどの培養基材１００に対して、まず、転写成形、真空成形、圧空成形などの加工を行うことによって培養基材１００の表面積を拡大した後、培養基材１００の表面に細胞接着性材料２００を塗工する方法がある。
同図には、加工により、山状部と谷状部からなる溝であって、溝が延びる方向に垂直な断面が略Ｖ字形状のものが、培養基材１００の一方の表面側に形成される例が示されている。
この方法の場合、培養基材１００の表面に対して細胞接着性材料２００を均一に塗工することはできず、また安定的に塗工することはできない。また、塗工に必要な細胞接着性材料の使用量が多くなる上、塗工ムラにより接着細胞に対する毒性が生じる虞があるという問題があった。
具体的には、略Ｖ字形状の溝の底部において、細胞接着性材料２００からなる材料だまり部２０１が形成されてしまう。材料だまり部とは、図１に示すように、略Ｖ字形状の溝の底部において、細胞接着性材料が厚く蓄積されてしまう部分を意味する。このため、溝の底部では接着細胞に対する毒性が生じる虞があった。
また、略Ｖ字形状の溝の側面における細胞接着性材料２００からなるコーティング層が薄くなってしまう。このため、溝の側面では接着細胞を十分に接着できない虞があった。
また、略Ｖ字形状の溝の側面における細胞接着性材料２００からなるコーティング層が薄くなってしまう。このため、溝の側面では接着細胞を十分に接着できない虞があった。
これに対して、図１（Ｂ）に示すように、本実施形態の培養容器の製造方法では、まず培養基材１０に対して細胞接着性材料２０を塗工する。これによって、培養基材１０の表面に細胞接着性材料２０からなるコーティング層が形成される。
次いで、得られた培養基材１０に対して、転写成形、真空成形、圧空成形などの加工を行うことによって、培養基材１０の表面積を拡大する。同図には、加工により、略Ｖ字形状の溝が、培養基材１０のコーティング層が塗工された表面側に形成される例が示されている。
次いで、得られた培養基材１０に対して、転写成形、真空成形、圧空成形などの加工を行うことによって、培養基材１０の表面積を拡大する。同図には、加工により、略Ｖ字形状の溝が、培養基材１０のコーティング層が塗工された表面側に形成される例が示されている。
この方法によれば、培養基材１０の表面に対して細胞接着性材料２０を均一に塗工することができ、安定的に塗工することが可能である。また、培養基材１０の表面積を拡大する前に塗工を行うため、塗工に必要な細胞接着性材料２０の使用量を少なくすることが可能となっている。
さらに、この方法によれば、略Ｖ字形状の溝の底部に細胞接着性材料２０からなる材料だまり部を形成させることがなく、溝の側面において細胞接着性材料２０からなるコーティング層を均一に形成させることができる。
このため、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、接着細胞に対する培養容器の細胞毒性の問題を解消することができる。また、略Ｖ字形状の溝の表面において細胞接着性材料２０からなるコーティング層を均一な厚みに形成させることができため、溝の側面において接着細胞を十分に接着できないという問題を解消することが可能になっている。
このため、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、接着細胞に対する培養容器の細胞毒性の問題を解消することができる。また、略Ｖ字形状の溝の表面において細胞接着性材料２０からなるコーティング層を均一な厚みに形成させることができため、溝の側面において接着細胞を十分に接着できないという問題を解消することが可能になっている。
本実施形態の培養容器の製造方法において、培養基材としては、フィルム又はシートを用いることが好ましい。
また、培養基材の材料としては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのオレフィン系樹脂を好適に用いることができる。その他用いることができる材料として、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン-αオレフィン共重合体、エチレン-酢酸ビニル共重合体、エチレン-ビニルアルコール共重合体、エチレン-アクリル酸共重合体、エチレン-メタクリル酸共重合体、エチレン-メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素樹脂、シリコーン樹脂、ポリブタジエン樹脂、塩化ポリエチレンなどが挙げられる。また、オレフィン系熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系熱可塑性エラストマー、スチレン系熱可塑性エラストマー、ウレタン系熱可塑性エラストマー、エステル系熱可塑性エラストマー、ナイロン系熱可塑性エラストマーなどの熱可塑性エラストマーも用いることができる。また、ウレタンゴム、シリコーンゴム、フッ素ゴムなどの熱硬化性エラストマーや、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、ユリア樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ウレタン樹脂、熱硬化性ポリイミドなどの熱硬化性樹脂も用いることができる。
また、培養基材の材料としては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのオレフィン系樹脂を好適に用いることができる。その他用いることができる材料として、ポリメチルペンテン、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル、ポリエステル、ポリアミド、アイオノマー、エチレン-αオレフィン共重合体、エチレン-酢酸ビニル共重合体、エチレン-ビニルアルコール共重合体、エチレン-アクリル酸共重合体、エチレン-メタクリル酸共重合体、エチレン-メタクリル酸メチル共重合体、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、フッ素樹脂、シリコーン樹脂、ポリブタジエン樹脂、塩化ポリエチレンなどが挙げられる。また、オレフィン系熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系熱可塑性エラストマー、スチレン系熱可塑性エラストマー、ウレタン系熱可塑性エラストマー、エステル系熱可塑性エラストマー、ナイロン系熱可塑性エラストマーなどの熱可塑性エラストマーも用いることができる。また、ウレタンゴム、シリコーンゴム、フッ素ゴムなどの熱硬化性エラストマーや、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、ユリア樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ウレタン樹脂、熱硬化性ポリイミドなどの熱硬化性樹脂も用いることができる。
本実施形態の培養容器の製造方法において、培養基材に細胞接着性材料を均一に塗工して、その表面に加工を行うために、培養基材の初期表面は平滑であることが好ましい。
また、本実施形態の培養容器の製造方法において、培養基材に細胞接着性材料を塗工するに先だって、培養基材に表面処理（親水化処理）を行い、その後その表面に細胞接着性材料を塗工してもよい。表面処理としては、コロナ処理やエキシマ処理などを好適に行うことができる。
これにより、培養基材の表面に対する細胞接着性材料の接着性を向上させることができる。
これにより、培養基材の表面に対する細胞接着性材料の接着性を向上させることができる。
本実施形態の培養容器の製造方法において、形成される培養容器としては、軟包材からなる袋状の培養容器（培養バッグ）であることが好ましい。
培養バッグは、下面フィルム（底部側フィルム）と上面フィルム（天板側フィルム）の周辺部をヒートシールなどにより貼り合わせることによって形成することができる。
培養バッグにおいて、細胞接着性材料が塗工された培養基材の表面は、培養面として形成され、この培養面に接着細胞が接着して培養される。
培養バッグは、下面フィルム（底部側フィルム）と上面フィルム（天板側フィルム）の周辺部をヒートシールなどにより貼り合わせることによって形成することができる。
培養バッグにおいて、細胞接着性材料が塗工された培養基材の表面は、培養面として形成され、この培養面に接着細胞が接着して培養される。
培養バッグには、少なくとも一つのポートが設けられる。このポートにチューブが接続されて、チューブに配設されたポンプなどの送液手段により、ポートを介して、培養バッグへの培地の注入及び培養バッグからの培地の排出などの培地の送液が行われる。
ポートの材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン系エラストマー、ＦＥＰ（パーフルオロエチレンプロペンコポリマー）などの熱可塑性樹脂を用いることができる。
ポートの材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン系エラストマー、ＦＥＰ（パーフルオロエチレンプロペンコポリマー）などの熱可塑性樹脂を用いることができる。
本実施形態の培養容器の製造方法において、細胞接着性材料としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ラミニン、又はフィブロネクチンの少なくともいずれかを用いることが好ましい。
また、本実施形態で用いる細胞接着性材料は、これらに限定されず、接着細胞を培養面に接着可能とする材料であれば、その他のものを用いてもよい。
また、本実施形態で用いる細胞接着性材料は、これらに限定されず、接着細胞を培養面に接着可能とする材料であれば、その他のものを用いてもよい。
細胞接着性材料として用いることの可能な細胞接着性タンパク質の例としては、上記に記載のものの他、ビトロネクチン、エンタクチン、オステオポンチン、トロンボスポンジン、ネトリン、テネイシン、ニドジェン、フィブリノーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、ラミニンとそのフラグメント(株式会社ニッピ iMatrix-511)などが挙げられる。
また、細胞接着性材料として用いることの可能な細胞接着性ポリマーの例としては、上記に記載のものの他、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアセタール、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、キチンなどが挙げられる。
さらに、細胞接着性材料として、温度応答性ポリマーであるポリ-N-イソプロピルアクリルアミド(PIPAAm)や、その他ｐＨ応答性ポリマー、光応答性ポリマーなどの刺激応答性ポリマーを用いてもよく、以上の材料を組み合わせて使用してもよい。
さらに、細胞接着性材料として、温度応答性ポリマーであるポリ-N-イソプロピルアクリルアミド(PIPAAm)や、その他ｐＨ応答性ポリマー、光応答性ポリマーなどの刺激応答性ポリマーを用いてもよく、以上の材料を組み合わせて使用してもよい。
また、本実施形態の培養容器の製造方法において、培養基材の表面への細胞接着性材料の塗工は、例えば、バーコーター、グラビアコーター、スプレーコート、スピンコートなどによって好適に行うことができる。
また、本実施形態の培養容器の製造方法を、培養基材の加工において、培養基材のコーティング剤が塗工された表面側に山状部と谷状部からなる複数の溝であって、溝が延びる方向に垂直な断面が略Ｖ字形状の溝を形成し、溝が形成された培養基材の表面を培養容器の培養面とする方法とすることが好ましい。
また、培養基材のコーティング剤が塗工された表面の反対側にも略Ｖ字形状の溝を形成させてもよい。後述するように、本実施形態において、真空成形や圧空成形により培養容器を製造する場合には、培養基材を型に押し当てながら成形を行うため、培養基材のコーティング剤が塗工された表面側とその反対側の両方に略Ｖ字形状の溝が形成される。
また、本実施形態の培養容器の製造方法において、溝における略Ｖ字形状の側面の傾斜角を、８０度以下に加工することが好ましい。
溝における略Ｖ字形状の側面の傾斜角が６０度の場合、当該溝の表面積は、当該溝がない場合の対応する領域の表面積に対して２倍となる。同様に、同傾斜角が６５度の場合、当該溝の表面積は２．３７倍となり、同傾斜角が７０度の場合、当該溝の表面積は２．９２倍となり、同傾斜角が７５度の場合、当該溝の表面積は３．８６倍となり、同傾斜角が８０度の場合、当該溝の表面積は５．６７倍となる。このような傾斜角と溝の表面積の関係は、溝の表面にコーティング層が形成されている場合と形成されていない場合において同様である。
溝における略Ｖ字形状の側面の傾斜角が６０度の場合、当該溝の表面積は、当該溝がない場合の対応する領域の表面積に対して２倍となる。同様に、同傾斜角が６５度の場合、当該溝の表面積は２．３７倍となり、同傾斜角が７０度の場合、当該溝の表面積は２．９２倍となり、同傾斜角が７５度の場合、当該溝の表面積は３．８６倍となり、同傾斜角が８０度の場合、当該溝の表面積は５．６７倍となる。このような傾斜角と溝の表面積の関係は、溝の表面にコーティング層が形成されている場合と形成されていない場合において同様である。
したがって、培養面積の観点からは、同傾斜角は大きいほど好ましい。一方、同傾斜角は大きいほど、加工型の先端部にチッピングが生じたり、加工物の先端が変形したりするなど、加工性能が低下する。同傾斜角が８３度の場合、当該溝の表面積は８．２１倍となるが、この傾斜角では、加工型を製作することができず、加工物を加工することはできなかった。同傾斜角が８０度の加工型を製作して、これを用いて加工物を作成することが、概ね限界であった。
このため、本実施形態の培養容器の製造方法において、溝の表面積を、細胞接着性材料の塗工後で加工前の培養基材の表面積の２～５．６７倍にすることが好ましい。
このため、本実施形態の培養容器の製造方法において、溝の表面積を、細胞接着性材料の塗工後で加工前の培養基材の表面積の２～５．６７倍にすることが好ましい。
また、本実施形態の培養容器の製造方法において、略Ｖ字形状の溝の深さ（山状部の頂端部から谷状部の最下点を通る平面までの垂直距離）は、１０μｍ～１０００μｍ程度とすることが好ましく、５０μｍ～５００μｍ程度とすることがより好ましい。
ここで、本実施形態の培養容器の製造方法において、培養基材の一方の表面側に略Ｖ字形状の溝を加工することが好ましく、培養基材の一方の表面側に複数のウェルを加工することが好ましくない理由について、図２及び図３を参照して説明する。
図２の左には、培養基材１０に細胞接着性材料２０が塗工された状態の断面説明図が示されている。また、細胞接着性材料２０が塗工された表面側に複数の四角柱と四角錐からなるウェルが形成された状態を示す断面説明図が右上に示され、細胞接着性材料２０が塗工された表面側に複数の略Ｖ字形状の溝が形成された状態を示す断面説明図が右下に示されている。
また、図３（Ａ）に複数の四角柱と四角錐からなるウェルが形成された培養基材の表面の顕微鏡写真を、図３（Ｂ）に複数の略Ｖ字形状の溝が形成された培養基材の表面の顕微鏡写真を示す。なお、これらの写真における培養基材の表面にはコーティング層が形成されていないが、それぞれのウェルの形状と略Ｖ字形状の溝の形状は、コーティング層が形成されたものと概ね同様である。
図２の右上に示されるように、このようなウェルを培養基材の表面に加工する場合は、垂直方向のコーティング層が引き延ばされるため、培養基材の表面に均一な厚みのコーティング層を形成することができない。また、半球状のウェルを培養基材の表面に加工する場合は、ウェルに形成されない天面部分が残るため、均一に塗工することは困難である。
これに対して、本実施形態の培養容器の製造方法におけるように、培養基材の表面に略Ｖ字形状の溝を加工する場合は、培養基材の表面に均一な厚みのコーティング層を形成することが可能である。
これに対して、本実施形態の培養容器の製造方法におけるように、培養基材の表面に略Ｖ字形状の溝を加工する場合は、培養基材の表面に均一な厚みのコーティング層を形成することが可能である。
また、本実施形態の培養容器の製造方法では、培養基材の表面に、複数の溝を直線状に並行して加工し、山状部の頂端部を直線状に形成させることができる。すなわち、図３（Ｂ）の写真に示されるように、培養基材の表面にライン形状に略Ｖ字形状の溝を形成させることができる。
このため、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、接着細胞をこのライン形状の溝に沿って増殖させる培養容器を得ることができるため、培養面積を有効に増やすことが可能である。
このため、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、接着細胞をこのライン形状の溝に沿って増殖させる培養容器を得ることができるため、培養面積を有効に増やすことが可能である。
一方、図３（Ａ）のように複数のウェルを形成させる場合、接着細胞は下方へ向かう斜面に広がって増殖しないため、ある凹部で培養された接着細胞がその隣の凹部へ広がって増殖することはない。また、全ての凹部のそれぞれに対して、細胞を播種することは増殖効率の観点から望ましくない。このため、接着細胞を培養する場合は、培養基材の表面に複数のウェルを形成させることは好ましくない。
また、培養基材の加工において、培養基材を袋状に形成した後、略Ｖ字形状の溝の形成をブロー成形、真空成形、及び圧空成形の少なくともいずれかにより行うことが好ましく、真空圧空成形により行うことが特に好ましい。
真空圧空成形としては、例えば、複数の略Ｖ字形状の溝に対応するサイズの凸部が形成された型に培養バッグを配置して、真空圧空成形を行う治具に挟み込んで加圧し、培養バッグ内に高圧エアーを吹き込み、型の外側から真空引きを行い、型を加熱することで、培養バッグ内に複数の略Ｖ字形状の溝を成形させることができる。
このときの加熱温度としては、細胞接着性材料が溶解しない温度に設定することが好ましく、例えば常温～１００℃程度で行うことが好ましく、５０℃～９０℃程度で行うことがより好ましい。
真空圧空成形としては、例えば、複数の略Ｖ字形状の溝に対応するサイズの凸部が形成された型に培養バッグを配置して、真空圧空成形を行う治具に挟み込んで加圧し、培養バッグ内に高圧エアーを吹き込み、型の外側から真空引きを行い、型を加熱することで、培養バッグ内に複数の略Ｖ字形状の溝を成形させることができる。
このときの加熱温度としては、細胞接着性材料が溶解しない温度に設定することが好ましく、例えば常温～１００℃程度で行うことが好ましく、５０℃～９０℃程度で行うことがより好ましい。
本実施形態において、真空成形や圧空成形により培養容器を製造する場合、培養基材を型に押し当てながら成形を行うため、図４に示すように、培養基材１０のコーティング剤２０が塗工された表面側とコーティング剤２０が塗工されていない表面側の両方に略Ｖ字形状の溝が形成される。
また、耐熱性の高い細胞接着性材料を用いる場合には、培養基材の加工において、略Ｖ字形状の溝の形成を加熱転写により行い、次いで、培養基材を袋状に形成してもよい。この場合、ベース材上に緩衝材を配置し、緩衝材の上に培養基材としてのフィルム又はシートを設置する。次に、培養基材上に複数の略Ｖ字形状の溝に対応する凸部が形成された型を配置し、型の上から加熱プレートを用いて培養基材を押圧して、加圧しながら加熱することにより、培養基材に複数の略Ｖ字形状の溝を形成させることができる。また、型としては、シリコン型や、ニッケルなどの金属型などを好適に用いることができる。
このとき、加熱転写において用いる型から培養基材を引き剥し易くするために、この型における培養基材に対面する表面に離型剤を塗布した後、略Ｖ字形状の溝の加工を行うことが好ましい。離型剤としては、フッ素系離型剤やシリコン系離型剤を好適に用いることができる。
このとき、加熱転写において用いる型から培養基材を引き剥し易くするために、この型における培養基材に対面する表面に離型剤を塗布した後、略Ｖ字形状の溝の加工を行うことが好ましい。離型剤としては、フッ素系離型剤やシリコン系離型剤を好適に用いることができる。
本実施形態の培養容器の製造方法によって得られる培養容器は、接着細胞の培養に好適に用いることができる。
培養する接着細胞としては、例えば、ｉＰＳ細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、肝細胞、膵島細胞、心筋細胞、角膜内皮細胞等を挙げることができる。
培養する接着細胞としては、例えば、ｉＰＳ細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、肝細胞、膵島細胞、心筋細胞、角膜内皮細胞等を挙げることができる。
本実施形態の培養容器は、少なくとも一つのポートを備えた培養容器であって、培養容器の培養面に山状部と谷状部からなる溝であって、溝が延びる方向に垂直な断面が略Ｖ字形状の溝を備え、溝の表面に細胞接着性材料のコーティング層が均一な厚みで備えられたことを特徴とする。
また、溝に、細胞接着性材料からなる材料だまり部を有さないことを特徴とする。
また、溝に、細胞接着性材料からなる材料だまり部を有さないことを特徴とする。
すなわち、上述したとおり、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、培養基材に細胞接着性材料からなるコーティング層を塗工した後、コーティング層が塗工された培養基材の表面側に略Ｖ字形状の溝を加工して、その表面を培養面とする培養容器を形成するため、本実施形態の培養容器は、培養面における略Ｖ字形状の溝の表面に細胞接着性材料のコーティング層が均一な厚みで備えられている。
このように、本実施形態の培養容器は、培養面に細胞接着性材料がムラなく塗工されているため、接着細胞を好適に培養することが可能である。
さらに、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、略Ｖ字形状の溝において、細胞接着性材料からなる材料だまり部が形成されることを確実に防止することが可能である。このため、本実施形態の培養容器は、接着細胞を培養するにあたって、細胞毒性の虞のないものとなっている。
さらに、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、略Ｖ字形状の溝において、細胞接着性材料からなる材料だまり部が形成されることを確実に防止することが可能である。このため、本実施形態の培養容器は、接着細胞を培養するにあたって、細胞毒性の虞のないものとなっている。
本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、略Ｖ字形状の溝を直線状に並行して加工するのではなく、同心円状や同心楕円状に加工するなど適宜変更することが可能である。
例えば、略Ｖ字形状の溝を直線状に並行して加工するのではなく、同心円状や同心楕円状に加工するなど適宜変更することが可能である。
本発明は、接着細胞を効率的に大量に作成する場合などに、好適に利用することが可能である。
この明細書に記載の文献及び本願のパリ優先の基礎となる日本出願明細書の内容を全てここに援用する。
１０ 培養基材
２０ 細胞接着性材料
２０ 細胞接着性材料
Claims (12)
- 培養基材に予めコーティング剤として細胞接着性材料を塗工し、その後、前記コーティング剤が塗工された前記培養基材の表面に加工を行い、加工された前記培養基材の表面を培養面とする培養容器を形成することを特徴とする培養容器の製造方法。
- 前記培養基材がフィルム又はシートであり、前記培養容器が袋状であることを特徴とする請求項１記載の培養容器の製造方法。
- 前記細胞接着性材料が、コラーゲン、ゼラチン、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ラミニン、又はフィブロネクチンの少なくともいずれかであることを特徴とする請求項１又は２記載の培養容器の製造方法。
- 前記加工において、前記培養基材の前記コーティング剤が塗工された表面側に山状部と谷状部からなる複数の溝であって、前記溝が延びる方向に垂直な断面が略Ｖ字形状の溝を形成し、溝が形成された前記培養基材の表面を前記培養容器の培養面とすることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の培養容器の製造方法。
- 前記溝における略Ｖ字形状の側面の傾斜角を、８０度以下に加工することを特徴とする請求項４記載の培養容器の製造方法。
- 前記溝の表面積を、前記細胞接着性材料の塗工後で加工前の前記培養基材の表面積の２～５．６７倍にすることを特徴とする請求項５記載の培養容器の製造方法。
- 前記溝に、前記細胞接着性材料からなる材料だまり部を形成させないことを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載の培養容器の製造方法。
- 前記加工において、前記培養基材を袋状に形成した後、前記略Ｖ字形状の溝の形成をブロー成形、真空成形、及び圧空成形の少なくともいずれかにより行うことを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の培養容器の製造方法。
- 前記加工において、前記凹凸加工を加熱転写により行い、次いで、前記培養基材を袋状に形成することを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の培養容器の製造方法。
- 前記加熱転写において用いる型に離型剤を塗布した後、前記凹凸加工を行うことを特徴とする請求項９記載の培養容器の製造方法。
- 少なくとも一つのポートを備えた培養容器であって、
前記培養容器の培養面に山状部と谷状部からなる溝で、かつ前記溝が延びる方向に垂直な断面が略Ｖ字形状の溝を備え、前記溝の表面に細胞接着性材料のコーティング層が均一な厚みで備えられたことを特徴とする培養容器。 - 前記溝に、前記細胞接着性材料からなる材料だまり部を有さないことを特徴とする請求項１１記載の培養容器。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 23749607 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
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| NENP | Non-entry into the national phase |
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