CN109810936A - 一种细胞培养基添加剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种细胞培养基添加剂，该细胞培养基添加剂包括羊胚胎或羊胎盘提取液；以及动物血清/浆，还包括抗氧化因子。本发明制备的羊胚胎或羊胎盘提取液中包含各种蛋白、生长因子，小分子营养物质，如丙种球蛋白、白蛋白、转铁蛋白等，这些有效物质能够促进细胞的生长，且该提取物安全性高，成本低，与动物血清/浆结合，能够有效的为各类细胞生长、传代等提供营养物质，可代替进口胎牛血清等昂贵成分，且能够保持各类细胞的有效培养、传代等。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种细胞培养基添加剂。
背景技术
目前最常用的培养基添加剂为胎牛血清，一般实验室用的进口胎牛血清价格昂贵，500ml胎牛血清通常需要花费3000元-4000元人民币，细胞培养成本很高。此外，胎牛血清由于其潜在的疾病传染的可能，不能用于临床。但若用市售的无血清培养基成本更高，通常500ml无血清培养基需要花费人民币超过2000元。因此，开发一种成本低、能保证细胞正常生长且安全的培养基添加剂是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种细胞培养基添加剂，可有效解决现有的培养基添加剂成本高，不安全的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种细胞培养基添加剂，包括：
羊胚胎或羊胎盘提取液；以及
动物血清/浆；其中羊胚胎或羊胎盘提取液添加到细胞培养基中的终浓度为0.15-0.45mg/ml，动物血清/浆体积为培养基体积的1-5％。
进一步地，一种细胞培养基添加剂，还包括抗氧化因子。
进一步地，羊胚胎或羊胎盘提取液通过以下方法制备得到：
(1)将羊胚胎或羊胎盘用含抗生素的生理盐水清洗干净，切块，粉碎，然后按1g：2-3ml的比例向组织中添加提取溶剂，匀浆；
(2)于0-40℃条件下搅拌匀浆3-6h，使其成粥糜状，并调pH值为4.9-5.0，目的是在此等电点沉淀不必要的蛋白质；
(3)将步骤(2)所得物离心，取上清，并调节上清液pH值为6.3-6.4，然后于55-65℃热处理8-12min，目的是在此等电点沉淀不耐热酶和蛋白质；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)1-2次；
(5)将热处理后的物质离心，取上清，进行灭活，并调节pH值至7.0-7.4，目的是使其接近活细胞状态，然后再用超滤膜包处理，制得羊胚胎或羊胎盘提取液。
进一步地，羊胚胎或羊胎盘来源于山羊或绵羊，优选为绵羊孕中、晚期的胚胎。
进一步地，提取溶剂为水、细胞培养基、1％牛磺酸钠溶液或PBS。
进一步地，步骤(2)中调pH值为5.0；步骤(3)中于60℃热处理10min。
进一步地，动物血清/浆来源于动物脐血、胚胎血、富血小板因子血浆。
进一步地，抗氧化因子包括谷氨酰胺、丙酮酸钠和维生素C，谷氨酰胺、丙酮酸钠和维生素C添加到细胞培养基中的终浓度分别为2-3mM、1-2mM、15-30μg/ml。
本发明提供的细胞培养基添加剂，具有以下有益效果：
本发明通过特定的工艺从羊胚胎或羊胎盘中提取有效物质，提取过程中先将羊胚胎或羊胎盘组织破碎，然后加入提取溶剂提取出有效物质，然后通过调节pH值使其偏酸性，离心去沉淀，并调节上清液pH为弱酸性，在55-65℃温度下进行热处理，因不耐热酶或蛋白质在此等电点和温度条件下能够形成沉淀，通过离心这一简单操作便可将不耐热酶或蛋白质这些杂质去除掉，然后调整上清液pH值为7.0-7.4，接近活细胞状态，最后经过超滤除菌等步骤获得本发明提取液。提取液中包括各种蛋白、生长因子，小分子营养物质等，如丙种球蛋白、白蛋白、转铁蛋白等，这些有效物质能够促进细胞的生长，且该提取物安全性高，成本低，整个过程也不需要通过酶来进行酶解，避免了去除酶等复杂的工艺过程。
现有技术中向细胞培养液中添加胎牛血清，其终浓度为4mg/ml，而本申请中羊胚胎或羊胎盘提取液添加后的终浓度仅为0.15-0.45mg/ml，添加量远低于胎牛血清，为了提高细胞的培养效果，在添加羊胚胎或羊胎盘提取液的同时再添加一定量的动物血清/浆，可以为细胞补充不足的营养成分，如生长因子等。因此，本发明将将制得的羊胚胎或羊胎盘提取液与动物血清/浆结合，能够有效的为各类细胞生长、传代等提供营养物质，可代替进口胎牛血清等昂贵成分，且能够保持各类细胞的有效培养、传代等。
附图说明
图1为实施例2中各组培养的第4代人脐带间充质干细胞的细胞形态。
图2为实施例3实验组培养的第10代大鼠脂肪间充质干细胞形态。
图3为实施例3对照组培养的第9代大鼠脂肪间充质干细胞形态。
图4为实施例4中实验组培养的第8代人脐带间充质干细胞的细胞形态。
图5为实施例4中对照组培养的第8代人脐带间充质干细胞的细胞形态。
具体实施方式
本发明提供的细胞培养基添加剂，包括羊胚胎或羊胎盘提取液和动物血清/浆，还可以再添加抗氧化因子。
其中，羊胚胎或羊胎盘来源于山羊或绵羊，优选为绵羊孕中、晚期的胚胎；动物血清/浆来源于动物脐血、胚胎血、富血小板因子血浆PFRP(201310042567.0)；抗氧化因子包括但不限于谷氨酰胺、丙酮酸钠、维生素C。
羊胚胎或羊胎盘提取液通过以下方法制备得到：
(1)取新鲜的绵羊孕中、晚期胚胎或胎盘，用含抗生素(100U/ml青链霉素或200U/ml卡那霉素或50ug/ml庆大霉素)的生理盐水将其血液冲洗干净，置于-20℃以下冷冻保存；
(2)取冷冻保存的羊胚胎或羊胎盘组，切块，将块状组织再次用生理盐水清洗干净，然后粉碎，每500g组织添加1000-1500ml 1％牛磺酸钠溶液(或等体积的注射用水、DMEM培养基、PBS缓冲液)，用组织匀浆器进行匀浆，并从1-5档渐进间断推进，匀浆时间为2-5min；
(3)将步骤(2)所得物在0-40℃条件下搅拌匀浆3-6h，使其成粥糜状，并调pH值为4.9-5.0；
(4)将步骤(3)所得物于8000-10000r/min条件下离心10min，取上清，并调节上清液pH值为6.3-6.4，然后于55-65℃热处理8-12min；
(5)重复步骤(3)和步骤(4)1-2次；
(6)将热处理后的物质于8000-10000r/min条件下离心10min，取上清；
(7)向步骤(6)所得上清液中添加硫酸盐至饱和浓度，然后于60℃加热10h，进行病毒灭活；
(8)将步骤(7)所得物的pH值上调至7.0-7.4，然后用3-5KD膜包进行超滤处理，最后除菌、分装、冻干。
动物血清通过以下方法制备得到：
(1)在动物胚胎或胎盘娩出前/后，用无菌采集管采集其血液；
(2)将血液置于室温或4℃条件下进行自然凝固，然后收集血清，也可以采集抗凝血，离心分离血浆，添加凝血酶和钙离子去除纤维蛋白后收集血清；
(3)对收集的血清通过光化学法进行病毒灭活，再置于56℃进行补体灭活30min，最后除菌，分装，-20℃及以下温度进行低温保存。
具体实施过程见以下实施例：
实施例1细胞培养添加剂的制备
1、制备羊胚胎或羊胎盘提取液
(1)取新鲜的绵羊中期胚胎，用含200U/ml卡那霉素的生理盐水将其血液冲洗干净，置于-20℃冷冻保存；
(2)取冷冻保存的绵羊中期胚胎，切块，将块状组织再次用生理盐水清洗干净至肉色；
(3)将组织块粉碎，每500g组织添加1500ml 1％牛磺酸钠溶液，用组织匀浆器进行匀浆，并从1-5档渐进间断推进，匀浆时间为2min；
(4)将步骤(3)所得物在40℃条件下缓柔搅拌匀浆3h，使其成粥糜状，并调pH值为5.0；
(5)将步骤(4)所得物于8000r/min条件下离心10min，取上清，并调节上清液pH值为6.3，然后于60℃热处理10min；
(6)将热处理后的物质于8000-10000r/min条件下离心10min，取上清；
(7)向步骤(6)所得上清液中添加硫酸盐至饱和浓度，然后于60℃加热10h，进行病毒灭活；
(8)将步骤(7)所得物的pH值上调至7.0，然后用5KD膜包进行超滤处理，最后除菌，冻干，制得羊胚胎提取液。
2、将羊胚胎提取液分别与5％绵羊脐血血清、2.5％富血小板生长因子血浆PFRP和2％市售胎牛血清组合，配套形成细胞培养基添加剂，具体为：
组合1：羊胚胎提取液+5％绵羊脐血血清；
组合2：羊胚胎提取液+2.5％富血小板生长因子血浆PFRP；
组合3：羊胚胎提取液+2％市售胎牛血清。
将这些细胞添加剂添加到细胞培养基中进行细胞的培养，具体见以下实施例：
实施例2人脐带间充质干细胞传代培养(组合1)
采用市售的低糖DMEM培养基为基础培养基，然后添加细胞培养添加剂，接着接种第2代人脐带间充质干细胞，接种量为1×105个/ml，在T75培养瓶中进行传代培养，传代至第6代结束。
实验组：添加剂为组合1，将添加剂添加到低糖DMEM基础培养基中后，添加剂中各组分的终浓度分别为：0.15mg/ml羊胚胎提取液、5％绵羊脐血血清(体积浓度)，然后再加入2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和30μg/ml维生素C。
对照组1(胎牛血清培养组)：在低糖DMEM培养基中添加10％胎牛血清，该胎牛血清为市售进口胎牛血清。
对照组2(无血清培养组)：培养基为市售无血清培养基，根据无血清培养基说明书进行使用。
对各组培养的第4代人脐带间充质干细胞进行检测，细胞形态见图1，图1中从左到右分别为对照组2、对照组1和实验组。
正常间充质干细胞镜下为成纤维细胞状态，有光泽，有活力，有增殖，细胞生长状态不好时会出现空泡，形态改变，成细长或片状，不会出现增殖等现象。由图1可知，实验组中的细胞状态生长良好。
对各组培养的第4代人脐带间充质干细胞的倍增时间进行检测，实验组和对照组1的倍增时间接近，约28h，对照组2的倍增时间约22h。
此外，还对各组培养的第4代人脐带间充质干细胞CD表型做了检测，检测结果如下表：
实施例3大鼠脂肪间充质干细胞ADSCs传代培养(组合3)
采用市售的低糖DMEM培养基为基础培养基，然后添加细胞培养添加剂，接着接种第1代大鼠脂肪间充质干细胞，接种量为1×105个/ml，在T75培养瓶中进行传代培养，传代至第10代结束。
实验组：添加剂为组合3，将添加剂添加到低糖DMEM基础培养基中后，添加剂中各组分的终浓度分别为：0.25mg/ml羊胚胎提取液、2％市售胎牛血清，还加入了2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和15μg/ml维生素C。
对照组(胎牛血清培养组)：在低糖DMEM培养基中添加10％胎牛血清，该胎牛血清为市售进口胎牛血清。
对各组培养的大鼠脂肪间充质干细胞进行检测，细胞形态见图2和图3，图2为实验组培养的第10代大鼠脂肪间充质干细胞形态，图3为对照组培养的第9代大鼠脂肪间充质干细胞形态。
由图2和3可知，实验组中的细胞形态能很好的进行生长，与对照组中细胞形态大体接近。
实施例4人脐带间充质干细胞传代培养(组合2)
采用市售的低糖DMEM培养基为基础培养基，然后添加细胞培养添加剂，接着接种第6代人脐带间充质干细胞，接种量为8×104个/ml。
实验组：添加剂为组合2，将添加剂添加到低糖DMEM基础培养基中后，添加剂中各组分的终浓度分别为：0.4mg/ml羊胚胎提取液、2.5％富血小板生长因子血浆PFRP，还加入了2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和30μg/ml维生素C。
对照组在低糖DMEM培养基中添加10％胎牛血清，该胎牛血清为市售进口胎牛血清。
观察实验组和对照组第8代人脐带间充质干细胞生长状态，细胞形态见图4-5，图4为实验组，图5为对照组。
正常间充质干细胞镜下为成纤维细胞状态，有光泽，有活力，有增殖，细胞生长状态不好时会出现空泡，形态改变，成细长或片状，不会出现增殖等现象。由图4可知，实验组的细胞状态生长良好。
Claims (9)
1.一种细胞培养基添加剂，其特征在于，包括：
羊胚胎或羊胎盘提取液；以及
动物血清/浆；
其中，羊胚胎或羊胎盘提取液添加到细胞培养基中的终浓度为0.15-0.45mg/ml，动物血清/浆体积为培养基体积的1-5％。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基添加剂，其特征在于，还包括抗氧化因子。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养基添加剂，其特征在于，羊胚胎或羊胎盘提取液通过以下方法制备得到：
(1)将羊胚胎或羊胎盘用含抗生素的生理盐水清洗干净，切块，粉碎，然后按1g：2-3ml的比例向组织中添加提取溶剂，匀浆；
(2)于0-40℃条件下搅拌匀浆3-6h，然后调pH值为4.9-5.0；
(3)将步骤(2)所得物离心，取上清，并调节上清液pH值为6.3-6.4，然后于55-65℃热处理8-12min；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)1-2次；
(5)将热处理后的物质离心，取上清，进行灭活，并调节pH值至7.0-7.4，然后再用超滤膜包处理，制得羊胚胎或羊胎盘提取液。
4.根据权利要求3所述的细胞培养基添加剂，其特征在于，步骤(1)中羊胚胎或羊胎盘来源于山羊或绵羊孕中、晚期的胚胎。
5.根据权利要求3所述的细胞培养基添加剂，其特征在于，步骤(1)中提取溶剂为水、细胞培养基、1％牛磺酸钠溶液或PBS。
6.根据权利要求3所述的细胞培养基添加剂，其特征在于，步骤(2)中调pH值为5.0；步骤(3)中于60℃热处理10min。
7.根据权利要求1所述的细胞培养基添加剂，其特征在于，动物血清/浆来源于动物脐血、胚胎血或富血小板因子血浆。
8.根据权利要求1所述的细胞培养基添加剂，其特征在于，抗氧化因子包括谷氨酰胺、丙酮酸钠和维生素C，谷氨酰胺、丙酮酸钠和维生素C在细胞培养基中的终浓度分别为2-3mM、1-2mM、15-30μg/ml。
9.一种细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和权利要求1-8任一项所述的细胞培养基添加剂。
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