KR20080099264A - Ｒｅｌｔ를 표적화하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

항-RELT 모노클로날 항체, 및 상기 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 면역 세포 발생을 조정하고 시토킨 생산을 조정하는데 RELT 폴리펩티드 및 핵산을 사용하는 방법을 또한 제공한다.
항-RELT 모노클로날 항체, RELT 폴리펩티드, 핵산, 시토킨, IFN-α

Description

ＲＥＬＴ를 표적화하기 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING RELT}
본 발명은 면역 세포 발생을 조정하고 시토킨 생산을 조정하는데 있어서 RELT 폴리펩티드, 및 핵산을 사용하는 방법의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항-RELT 항체, 및 보다 특히 RELT-발현 세포로부터 시토킨 생산의 작용제인 항-RELT 항체의 분야에 관한 것이다.
타입 I 인터페론 (IFN)은 매우 다양한 세포 종류에 다면발현 효과를 갖는 시토킨이다. IFN은 그들의 항-바이러스 활성으로 가장 잘 알려져 있지만, 이들은 또한 항-세균, 항-원생동물, 면역조정, 및 세포-성장 조절 기능을 갖는다 ([van den Broek et al., Immunol. Rev. 148: 5-18 (1995)]; [Pfeffer et al., Cancer Res. 58: 2489-99 (1998)]). 타입 I 인터페론은 인터페론-α (IFN-α) 및 인터페론-β (IFN-β)를 포함한다.
IFN-생산 세포 (IPC)로서도 알려진 뮤린 CD11c+B220+CD11b-CD45RB+ 형질세포양 (plasmacytoid) 수지상 세포 (pDC)는 특유한 형질세포양 형태를 나타내고, 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 광범위한 DNA 또는 RNA 바이러스에 노출 될 때 타입 I IFN의 강한 생산자이다 ([Colonna et al., Nat. Immunol. 5: 1219-26 (2004)]; [Hochrein et al., Hum. Immunol. 63: 1103-10 (2002)]; [Nakano et al., J. Exp. Med. 194: 1171-8 (2001)]; [Diebold et al., Science 303: 1529-31 (2004)]; [Dalod et al., J. Exp. Med. 195: 517-28 (2002)]; [Asselin-Paturel et al., Nat. Immunol. 2: 1144-50 (2001)]; 및 [Lund et al., J. Exp. Med. 198: 513-20 (2003)]). 상기 IFN 생산은 Toll-유사 수용체 7 및 9 및 하류 어댑터 (adaptor) MyD88에 의존한다 ([Diebold et al., Science 303: 1529-31 (2004)]; [Lund et al., J. Exp. Med. 198: 513-20 (2003)]; [Krug et al., Immunity 21: 107-19 (2004)]; [Hemmi et al., J. Immunol. 170: 3059-64 (2003)]). 뮤린 사이토메갈로바이러스 (MCMV)와 같은 특정 바이러스로 감염된 마우스에서, pDC는 IFN-α의 주요한, 아마도 단독의 공급원이다 ([Dalod et al., J. Exp. Med. 195: 517-28 (2002)]; [Asselin-Paturel et al., Nat. Immunol. 2: 1144-50 (2001)]). pDC 및 보통 (conventional) CD11c+B220-DC (cDC) (항원-특이적 나이브 (naive) T 세포를 프라이밍하는 "전문 (professional)" 항원-제시 세포의 독특한 하위세트) ([Colonna et al., Nat. Immunol. 5: 1219-26 (2004)]; [Banchereau et al., Nature 392: 245-52 (1998)])의 발생 및 협동은 주어진 병원체에 대한 적절한 면역 반응의 생성에 중대하다. pDC는 또한 자가면역 질병, 예를 들어 루푸스의 발생 및 병태생리에서 (예를 들어, [Ronnblom, J. Exp. Med. 194: F59 (2001)] 참조), 면역 질환, 예를 들어 알레르기 비염 및 천식에서 ([Jahnsen et al., J. Immunol. 165: 4062-4068 (2000)]; [Matsuda et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med. 166: 1050-1054 (2002)]), 및 암 (예를 들어, 문헌 [Zou et al., Nat. Med. 7: 1339-1346 (2001)]에 설명된 바와 같은 난소암), 및 골수 형성 이상 증후군 (MDS) (문헌 [Ma et al., Leukemia 18(9): 1451-1456 (2004)]에 설명된 바와 같이)에서 핵심적인 역할을 하는 것으로 나타났다.
뮤린 골수 내의 보통 림프전구세포 (CLP) 및 보통 골수전구세포 (CMP) 세포는 모두 cDC 및 pDC 집단에서 일어날 수 있고 [Shigematsu et al., Immunity 21: 43-53], 말초혈 내의 CD11c+MHC 클래스 II- 하위세트는 pDC 및 cDC 하위세트에 대한 직접적 전구체를 함유하는 집단으로서 확인되었다 (del Hoyo et al., Nature 415: 1043-7 (2002)). 마우스에서 유전자 표적 연구에서는 cDC의 발생을 조절하는 몇몇 세포내 신호 전달 분자 및 전사 인자를 확인하였고; IFN 조절 인자 (IRF) 2, IRF4, Ikaros, RelB, TRAF6, 및 PU.1은 각각 cDC 발생을 위해 필수적이다 (Ardavin et al., Nat. Rev. Immunol. 3: 582-90 (2003)). pDC 발생에 대해서는 상당히 적게 알려져 있다. IRF8/IFN 컨센서스 서열 결합 단백질 (ICSBP)이 결핍된 마우스는 pDC 발생에서 결함을 보이지만, 골수 세포 및 cDC 발생이 또한 상기 마우스에서 손상된다 (Tsujimura et al., J. Immunol. 170: 1131-5 (2003)). 전구세포의 pDC 및 cDC로의 분화는 마우스 또는 골수 세포 배양액에서 fms-관련 티로신 키나제 3 리간드 (FLT3L)에 의해 자극된다 ([Vollstedt et al., J. Exp. Med. 197: 575-84 (2003)]; [Gilliet et al., J. Exp. Med. 195: 953-8 (2002)).
특정 TNF 수용체 및 그들의 리간드는 수지상 세포 활성화 및 활성의 중요한 매개인자로서 확인되었다 (Anderson et al., Nature 390: 175-179 (1997)). TNF 수용체 수퍼패밀리 (TNFRSF)는 적어도 29개의 멤버로 이루어지고, 그 중 대부분은 타입 I 내재형 (integral) 막 단백질이다. 상기 수용체는 대개 3개의 디술피드 결합에 의해 가교된 6개의 시스테인 잔기를 함유하는 슈도-리피트 (pseudo-repeat)인 보존된, 세포외 시스테인-풍부 도메인 (CRD)을 갖는다. TNFRSF 멤버는 그들의 인지체 리간드에 의해 결합될 때 일련의 생물학적 결과, 예를 들어 세포 생존, 세포 사멸, 증식, 및 분화를 촉진한다 ([Locksley et al., Cell 104: 487-501 (2001)]; [Bodmer et al., Trends Biochem. Sci. 27: 19-26 (2002)).
TNFRSF 내에, 그의 특이적 리간드가 아직 확인되지 않은 몇몇 고아 (orphan) 수용체, 예를 들어 림프 조직에서 발현되는 수용체 (RELT)/TNFRSF 19L이 존재한다 (Sica et al., Blood 97: 2702-7 (2001)). RELT는 2개의 CRD를 갖는 타입 I 세포 표면 단백질이다. 이소 (ectopically) 발현될 때, RELT는 선천 및 획득 면역 모두를 위해 요구되는 유전자의 발현을 위한 필수 전사 인자인 NF-κB (id.)를 활성화한다 (Bonizzi et al., Trends Immunol. 25: 280-8 (2004)). RELT mRNA 발현은 림프계 조직, 예를 들어 비장 및 림프절에 주로 한정되는 것으로 보인다 (Sica et al., Blood 97: 2702-7 (2001)). 면역 세포 조절 및 기능에서 RELT의 역할을 이해하는 것은 면역 질병을 치료하기 위한 새로운 방안을 제공할 수 있다.
특허 출원 및 공개를 포함한 본원에서 언급된 모든 참고문헌은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
<발명의 개요>
특정 면역 세포의 발생을 조정하고 특정 면역 세포로부터 시토킨 생산을 조정하는데 있어서 RELT 폴리펩티드 및 핵산을 사용하는 방법을 제공한다. RELT에 결합하고/하거나 RELT와 연관된 생물학적 활성을 조절할 수 있는 신규한 항체를 또한 제공한다.
한 실시태양에서, RELT에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 한 실시태양에서, 각각 서열 42-49, 51-58, 및 60-67 중의 임의의 서열의 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3 중에서 선택되는 적어도 하나의 초가변 (HVR) 서열을 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 한 측면에서, 단리된 항체는 RELT에 특이적으로 결합한다. 다른 측면에서, 단리된 항체는 서열 1 및 서열 2 중에서 선택된 경쇄 초가변 서열을 추가로 포함한다. 다른 측면에서, 항체는 인간 RELT에 특이적으로 결합한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT의 적어도 하나의 RELT 리간드에 대한 결합을 억제한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT의 길항제이다. 다른 측면에서, 항체는 적어도 하나의 RELT-매개 신호 전달 경로를 억제한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT를 발현하는 세포로부터 NF-κB의 생산을 자극한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT의 작용제이다. 다른 측면에서, 항체는 적어도 하나의 RELT-매개 신호 전달 경로를 자극한다.
다른 실시태양에서, HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 중에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 단리된 항체를 제공하고, 여기서 HVR-H1은 아미노산 서열 a b c d e f g h i j를 포함하고, 여기서 아미노산 a는 글라이신이고; 아미노산 b는 페닐알 라닌이고; 아미노산 c는 트레오닌이고; 아미노산 d는 이소류신이고; 아미노산 e는 트레오닌, 세린, 및 아스파라긴 중에서 선택되고; 아미노산 f는 아스파라긴, 글라이신, 세린, 및 아스파르트산 중에서 선택되고; 아미노산 g는 트레오닌, 세린, 및 아스파라긴 중에서 선택되고; 아미노산 h는 트립토판, 티로신, 및 세린 중에서 선택되고; 아미노산 i는 이소류신이고; 아미노산 j는 히스티딘이고; 여기서 HVR-H2는 아미노산 서열 k l m n o p q r s t u v w x y z a' b'를 포함하고, 여기서 아미노산 k는 글라이신 및 알라닌 중에서 선택되고; 아미노산 l은 페닐알라닌, 아르기닌, 트립토판, 글라이신, 아스파라긴, 및 티로신 중에서 선택되고; 아미노산 m은 이소류신이고; 아미노산 n은 세린, 티로신, 트레오닌, 및 아스파라긴 중에서 선택되고; 아미노산 o는 프롤린이고; 아미노산 p는 세린, 아스파라긴, 티로신, 및 알라닌 중에서 선택되고; 아미노산 q는 글라이신, 아스파라긴, 아스파르트산, 및 세린 중에서 선택되고; 아미노산 r은 글라이신이고; 아미노산 s는 티로신, 아스파라긴, 아스파르트산, 및 세린 중에서 선택되고; 아미노산 t는 트레오닌이고; 아미노산 u는 아스파라긴, 티로신, 및 아스파르트산 중에서 선택되고; 아미노산 v는 티로신이고; 아미노산 w는 알라닌이고; 아미노산 x는 아스파르트산이고; 아미노산 y는 세린이고; 아미노산 z는 발린이고; 아미노산 a'는 라이신이고; 아미노산 b'는 글라이신이고; 여기서 HVR-H3은 아미노산 서열 c' d' e' f' g' h' i' j' k' l' m' n' o' p' q' r' s' t' u' v'를 포함하고, 여기서 아미노산 c'는 아르기닌 및 라이신 중에서 선택되고; 아미노산 d'는 페닐알라닌, 트립토판, 세린, 글라이신, 류신, 및 아스파르트산 중에서 선택되고; 아미노산 e'는 류신, 아스파르트산, 알라닌, 세린, 및 아 르기닌 중에서 선택되고; 아미노산 f'는 세린, 티로신, 글라이신, 트립토판, 및 히스티딘 중에서 선택되고; 아미노산 g'는 아스파르트산, 이소류신, 류신, 알라닌, 트립토판, 및 발린 중에서 선택되고; 아미노산 h'는 글라이신, 아스파르트산, 아스파라긴, 트립토판, 알라닌, 트레오닌, 및 히스티딘 중에서 선택되고; 아미노산 i'는 알라닌, 글라이신, 메티오닌, 트립토판, 아스파르트산, 및 글루탐산 중에서 선택되고; 아미노산 j'는 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 발린, 글라이신, 및 글루탐산 중에서 선택되고; 아미노산 k'는 알라닌, 발린, 글라이신, 히스티딘, 글루탐산, 및 아르기닌 중에서 선택되고; 아미노산 l'는 아르기닌, 티로신, 발린, 페닐알라닌, 및 글라이신 중에서 선택되고; 아미노산 m'는 아스파르트산, 트레오닌, 메티오닌, 글루탐산, 티로신, 및 아르기닌 중에서 선택되고; 아미노산 n'는 티로신, 세린, 글루탐산, 알라닌, 아스파르트산, 및 프롤린 중에서 선택되거나, 존재하지 않고; 아미노산 o'는 알라닌, 티로신, 메티오닌, 트립토판, 및 발린 중에서 선택되거나, 존재하지 않고; 아미노산 p'는 메티오닌, 알라닌, 발린, 및 글라이신 중에서 선택되거나, 존재하지 않고; 아미노산 q'는 아르기닌, 발린, 메티오닌, 및 아스파르트산 중에서 선택되거나, 존재하지 않고; r' 는 티로신 및 메티오닌 중에서 선택되거나, 존재하지 않고; s'는 발린이거나 존재하지 않고; t'는 메티오닌이거나, 존재하지 않고; u'는 아스파르트산이고, v'는 티로신이다. 한 측면에서, 단리된 항체는 RELT에 특이적으로 결합한다. 한 측면에서, 단리된 항체는 서열 1 및 서열 2 중에서 선택된 경쇄 초가변 서열을 추가로 포함한다. 다른 측면에서, 항체는 인간 RELT에 특이적으로 결합한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT의 적어도 하나의 RELT 리간드에 대한 결합을 억제한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT의 길항제이다. 다른 측면에서, 항체는 적어도 하나의 RELT-매개 신호 전달 경로를 억제한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT를 발현하는 세포로부터 NF-κB의 생산을 자극한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT의 작용제이다. 다른 측면에서, 항체는 적어도 하나의 RELT-매개 신호 전달 경로를 자극한다.
다른 실시태양에서, 도 5A 및 5B에서 클론 C21, C10, E5/E7, F4, F5, H7, H9, 및 H11에 대해 제시된 것에 대응하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3 서열을 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 한 측면에서, 단리된 항체는 RELT에 특이적으로 결합한다. 한 측면에서, 단리된 항체는 서열 1 및 서열 2 중에서 선택된 경쇄 초가변 서열을 추가로 포함한다. 다른 측면에서, 항체는 인간 RELT에 특이적으로 결합한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT의 적어도 하나의 RELT 리간드에 대한 결합을 억제한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT의 길항제이다. 다른 측면에서, 항체는 적어도 하나의 RELT-매개 신호 전달 경로를 억제한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT를 발현하는 세포로부터 NF-κB의 생산을 자극한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT의 작용제이다. 다른 측면에서, 항체는 적어도 하나의 RELT-매개 신호 전달 경로를 자극한다.
다른 실시태양에서, 서열 49의 HVR-H1 서열, 서열 58의 HVR-H2 서열, 및 서열 67의 HVR-H3 서열을 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 한 측면에서, 단리된 항체는 서열 1 및 서열 2 중에서 선택된 경쇄 초가변 서열을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 항체는 인간 RELT에 특이적으로 결합한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT 의 적어도 하나의 RELT 리간드에 대한 결합을 억제한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT의 길항제이다. 다른 측면에서, 항체는 적어도 하나의 RELT-매개 신호 전달 경로를 억제한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT를 발현하는 세포로부터 NF-κB의 생산을 자극한다. 다른 측면에서, 항체는 RELT의 작용제이다. 다른 측면에서, 항체는 적어도 하나의 RELT-매개 신호 전달 경로를 자극한다.
다른 실시태양에서, 상기 설명된 임의의 항체와 RELT 상의 동일한 항원 결정자에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 한 실시태양에서, RELT에 대한 결합에 대해 상기 설명된 임의의 항체와 경쟁하는 단리된 항체를 제공한다.
본 발명의 항체는 임의의 수의 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 키메라 (chimeric) 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 인간 항체가 아니고, 예를 들어 제노마우스 (xenomouse)에서 생산된 항체가 아니다 (예를 들어, WO96/33735에 설명된 바와 같이). 본 발명의 항체는 전장 또는 그의 단편 (예를 들어, 항원 결합 성분을 포함하는 단편)일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 한 측면에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명의 항체를 생산할 수 있는 세포주를 제공한다. 한 측면에서, 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 항체가 생산되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 본 발명의 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 유효량의 본 발명의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 실시태양에서, 샘플을 본 발명의 적어도 하나의 항체에 노출시키고, 적어도 하나의 항체의 샘플 내의 RELT 폴리펩티드에 대한 결합을 결정하는 것을 포함하는, RELT 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내에서 RELT 폴리펩티드의 존재를 결정하는 방법을 제공한다.
다른 실시태양에서, 환자에게 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 환자 내의 IFN-α에 의해 유발되거나, 악화되거나, 연장되는 질병 또는 병태의 치료를 위한 방법을 제공한다. 한 측면에서, 질병 또는 병태는 질병 또는 병태의 부재 하의 IFN-α 수준에 비해 환자에서 감소된 IFN-α 수준에 의해 유발되거나, 악화되거나, 연장된다. 한 측면에서, 질병 또는 병태는 질병 또는 병태의 부재 하의 IFN-α 수준에 비해 환자에서 증가된 IFN-α 수준에 의해 유발되거나, 악화되거나, 연장된다. 다른 실시태양에서, 환자에게 유효량의 가용형의 RELT를 투여하는 것을 포함하는, 환자 내의 IFN-α와 연관된 질병 또는 병태의 치료를 위한 방법을 제공한다.
한 측면에서, 환자는 포유동물 환자이다. 다른 측면에서, 환자는 인간이다. 다른 측면에서, 질병 또는 병태는 세포 증식 질환, 감염, 면역/염증성 질환, 및 인터페론-관련 질환의 적어도 하나로부터 선택된다. 다른 측면에서, 면역/염증성 질환은 루푸스, 천식, 및 알레르기 비염 중에서 선택된다. 다른 측면에서, 감염은 미생물 감염, 바이러스 감염, 및 진균 감염 중에서 선택된다. 다른 측면에서, 세포 증식 질환은 골수 형성 이상 증후군 (MDS) 및 암 중에서 선택된다.
다른 실시태양에서, CD11c+MHC II- 세포에서 RELT 발현을 억제하는 것을 포함하는, 보통 수지상 세포 (cDC)에 비해 CD11c+MHC II- 세포로부터 생산된 형질세포양 수지상 세포 (pDC)의 비율을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, CD11c+MHC II- 세포에서 RELT 활성을 억제하는 것을 포함하는, 보통 수지상 세포 (cDC)에 비해 CD11c+MHC II- 세포로부터 생산된 형질세포양 수지상 세포 (pDC)의 비율을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 한 측면에서, RELT 발현 또는 활성을 억제하는 것은 CD11c+MHC II- 세포에서 RELT를 파괴하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, RELT 발현 또는 활성을 억제하는 것은 RELT에 대해 안티센스인 올리고뉴클레오티드를 CD11c+MHC II- 세포에 투여하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, RELT 발현 또는 활성을 억제하는 것은 CD11c+MHC II- 세포에 RELT의 그의 정상 리간드에 대한 결합을 억제하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, RELT 발현 또는 활성을 억제하는 것은 생체 내에서 일어난다. 다른 측면에서, RELT 발현 또는 활성을 억제하는 것은 시험관 내에서 일어난다.
다른 실시태양에서, CD11c+MHC II- 세포에서 RELT 발현을 자극하는 것을 포함하는, 보통 수지상 세포에 비해 CD11c+MHC II- 세포로부터 생산된 형질세포양 수지상 세포의 비율을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, CD11c+MHC II- 세포에서 RELT 활성을 자극하는 것을 포함하는, 보통 수지상 세포에 비해 CD11c+MHC II- 세포로부터 생산된 형질세포양 수지상 세포의 비율을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 한 측면에서, RELT 발현 또는 활성을 자극하는 것은 RELT를 작용하도록 하는 (agonizing) 항체를 CD11c+MHC II- 세포에 투여하는 것을 포함한다.
다른 실시태양에서, 포유동물에서 RELT 발현을 억제하는 것을 포함하는, 포유동물에서 IFN-α 생산을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 포유동물에서 RELT 활성을 억제하는 것을 포함하는, 포유동물에서 IFN-α 생산을 증가시키기 위한 방법을 제공한다.
다른 실시태양에서, 포유동물의 CD11c+MHC II- 세포에서 RELT 발현을 자극하는 것을 포함하는, 포유동물에서 IFN-α 생산을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 포유동물의 CD11c+MHC II- 세포에서 RELT 활성을 자극하는 것을 포함하는, 포유동물에서 IFN-α 생산을 감소시키기 위한 방법을 제공한다.
다른 실시태양에서, 포유동물에서 발현된 RELT의 양을 검출하는 것을 포함하는, 포유동물에서 비정상 IFN-α 수준에 관련된 질병 또는 병태를 진단하기 위한 방법을 제공한다. 한 측면에서, 질병 또는 병태는 세포 증식 질환, 감염, 면역/염증성 질환, 및 인터페론-관련 질환의 적어도 하나로부터 선택된다.
도 1A 및 1B와 도 2는 다음과 같은 서열을 갖는, 본 발명을 실시하는데 사용하기 위한 예시적인 억셉터 (acceptor) 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 도시한 것이다:
가변 중쇄 ( VH ) 컨센서스 프레임워크 (도 1A 및 1B)
인간 VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 마이너스 카바트 (Kabat) CDR (서열 3, 73, 74, 75)
인간 VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 구역 (서열 4-6, 76-78, 79-81, 및 82-84)
인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 7, 85, 86, 87)
인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 구역 (서열 8-10, 88-90, 91-93, 94-96)
인간 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 11, 97, 98, 99)
인간 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 구역 (서열 12-14, 100-102, 103-105, 106-108)
인간 VH 억셉터 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 15, 109, 110, 111)
인간 VH 억셉터 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 구역 (서열 16-17, 112-114, 115-117)
인간 VH 억셉터 2 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 18, 118, 119, 120)
인간 VH 억셉터 2 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 구역 (서열 19-21, 121-123, 124-126, 127-129)
가변 경쇄 ( VL ) 컨센서스 프레임워크 (도 2)
인간 VL 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크 (서열 22, 130, 131, 132)
인간 VL 카파 하위군 II 컨센서스 프레임워크 (서열 23, 133, 134, 135)
인간 VL 카파 하위군 III 컨센서스 프레임워크 (서열 24, 136, 137, 138)
인간 VL 카파 하위군 IV 컨센서스 프레임워크 (서열 25, 139, 140, 141)
도 3은 huMAb4D5-8 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 구역 서열을 도시한 것이다. 위첨자/굵은 숫자는 카바트에 따른 아미노산 위치를 나타낸다.
도 4는 huMAb4D5-8 경쇄 및 중쇄의 변형/변이체 프레임워크 구역 서열을 도시한 것이다. 위첨자/굵은 숫자는 카바트에 따른 아미노산 위치를 나타낸다.
도 5A 및 5B는 실시예 1(A)에 설명된 바와 같은 항-RELT 항체 분자의 중쇄 HVR 루프 서열을 보여준다. 도면은 중쇄 HVR 서열, H1, H2, 및 H3을 보여준다. 아미노산 위치는 하기 설명되는 카바트 번호 체계에 따라 번호를 매긴다.
도 6은 실시예 1(b)(1)에 설명된 바와 같이, 세포 표면에서 마우스 RELT를 발현하지 않는 ("BHK") 또는 발현하는 ("mRELT/BHK") 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포에 대한 항-RELT 항체의 결합의 FACS 분석의 결과를 도시한 것이다.
도 7은 실시예 1(b)(1)에 설명된 바와 같이, 세포 표면에서 마우스 RELT를 발현하지 않는 ("-/-") 또는 발현하는 ("+/+") 비장세포에 대한 항-RELT 항체의 결 합의 FACS 분석의 결과를 도시한 것이다.
도 8은 실시예 1(b)(2)에 설명된 바와 같이, relt - xedar로 형질감염되고 다양한 항-RELT 항체로 처리된 세포에서 NF-κB 활성화의 활성화 정도를 도시한 것이다.
도 9는 실시예 1(b)(4)에 설명된 바와 같이, 고해상 BIAcore(등록상표) 분석 동안 관찰된 다양한 농도의 항-RELT 항체 H11와 마우스 RELT 사이의 결합 상호작용을 도시한 것이다.
도 10은 실시예 1(b)(5)에 설명된 바와 같이, 항-RELT 항체 H11이 293 세포의 표면에서 발현된 인간 RELT에 특이적으로 결합하는 것을 입증하는 FACS 분석을 도시한 것이다.
도 11은 실시예 2에 설명된 바와 같이, 상이한 T 세포 집단에 대한 항-RELT 항체 H11 결합의 FACS 분석의 결과를 도시하고, 이는 각각의 T 세포 집단이 세포 표면에서 RELT를 발현한 것을 보여준다.
도 12는 실시예 2에 설명된 바와 같이, 상이한 B 세포 집단에 대한 항-RELT 항체 H11 결합의 FACS 분석의 결과를 도시하고, 이는 B 세포 집단이 H11 항체에 의해 결합되지 않았음을 보여준다.
도 13은 실시예 2에 설명된 바와 같이, 비장세포에 대한 항-RELT 항체 H11 결합의 FACS 분석의 결과를 도시하고, 이는 T 세포 및 대식세포가 세포 표면에서 RELT를 발현하였음을 보여준다.
도 14A-C는 실시예 3(a)에 설명된 바와 같은, RELT-결핍 마우스의 생성을 도 시한 것이다. 도 14A는 마우스 RELT 엑손 II 내지 V (아미노산 17-209를 코딩하는)을 교체하기 위해 사용된 loxP 부위가 인접하는 PGK-neo 선택 카세트를 보여준다. 도 14B는 실시예 3(a)에 설명된 바와 같이 relt +/+, relt +/-, 및 relt -/- 마우스로부터 게놈 DNA의 서던 블롯 (Southern Blot) 분석을 도시한 것이다. 도 14C는 relt +/+ ("WT") 및 relt -/- 마우스로부터의 T 세포 상에서 표면 RELT 발현에 대한 유동 세포측정 분석의 결과를 보여준다. 두 그래프에서 최좌측 곡선 (굵은)은 대조 항체에 의한 염색을 나타내는 반면, 최우측 곡선은 RELT-특이적 mAb H11에 의한 염색을 나타낸다.
도 15A-15D는 실시예 3(b)에 설명된 바와 같이, RELT가 마우스에서 정상 T 세포, B 세포 및 NK 세포 발생에 요구되는지 결정하기 위해 설계된 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 15A는 10주령 야생형 및 relt -/- 마우스로부터의 비장 세포의 유동 세포측정 분석의 결과를 도시한 것이다. 값은 각각의 유전형의 10마리 마우스의 평균±표준 편차를 나타낸다. T 세포는 CD3+IgM-B220-DX5-인 세포로서 확인되었다. B 세포는 CD3-IgM+B220+DX5-인 세포로서 확인되었다. NK 세포는 CD3-IgM-B220-DX5+인 세포로서 확인되었다. 도 15B는 도 15A에서와 같이 확인된 T 세포, B 세포 및 NK 세포 상의 RELT의 발현을 도시한 것이다. 각각의 그래프에서 최좌측 (굵은) 곡선은 대조 mAb에 의한 염색을 나타내는 반면, 최우측 곡선은 RELT-특이적 mAb H11에 의한 염색을 나타낸다. 도 15C는 야생형 ("WT") 및 relt -/- 마우스로부터의 흉선세포의 유동 세포측정 분석을 도시한 것이다. 각각의 4분면 내에 양성 세포의 백분율을 나타내고, 이는 각각의 유전형의 5마리 마우스를 대표한다. 도 15D는 항-CD3 항체 단독 (좌측 패널) 또는 항-CD3 항체와 항-CD28 항체 모두에 노출된 야생형 및 relt -/- 마우스로부터의 정제된 T 세포 상의 [3H] -티미딘 혼입 분석의 결과를 도시하는 그래프이고, 이는 RELT가 T 세포 증식에 필수적이 아님을 입증한다.
도 16A-16G는 실시예 3(c)에 설명된 바와 같이, 면역원 시험 접종 (challenge) 시에 마우스에 의한 항체 서브타입 생산에 대한 마우스에서 relt를 파괴한 효과를 결정하기 위한 실험의 결과를 도시한 것이다.
도 17A-D는 실시예 3(d)에 설명된 바와 같이, 마우스에서 수지상 세포 집단에 대한 RELT 폐지의 효과를 결정하기 위한 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 17A는 10주령 야생형 및 relt -/- 마우스에서 비장 수지상 세포 하위세트에 대한 유동 세포측정 분석의 결과를 보여준다. 플롯은 총 비장 세포의 CD11c 염색 (좌측 패널), 또는 CD11c+ 세포를 선택하기 위해 전자적으로 게이팅한 후 CD11b 및 B220 염색 (우측 패널)을 나타낸다. 결과는 각각의 유전형의 10마리 마우스를 대표한다. 도 17B는 10마리 마우스의 각각의 군에서 pDC (CD11c+B220+CD11b-) 및 cDC (CD11c+B220-CD11b+)에 대한 평균±표준 편차를 둘 모두 총 세포수 및 백분율의 면에서 보여준다. 도 17C는 pDC 및 cDC 상에서 RELT 발현에 대한 유동 세포측정 분석의 결과를 보여준다. 각각의 그래프에서 최좌측 (굵은) 곡선은 대조 mAb에 의한 결합을 나타내는 반면, 최우측 곡선은 항-RELT 항체 H11에 의한 결합을 나타낸다. 도 17D는 야생형 (최좌측 곡선) 또는 relt -/- (최우측, 굵은 곡선) 마우스로부터의 CD11c+B220+ 세포에 대한 항-CD45RB, I-A, CD80, 또는 CD86 항체 결합의 유동 세포측정 분석의 결과를 도시한 것이다. 속이 채워진 막대표는 대조 항체에 대한 결합을 도시한 것이다.
도 18A 및 18B는 실시예 3(e)에 설명된 바와 같이, CD11c+MHC II- pDC 전구세포 집단 상의 RELT 파괴의 효과를 평가하기 위한 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 18A는 10-주령 야생형 및 relt -/- 마우스로부터의 말초혈의 유동 세포측정 분석의 결과를 도시한 것이다. 각각의 유전형의 10마리 마우스에서 CD11c+I-A- 세포의 평균 백분율±표준 편차를 나타낸다. 도 18b는 MHC II- DC 전구 세포 상에서 세포 표면 RELT 발현에 대한 유동 세포측정 분석의 결과를 도시한 것이다. 최좌측 (굵은) 곡선은 대조 항체의 결합을 나타내는 반면, 최우측 곡선은 항-RELT 항체 H11에 의한 결합을 나타낸다.
도 19는 실시예 4에 설명된 바와 같이, 야생형 및 relt -/- 세포 집단에 의한 IFN-α 생산을 평가하는 실험의 결과를 도시한 것이다. 도 19는 표시된 용량의 CpG-ODN과 함께 24시간 동안 배양한 10주령 야생형 및 relt -/- 마우스로부터 얻은 비장세포 (좌측 패널) 또는 정제된 pDC 및 cDC (우측 패널)로부터 IFN-α 생산을 보여준다. 값은 각각의 유전형의 7마리 마우스의 평균±표준 편차를 나타낸다.
도 20은 실시예 5에 설명된 바와 같이, 골수-유래된 세포 상에서 RELT 결실의 영향을 평가하는 실험의 결과를 도시한 것이다. 치사량 방사선 조사시킨 야생형 및 relt -/- 마우스에게 비처리 야생형 및 relt -/- 골수를 정맥내 주입하였다. 8주 후, 키메라 마우스로부터의 비장 및 혈액 세포를 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 데이타는 각각의 유전형의 7마리 마우스로부터 비장 pDC (CD11c+B220+CD11b-) 및 말초혈 MHC II- DC 전구 세포 (CD11c+I-A-)의 평균 백분율±표준 편차를 나타낸다.
일반적인 기술
본 발명의 실시에는 달리 나타내지 않으면 당업자가 알고 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 상기 기술은 예를 들어 문헌 (["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", third edition (Sambrook et al., 2001)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; ["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)]; ["Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994)]; [PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))]; [Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual]; ["A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988)]; 및 ["Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001)])에 상세하게 설명되어 있다.
<정의>
본원에서 사용될 때 용어 "림프 조직에서 발현되는 수용체" 및 "RELT"는 전장 RELT 폴리펩티드, 신호 서열이 제거된 RELT 폴리펩티드의 성숙 형태, 및 RELT 폴리펩티드의 가용형 형태를 포함하고 이로 제한되지 않는 RELT의 천연 및 합성 폴리펩티드의 모든 종으로서 정의된다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 항체는 (1) 예를 들어, 로우리 (Lowry) 방법에 의해 결정될 때 항체의 95 중량% 초과, 일부 실시태양에서 99 중량% 초과 수준까지, (2) 예를 들어, 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 예를 들어, 쿠마시 (Coomassie) 블루 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분도 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 사용될 때 용어 "항-RELT 항체"는 RELT에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 나타낸다.
본원에서 사용될 때 구문 "실질적으로 유사한", "실질적으로 동일한", "동등한", 또는 "실질적으로 동등한"은 당업자가 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 문맥 내에서 2개의 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계학적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주하도록 2개의 수치값 (예를 들어, 하나는 분자와 연관되고, 다른 하나는 참조/비교 분자와 연관된) 사이에 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서 예를 들어, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 및/또는 약 10% 미만이다.
본원에서 사용될 때 구문 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 당업자가 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 문맥 내에서 2개의 값 사이의 차이를 통계학적으로 유의한 것으로 간주하도록 2개의 수치값 (일반적으로 하나는 분자와 연관되고, 다른 하나는 참조/비교 분자와 연관된) 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서 예를 들어, 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 및/또는 약 50% 초과이다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 나타낸다. 달리 나타내지 않으면, 본원에서 사용될 때 "결합 친화도"는 결합쌍의 멤버 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화도를 나타낸다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)에 의해 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함한 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 쉽게 해리하는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 빠르게 결합하고 보다 오래 결합된 상태로 유지되는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시태양을 아래에 설명한다.
한 실시태양에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 하기 분석에서 설명되는 바와 같이 목적하는 항체의 Fab 버젼 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성 표지된 항원 결합 분석 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 (125I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화시킨 후, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 사용하여 결합된 항원을 포획함으로써 측정한다 (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol. 293 : 865-881). 분석 조건을 확립하기 위해, 미량역가 플레이트 (다이넥스 (Dynex))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 ㎍/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스 (Cappel Labs))로 밤새 코팅하고, 후속적으로 PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (약 23℃)에서 차단하였다. 비흡착 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 목적하는 Fab의 연속 희석액과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 목적하는 Fab를 밤새 인큐베이팅하지만, 평형이 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 65시간) 동안 계속 인큐베이팅할 수 있다. 그 후, 혼합물은 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이팅을 위해 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% Tween-20으로 8회 세척한다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 ㎕/웰의 섬광제 (scintillant) (MicroScint-20; 팩카드 (Packard))를 첨가하고, 플레이트를 Topcount 감마 계수기 (팩카드) 상에서 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도를 경쟁적 결합 분석에서 사용하기 위해 선택한다. 다른 실시태양에 따르면, Kd 또는 Kd 값은 10 이하의 응답 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (비아코아, 인크. (BIAcore, Inc., 미국 뉴저지주 피스카타웨이))를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용함으로써 측정한다. 간단히 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코아, 인크.)을 제조사의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 ㎍/ml(~0.2 μM)으로 희석한 후, 커플링된 단백질의 약 10 응답 단위 (RU)를 달성하도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원 주입 후에, 미반응기를 차단하기 위해 1M 에탄올아민을 주입한다. 운동학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 약 25 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 0.05% Tween 20을 갖는 PBS (PBST) 내에서 주입한다. 회합율 (kon) 및 해리율 (koff)은 회합 및 해리 센소그램을 동시 피팅함으로써 단순 일대일 랭그뮈어 (Langmuir) 결합 모델 (BIAcore 평가 소프트웨어 버젼 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비 koff/kon으로서 계산한다 (예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881] 참조). 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 106 M- ls-1을 초과하면, 온-레이트는 분광계, 예를 들어 정지 유동 설치 분광분석기 (아비브 인스트루먼츠 (Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 (써모스펙트로닉 (ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드 통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "회합율" 또는 "회합 속도" 또는 "kon"는 또한 10 이하의 응답 단위 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (비아코아, 인크.)를 사용하여 상기한 바와 동일한 표면 플라즈몬 공명 분석으로 결정할 수 있다. 간단히 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코아, 인크.)을 제조사의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)으로 5 ㎍/ml (~0.2 μM)로 희석한 후, 커플링된 단백질의 약 10 응답 단위 (RU)를 달성하도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원 주입 후에, 미반응기를 차단하기 위해 1M 에탄올아민을 주입한다. 운동학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 약 25 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 0.05% Tween 20을 갖는 PBS (PBST) 내에서 주입한다. 회합율 (kon) 및 해리율 (koff)은 회합 및 해리 센소그램을 동시 피팅함으로써 단순 일대일 랭그뮈어 결합 모델 (BIAcore 평가 소프트웨어 버젼 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비 koff/kon으로서 계산한다 (예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881] 참조). 그러나, 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 106 M- ls-1을 초과하면, 온-레이트는 분광계, 예를 들어 정지 유동 설치 분광분석기 (아비브 인스트루먼츠) 또는 교반 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 (써모스펙트로닉)에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드 통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
본원에서 사용될 때 용어 "벡터"는 그가 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 나타내도록 의도된다. 한 종류의 벡터는 그 내부에 추가의 DNA 세그먼트 (세그먼트)가 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 의미하는 "플라스미드"이다. 다른 종류의 벡터는 파지 벡터이다. 또다른 종류의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 그가 도입되는 숙주 세포 내에서 자동 복제할 수 있다 (예를 들어, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 그에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 그들이 작동적으로 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히 "재조합 벡터")로서 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태로 존재한다. 플라스미드는 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이므로, 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본원에서 상호교환가능하게 사용될 때 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 의미하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 포함될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화 뉴클레오티드 및 그들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에는 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 라벨 (label)로 컨쥬게이팅함으로써 합성 후에 추가로 변형될 수 있다. 다른 종류의 변형은 예를 들어, 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 "캡 (cap)" 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어, 전하를 띄지 않는 연결기 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등)로 및 전하를 띈 연결기 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형, 펜던트 모이어티 (moiety), 예를 들어, 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-라이신 등)을 함유하는 것, 인터컬레이터 (intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 솔라렌 등)을 갖는 것, 킬레이터 (chelator) (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)을 함유하는 것, 알킬레이터 (alkylator)를 함유하는 것, 변형 연결기 (예를 들어, 알파 아노머 (anomeric) 핵산 등)을 갖는 것과, 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형 형태를 포함한다. 또한, 당 내에 보통 존재하는 임의의 히드록실기는 예를 들어, 포스포네이트기, 인산기에 의해 교체되거나, 표준 보호기로 보호되거나, 추가의 뉴클레오티드에 대해 추가의 연결기를 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 고체 또는 반-고체 지지체에 컨쥬게이팅될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 아민 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑 (capping)기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 일반적으로 당업계에 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사형, 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 탄소환 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예를 들어 아라비노스, 자일로스 또는 라이속스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환상 유사체 및 염기성 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결기는 대체 연결기로 교체될 수 있다. 대체 연결기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 임의로 에테르 (-O-) 연결기를 함유하는 치환 또는 비치환 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알딜임)로 교체되는 실시태양을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결기가 동일할 필요는 없다. 상기 설명은 RNA 및 DNA를 포함한 본원에 인용된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에서 사용될 때 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 반드시는 아니지만, 일반적으로 길이가 약 200 뉴클레오티드 미만인 짧은, 일반적으로 단일가닥의, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배제되지 않는다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 설명은 올리고뉴클레오티드에 동등하고 충분히 적용가능하다.
"항체" (Ab)" 및 "면역글로불린" (Ig)은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 항체는 특이적 항원에 결합 특이성을 나타내지만, 면역글로불린은 항체, 및 일반적으로 항원 특이성이 결핍되는 다른 항체-유사 분자를 모두 포함한다. 후자의 종류의 폴리펩티드는 예를 들어, 림프계에 의해 낮은 수준으로, 골수종에 의해 증가된 수준으로 생산된다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 넓은 의미에서 상호교환가능하게 사용되고, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 1가, 다가 항체, 다중특이적 항체 (목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 예를 들어, 이중특이적 항체)를 포함하고, 또한 특정 항체 단편 (본원에서 보다 상세히 설명된 바와 같이)을 포함할 수 있다. 항체는 키메라, 인간, 인간화 및/또는 친화도 성숙 항체일 수 있다.
항체의 "가변 구역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 나타낸다. 상기 도메인은 일반적으로 항체의 최대 가변 부분이고, 항원 결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 사이에 서열에서 크게 상이함을 의미하고, 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 상보성 결정 구역 (CDR) 또는 초가변 구역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 (FR)로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은, 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된, 주로 베타-시트 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함한다. 각 사슬 내의 CDR은 FR 구역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (예를 들어 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed. National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 상이한 효과기 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포독성에서 항체의 참여를 나타낸다.
항체를 파파인 소화시키면 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편 (상기 명칭은 쉽게 결정화하는 그의 능력을 반영한다)을 생성시킨다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성시킨다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이중쇄 Fv종에서, 상기 구역은 강하게 비공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 단일쇄 Fv종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 이중쇄 Fv종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커 (linker)에 의해 공유 연결될 수 있다. 상기 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이지만 항원을 인식하여 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 구역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 수개의 잔기가 부가된다는 점에서 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 결합이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물종으로부터 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 명백하게 구분되는 종류 중 하나에 분류될 수 있다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (면역글로불린)는 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)]에 일반적으로 설명되어 있다. 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 상호 교환가능하게 사용되고, 아래에 정의된 항체 단편이 아닌 그의 실질적으로 무손상 형태의 항체를 의미한다. 상기 용어는 특히 Fc 구역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 의미한다.
"항체 단편"은 무손상 항체 내에 존재할 때 그 부분과 정상적으로 연관된 기능의 적어도 하나 및 대부분 또는 전부만큼 보유하는 무손상 항체의 일부만을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 다른 실시태양에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 구역을 포함하는 항체 단편은 무손상 항체 내에 존재할 때 Fc 구역과 정상적으로 연관되는 적어도 하나의 생물학적 기능, 예를 들어 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합을 보유한다. 한 실시태양에서, 항체 단편은 무손상 항체에 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 상기 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암 (arm)을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻은 항체를 나타내고, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 변경 표현 "모노클로날"은 별개의 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타낸다. 상기 모노클로날 항체는 대개 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서 표적-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 방법에 의해 수득하였다. 예를 들어, 선택 방법은 복수의 클론, 예를 들어 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 특유한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은 예를 들어, 표적에 대한 친화도를 개선시키고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양액에서 그의 생산을 개선시키고, 그의 생체 내 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 생성시키는 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임을 이해해야 한다. 대개 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 달리, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 그들의 특이성에 추가로, 모노클로날 항체 제제는 대개 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 점에서 유리하다. 변경 표현 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 것으로서 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 다양한 기술, 예를 들어, 하이브리도마 방법 (예를 들어, [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 ([Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1992)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)]) 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 로커스 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 인간 또는 인간-유사 항체를 동물에서 생산하기 위한 기술 (예를 들어, WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993)]; 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; [Marks et al., Bio.Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)] 참조)에 의해 제조할 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이면서 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 및 상기 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 4,816,567; 및 [Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).
비-인간 (예, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시태양에서, 인간화 항체는 수여자의 초가변 구역의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 구역의 잔기로 교체된 인간 면역글로불린 (수여 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 구역 (FR) 잔기가 대응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변경은 항체 성능을 더욱 개선하기 위한 것이다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 대개 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 초가변 루프에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 구역 (Fc), 대개 인간 면역글로불린의 Fc를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 ([Jones et al, Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)])을 참조한다. 또한, 다음 문헌과 여기에 언급된 문헌을 참고한다 ([Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; 및 [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]).
용어 "초가변 구역", "HVR", 또는 "HV"는 본원에서 사용될 때 서열에서 초가변이고/이거나 구조상 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 구역을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 구역; VH 내에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 많은 초가변 구역 묘사가 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 구역 (CDR)은 서열 변동성에 기초하고, 가장 흔히 사용된다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). 용어 "CDR" 앞의 문자 "HC" 및 "LC"는 각각 중쇄 및 경쇄의 CDR을 나타낸다. 코티아 (Chothia)는 그 대신 구조 루프의 위치를 나타낸다 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM 초가변 구역은 카바트 CDR과 코티아 구조 루프 사이의 절충안을 나타내고, Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용된다. "접촉 (contact)" 초가변 구역은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석에 기초한다. 각각의 상기 초가변 구역의 잔기를 아래에 나타낸다.
루프 카바트 AbM 코티아 접촉
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(카바트 번호)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(코티아 번호)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
초가변 구역은 다음과 같이 "연장된 초가변 구역"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 상기 정의에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 번호를 매긴다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 규정되는 초가변 구역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.
용어 "카바트에 따른 가변 도메인 잔기 번호" 또는 "카바트에 따른 아미노산 위치 번호" 및 그의 변형은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에서 항체 편집 (compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 번호 체계를 나타낸다. 상기 번호 체계를 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 그에 삽입에 대응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 후에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 후에 삽입된 잔기 (예를 들어 카바트에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 번호는 항체 서열의 상동성 구역을 "표준" 카바트 번호 매겨진 서열과 정렬시킴으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 상기 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬로 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성하도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대해서는, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디 (diabody)"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내고, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 페어링하여 2개의 항원 결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 상세히 기재되어 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본원에 개시된 인간 항체의 제조 기술 중 임의의 기술을 사용하여 제조된 항체이다. 인간 항체의 상기 정의는 특별히 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 제외한다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는 그의 하나 이상의 HVR에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시태양에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 과정에 의해 제조된다. 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에서는 VH 및 VL 도메인 셔플링 (shuffling)에 의한 친화도 성숙을 설명하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이 유발은 문헌 ([Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)])에 기재되어 있다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 특정 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
본원에서 사용될 때 "작용제 항체"는 목적하는 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능적 활성을 모방하는 항체이다.
"질환"은 본 발명의 항체를 사용하는 치료로부터 잇점을 얻는 임의의 병태이다. 질환은 포유동물을 문제되는 질환에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 상태를 포함하여 만성 및 급성 질환 또는 질병을 포함한다. 본원에서 치료될 질환의 비-제한적인 예는 감염, 세포 증식 질환, 면역/염증성 질환 (자가면역 질환을 포함하고 이로 제한되지 않음), 및 다른 인터페론-관련 질환을 포함한다.
용어 "감염"은 감염에 걸린 포유동물의 정상 생리학에 침입 또는 침범하는 하나 이상의 다른 유기체에 의해 유발된 질병을 나타낸다. 감염의 예는 바이러스 감염, 세균 감염, 기생충 감염 (예를 들어, 연충 (worm) 및 선충 (nematode)에 의해 유발되는 감염), 및 진균 감염을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
용어 "세포 증식 질환" 및 "증식 질환"은 일정 정도의 비정상적인 세포 증식과 연관된 질환을 나타낸다. 한 실시태양에서, 세포 증식 질환은 암이다. 용어 "암" 및 "암성"은 대개 상향조절된 세포 성장/증식 및 예를 들어, 종양 형성의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 (Hodgkin) 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 특정한 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포암, 위장관암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 직장결장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 질환, 및 다양한 종류의 두경부암을 포함한다. 세포 증식 질환은 또한 전백혈병성 (pre-leukemic) 질환, 예를 들어 골수 형성 이상 증후군 (MDS)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용될 때 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 나타낸다. 용어 "암", "암성", "세포 증식 질환", "증식성 질환" 및 "종양"은 본원에 언급된 바와 같이 상호 배타적이지 않다.
용어 "인터페론-관련 질환"은 대개 하나 이상의 인터페론의 비정상 양 또는 활성의 특징을 갖거나 그에 의해 기여되는 질환을 나타내거나 설명한다. 인터페론-관련 질환의 예는 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
용어 "염증성 질환" 및 "면역 질환"은 비정상 면역학 메카니즘 및/또는 비정상 시토킨 신호 전달 (예를 들어, 비정상 인터페론 신호 전달)에 의해 유발되는 질환을 나타내거나 설명한다. 염증성 및 면역 질환의 예는 자가면역 질병, 면역 결핍 증후군 및 과민증을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본원에서 "자가면역 질병"은 개체 자신의 조직으로부터 발생하고 그에 대해 작용하는 비-악성 질병 또는 질환이다. 본원에서 자가면역 질병은 특별히 악성 또는 암성 질병 또는 병태를 제외하고, 특히 B 세포 림프종, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모(hairy)세포 백혈병 및 만성 골수모세포성 백혈병을 제외한다. 자가면역 질병 또는 질환의 예는 염증 반응, 예를 들어 염증성 피부 질병, 예를 들어 건선 및 피부염 (예를 들어, 아토피 피부염); 전신 피부경화증 및 경화증; 염증성 대장 질병과 연관된 반응 (예를 들어, 크론 (Crohn)병 및 궤양성 대장염); 호흡 곤란 증후군 (예를 들어, 성인 호흡 곤란 증후군; ARDS); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 대장염; 사구체신염; 알레르기 병태, 예를 들어 습진 및 천식, 및 T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 포함하는 다른 병태; 죽상경화증; 백혈구 부착 결핍증; 류마티스 관절염; 전신 홍반성 루푸스 (SLE) (루푸스 신장염, 피부 루푸스를 포함하고 이로 제한되지 않음); 당뇨병 (예를 들어, I형 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발 경화증; 레이노드 (Reynaud) 증후군; 자가면역 갑상선염; 하시모토 (Hashimoto) 갑상선염; 알레르기 뇌척수염; 쇼그렌 (Sjogren) 증후군; 유년기 발병 당뇨병; 및 대개 결핵, 사코이드증, 다발근육염, 육아종증 및 혈관염에서 발견되는 시토킨 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연된 과민증과 연관된 면역 반응; 악성 빈혈 (애디슨 (Addison)병); 백혈구 누출을 포함하는 질병; 중추신경계 (CNS) 염증성 질환; 다발 장기 손상 증후군; 용혈성 빈혈 (크리오글로빈혈증 또는 쿰스 (Coombs) 양성 빈혈을 포함하고 이로 제한되지 않음); 중증 근육무력증; 항원-항체 복합체 매개 질병; 항-사구체 기저막 질병; 항인지질 증후군; 알레르기 신경염; 그레이브스 (Graves) 질병; 램버트-이튼 (Lambert-Eaton) 근무력증 증후군; 수포성 유천포창; 천포창; 자가면역 다발내분비장애; 라이터 (Reiter) 질병; 근육강직 증후군; 베체트 (Behcet) 질병; 거대세포 동맥염; 면역 복합체 신장염; IgA 신장병증; IgM 다발신경병증; 면역 혈소판감소성 자색반증 (ITP) 또는 자가면역 혈소판감소증 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
면역 결핍 증후군의 예는 모세혈관 확장성 조화운동불능, 백혈구 부착 결핍 증후군, 림프구 감소증, 이상 감마글로불린혈증, HIV 또는 델타레트로바이러스 감염, 공통 가변성 면역결핍증, 중증 혼합 면역결핍증, 포식세포 살균 기능이상, 무감마글로불린혈증, 디조지 (DiGeorge) 증후군, 및 비스코트-알드리히 (Wiskott-Aldrich) 증후군을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 과민증의 예는 알레르기, 천식, 피부염, 두드러기, 아나필락시스, 위슬러 (Wissler) 증후군, 및 혈소판감소성 자색반증을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "치료"는 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경시키려는 임상 시술을 나타내고, 임상 병리학의 예방을 위해 또는 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질병의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학 결과의 감소, 염증 및/또는 조직/장기 손상의 억제 또는 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 호전, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 질병 또는 질환의 발생을 지연시키기 위해 사용된다.
"개체"는 척추동물이다. 특정 실시태양에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물은 농장 동물 (예를 들어 소), 스포츠 동물, 애완동물 (예를 들어 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 래트를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 척추동물은 인간이다.
치료를 목적으로 하는 "포유동물"은 포유동물로서 분류되는 임의의 동물, 예를 들어 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소 등을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 포유동물은 인간이다.
"유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 효과적인 양을 의미한다.
본 발명의 물질/분자의 "치료 유효량"은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 물질/분자의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 또한, 치료 유효량은 물질/분자의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 치료상 유익한 효과가 능가하는 양이다. "예방 유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적하는 예방 결과를 달성하기 위해 효과적인 양을 나타낸다. 반드시는 아니지만 대개, 예방 용량은 질병의 보다 초기 단계에 앞서, 또는 보다 초기 단계에서 대상에서 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 제한하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 나타낸다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At211, Il31, Il25, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학치료제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제 (intercalating agent), 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산 분해 효소, 항생제, 및 독소, 예를 들어 소분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 및 그의 단편 및/또는 변이체, 및 아래에 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하고자 한다. 다른 세포독성제는 아래에 기재된다. 살종양제는 종양 세포를 파괴한다.
"화학치료제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 CYTOXAN(등록상표) 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트, 예를 들어 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, MARINOL(등록상표)); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 부툴린산; 캄포테신 (예를 들어 합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTIN(등록상표)); CPT-11 (이로노테칸, CAMPTOSAR(등록상표)), 아세틸캄토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (예를 들어 그의 아도제레신, 카르제레신 및 비제레신 합성 유사체); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (예를 들어 합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1); 에류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타이인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레틸아민 옥시드 염산염, 멜파란, 노벤비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 에네디와인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마I1 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 (chromophore) 및 관련 발색단백질 에네디와인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우쓰라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN(등록상표) 독소루비신 (예를 들어 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신, 항-대사체, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플로스우리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테치미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프로리닌산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토잔트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소잔트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(등록상표) 다당체 복합체 (제이에이치에스 내쳐럴 프로덕츠 (JHS Natural Products, 미국 오레곤주 유진)); 로족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE(등록상표), FILDESIN(등록상표)); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, TAXOL(등록상표) 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지 (Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지주 프린스톤)), ABRAXANE(등록상표) 크레모포르-프리 (Cremophor-free), 파클리탁셀의 알부민-처리된 나노입자 제제 (아메리칸 파마슈티칼 파트너스 (American Pharmaceutical Partners, 미국 일리노이주 샤윰버그)), 및 TAXOTERE(등록상표) 독세탁셀 (롱-프랑 로라 (Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니)); 클로람부실; 겜시타빈 (GEMZAR(등록상표)); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN(등록상표)); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토잔트론; 빈크리스틴 (ONCOVIN(등록상표)); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (NAVELBINE(등록상표)); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노산; 카페시타빈 (XELODA(등록상표)); 및 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체 및 2개 이상의 상기 물질의 조합물, 예를 들어 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 플레드니솔론의 조합 요법의 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보빈과 조합한 옥살리플라틴 (ELOXATINTM)을 사용한 치료의 약어)를 포함한다.
또한, 상기 정의에는 암의 성장을 촉진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하고, 종종 전신 또는 신체 전체 치료 형태로 사용되는 항호르몬제가 포함된다. 이들은 호르몬 자체일 수 있다. 그 예는 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (예를 들어 NOLVADEX(등록상표) 타목시펜), EVISTA(등록상표) 랄록시펜, 드로록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 FARESTON(등록상표) 토레미펜; 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향조절제 (ERD); 난소를 억제하거나 기능을 차단하는 물질, 예를 들어, 황체화 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 작용제, 예를 들어 LUPRON(등록상표) 및 ELIGARD(등록상표) 류프롤리드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 다른 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신선에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테치미드, MEGASE(등록상표) 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN(등록상표) 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, RIVISOR(등록상표) 보로졸, FEMARAO(등록상표) 레트로졸, 및 ARIMIDEX(등록상표) 아나스트로졸을 포함한다. 또한, 상기 화학치료제의 정의에는 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트 (예를 들어, BONEFOS(등록상표) 또는 OSTAC(등록상표)), DIDROCAL (등록상표) 에티드로네이트, NE-58095, ZOMETA(등록상표) 졸레드론산/졸레드로네이트, FOSAMAX(등록상표) 알렌드로네이트, AREDIA(등록상표) 팔미드로네이트, SKELID(등록상표) 틸루드로네이트, 또는 ACTONEL(등록상표) 리세드로네이트; 및 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 부착성 세포 증식에 연관되는 신호 전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예를 들어 THERATOPE (등록상표) 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN(등록상표) 백신, LEUVECTIN(등록상표) 백신, 및 VAXID(등록상표) 백신; LURTOTECAN(등록상표) 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX(등록상표) rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (ErbB-2 및 GW572016로도 알려진 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); 및 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
조성물 및 그의 제조 방법
본 발명은 RELT에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 서열 42-49의 서열을 포함하는 HVR-H1 구역을 포함하는 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 서열 51-58의 서열을 포함하는 HVR-H2 구역을 포함하는 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 서열 60-67의 서열을 포함하는 HVR-H3 구역을 포함하는 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 서열 42-49의 서열을 포함하는 HVR-H1 구역, 및 적어도 하나의 서열 51-58의 서열을 포함하는 HVR-H2 구역을 포함하는 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 서열 60-67의 서열을 포함하는 HVR-H3 구역을 포함하는 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 서열 42-49의 서열을 포함하는 HVR-H1 구역, 및 적어도 하나의 서열 60-67의 서열을 포함하는 HVR-H3 구역을 포함하는 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 서열 51-58의 서열을 포함하는 HVR-H2 구역, 및 적어도 하나의 서열 60-67의 서열을 포함하는 HVR-H3 구역을 포함하는 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 다음 중 적어도 하나, 적어도 2개, 또는 적어도 2개를 포함하는 항체를 제공한다:
i. 서열 42-49의 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H1 서열;
ii. 서열 51-58의 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H2 서열;
iii. 서열 60-67의 적어도 하나의 서열을 포함하는 HVR-H3 서열.
서열 42-49, 51-58, 및 60-67의 아미노산 서열은 도 5A 및 5B에 표시된 바와 같이 개별 HVR (즉, H1, H2, H3)에 관하여 번호를 매기고, 번호 매김은 하기 설명되는 카바트 번호 체계에 따른다. 한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 상기 (i)-(iii)의 HVR 서열 중 하나, 2 또는 3개, 및 서열 1 또는 2에 설명된 경쇄 초가변 구역을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 도 5A 및 5B에 도시된 중쇄 HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 1 또는 2에 도시된 경쇄 HVR 서열을 추가로 포함한다.
본 발명의 항체의 일부 실시태양은 하기 서열 1에 도시된 인간화 4D5 항체 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN(등록상표), 제넨테크, 인크. (Genentech, Inc., 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코))의 경쇄 가변 도메인을 포함한다 (또한 미국 특허 6,407,213 및 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93] 참조).
Figure 112008057209083-PCT00001
한 실시태양에서, huMAb4D5-8 경쇄 가변 도메인 서열은 위치 30, 66 및 91의 하나 이상에서 변형된다 (각각 상기 굵은/이탤릭체로 표시한 Asn, Arg 및 His). 한 실시태양에서, 변형 huMAb4D5-8 서열은 위치 30에서 Ser, 위치 66에서 Gly 및/또는 위치 91에서 Ser을 포함한다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 하기 서열 2에 도시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다:
Figure 112008057209083-PCT00002
huMAb4D5-8에 관하여 치환된 잔기는 상기 굵은/이탤릭체로 표시한다.
본 발명의 항체는 RELT에 대한 결합 활성이 실질적으로 보유된다면, 임의의 적합한 프레임워크 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 인간 하위군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다. 상기 항체의 한 실시태양에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에서 치환을 포함한다. 상기 항체의 일부 실시태양에서, 위치 71은 A이고/이거나, 73은 T이고/이거나 78은 A이다. 한 실시태양에서, 상기 항체는 huMAb4D5-8 (HERCEPTIN(등록상표), 제넨테크, 인크.)의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함한다 (또한 미국 특허 6,407,213 & 5,821,337 및 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93] 참조). 한 실시태양에서, 상기 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 상기 항체는 미국 특허 6,407,213 & 5,821,337에 설명된 바와 같이 huMAb4D5-8의 경쇄 HVR 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 상기 항체는 huMAb4D5-8 (서열 1 및 2) (HERCEPTIN(등록상표), 제넨테크, 인크.)의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다 (또한 미국 특허 6,407,213 & 5,821,337 및 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93] 참조).
한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 프레임워크 서열은 적어도 하나의 서열 3-21, 30-33, 38-41, 및 73-129의 서열을 포함하고, HVR H1, H2 및 H3 서열은 각각 서열 42-50, 51-59, 및 60-68의 적어도 하나로부터 선택된다. 한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 프레임워크 서열은 적어도 하나의 서열 22-25, 26-29, 34-37, 및 130-141의 서열을 포함하고, 초가변 구역은 서열 1 및 2 중에서 선택된다.
한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 프레임워크 서열은 서열 3-21 및 73-129의 적어도 하나의 서열을 포함하고, HVR H1, H2 및 H3 서열은 각각 서열 49, 58, 및 67이다 (클론 H11). 이와 유사하게, 다른 실시태양에서, 각각의 클론 C21, C10, E5/E7, F4, F5, H7, 및 H9의 항체는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 프레임워크 서열을 서열 3-21 및 73-129의 적어도 하나의 서열을 포함하고, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3 서열은 도 5A 및 5B에서 각각의 클론 또는 Fab에 대해 구체적으로 열거한 서열이다.
한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 목적하는 표적 결합 친화도를 얻도록 친화도 성숙된다.
한 측면에서, 본 발명은 RELT에 대한 결합에 대해 상기 언급된 임의의 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 임의의 항체와 RELT 상의 동일한 항원 결정자에 결합하는 항체를 제공한다.
적어도 하나의 항-RELT 항체, 또는 항-RELT 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시태양에서, 조성물은 제약 조성물일 수 있다. 본원에서 사용될 때, 조성물은 RELT에 결합하는 하나 이상의 항체, 및/또는 RELT에 결합하는 하나 이상의 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 조성물은 적합한 담체, 예를 들어 버퍼를 포함한 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있고, 이는 당업계에 잘 공지되어 있다.
단리된 항체 및 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다. 특정 실시태양에서, 단리된 항체 및 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수하다.
한 실시태양에서, 항-RELT 항체는 모노클로날이다. 다른 실시태양에서, 항-RELT 항체의 단편 (예를 들어, Fab, Fab'-SH 및 F(ab')2 단편)을 제공한다. 상기 항체 단편은 전통적인 수단, 예를 들어 효소 소화에 의해 생성될 수 있거나, 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 상기 항체 단편은 키메라, 인간화, 또는 인간 항체 단편일 수 있다. 상기 단편은 하기 설명된 진단 및 치료 목적에 유용하다.
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하는 항- RELT 항체의 생성
그로부터 목적하는 항체를 수득할 수 있는 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 목적하는 항체를 생성하는 하나의 방법은 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93]에 설명된 바와 같이 파지 항체 라이브러리를 사용하는 것이다.
본 발명의 항-RELT 항체는 목적하는 활성(들)을 갖는 합성 항체 클론을 스크리닝하기 위해 조합 라이브러리를 사용함으로써 제조할 수 있다. 원칙적으로, 합성 항체 클론은 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 구역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택된다. 상기 파지 라이브러리는 목적하는 항원에 대하여 친화도 크로마토그래피에 의해 선택된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되어, 라이브러리 내의 비-결합 클론으로부터 분리된다. 이어서, 결합 클론은 항원으로부터 용출되고, 추가의 사이클의 항원 흡착/용출에 의해 더욱 풍부해질 수 있다. 본 발명의 임의의 항-RELT 항체는 목적하는 파지 클론에 대해 스크리닝하기 위해 적합한 항원 스크리닝 과정을 설계한 후, 목적하는 파지 클론으로부터 Fv 서열 및 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에 설명된 적합한 불변 구역 (Fc) 서열을 사용하여 전장 항-RELT 항체 클론을 구성함으로써 얻을 수 있다.
항체의 항원 결합 도메인은 3개의 초가변 루프 또는 상보성 결정 구역 (CDR)을 제시하는 약 110 아미노산의 2개의 가변 (V) 구역 (각각 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)로부터 하나씩)으로부터 형성된다. 가변 도메인은 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994)]에 설명된 바와 같이 단일쇄 Fv (scFv) 단편으로서 (여기서, VH 및 VL은 짧은 가요성 펩티드를 통해 공유 연결된다), 또는 Fab 단편으로서 (여기서, 이들을 각각 불변 도메인에 융합되고, 비공유 상호작용한다) 파지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있다. 본원에서 사용될 때, scFv 코딩 파지 클론 및 Fab 코딩 파지 클론은 종합적으로 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로서 불린다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994)]에 설명된 바와 같이 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 따로 클로닝되고, 파지 라이브러리 내에 무작위로 재조합될 수 있고, 이어서 이는 항원 결합 클론에 대해 탐색될 수 있다. 면역화 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 제작할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 별법으로, 문헌 [Griffiths et al, EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 설명된 바와 같이, 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또는 자가 항원에 대해 단일 인간 항체 원료를 제공하기 위해, 나이브 레퍼토리가 클로닝될 수 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 또한 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992)]에 설명된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 세그먼트를 클로닝하고, 고도 가변 CDR3 구역을 코딩하기 위해 및 시험관 내 재배열을 달성하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써 합성적으로 제조될 수 있다.
섬유형 (filamentous) 파지는 부 코트 단백질 pIII에 대한 융합에 의해 항체 단편을 디스플레이하기 위해 사용된다. 항체 단편은 단일쇄 Fv 단편으로서 (여기서, VH 및 VL 도메인은 예를 들어 문헌 [Marks et ah, J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991)]에 설명된 바와 같이 가요성 폴리펩티드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩티드 사슬 상에서 연결된다), 또는 Fab 단편으로서 (여기서, 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al , Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)]에 설명된 바와 같이 하나의 사슬은 pIII에 융합되고, 다른 사슬은 세균 숙주 세포 원형질막 공간 내로 분비되고, 여기서 Fab-코트 단백질 구조의 조립체가 야생형 코트 단백질의 일부를 치환함으로써 파지 표면 상에 디스플레이된다) 디스플레이될 수 있다.
일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수집한 면역 세포로부터 얻어진다. 항-RELT 클론에 유리하게 편향된 라이브러리가 요망되는 경우, 대상을 항체 반응을 생성하도록 RELT로 면역화시키고, 비장 세포 및/또는 순환 B 세포 또는 다른 말초혈 림프구 (PBL)를 라이브러리 제작을 위해 회수한다. 한 실시태양에서, 항-인간 RELT 클론에 유리하게 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 RELT 면역화가 RELT에 대항한 B 세포 생산 인간 항체를 초래하도록 기능적 인간 면역글로불린 유전자 어레이를 갖는 (기능적 내인성 항체 생산 시스템이 결핍된) 트랜스제닉 (transgenic) 마우스에서 항-인간 RELT 항체 반응을 생성함으로써 얻어진다. 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스의 생성은 아래에 섹션 (III)(b)에 설명되어 있다.
항-RELT 반응성 세포 집단에 대한 추가의 농축은 예를 들어, RELT 친화도 크로마토그래피 또는 플루오로크롬-표지된 RELT에 대한 세포의 흡착 후 유동-활성화된 세포 분류 (FACS)를 사용하는 세포 분리에 의해 RELT-특이적 막 결합 항체를 발현하는 B 세포를 단리하기 위해 적합한 스크리닝 과정을 사용함으로써 얻을 수 있다.
별법으로, 비면역화 공여체로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL의 사용은 가능한 항체 레퍼토리의 보다 우수한 표현을 제공하고, 또한 RELT가 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간) 종을 사용하여 항체 라이브러리의 제작을 허용한다. 시험관 내 항체 유전자 제작을 포함하는 라이브러리를 위해, 재배열되지 않은 항체 유전자 세그먼트를 코딩하는 핵산을 제공하기 위해 줄기 세포를 대상으로부터 수집한다. 목적하는 면역 세포는 다양한 동물 종, 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 토끼, 늑대, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 및 새 종 등으로부터 얻을 수 있다.
항체 가변 유전자 세그먼트 (예를 들어 VH 및 VL 세그먼트)를 코딩하는 핵산을 해당 세포로부터 회수하고 증폭시킨다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우에, 목적하는 DNA는 림프구로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 단리한 후, 문헌 [Orlandi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)]에 설명된 바와 같이 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단을 매칭시키는 프라이머를 사용하여 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리를 제조하는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 얻을 수 있다. V 유전자는 문헌 ([Orlandi et al (1989)] 및 [Ward et al, Nature, 341: 544-546 (1989)]에 설명된 바와 같이, 성숙 V-도메인을 코딩하는 엑손의 5' 말단에서 역방향 프라이머 및 J-세그먼트 내에 기반한 정방향 프라이머를 사용하여 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다. 그러나, cDNA로부터 증폭시키기 위해, 역방향 프라이머가 또한 문헌 [Jones et al, Biotechnol, 9: 88-89 (1991)에 설명된 바와 같이 리더 (leader) 엑손에 기반할 수 있고, 정방향 프라이머는 문헌 [Sastry et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)에 설명된 바와 같이 불변 구역 내에 기반할 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 문헌 ([Orlandi et al. (1989)] 또는 [Sastry et al. (1989)])에 설명된 바와 같이 다의성 (degeneracy)을 프라이머 내에 포함시킬 수 있다. 특정 실시태양에서, 라이브러리 다양성은 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991)]의 방법 또는 문헌 [Orum et al, Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 설명된 바와 같이 면역 세포 핵산 샘플 내에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 배열을 증폭하기 위해 각각의 V-유전자 패밀리에 표적화된 PCR 프라이머를 사용함으로써 최대화된다. 증폭된 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해, 희귀 (rare) 제한 부위가 문헌 [Orlandi et al. (1989)]에 설명된 바와 같이 한 단부에서 태그 (tag)로서, 또는 문헌 [Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991)]에 설명된 바와 같이 태깅된 프라이머를 사용하는 추가의 PCR 증폭에 의해 PCR 프라이머 내에 도입될 수 있다.
합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리는 V 유전자 세그먼트로부터 시험관 내에서 유도될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 세그먼트는 클로닝되고 서열결정되고 (문헌 [Tomlinson et al, J. Mol. Biol, 227: 776-798 (1992)]에 보고됨), 맵핑되었고 (문헌 [Matsuda et al, Nature Genet., 3: 88-94 (1993)]에 보고됨); 상기 클로닝된 세그먼트 (H1 및 H2 루프의 주요 배위를 모두 포함함)는 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992)]에 설명된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 코딩하는 PCR 프라이머를 사용하여 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. VH 레퍼토리는 또한 문헌 [Barbas et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 설명된 바와 같이 단일 길이의 긴 H3 루프에 집중된 모든 서열 다양성을 갖도록 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 세그먼트는 클로닝되고 서열결정되었고 (문헌 [Williams and Winter, Eur. J. Immunol, 23: 1456-1461 (1993)에 보고됨), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 합성 V 유전자 레퍼토리 (VH 및 VL 폴드 (fold)의 범위, 및 L3 및 H3 길이에 기반하는)는 상당히 구조적으로 다양한 항체를 코딩할 것이다. V-유전자 코딩 DN의 증폭 후, 생식선 V-유전자 세그먼트는 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관 내에서 재배열될 수 있다.
항체 단편의 레퍼토리는 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 몇 가지 방식으로 함께 결합함으로써 제작될 수 있다. 각각의 레퍼토리는 상이한 벡터 내에 생성될 수 있고, 벡터는 예를 들어, 문헌 [Hogrefe et al, Gene, 128: 119-126 (1993)]에 설명된 바와 같이 시험관 내에서, 또는 조합 감염, 예를 들어, 문헌 [Waterhouse et al, Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993))에 설명된 loxP 시스템에 의해 생체 내에서 재조합될 수 있다. 생체내 재조합 방안은 이. 콜라이 (E. coli) 형질전환 효율에 의해 부과된 라이브러리 크기의 제한을 극복하기 위해 Fab 단편의 2-사슬 특성을 활용한다. 나이브 VH 및 VL 레퍼토리는 하나는 파지미드 내로, 다른 하나는 파지 벡터 내로 따로 클로닝된다. 이어서, 2개의 라이브러리는 파지미드-함유 세균의 파지 감염에 의해 결합되어, 각각의 세포는 상이한 조합을 함유하고, 라이브러리 크기는 존재하는 세포의 수에 의해서만 제한된다 (약 1012 클론). 두 벡터는 생체내 재조합 시그널을 함유하여, VH 및 VL 유전자는 단일 레플리콘 상으로 재조합되고, 파지 비리온 내로 동시에 패키징된다. 상기 큰 라이브러리는 우수한 친화도 (Kd -1 약 10-8 M)의 다수의 다양한 항체를 제공한다.
별법으로, 레퍼토리들은 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 설명된 바와 같이 동일한 벡터 내로 순차적으로 클로닝되거나, 예를 들어 문헌 [Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991)]에 설명된 바와 같이 PCR에 의해 함께 조립된 후 클로닝될 수 있다. PCR 조립은 또한 VH 및 VL DNA을 가요성 펩티드 스페이서를 코딩하는 DNA와 연결시켜 단일쇄 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 다른 기술에서, 문헌 [Embleton et al, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)]에 설명된 바와 같이 "세포내 PCR 조립"이 VH 및 VL 유전자를 림프구 내에서 PCR에 의해 결합시킨 후, 연결된 유전자의 레퍼토리를 클로닝하기 위해 사용된다.
라이브러리의 스크리닝은 당업계에 공지된 임의의 기술로 달성할 수 있다. 예를 들어, RELT는 흡착 플레이트의 웰을 코팅하기 위해 사용되거나, 흡착 플레이트에 고정된 숙주 세포 상에서 발현되거나, 세포 분류에서 사용되거나, 스트렙타비딘-코팅된 비드로 포획하기 위해 비오틴에 컨쥬게이팅되거나, 파지 디스플레이 라이브러리를 선택하기 위한 임의의 다른 당업계에 공지된 방법에서 사용될 수 있다.
파지 라이브러리 샘플을 파지 입자의 적어도 일부를 흡착제와 결합시키기 위해 적합한 조건 하에 고정된 RELT와 접촉시킨다. 보통, pH, 이온 강도, 온도 등을 포함하는 조건은 생리학적 조건을 모방하도록 선택된다. 고체상에 결합된 파지를 세척한 후, 예를 들어 문헌 [Barbas et al, Proc. Natl Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 설명된 바와 같이 산으로, 또는 예를 들어 문헌 [Marks et al, J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991)]에 설명된 바와 같이 알칼리로, 또는 예를 들어 문헌 [Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법과 유사한 과정으로 RELT 항원 경쟁에 의해 용출시킨다. 파지는 단일 선택 라운드에서 20-1,000배 농축될 수 있다. 또한, 농축된 파지를 세균 배양액에서 성장시키고, 추가의 선택 라운드로 실행시킬 수 있다.
선택의 효율은 세척 동안 해리 운동학, 및 단일 파지 상에서 다수 항체 단편이 항원과 동시에 결합할 수 있는지 여부를 포함한 많은 요인에 좌우된다. 빠른 해리 운동학 (및 약한 결합 친화도)를 갖는 항체는 짧은 세척, 다가 파지 디스플레이 및 고체상에서 높은 코팅 밀도의 항원을 사용하여 보유될 수 있다. 높은 밀도는 다가 상호작용을 통해 파지를 안정화시킬 뿐만 아니라, 해리된 파지의 재결합에 유리하다. 느린 해리 운동학 (및 우수한 결합 친화도)를 갖는 항체의 선택은 문헌 [Bass et al, Proteins, 8: 309-314 (1990)]과 WO 92/09690에 설명된 바와 같이 오랜 세척 및 1가 파지 디스플레이, 및 문헌 [Marks et al, Biotechnol, 10: 779-783 (1992)]에 설명된 바와 같이 낮은 코팅 밀도의 항원을 사용하여 촉진될 수 있다.
상이한 친화도의, 심지어 RELT에 대해 근소하게 상이한 친화도를 갖는 파지 항체 사이를 선택하는 것이 가능하다. 그러나, 선택된 항체 (예를 들어 상기 설명된 일부 친화도 성숙 기술에서 수행된 바와 같이)의 무작위 돌연변이는 항원에 가장 강하게 결합하고, 몇몇은 보다 고친화도를 갖는 많은 돌연변이체를 초래하는 경향이 있다. RELT를 제한하면, 드문 고 친화도 파지가 경쟁에 의해 제거될 수 있다. 보다 고친화도 돌연변이체를 모두 보유하기 위해, 파지는 과잉의 비오티닐화 RELT와 함께 인큐베이팅될 수 있지만, 비오티닐화 RELT는 RELT에 대한 표적 몰 친화도 상수보다 더 낮은 몰농도의 농도로 사용된다. 이어서, 고 친화도-결합 파지는 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드에 의해 포획될 수 있다. 상기 "평형 포획"으로 항체는 그들의 결합 친화도에 따라 선택될 수 있고, 그의 민감도는 보다 낮은 친화도를 갖는 매우 과잉의 파지로부터 2배 정도로 적은 더 높은 친화도를 갖는 돌연변이체 클론의 단리를 허용한다. 고체상에 결합된 파지를 세척하는데 사용되는 조건은 또한 해리 운동학에 기초하여 식별하기 위해 조작될 수 있다.
항-RELT 클론은 활성 선택될 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명은 생체 내 투여될 때 또는 시험관 내에서 MHC II- DC 전구 세포 배양액에 첨가될 때 cDC에 비해 pDC의 생산을 증가시키는 항-RELT 항체를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 생체 내 투여될 때 IFN-α의 혈청 농도를 증가시키거나, 시험관 내에서 MHC II- DC 전구 세포 배양액에 첨가될 때 IFN-α 분비를 증가시키는 항-RELT 항체를 제공한다. 상기 항-RELT 항체에 대응하는 Fv 클론은 (1) 상기 섹션 B(I)(2)에 설명된 파지 라이브러리로부터 항-RELT 클론을 단리하고, 임의로 파지 클론의 단리된 집단을 적합한 세균 숙주에서 집단을 성장시킴으로써 증폭시키고; (2) 각각 차단 및 비-차단 활성이 요망되는 RELT 및 제2 단백질을 선택하고; (3) 항-RELT 파지 클론을 고정된 RELT에 흡착시키고; (4) 과잉의 제2 단백질을 사용하여 제2 단백질의 결합 결정자와 겹치고/겹치거나 공유하는 RELT-결합 결정자를 인식하는 임의의 바람직하지 않은 클론을 용출시키고; (5) 단계 (4) 이후에 흡착되어 남아있는 클론을 용출시킴으로써 선택될 수 있다. 임의로, 목적하는 차단/비-차단 특성을 갖는 클론은 본원에 설명된 선택 과정을 1회 이상 반복함으로써 추가로 농축될 수 있다.
본 발명의 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 통상적인 과정을 이용하여 (예를 들어, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 해당 중쇄 및 경쇄 코딩 구역을 특이적으로 증폭시키도록 고안된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열결정된다. 일단 단리된 후, DNA는 발현 벡터 내로 넣어질 수 있고, 이어서 이는 재조합 숙주 세포에서 목적하는 모노클로날 항체의 합성을 얻기 위해 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염된다. 항체-코딩 DNA의 세균에서 재조합 발현에 관한 문헌은 문헌 ([Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993)] 및 [Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)])을 포함한다.
본 발명의 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 구역을 코딩하는 공지의 DNA 서열 (예를 들어, 적절한 DNA 서열은 문헌 [Kabat et al. 상기 문헌]으로부터 얻을 수 있다)과 결합되어, 전체 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 클론을 형성할 수 있다. 임의의 이소형의 불변 구역, 예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 구역이 상기 목적에 사용될 수 있고, 상기 불변 구역은 임의의 인간 또는 동물종으로부터 얻을 수 있음이 이해될 것이다. 하나의 동물 (예를 들어 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래된 후, 다른 동물종의 불변 구역 DNA에 융합되어 "하이브리드," 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 위한 코딩 서열(들)을 형성하는 Fv 클론은 본원에 설명된 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 한 실시태양에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 인간 불변 구역 DNA에 융합되어 모든 인간, 전체 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한다.
나이브 라이브러리 (천연 또는 합성의)에 의해 생산된 항체는 중등도 친화도 (Kd -1 약 106 내지 107 M-1)의 것일 수 있지만, 친화도 성숙은 또한 문헌 [Winter et al (1994), 상기 문헌]에 설명된 바와 같이 2차 라이브러리를 제작하고 그로부터 재선택함으로써 시험관 내에서 모방될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 문헌 [Hawkins et al, J. Mol. Biol, 226: 889-896 (1992)]의 방법 또는 문헌 [Gram et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서 오류-허용 (error-prone) 중합효소 (문헌 [Leung et al, Technique, 1: 11-15 (1989)]에 보고된)를 사용함으로써 시험관 내에서 무작위로 도입될 수 있다. 추가로, 친화도 성숙은 예를 들어 선택된 개별 Fv 클론에서 해당 CDR에 이르는 무작위 서열을 갖는 프라이머를 사용하는 PCR을 이용하여 하나 이상의 CDR을 무작위 돌연변이시키고, 보다 고친화도 클론을 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. WO 9607754 (1996년 3월 14일 공개)에서는 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하기 위해 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 구역에서 돌연변이 유발 방법을 설명한다. 다른 효과적인 방안은 비면역화 공여체로부터 얻은 자연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리를 사용하는 파지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고, 문헌 [Marks et al, Biotechnol, 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 수회의 사슬 재셔플링으로 보다 고친화도에 대해 스크리닝하는 것이다. 상기 기술을 통해 친화도가 10-9 M 범위인 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다.
항- RELT 항체를 생성하는 다른 방법
항체를 생성하여 그의 친화도를 평가하는 다른 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 ([Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)]; 미국 특허 4,816,567; [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]; [Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; [Munson et al, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]; [Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl, 28: 716-734 (1989)]; [Abrahmsen et al, EMBO J., 4: 3901 (1985)]; [Methods in Enzymology, vol. 44 (1976)]; [Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]에 설명되어 있다.
일반적인 방법
일반적으로, 본 발명은 하나 이상의 RELT 활성의 부분적 또는 전체적 차단이 요구되는 RELT-매개 질환의 치료를 위해 유용한 항-RELT 항체를 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명의 항-RELT 항체는 세포 증식 질환의 치료에 사용된다. 다른 실시태양에서, 본원에서 제공되는 항-RELT 항체는 감염의 치료에 사용된다. 다른 실시태양에서, 본원에서 제공되는 항-RELT 항체는 상기 나타낸 바와 같은 면역 질환의 치료에 사용된다. 다른 실시태양에서, 본원에서 제공되는 항-RELT 항체는 상기 나타낸 바와 같은 염증성 질환의 치료에 사용된다. 다른 실시태양에서, 본원에서 제공되는 항-RELT 항체는 다른 인터페론-관련 질환의 치료에 사용된다.
본원에 나타낸 바와 같이, CD11c+B22O+CD11b-CD45RB+ 형질세포양 수지상 세포 ("pDC")에 대한 음성 조절인자이지만, 보통 CD11c+B220- 수지상 세포 ("cDC")에 대해서는 아니다. 따라서, 본 발명의 항-RELT 항체는 항체에 결합된 에피토프에 따라 RELT의 정상 기능 수행을 길항할 수 있거나 (그에 의해 전구 세포로부터 IFN-α-분비 pDC의 생산을 증가시킨다), RELT의 정상 기능 수행을 작용시킬 수 있다 (그에 의해 전구 세포로부터 IFN-α-분비 pDC의 생산을 감소시킨다). RELT의 하나 이상의 그의 천연 리간드에 대한 결합을 차단하는 항-RELT 항체는 아마도 RELT 활성에 대해 길항적일 것이다. RELT의 하나 이상의 그의 천연 리간드에 대한 결합을 안정화하거나 증가시키는 (즉, RELT의 하나 이상의 RELT 억제인자에 대한 결합을 차단함으로써, 또는 그의 천연 리간드에 결합하는 RELT의 능력을 저해하지 않으면서 RELT의 분해를 방지함으로써) 항-RELT 항체는 RELT 활성에 작용성일 것이다. 작용제 및 길항 항체는 모두 본 발명에서 고려되고, 따라서 본 발명의 항-RELT 항체를 사용하여 시험관 내에서 및 생체 내에서 상대적 pDC 및 IFN-α 수준을 증가시키는 (길항) 또는 감소시키는 (작용) 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명의 항-RELT 항체는 세포 집단에서 및 제시된 세포 내에서 RELT 밀도 및 분포의 결정, 및 RELT의 존재 또는 양에 기초한 세포 분류를 포함하여, RELT의 검출 및 단리, 예를 들어 다양한 세포 유형 및 조직에서 RELT의 검출을 위한 시약으로서 유용성을 갖는다.
또다른 측면에서, 본 발명의 길항적 항-RELT 항체는 본 발명의 대상 항체와 유사한 차단 활성 패턴을 갖는 RELT 길항제의 개발에 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 길항적 항-RELT 항체는 동일한 RELT 결합 특징 및/또는 RELT 매개 경로를 차단하는 능력을 갖는 다른 항체를 확인하는데 사용될 수 있다. 추가의 예로서, 본 발명의 항-RELT 항체는 선형 및 입체형태적 에피토프를 비롯한 본원에 예시된 항체와 실질적으로 동일한 RELT의 항원 결정자(들)에 결합하는 다른 항-RELT 항체를 확인하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 항-RELT 항체는 하나 이상의 결합 파트너의 RELT에 대한 결합을 차단하는데 유사한 약물학적 효과를 나타낼 RELT의 소분자 길항제를 스크리닝하기 위한, RELT가 관련되는 생리학적 경로를 기초로 한 분석에 사용될 수 있다. 본원에 나타낸 바와 같이, 마우스에서 relt의 결실은 IFN-α-분비 pDC의 집단을 증가시키고, 따라서 상기 마우스에서 IFN-α의 혈청 수준을 전체적으로 증가시킨다. 따라서, 차단 항-RELT 항체는 pDC 발생의 RELT-매개 억제의 소분자 길항제를 확인하기 위한 스크리닝에 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 잠재적인 소분자 길항제의 활성은 MHC II- DC 전구 세포로부터 pDC 발생을 억제하는데 있어서 길항적 항-RELT 항체의 활성에 비교될 수 있다.
본원에 나타낸 바와 같이, 마우스에서 relt를 파괴시키면 cDC에 비해 CD11c+MHC II- 세포로부터 생산되는 pDC의 양을 증가시킨다. 따라서, 다른 실시태양에서, 본 발명은 CD11c+MHC II- 세포에서 RELT 발현 및/또는 활성을 억제함으로써 CD11c+MHC II- 세포로부터 pDC 대 cDC의 비율을 조정하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 relt를 파괴함으로써 억제된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 RELT DNA 또는 RNA에 대해 안티센스인 올리고뉴클레오티드를 투여함으로써 억제된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 RELT를 길항하는 하나 이상의 항체를 투여함으로써 억제된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 하나 이상의 본 발명의 항체를 투여함으로써 억제된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 항체 H11을 투여함으로써 억제된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 시험관 내에서 억제된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 생체 내에서 억제된다.
이와 유사하게, 본 발명은 CD11c+MHC II- 세포에서 RELT 발현 및/또는 활성을 자극하는 것을 포함하는, cDC 세포에 비해 CD11c+MHC II- 세포로부터 생산되는 pDC의 비율을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 한 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 RELT를 작용하도록 하는 하나 이상의 항체를 투여함으로써 자극된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 생체 내에서 자극된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 시험관 내에서 자극된다.
IFN-α는 pDC에 의해 주로 생산되는 것으로 알려져 있고, 본원에 나타낸 바와 같이, 생체 내에서 전신 IFN-α 수준은 주로 pDC에 의한 IFN-α의 생산에 기인한다. 따라서, 본 발명은 RELT 발현 및/또는 활성을 억제함으로써 IFN-α 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 relt를 파괴함으로써 억제된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 RELT DNA 또는 RNA에 대해 안티센스인 올리고뉴클레오티드를 투여함으로써 억제된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 RELT를 길항하는 하나 이상의 항체를 투여함으로써 억제된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 하나 이상의 본 발명의 항체를 투여함으로써 억제된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 항체 H11을 투여함으로써 억제된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 시험관 내에서 억제된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 생체 내에서 억제된다.
이와 유사하게, 본 발명은 RELT 발현 및/또는 활성을 자극함으로써, IFN-α 생산을 감소시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 RELT를 작용하도록 하는 하나 이상의 항체를 투여함으로써 자극된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 생체 내에서 자극된다. 다른 측면에서, RELT 발현 및/또는 활성은 시험관 내에서 자극된다.
후보 항체의 생성은 본원에 기재된 것을 비롯한 당업계의 통상적인 기술, 예를 들어 하이브리도마 기술 및 결합제 분자의 파지 디스플레이된 라이브러리의 스크리닝을 이용하여 달성될 수 있다. 상기 방법은 당업계에 잘 확립되어 있다.
간단히 설명하면, 본 발명의 항-RELT 항체는 목적하는 활성(들)을 갖는 합성 항체 클론에 대해 스크리닝하는 조합 라이브러리를 사용하여 제조될 수 있다. 원칙적으로, 합성 항체 클론은 파지 외피 단백질에 융합된 항체 가변 구역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택된다. 상기 파지 라이브러리는 목적하는 항원에 대한 친화도 크로마토그래피에 의해 선택된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되고, 따라서 라이브러리에서 비-결합 클론으로부터 분리된다. 그 후, 결합 클론은 항원으로부터 용출되고, 추가의 항원 흡착/용출 사이클에 의해 추가로 농축될 수 있다. 임의의 본 발명의 항-RELT 항체는 해당 파지 클론에 대해 선택하는 적합한 항원 스크리닝 절차를 설계한 후, 해당 파지 클론으로부터의 Fv 서열 및 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에 기재된 적합한 불변 구역 (Fc) 서열을 이용하여 전장 항-RELT 항체 클론을 작성함으로써 얻을 수 있다. 또한, PCT 공개 WO03/102157, 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조한다.
한 실시태양에서, 본 발명의 항-RELT 항체는 모노클로날이다. 또한, 본 발명의 범위에는 항체 단편, 예를 들어 본원에서 제공된 항-RELT 항체의 Fab, Fab', Fab'-SH 및 F(ab')2 단편, 및 그의 변이체가 포함된다. 상기 항체 단편은 전통적인 수단, 예를 들어 효소 소화에 의해 생성될 수 있거나, 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 상기 항체 단편은 키메라, 인간 또는 인간화 항체 단편일 수 있다. 상기 단편은 본원에 제시된 실험, 진단, 및 치료 목적에 유용하다.
모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득될 수 있고, 즉 상기 집단을 구성하는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 변경 표현 "모노클로날"은 별개의 항체들의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 나타낸다.
본 발명의 항-RELT 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al, Nature, 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법을 포함하여 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 별법으로 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 4,816,567)에 의해 제조할 수 있다.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 항체의 재조합 생산을 위해, 이를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터 내로 삽입한다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열을 결정한다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터의 선택은 사용되는 숙주 세포에 부분적으로 의존한다. 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 (일반적으로 포유동물) 기원의 세포를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 구역을 비롯하여 임의의 이소형의 불변 구역이 상기 목적을 위해 사용될 수 있고, 상기 불변 구역은 임의의 인간 및 동물종으로부터 얻을 수 있음이 이해될 것이다.
원핵 숙주 세포를 사용한 항체 생산
벡터 제작
본 발명의 항체의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오티드 서열은 항체 생산 세포, 예를 들어 하이브리도마 세포로부터 단리되어 서열 결정될 수 있다. 별법으로, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 일단 얻은 후에, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 원핵 숙주에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제 및 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입된다. 입수가능하고 당업계에 공지된 많은 벡터를 본 발명의 목적에 이용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특정 숙주 세포에 따라 결정될 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 모두) 및 벡터가 존재하게 되는 특정 숙주 세포와의 상용성에 따라 상이한 성분을 포함한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입체 및 전사 종결 서열을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 상용성인 종으로부터 유도된 레플리콘 및 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터가 상기 숙주와 함께 사용된다. 벡터는 통상적으로 복제 부위 및 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 (marking) 서열을 포함한다. 예를 들어, 이. 콜라이는 일반적으로 이. 콜라이 종으로부터 유도된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환시킨다. pBR322는 암피실린 (Amp) 및 테트라사이클린 (Tet) 내성을 코딩하는 유전자를 포함하고, 따라서 형질전환된 세포를 확인하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 그의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지도 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 상기 프로모터를 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예는 카터 (Carter) 등의 미국 특허 5,648,237에 상세하게 기재되어 있다.
또한, 숙주 미생물과 상용성인 레플리콘 및 조절 서열을 포함하는 파지 벡터를 상기 숙주에 대한 형질전환 벡터로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지, 예를 들어 λGEM.TM.-11이 이. 콜라이 LE392와 같은 감수성 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있는 재조합 벡터 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 2 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 그의 발현을 조정하는 시스트론에 대해 상류 (5')에 위치하는 비번역된 조절 서열이다. 원핵 프로모터는 전형적으로 두 종류의 프로모터, 즉 유도가능 및 구성적 프로모터로 분류된다. 유도가능 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들어 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에 반응하여 그의 제어 하에 시스트론의 전사 수준의 증가를 개시시키는 프로모터이다.
다양한 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 매우 많은 프로모터가 공지되어 있다. 선택된 프로모터는 프로모터를 제한 효소 소화를 통해 공급원 DNA로부터 제거하고 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터 내로 삽입함으로써 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 많은 이종 프로모터 모두를 사용하여 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 일부 실시태양에서, 일반적으로 천연 표적 폴리펩티드 프로모터에 비해 발현된 표적 유전자의 보다 큰 전사 및 보다 높은 수율을 가능하게 하기 때문에, 이종성 프로모터가 이용된다.
원핵 숙주에 사용하기 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, 베타-갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 세균 (예를 들어 다른 공지의 세균 또는 파지 프로모터)에서 기능하는 다른 프로모터도 적합하다. 이들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있고, 따라서 당업자는 임의의 필요한 제한 부위를 공급하기 위해서 링커 또는 어댑터 (adaptor)를 사용하여 이들 서열을 표적 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 시스트론에 작동가능하게 라이게이션시킬 수 있다 (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269).
본 발명의 한 측면에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 발현된 폴리펩티드의 막을 가로지른 전위 (translocation)를 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 한 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내에 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택되는 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이어야 한다. 이종 폴리펩티드에 천연적인 신호 서열을 인식하여 프로세싱하지 않는 원핵 숙주세포의 경우, 신호 서열은 예를 들어 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열안정성 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원핵 신호 서열에 의해 치환된다. 본 발명의 한 실시태양에서, 발현계의 두 시스트론 모두에 사용되는 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 그의 변이체이다.
본 발명에 따른 면역글로불린의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있으며, 따라서 각각의 시스트론 내의 분비 신호 서열의 존재를 요구하지 않는다. 이와 관련하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄가 발현되고, 폴딩되고, 집합되어 세포질 내에서 기능적 면역글로불린을 형성한다. 특정 숙주 균주 (예를 들어, 이. 콜라이 trxB- 균주)는 디술피드 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공함으로써, 발현된 단백질 서브유닛의 완전한 폴딩 및 집합을 허용한다 (Proba and Pluckthun, Gene, 159:203 (1995)).
본 발명의 항체는 또한 발현된 폴리펩티드 성분의 정량적인 비율을 본 발명의 분비되고 적절하게 집합된 항체의 수율을 최대화하기 위해 조절할 수 있는 발현계를 이용하여 생산될 수 있다. 이러한 조절은 폴리펩티드 성분에 대한 번역 강도의 동시 조절에 의해 적어도 부분적으로 달성된다.
번역 강도의 조절을 위한 한 가지 기술은 시몬스(Simmons) 등의 미국 특허 제5,840,523호에 개시되어 있다. 이는 시스트론 내의 번역 개시 구역 (TIR)의 변이체를 이용한다. 소정의 TIR에 대해, 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체는 일정 범위의 번역 강도로 생성됨으로써, 상기 인자를 특정 사슬의 목적하는 발현 수준을 위해 조정하는 편리한 수단을 제공할 수 있다. TIR 변이체는 아미노산 서열을 변경할 수 있는 코돈 변화를 초래하는 통상적인 돌연변이 유발 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 실시태양에서, 뉴클레오티드 서열의 변경은 침묵 변경이다. TIR의 변경은 예를 들어 신호 서열의 변경과 함께 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열의 수 또는 간격의 변경을 포함할 수 있다. 돌연변이체 신호 서열을 생성하는 한 가지 방법은 신호 서열의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 (즉, 변화가 침묵인) 코딩 서열의 시작점에서의 "코돈 뱅크 (codon bank)"의 생성이다. 이는 각각의 코돈의 제3 뉴클레오티드 위치의 변화에 의해 달성될 수 있으며, 또한 류신, 세린 및 아르기닌과 같은 일부 아미노산은 상기 뱅크를 제조하는데 있어서 복잡성을 추가할 수 있는 다수의 제1 및 제2 위치를 갖는다. 상기 돌연변이 유발 방법은 문헌 [Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158]에 상세히 기재되어 있다.
한 실시태양에서, 그 안의 각각의 시스트론에 대한 일정 범위의 TIR 강도를 갖는 벡터의 세트가 생성된다. 상기 제한된 세트는 각각의 사슬의 발현 수준뿐만 아니라 다양한 TIR 강도 조합 하에서 목적하는 항체 생성물의 수율의 비교를 제공한다. TIR 강도는 시몬스 등의 미국 특허 제5,840,523호에 상세히 기재된 바와 같이 리포터 유전자의 발현 수준을 정량화함으로써 측정될 수 있다. 번역 강도 비교를 기초로 하여, 본 발명의 발현 벡터 구성체에 조합되도록 목적하는 개별 TIR을 선택한다.
본 발명의 항체 발현에 적합한 원핵 숙주 세포는 원시세균 및 진정세균, 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 유기체를 포함한다. 유용한 세균의 예는 에스케리치아 (Escherichia) (예를 들어 이. 콜라이), 바실러스 (Bacilli) (예를 들어 비. 섭틸리스 (B. subtilis)), 장내세균 (Enterobacteria), 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 (예를 들어, 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa)), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 시겔라 (Shigella), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오실라 (Vitreoscilla), 또는 파라코커스 (Paracoccus)를 포함한다. 한 실시태양에서, 그람-음성 세포가 사용된다. 한 실시태양에서, 이. 콜라이 세포가 본 발명에서 숙주로서 사용된다. 이. 콜라이 균주의 예로는 유전자형 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc - fepE) degP41 kan R (미국 특허 제5,639,635호)을 갖는 균주 33D3를 비롯한 균주 W3110 (문헌 [Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]; ATCC 기탁 번호 27,325) 및 그의 유도체를 들 수 있다. 다른 균주 및 그의 유도체, 예를 들어 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이λ 1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608)이 또한 적합하다. 상기 예는 제한적이라기보다는 예시적이다. 한정된 유전자형을 갖는 임의의 상기 언급된 세균의 유도체를 제작하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 세균 세포 내의 레플리콘의 복제능을 고려하여 적절한 세균을 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, 이. 콜라이, 세라티아 또는 살모넬라 종은 pBR322, pBR325, pACYC177 또는 pKN410과 같은 널리 공지된 플라스미드가 레플리콘을 공급하기 위해 사용될 경우 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비해야 하며, 추가의 프로테아제 억제제는 바람직하게는 세포 배양물에 혼입될 수 있다.
항체 생산
숙주 세포를 상기 설명된 발현 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하는데 적절한, 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양시킨다.
형질전환은 DNA를 원핵 숙주 내로 도입시켜, DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해 복제가능하도록 하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 그 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리는 실질적인 세포벽 장벽을 함유하는 세균 세포에 일반적으로 사용된다. 또다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 이용되는 또다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩티드를 생성하는데 사용되는 원핵 세포를 당업계에 공지되고 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장시킨다. 적합한 배지의 예는 필수 영양 보충물이 부가된 루리아 브로쓰 (luria broth) (LB)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하는, 발현 벡터의 구조를 기초로 하여 선택된 선택제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린은 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위한 배지에 첨가된다.
또한, 탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원 이외의 임의의 필요한 보충물이, 단독으로 또는 복합 질소 공급원과 같은 또다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로서 도입되어 적절한 농도로 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어지는 군 중에서 선택된 1종 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포를 적합한 온도에서 배양한다. 이. 콜라이는 예를 들어 약 20℃ 내지 약 39℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 및 약 30℃에서 성장시킨다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 이. 콜라이에 대해, pH는 약 6.8 내지 약 7.4, 또는 약 7.0이다.
유도가능 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용될 경우, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에서 유도된다. 본 발명의 한 측면에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사 제어에 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도용의 포스페이트-제한 배지에서 배양된다. 한 실시태양에서, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (예를 들어, 문헌 [Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147] 참조). 당업계에 공지된 바와 같이, 사용되는 벡터 구성체에 따라 다양한 다른 인듀서가 사용될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 원형질막 공간 내로 분비되고 그로부터 회수된다. 단백질 회수는 전형적으로, 일반적으로 삼투압 충격, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 분쇄하는 것을 포함한다. 세포가 분쇄되면, 세포 파쇄물 또는 전체 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질을 예를 들어 친화도 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다. 별법으로, 단백질을 배양 배지 내로 옮기고, 그 안에서 단리할 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상등액을 여과하고 농축하여 생성된 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 발현된 폴리펩티드를 추가로 단리하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯 분석과 같은 통상적으로 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 항체 생산은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식 (fed-batch) 발효 절차는 재조합 단백질의 생산에 이용가능하다. 대규모 발효는 적어도 1000 리터의 용량, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 상기 발효기는 산소 및 영양물, 특히 글루코스 (바람직한 탄소/에너지 공급원)를 분배시키는 교반기 추진기를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로 부피 용량으로 대략 100 리터 이하인 발효기에서의 발효를 지칭하며, 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있다.
발효 과정에서, 단백질 발현의 유도는 전형적으로 세포를 적합한 조건 하에서 목적하는 밀도, 예를 들어 약 180 내지 220의 OD550으로 성장시킨 후에 개시되며, 이 단계에서 세포는 초기 정지상이다. 당업계에 공지되고 상기 기재된 바와 같이, 사용되는 벡터 구성체에 따라 다양한 인듀서를 사용할 수 있다. 세포를 유도 전에 보다 짧은 기간 동안 성장시킬 수 있다. 세포를 통상적으로 약 12 내지 50시간 동안 유도하지만, 보다 길거나 보다 짧은 유도 시간이 사용될 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율 및 품질을 개선시키기 위해, 다양한 발효 조건을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩티드의 완전한 집합 및 폴딩을 개선시키기 위해, Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (섀퍼론 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)와 같은 섀퍼론 단백질을 과다발현하는 추가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵 세포를 동시에 형질전환시킬 수 있다. 섀퍼론 단백질은 세균 숙주 세포에서 생산된 이종 단백질의 완전한 폴딩 및 가용성을 용이하게 하는 것으로 입증되었다 (문헌 [Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605]; 조지오 (Georgiou) 등의 미국 특허 제6,083,715호; 조지오 등의 미국 특허 제6,027,888호; [Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105]; [Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113]; [Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210]).
발현된 이종 단백질 (특히, 단백질 분해에 감수성인 단백질)의 단백질 분해를 최소화하기 위해, 단백질 분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주를 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이들의 조합과 같은 공지된 세균 프로테아제를 코딩하는 유전자에서 유전자 돌연변이(들)를 수행하도록 변형될 수 있다. 일부 이. 콜라이 프로테아제-결핍 균주가 이용가능하며, 예를 들어 문헌 ([Joly et al. (1998), 상기 문헌]; 조지오 등의 미국 특허 제5,264,365호; 조지오 등의 미국 특허 제5,508,192호; [Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)])에 기재되어 있다.
한 실시태양에서, 단백질 분해 효소가 결핍되고 하나 이상의 섀퍼론 단백질을 과다발현하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균주가 본 발명의 발현계에서 숙주 세포로 사용된다.
항체 정제
일 실시태양에서, 본원에서 생산된 항체 단백질을 추가의 분석 및 사용을 위해 추가로 정제하여 실질적으로 균질한 제제를 수득한다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 이용될 수 있다. 다음 절차는 적합한 정제 절차의 예이다: 면역친화도 또는 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 황산암모늄 침전법, 및 예를 들어 세파덱스 (Sephadex) G-75를 이용한 겔 여과.
한 측면에서, 고체상 상에 고정된 단백질 A는 본 발명의 항체 생성물의 면역친화도 정제에 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 구역에 고 친화도로 결합하는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)로부터의 41 kD 세포벽 단백질이다 (Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13). 단백질 A가 고정되는 고체상은 유리 또는 실리카 표면, 또는 제어된 공극 유리 컬럼 또는 규산 컬럼을 포함하는 컬럼일 수 있다. 일부 용도에서, 컬럼을 가능하게는 글리세롤과 같은 시약으로 코팅하여 오염물의 비특이적 부착을 방지한다.
정제의 제1 단계로서, 상기 기재된 바와 같은 세포 배양액으로부터 유래된 제제를 단백질 A 고정된 고체상에 적용하여 목적하는 항체가 단백질 A에 특이적으로 결합하게 한다. 그 후, 고체상을 세척하여 고체상에 비-특이적으로 결합된 오염물을 제거한다. 최종적으로, 목적하는 항체를 용출에 의해 고체상으로부터 회수한다.
진핵 숙주 세포를 이용한 항체의 생성:
벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
(i) 신호 서열 성분
진핵 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 또한 목적하는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열, 또는 다른 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 일반적으로 숙주세포에 의해 인식되고 프로세싱된 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단된) 것이다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 헤르페스 gD 신호가 이용가능하다.
이러한 전구체 구역을 위한 DNA는 항체를 코딩하는 DNA에 대한 리딩 프레임 (reading frame)으로 라이게이션된다.
( ii ) 복제 기점
일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다. 예를 들어, SV40 기점이 전형적으로 사용될 수 있는데, 그 이유는 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문이다.
( iii ) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택가능한 마커로도 지칭되는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하거나, (b) 관련될 경우 영양요구성 결핍을 보충하거나, (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양물을 공급하는 단백질을 코딩한다.
선택 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 저항성을 부여하는 단백질을 생성하고, 따라서 선택 처리시에도 생존한다. 이러한 우세한 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 이용한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능 마커의 다른 예는 항체 핵산, 예를 들어 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II (예를 들어, 영장류 메탈로티오네인 유전자), 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 섭취하는 능력을 갖는 세포의 확인을 가능하게 하는 것이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 메토트렉세이트 (Mtx), DHFR의 경쟁적 길항제를 포함하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인할 수 있다. 야생형 DHFR을 사용할 때 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)이다.
별법으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또다른 선택가능 마커, 예를 들어 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환된 또는 동시 형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 포함하는 야생형 숙주)는 선택가능 마커에 대한 선택제, 예를 들어, 아미노글리코사이드계 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418를 포함하는 배지에서 세포의 성장에 의해 선택될 수 있다 (미국 특허 4,965,199를 참조).
( iv ) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 대체로 숙주 유기체에 의해 인식되고 목적하는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 프로모터 서열이 진핵세포에 대해 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위의 약 25 내지 30 염기 상류에 위치하는 AT 풍부 구역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시점으로부터 70 내지 80 염기 상류에 존재하는 또다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 구역이다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에 존재한다. 상기 모든 서열은 진핵 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
포유동물 숙주 세포 내의 벡터로부터의 항체 폴리펩티드 전사는 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성일 경우 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해 조절될 수 있다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 기점을 포함하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 인간 사이토메갈로바이러스의 최조기 (immediate early) 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 소 파필로마 바이러스를 벡터로서 사용하는 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 4,419,446에 기재되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 헤르페스 바이러스로부터 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해서는 문헌 [Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982)]을 참조한다. 별법으로, 라우스 (rous) 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.
(v) 인핸서 요소 성분
보다 고등한 진핵세포에 의한 본 발명의 항체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 하류 쪽의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소는 문헌 [Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 위치 5' 또는 3'에서 항체 폴리펩티드 코딩 서열까지 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로 프로모터부터 부위 5'에 위치한다.
( vi ) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터도 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 상기 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 구역으로부터 통상 얻을 수 있다. 이들 구역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 내의 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. 한 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 구역이다. W094/11026 및 본원에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
( vii ) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원의 벡터에서 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 비롯하여 본원에 기재된 보다 고등한 진핵 세포를 포함한다. 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인 (현탁 배양으로 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포들 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1997)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL 1587); 인간 경부 암세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포는 항체 생산을 위한 상기한 발현 또는 클로닝 벡터를 사용하여 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양한다.
( viii ) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하기 위해 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어 햄 (Ham) F10 (시그마 (Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 (Dulbecco) 개질 이글 (Eagle) 배지 (DMEM, 시그마)가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 또한, 문헌 ([Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:225 (1980)], 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985)에 설명된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 버퍼 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, GENTAMYCIN (등록상표) 약물), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 동등 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물이 또한 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
( ix ) 항체의 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포 내에서 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되면, 제1 단계로서, 입자형 파쇄물, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 상기 발현계로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백질 분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어, 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고, 친화도 크로마토그래피가 일반적으로 허용되는 정제 기술이다. 친화도 시약, 예를 들어 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존한다. 단백질 A가 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (Lindmark et al. J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 추천된다 (Guss et al. EMBO J. 5: 15671575 (1986)). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠이 아가로스를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유동 속도와 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX (등록상표) 수지 (제이.티. 베이커 (J.T. Baker), 미국 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스 (등록상표) 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전도 회수되는 항체에 따라 사용될 수 있다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 목적하는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 필요한 경우, 예를 들어 약 2.5-4.5의 pH에서, 일반적으로 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가의 정제 단계에 적용될 수 있다.
일반적으로, 연구, 시험 및 임상 용도로 사용하기 위한 항체의 제조를 위한 기술 및 방법은 당업계에 널리 확립되어 있으며, 상기와 일치하고/하거나 목적하는 특정 항체에 대한 당업자에 의해 적절한 것으로 간주되는 바와 같음을 유념해야 한다.
활성 분석
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다양한 분석법에 의해 그의 물리적/화학적 특성 및 생물학적 기능에 대해 특성화될 수 있다.
정제된 항체는 N-말단 서열 결정, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 소화를 포함하고 이에 제한되지 않는 일련의 분석법에 의해 추가로 특성화될 수 있다.
필요에 따라, 항체를 그의 생물학적 활성에 대해 분석한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체를 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다. 당업계에 공지되고 본원에서 사용될 수 있는 항원 결합 분석법은 웨스턴 블롯, 방사성 면역분석법, ELISA (효소 결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석법, 면역침전 분석법, 형광 면역분석법 및 단백질 A 면역분석법과 같은 기술을 이용한 임의의 직접적 또는 경쟁적 결합 분석법을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
한 실시태양에서, 본 발명은 항체를, 생체 내에서 항체의 반감기가 중요하지만 특정 효과기 기능 (예를 들어 보체 및 ADCC)에는 불필요하거나 유해한 많은 적용에 대한 바람직한 후보가 되게 하는, 전부는 아니지만 일부의 효과기 기능을 갖는 변경된 항체를 고려한다. 특정 실시태양에서, 항체의 Fc 활성을 측정하여 목적하는 특성만이 유지되는 것을 확인한다. 시험관 내 및/또는 생체 내 세포독성 분석을 수행하여, CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석을 수행하여, 항체가 FcγR 결합이 없지만 (따라서 또한 ADCC 활성이 없지만) FcRn 결합 능력을 보유하는지를 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차적인 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 제464면의 표 3에 요약되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 예는 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재되어 있다. 이러한 분석에 유용한 효과기 세포로는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 들 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한, C1q 결합 분석을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 없는지를 확인할 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다. 또한, FcRn 결합 및 생체내 청소율/반감기 측정을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
항체 단편
본 발명은 항체 단편을 포함한다. 특정 상황에서, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 단편의 보다 작은 크기는 신속한 소실을 가능하게 하고, 고형 종양에 대한 접근성을 개선시킬 수 있다.
항체 단편 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 상기 단편은 무손상 항체의 단백질 분해 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 ([Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]) 참조). 그러나, 상기 단편은 이제 재조합 숙주세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되어 분비될 수 있고, 이에 의해 다량의 상기 단편을 간편하게 생산할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의한 바와 같이 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 방법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주세포 배양액으로부터 직접 단리할 수 있다. 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 생체 내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편은 미국 특허 5,869,046에 기재되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 자명할 것이다. 다른 실시태양에서, 선택되는 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (WO 93/16185; 미국 특허 5,571,894; 및 미국 특허 5,587,458 참조). Fv 및 sFv는 불변 구역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종류이고, 따라서 생체 내 사용 동안 비특이적 결합 감소에 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에 효과기 단백질을 융합시키도록 제조될 수 있다 (Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌). 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
인간화 항체
본 발명은 인간화 항체를 포함한다. 비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 그 내부에 비-인간 공급원으로부터 유도된 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입될 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 "도입 (import)" 잔기로서 종종 언급되고, 일반적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 일반적으로 인간 항체의 대응하는 서열을 초가변 구역 서열로 대체함으로써 윈터 (Winter) 등의 방법 (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536)을 따라 수행할 수 있다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비-인간종의 대응하는 서열로 대체된 키메라 항체 (미국 특허 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 초가변 구역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다.
인간화 항체 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성 감소를 위해 매우 중요하다. 소위 "최적 맞춤 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열은 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류와 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체의 인간 프레임워크로서 허용된다 ([Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위집단의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래한 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 복수개의 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 ([Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285]; [Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623]).
항체가 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 일반적으로 더욱 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 바람직한 방법에 따르면, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모서열 및 상이한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 그려 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 상기 디스플레이의 조사를 통해 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 끼치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 초가변 구역 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접적으로 가장 실질적으로 관련된다.
인간 항체
본 발명의 인간 항-RELT 항체는 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기한 바와 같이 공지의 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 제조할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 인간 모노클로날 항-RELT 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 예를 들어 문헌 ([Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984)], [Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)])에 기재되어 있다.
면역화시에 내인성 면역글로불린 생성의 부재시에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 동물 (예, 마우스)을 현재 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포 돌연변이체 마우스의 항체 중쇄 연결 구역 (JH) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제한다고 설명되었다. 상기 생식세포 돌연변이체 마우스에서 인간 생식세포 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 시험 접종시에 인간 항체를 생성시킬 것이다 (예를 들어, 문헌 ([Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-255 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255 (1993)]; 및 [Bruggermann et al, Year in Immunol, 7: 33 (1993)]) 참조).
또한, 유전자 셔플링을 사용하여 비-인간, 예를 들어 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도할 수 있고, 여기서 인간 항체는 출발 비-인간 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅 (imprinting)"으로도 불리는 상기 방법에 따라, 상기한 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 의해 얻은 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 구역이 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어 비-인간 사슬/인간 사슬 scFv 또는 Fab 키메라를 생성시킨다. 항원으로 선택하여, 인간 사슬이 1차 파지 디스플레이 클론에서 대응하는 비-인간 사슬의 제거시에 파괴되는 항원 결합 부위를 저장할 수 있는 비-인간 사슬/인간 사슬 키메라 scFv 또는 Fab를 단리한다. 즉, 에피토프가 인간 사슬 파트너 선택을 좌우 (임프린팅)한다. 나머지 비-인간 사슬을 대체하기 위해 과정을 반복할 때, 인간 항체를 얻게 된다 (1993년 4월 1일 공개된 국제 출원 공개 WO 93/06213 참조). CDR 그라프팅 (grafting)에 의한 비-인간 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 상기 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기가 없는 완전한 인간 항체를 제공한다.
이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시태양에서, 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 특정 실시태양에서, 결합 특이성의 하나는 RELT에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어 F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하고, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마 (quadroma))는 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산한다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO93/08829 (1993년 5월 13일 공개) 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
상이한 실시태양에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 예를 들어 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 구역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 특정 실시태양에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 구역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이는 제작에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 불균등한 비율이 최적 수율을 제공하는 실시태양에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 탄력성을 제공한다. 그러나, 균등한 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고수율을 나타낼 때 또는 상기 비가 특정한 유의성을 갖지 않을 때 하나의 발현 벡터 내에 2개 또는 3개의 모든 폴리펩티드 사슬의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 추가의 상세한 내용에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
다른 방법에 따르면, 한쌍의 항체 분자들 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화하도록 처리될 수 있다. 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)으로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예, 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체함으로써 큰 측쇄(들)에 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "캐비티 (cavity)"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예를 들어 동종이량체 (homodimer)에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "이종컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종컨쥬게이트 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 상기 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/00373 및 EP 03089) 제안되었다. 이종컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 잘 알려져 있고, 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 또한 문헌에서 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에서는 무손상 항체가 단백질 분해 방식으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기술하고 있다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비소산나트륨의 존재 하에 환원된다. 이어서 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로서 사용될 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에서는 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비되었고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관 내에서 유도 화학 커플링 반응에 적용되었다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발시킬 수 있었다.
이중특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양액으로부터 직접 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼 (zipper)를 사용하여 생산되었다 (Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 구역에서 환원되어 단량체를 형성한 다음, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 본 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 다른 메카니즘을 제공하였다. 이 단편은 동일한 사슬 상의 두개의 도메인 사이에 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인과 강제로 페어링되고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용한 이중특이적 항체 단편의 다른 제조 전략도 보고된 바 있다 (Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994) 참조).
3가 이상의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 (Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991)).
다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 빠르게 내재화 (internalizing) (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 항원 결합 부위가 3개 이상인 (예를 들어 4가 항체) 다가 항체 (IgM 클래스가 아닌)일 수 있고, 항체의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 이량체화 도메인은 예를 들어 Fc 구역 또는 힌지 구역을 포함한다 (또는 이로 이루어진다). 상기 시나리오에서, 항체는 Fc 구역 및 Fc 구역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 한 실시태양에서, 다가 항체는 3 내지 약 8개, 또는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬 (예를 들어 2개의 폴리펩티드 사슬)을 포함하고, 여기서 폴리펩티드 사슬(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 구역의 하나의 폴리펩티드 사슬이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 구역 사슬; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 구역 사슬을 포함할 수 있다. 본원에서 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에서 다가 항체는 예를 들어 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
항체 변이체
일부 실시태양에서, 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조된다. 상기 변이체는 예를 들어 항체의 아미노산 서열의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구성체가 요구되는 특성을 갖는다면 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행할 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 제조될 때 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
돌연변이 유발을 위해 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 구역을 확인하기 위한 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불린다. 여기서, 표적 잔기들의 잔기 또는 기가 확인되고 (예, arg, asp, his, lys 및 glu과 같은 대전된 잔기), 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 주도록 중성 또는 음으로 대전된 아미노산 (예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 교체된다. 이어서, 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 이들 아미노산 위치는 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정할 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발이 표적 코돈 또는 구역에서 수행되고, 발현된 면역글로불린은 목적하는 활성에 대해 스크리닝된다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포 독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어 ADEPT) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단 융합체를 포함한다.
다른 종류의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 항체 분자의 적어도 하나의 아미노산 잔기 대신에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이 유발을 위한 가장 흥미로운 부위는 초가변 구역을 포함하지만, FR 변형도 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 표 A에 나타낸다. 상기 치환이 생물학적 활성을 변경시키면, 하기 표 A에 "예시적인 치환"으로 명명된 또는 아미노산 종류에 대해 아래에서 상세히 설명하는 보다 큰 변화가 도입되고, 생성물을 스크리닝할 수 있다.
본래 서열 예시적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 형태로서의 치환 구역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 것에 대한 그의 효과가 크게 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 아미노산은 그의 측쇄 특성의 유사성에 따라 다음 군으로 분류할 수 있다 (A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)).
(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비대전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H)
별법으로, 자연 발생하는 잔기는 통상적인 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 분류할 수 있다.
(1) 소수성: 노르뉴신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 상기 종류의 하나의 멤버를 다른 종류와 교환하는 것을 수반할 것이다. 상기 치환되는 잔기는 또한 보존적 치환 부위 내로, 또는 나머지 (비-보존된) 부위 내로 도입될 수 있다.
한 종류의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 구역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성되는 변이체(들)은 이들이 생성되는 모 항체에 비해 변형된 (예를 들어 개선된) 생물학적 특성을 가질 것이다. 그러한 치환 변이체를 생성하기 위한 간편한 방법은 파지 디스플레이를 사용하는 친화도 성숙이다. 간단히 설명하면, 몇몇 초가변 구역 부위 (예를 들어 6-7개의 부위)가 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성하도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체는 각 입자 내에 패키징된 파지 코트 단백질의 적어도 일부 (예를 들어, M13의 유전자 III 산물)에 대한 융합체로서 필라멘트상 파지 입자로부터 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 그들의 생물학적 활성 (예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 구역 부위를 확인하기 위해, 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 구역 잔기를 확인하도록 스캐닝 돌연변이 유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝)을 수행할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 상기 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 본원에서 설명된 기술을 포함하여 당업계에 공지된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 그러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에서 설명된 기술을 포함하여 당업계에 공지된 기술을 사용하여 스크리닝시키고, 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조한다. 상기 방법은 천연 공급원으로부터의 단리 (자연 발생하는 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 항체의 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위 지정) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 항체의 Fc 구역에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여 Fc 구역 변이체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. Fc 구역 변이체는 힌지 시스테인의 위치를 포함하여 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 구역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 구역)을 포함할 수 있다.
본원 명세서 및 선행기술의 교시 내용에 따르면, 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 야생형 대응 항체에 비해, 예를 들어 Fc 구역에 하나 이상의 변형을 포함할 수 있음이 고려된다. 그럼에도 불구하고, 상기 항체는 야생형 대응 항체에 비교할 때 치료 유용성에 필요한 실질적으로 동일한 특성을 보유할 것이다. 예를 들어, WO99/51642에 기재된 바와 같이 변경된 (즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 야기하는 특정 변형이 Fc 구역에서 형성될 수 있다고 생각된다. 도한, Fc 구역 변이체의 다른 예에 대해서는 문헌 ([Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 5,648,260; 미국 특허 5,624,821; 및 WO94/29351)을 참고한다.
한 측면에서, 본 발명은 이종이량체화를 용이하게 하고/하거나 촉진시키는, Fc 구역을 포함하는 Fc 폴리펩티드의 계면에 변형을 포함하는 항체를 제공한다. 상기 변형은 제1 Fc 폴리펩티드 내에 돌출부를, 제2 Fc 폴리펩티드 내에 "캐비티"를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 돌출부는 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드의 복합체화를 촉진시키기 위해 캐비티 내에 위치할 수 있다. 상기 변형을 갖는 항체를 생성시키는 방법은 예를 들어 미국 특허 5,731,168에 기재되어 있는 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.
면역컨쥬게이트
다른 측면에서, 본 발명은 세포독성제, 예를 들어 화학치료제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 세균, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성 컨쥬게이트)에 컨쥬게이팅된 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트 또는 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)를 제공한다.
세포독성제 또는 세포증식 억제제, 즉 암 치료에서 종양 세포를 사멸하거나 억제하는 약물의 국소 전달을 위한 항체-약물 컨쥬게이트의 사용 ([Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172]; US 4,975,278)은 종양에 대한 약물 모이어티의 표적화 전달, 및 그 내부에서 세포내 축적을 허용하고, 여기서 상기 컨쥬게이팅되지 않은 약물 물질의 전신 투여는 제거하고자 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에 허용되지 않는 수준의 독성을 일으킬 수 있다 ([Baldwin et al., (1986) Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05]; [Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506]). 따라서, 최소 독성을 갖는 최대 효능이 추구된다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체가 모두 상기 전략에서 유용한 것으로 보고되었다 (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). 상기 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (Rowland et al., (1986) 상기 문헌). 항체-독소 컨쥬게이트에 사용되는 독소는 세균 독소, 예를 들어 디프테리아 독소, 식물 독소, 예를 들어 리신, 소분자 독소, 예를 들어 겔다나마이신 ([Mandler et al. (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581]; [Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028]; [Mandler et al. (2002) Bioconiugate Chem. 13:786-791]), 메이탄시노이드 (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)), 및 칼리케아미신 ([Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928]; [Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342])을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제를 포함하는 메카니즘에 의해 그의 세포독성 및 세포증식 억제 효과를 나타낼 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 컨쥬게이팅될 때 불활성이거나 활성이 보다 작은 경향이 있다.
제발린(ZEVALIN)(등록상표) (이브리투모맙 티욱세탄, 바이오젠/아이덱 (Biogen/Idec))은 정상 및 악성 B 림프구의 표면 상에서 발견된 CD20 항원에 대해 작용하는 뮤린 IgG1 카파 모노클로날 항체 및 티오우레아 링커-킬레이터에 의해 결합된 111In 또는 90Y 방사성 동위원소로 이루어진 항체-방사성 동위원소 컨쥬게이트이다 (문헌 [Wiseman et al (2000) Eur. J. Nucl. Med. 27(7):766-77]; [Wiseman et al (2002) Blood 99 (12):4336-42]; [Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10):2453-63]; [Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69]). 제발린이 B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL)에 대한 활성을 갖긴 하지만, 이를 투여하면 대부분의 환자에서 중증의 혈구감소증이 장기간 나타난다. 칼리케아미신과 연결된 hu CD33 항체로 구성된 항체 약물 컨쥬게이트인 밀로타르그(MYLOTARG)(상표명) (겜투주맙 오조가미신; 와이어스 파마슈티칼스 (Wyeth Pharmaceuticals))는 주사에 의해 급성 골수성 백혈병을 치료하기 위한 것으로 2000년에 승인되었다 (문헌 [Drugs of the Future (2000) 25(7):686]; 미국 특허 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). 디술피드 링커 SPP를 통하여 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1에 연결된 huC242 항체로 이루어진 항체 약물 컨쥬게이트인 칸투주맙 머탄신 (이뮤노젠, 인크. (Immunogen, Inc.))을 대상으로 하여, CanAg를 발현하는 암, 예를 들어 결장암, 췌장암, 위암 등을 치료하기 위한 시험이 진행되고 있다. MLN-2704 (밀레니엄 팜. (Millennium Pharm.), 비지엘 바이올로직스 (BZL Biologics), 이뮤노젠, 인크.)는 메이탄시노이드 약물 모이어티인 DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 이루어진 항체 약물 컨쥬게이트로서, 현재 전립선 종양의 잠재적 치료에 대해 시험중이다. 아우리스타틴 펩티드인 아우리스타틴 E (AE) 및 모노메틸아우리스타틴 (MMAE) (돌라스타틴의 합성 유사체)을 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종 상의 루이스 Y에 특이적임) 및 cAC10 (혈액학적 악성종양 상의 CD30에 특이적임)에 컨쥬게이팅시켰고 (문헌 [Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784]), 이는 치료제 개발 중에 있다.
면역컨쥬게이트 생산에 유용한 화학치료제는 상기 설명한 바 있다. 사용될 수 있는 효소 활성의 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다 (예를 들어, 1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232 참조). 다양한 방사성핵종이 방사성 컨쥬게이팅된 항체의 생산에 이용될 수 있다. 그 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re를 포함한다. 항체와 세포독성제의 컨쥬게이트는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al. Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)이 항체에 방사성 뉴클레오티드의 컨쥬게이팅을 위한 예시적인 킬레이팅제이다. WO94/11026을 참조한다.
항체와 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌로스타틴, 아우로스타틴, 트리코테센 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 상기 독소의 유도체의 컨쥬게이트도 본원에서 고려된다.
메이탄신 및 메이탄시노이드
일부 실시태양에서, 면역컨쥬게이트는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 컨쥬게이팅된 본 발명의 항체를 포함한다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타 (Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 (미국 특허 3,896,111). 뒤이어, 특정 미생물도 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생산하는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 4,151,042). 합성 메이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체는 예를 들어 미국 특허 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533에 개시되어 있다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는, 이들이 (i) 발효 또는 화학적 변형, 발효 생성물의 유도체화에 의한 제조에 비교적 접근가능하고, (ii) 비-디술피드 링커를 통해 항체에 컨쥬게이션되기에 적합한 관능기로 유도체화될 수 있고, (iii) 혈장에서 안정하며, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체 약물 컨쥬게이트에서 매력적인 약물 모이어티이다.
메이탄시노이드를 포함하는 면역컨쥬게이트, 그의 제조 방법 및 그의 치료 용도가, 예를 들어 그 명세서가 본원에 명백하게 참고로 포함된 미국 특허 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되어 있다. 문헌 [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에 인간 결장직장암에 대해 작용하는 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1로 명명된 메이탄시노이드를 포함하는 면역컨쥬게이트가 기재되어 있다. 컨쥬게이트는 배양된 결장암 세포에 대해 높은 세포독성을 보이는 것으로 밝혀졌고, 생체 내 종양 성장 분석에서 항종양 활성을 보였다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에서는 메이탄시노이드가 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 뮤린 항체 A7에 또는 HEK-2/neu 종양유전자에 결합하는 다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1에 디술피드 링커를 통해 컨쥬게이팅된 면역컨쥬게이트를 설명하고 있다. TA.1-메이탄시노이드 컨쥬게이트의 세포독성은 세포당 3 x 105 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방 암세포주 SK-BR-3에 대해 시험관 내에서 시험하였다. 약물 컨쥬게이트는 유리 메이탄시노이드 약물에 유사한 수준의 세포독성을 달성하였고, 이것은 항체 분자당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시켜 증가시킬 수 있다. A7-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 보였다.
항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 결합시킴으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,208,020 (그 개시 내용이 본원에 명백하게 참고로 포함됨) 참조). 항체 1분자에 컨쥬게이팅된 평균 3 내지 4개의 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향 없이 표적 세포의 세포독성을 증대시키는 효능을 나타내지만, 심지어 하나의 독소/항체 분자도 네이키드 (naked) 항체의 사용에 비해 세포독성을 증대시킬 것으로 예상된다. 메이탄시노이드는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 공지된 기술에 의해 합성되거나 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는 예를 들어 미국 특허 5,208,020, 및 본원에서 상기 언급된 다른 특허 및 비특허 간행물에 개시되어 있다. 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 메이탄시놀 분자의 방향족 고리 또는 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예를 들어 다양한 메이탄시놀 에스테르를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
예를 들어 그 개시 내용이 본원에 명백하게 참고로 포함된 미국 특허 5,208,020 또는 유럽 특허 0 425 235 B1, 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)] 및 2004년 10월 8일 출원된 미국 특허 출원 10/960,602에 개시된 것을 비롯한, 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트의 제조를 위한, 당업계에 공지된 많은 연결기가 있다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 2004년 10월 8일 출원된 미국 특허 출원 10/960,602에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다. 연결기는 상기 확인된 특허에 개시된 바와 같은 디술피드기, 티오에테르기, 산불안정기, 광불안정기, 펩티다제 불안정기, 또는 에스테라제 불안정기를 포함한다. 추가의 연결기가 본원에서 설명되고 예시된다.
항체와 메이탄시노이드의 컨쥬게이트는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 디술피드 연결을 제공하기 위한 커플링제로는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)를 들 수 있다.
링커는 결합의 유형에 따라서 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실기와 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 이러한 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 한 실시태양에서, 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
아우리스타틴 및 돌로스타틴
일부 실시태양에서, 면역컨쥬게이트는 돌라스타틴 또는 돌로스타틴 펩티드성 유사체 및 유도체, 아우리스타틴에 컨쥬게이팅된 본 발명의 항체를 포함한다 (미국 특허 5635483; 5780588). 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미소관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하며 (문헌 [Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584]), 항암 (미국 특허 5663149) 및 항진균 활성 (문헌 [Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965])을 갖는 것으로 나타났다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드성 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).
예시적인 아우리스타틴 실시태양은 2004년 11월 5일 출원된 미국 특허 출원 10/983,340 (발명의 명칭: "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", 그 개시 내용이 본원에 명백하게 참고로 포함됨)에 개시된 N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티를 포함한다.
예시적인 아우리스타틴 실시태양은 MMAE 및 MMAF를 포함한다. MMAE 또는 MMAF 및 다양한 링커 성분 (본원에 추가로 기재됨)을 포함하는 추가의 예시적인 실시태양은 Ab-MC-vc-PAB-MMAF, Ab-MC-vc-PAB-MMAE, Ab-MC-MMAE 및 Ab-MC-MMAF를 포함한다.
전형적으로, 펩티드-기반 약물 모이어티는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이의 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어 펩티드 화학 분야에 널리 공지된 액체상 합성 방법 (문헌 [E. Schroeder and K. Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조될 수 있다. 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 U.S. 5,635,483; U.S. 5,780,588; 문헌 ([Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465]; [Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drag Design 13:243-277]; [Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725]; 및 [Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863])에 따라 제조될 수 있다. 또한, 문헌 [Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784]; 2004년 11월 5일 출원된 미국 특허 출원 10/983,340 (발명의 명칭: "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", 그 전부가 본원에 참고로 포함됨) (예를 들어, 링커, 및 링커에 컨쥬게이팅된 MMAE 및 MMAF와 같은 모노메틸발린 화합물의 제조 방법이 개시됨)을 참조한다.
칼리케아미신
다른 실시태양에서, 면역컨쥬게이트는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 컨쥬게이팅된 본 발명의 항체를 포함한다. 항생제 중 칼리케아미신 패밀리는 피코몰 미만의 농도에서 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 컨쥬게이트를 제조하는 것에 대해서는 미국 특허 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 및 5,877,296 (모두 아메리칸 시아나미드 컴퍼니 (American Cyanamid Company)의 특허)를 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체로는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다 ([Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993)], [Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)]; 및 상기 언급된 아메리칸 시아나미드사의 미국 특허). 항체가 컨쥬게이팅될 수 있는 또다른 항-종양 약물은 항엽산제인 QFA이다. 칼리케아미신과 QFA는 둘다 세포내 작용 부위를 갖고, 형질막을 용이하게 통과하지 못한다. 따라서, 항체에 의해 매개되는 내재화를 통해 이들 물질을 세포 내로 흡수시키면 이들의 세포독성 효과가 크게 증진된다.
다른 세포독성제
본 발명의 항체에 컨쥬게이팅될 수 있는 다른 항종양제로는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 5,053,394, 5,770,710호에 기재된, 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 물질의 패밀리, 및 에스페라미신 (미국 특허 5,877,296)을 들 수 있다.
사용될 수 있는 효소 활성의 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 애루기노사로부터 유래됨), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 들 수 있다. 예를 들어, 1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232를 참조한다.
본 발명은 항체와, 뉴클레오티드 분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역컨쥬게이트를 추가로 고려한다.
종양을 선택적으로 파괴시키기 위해, 항체는 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 방사성 컨쥬게이팅된 항체의 생산을 위해 다양한 방사성 동위원소가 이용가능하다. 그 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 들 수 있다. 컨쥬게이트를 검출용으로 사용하는 경우에는, 컨쥬게이트는 섬광조영 연구용 방사성 원자, 예를 들어 Tc99m 또는 I123을 포함할 수 있거나, 또는 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, MRI로도 공지됨)용 스핀 표지, 예를 들어 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성 표지 또는 다른 표지를 공지된 방식으로 컨쥬게이트에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성할 수 있거나, 또는 예를 들어 수소 대신, 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 이용하는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성할 수 있다. Tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지를 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 요오도겐 (IODOGEN) 방법 (문헌 [Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57])을 사용하여 요오드-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에는 다른 방법이 상세히 기재되어 있다.
항체와 세포독성제의 컨쥬게이트는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌 [Vitetta et al., Science. 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성 뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO 94/11026을 참조한다. 이러한 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정성 링커, 펩티다제 감수성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술파이드 함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Research, 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 제5,208,020호)를 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 가교결합제 시약, 즉 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (피어스 바이오테크놀로지, 인크. (Pierce Biotechnology, Inc.), 미국 일리노이주 록포드)를 사용하여 제조된 ADC를 고려하고, 이로 제한되지 않는다. 문헌 [pages 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog]을 참조한다.
항체 약물 컨쥬게이트의 제조
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC)에서, 항체 (Ab)를 하나 이상의 약물 모이어티 (D), 예를 들어 항체당 약 1 내지 약 20개의 약물 모이어티에 링커 (L)를 통하여 컨쥬게이팅시킨다. 화학식 I의 ADC는 다음을 포함한, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 이용하여 여러 경로에 의해 제조할 수 있다: (1) 항체의 친핵기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 Ab-L을 형성시킨 후, 이를 약물 모이어티 D와 반응시키는 방법; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 D-L을 형성시킨 다음, 이를 항체의 친핵기와 반응시키는 방법. 추가의 ADC 제조 방법은 본원에 기재되어 있다.
Ab-(L-D)p
링커는 하나 이상의 링커 성분으로 이루어질 수 있다. 예시적인 링커 성분 으로는 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 ("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC"), 및 N-숙신이미딜 (4-요오도아세틸)아미노벤조에이트 ("SIAB")를 들 수 있다. 추가의 링커 성분은 당업계에 공지되어 있으며, 일부는 본원에 기재되어 있다. 또한, 2004년 11월 5일 출원된 미국 특허 출원 10/983,340 (발명의 명칭: "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", 그 전부가 본원에 참고로 포함됨)을 참조한다.
일부 실시태양에서, 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산 링커 성분으로는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드를 들 수 있다. 예시적인 디펩티드로는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)을 들 수 있다. 예시적인 트리펩티드로는 글라이신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글라이신-글라이신-글라이신 (gly-gly-gly)을 들 수 있다. 아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기는 천연 발생하는 것뿐만 아니라 소수 아미노산 및 비-천연 발생 아미노산 유사체, 예를 들어 시트룰린을 포함한다. 아미노산 링커 성분은 특정 효소, 예를 들어 종양-관련된 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 그의 선택성 측면에서 설계되고 최적화될 수 있다.
예시적인 링커 성분 구조를 아래에 제시한다 (여기서, 물결형 선은 ADC의 다 른 성분에 대한 공유 부착 부위를 나타냄).
Figure 112008057209083-PCT00003
추가의 예시적인 링커 성분 및 약어는 다음을 포함한다 (여기서, 항체 (Ab) 및 링커가 제시되며, p는 1 내지 약 8임).
Figure 112008057209083-PCT00004
Figure 112008057209083-PCT00005
항체 상의 친핵기로는 (i) N-말단 아민기; (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어 라이신; (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어 시스테인; 및 (iv) 당 히드록실 또는 아미노기 (여기서, 항체는 글리코실화된다)를 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 아민, 티올 및 히드록실기는 친핵성이고, 반응하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들어 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원 가능한 사슬간 디술피드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체를 환원제, 예를 들어 DTT (디티오트레이톨)로 처리함으로써 링커 시약과의 컨쥬게이션을 위해 반응성이 되도록 할 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 브릿지는 이론적으로, 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 아민을 티올로 전환시키는 라이신과 2-이미노티올란 (트라우트 (Traut) 시약)의 반응을 통하여 추 가의 친핵기를 항체 내로 도입할 수 있다. 반응성 티올기는 1, 2, 3, 4개, 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 항체를 제조함으로써) 항체 (또는 그의 단편) 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 항체 약물 접합체는 또한 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환기와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입하도록 항체를 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 글리코실화된 항체의 당을, 예를 들어 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화시켜 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤기를 형성할 수 있다. 생성되는 이민 쉬프 (Schiff) 염기 기는 안정한 결합을 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어 수소화붕소 시약에 의해 환원되어 안정한 아민 결합을 형성할 수 있다. 한 실시태양에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 약물 상의 적절한 기와 반응할 수 있는 카르보닐 (알데히드 및 케톤) 기가 단백질 내에 생성될 수 있다 (Hermanson, Bioconjugate Techniques). 또다른 실시태양에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질을 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 제1 아미노산 대신에 알데히드가 생성될 수 있다 ([Geoghegan ＆ Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146]; 미국 특허 제5362852호). 이러한 알데히드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
또한, 약물 모이어티 상의 친핵기로는, 반응하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있는, 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
별법으로, 항체와 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 일정 길이의 DNA는 컨쥬게이트의 목적하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 구역에 의해 격리되거나 또는 서로 인접해 있는 컨쥬게이트의 두 부분을 코딩하는 각각의 구역을 포함할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 항체를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 컨쥬게이팅시킬 수 있는데, 이러한 항체-수용체 컨쥬게이트를 환자에게 투여한 다음, 소실제를 사용하여 결합되지 않은 컨쥬게이트를 순환물로부터 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성 뉴클레오티드)에 컨쥬게이팅된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
항체 (Ab)-MC-MMAE는 다음과 같이 본원에 제공된 임의의 항체와 MC-MMAE의 컨쥬게이션에 의해 제조될 수 있다. pH 8.0의 50O mM 붕산나트륨 및 500 mM 염화나트륨에 용해된 항체를 과량의 100 mM 디티오트레이톨 (DTT)로 처리한다. 37℃에서 약 30분 동안 인큐베이션한 후, 버퍼를 세파덱스 G25 수지 상에서의 용출에 의해 교환하고, 1 mM DTPA가 존재하는 PBS로 용출한다. 용액의 280 nm에서의 흡광도 로부터 환원된 항체 농도, 및 DTNB (알드리치 (Aldrich), 미국 위스콘신주 밀워키)와의 반응과, 412 nm에서의 흡광도 측정에 의한 티올 농도를 측정함으로써, 티올/Ab 값을 조사한다. PBS에 용해된 환원된 항체를 얼음 상에서 냉각시킨다. DMSO에 용해된 약물 링커 시약인 말레이미도카프로일-모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 즉 MC-MMAE를 공지된 농도로 아세토니트릴 및 물로 희석하고, PBS 중 냉각된 환원된 항체 2H9에 첨가한다. 약 1시간 후, 과량의 말레이미드를 첨가하여 반응을 켄칭하고, 임의의 미반응된 항체 티올기를 캡핑한다. 반응 혼합물을 원심분리 한외여과에 의해 농축하고, 2H9-MC-MMAE를 정제하고, PBS 중 G25 수지를 통해 용출시켜 탈염화하고, 멸균 조건하에서 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 저장을 위해 동결한다.
항체-MC-MMAF는 Ab-MC-MMAE의 제조를 위해 제공된 프로토콜에 따라 본원에 제공된 임의의 항체와 MC-MMAF의 컨쥬게이팅에 의해 제조될 수 있다.
항체-MC-val-cit-PAB-MMAE는 Ab-MC-MMAE의 제조를 위해 제공된 프로토콜에 따라 본원에 제공된 임의의 항체와 MC-val-cit-PAB-MMAE의 컨쥬게이팅에 의해 제조된다.
항체-MC-val-cit-PAB-MMAF는 Ab-MC-MMAE의 제조를 위해 제공된 프로토콜에 따라 본원에 제공된 임의의 항체와 MC-val-cit-PAB-MMAF의 컨쥬게이팅에 의해 제조된다.
항체-SMCC-DM1은 다음과 같이 본원에 제공된 임의의 항체와 SMCC-DM1의 컨쥬게이팅에 의해 제조된다. 정제된 항체를 (숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로 헥산-1-카르복실레이트 (SMCC, 피어스 바이오테크놀로지, 인크)로 유도체화시켜 SMCC 링커를 도입한다. 구체적으로, 항체를 pH 6.5의 50 mM 인산칼륨/50 mM 염화나트륨/2 mM EDTA 20 mg/mL에서 7.5 몰 당량의 SMCC (DMSO 중 20 mM, 6.7 mg/mL)로 처리한다. 주위 온도에서 아르곤 하에서 2시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 pH 6.5의 5O mM 인산칼륨/50 mM 염화나트륨/2 mM EDTA로 평형화된 세파덱스 G25 컬럼을 통해 여과한다. 항체 함유 분획을 모아서 분석한다.
이렇게 제조된 항체-SMCC를 pH 6.5의 5O mM 인산칼륨/50 mM 염화나트륨/2 mM EDTA로 최종 농도 약 10 mg/mL로 희석하고, 디메틸아세트아미드 중 DM1의 10 mM 용액과 반응시킨다. 반응물을 주위 온도에서 아르곤 하에서 16.5시간 동안 교반한다. 컨쥬게이팅 반응 혼합물을 pH 6.5의 1 x PBS로 세파덱스 G25 겔 여과 컬럼 (1.5 x 4.9 cm)을 통해 여과한다. DM1 약물 대 항체 비율 (p)은 252 nm 및 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정된 바와 같이 약 2 내지 5일 수 있다.
Ab-SPP-DM1은 다음과 같이 본원에 제공된 임의의 항체와 SPP-DM1의 컨쥬게이팅에 의해 제조된다. 정제된 항체를 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트로 유도체화시켜 디티오피리딜기를 도입한다. NaCl (50 mM) 및 EDTA (1 mM)를 함유하는 50 mM 인산칼륨 버퍼 (pH 6.5) 44.7 mL 중 항체 (376.0 mg, 8 mg/mL)를 SPP (2.3 mL 에탄올 중 5.3 몰 당량)로 처리한다. 주위 온도에서 아르곤 하에서 90분 동안 인큐베이션한 후, 반응 혼합물을 35 mM 시트르산나트륨, 154 mM NaCl, 2 mM EDTA 버퍼로 평형화된 세파덱스 G25 컬럼을 통해 겔 여과한다. 항체 함유 분획을 모아서 분석한다. 항체의 변형 정도를 상기한 바와 같이 측정한다.
항체-SPP-Py (약 10 μmol)의 방출가능한 2-티오피리딘기)를 pH 6.5의 상기 35 mM 시트르산나트륨 버퍼로 최종 농도 약 2.5 mg/mL로 희석한다. 그 후, 3.0 mM 디메틸아세트아미드 (DMA, 최종 반응 혼합물 중 3％ v/v) 중 DM1 (1.7 당량, 17 μmol)을 항체 용액에 첨가한다. 반응을 주위 온도에서 아르곤 하에서 약 20시간 동안 진행시킨다. 반응물을 pH 6.5의 35 mM 시트르산나트륨, 154 mM NaCl으로 평형화된 세파크릴 (Sephacryl) S300 겔 여과 컬럼 (5.0 cm x 90.0 cm, 1.77 L) 상에 로딩한다. 유속은 약 5.0 mL/분일 수 있으며, 65개 분획 (각각 20.0 mL)이 수집된다. 252 nm 및 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 항체 분자당 결합된 DM1 약물 분자의 수 (p')를 측정하며, 이는 2H9 항체당 약 2 내지 4개의 DM1 약물 잔기일 수 있다.
항체-BMPEO-DM1은 다음과 같이 본원에 제공된 임의의 항체와 BMPEO-DM1의 컨쥬게이팅에 의해 제조된다. 항체를 비스-말레이미도 시약 BM(PEO)4 (피어스 케미칼 (Pierce Chemical))에 의해 변형시키고, 항체의 표면 상의 미반응된 말레이미도기가 남는다. 이는 BM(PEO)4를 50％ 에탄올/물 혼합물에 10 mM의 농도로 용해시키고, 10배 몰 과량을 인산염 완충 염수 중 항체를 함유하는 용액에 대략 1.6 mg/mL (10 μM)의 농도로 첨가하고, 이를 1시간 동안 반응시켜 항체-링커 중간체인 2H9-BMPEO를 형성함으로써 달성될 수 있다. 과량의 BM(PEO)4를 150 mM NaCl 버퍼를 갖는 pH 6의 30 mM 시트레이트에서의 겔 여과 (하이트랩 (HiTrap) 컬럼, 파마시아 (Pharmacia))에 의해 제거한다. 대략 10배 몰 과량의 DM1을 디메틸 아세트아미드 (DMA)에 용해시키고, 2H9-BMPEO 중간체에 첨가한다. 디메틸 포름아미드 (DMF)를 또한 사용하여 약물 모이어티 시약을 용해시킬 수 있다. 반응 혼합물을 밤새 반응시킨 후, PBS 상으로의 겔 여과 또는 투석으로 미반응된 DM1을 제거한다. PBS 중 S200 컬럼 상의 겔 여과를 이용하여 고분자량 응집체를 제거하고, 정제된 2H9-BMPEO-DM1을 제공한다.
항체 유도체
본 발명의 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 한 실시태양에서, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비-제한적인 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 그의 물에서의 안정성 때문에 제조상의 잇점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있으며, 분지되거나 비분지될 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나 초과의 중합체가 부착될 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 종류는 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건 하에서 요 법에 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 고려사항을 기초로 하여 결정될 수 있다.
다른 실시태양에서, 항체와 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 컨쥬게이트가 제공된다. 한 실시태양에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포를 치사시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
제약 제제
본 발명의 항체를 포함하는 치료 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 선택적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 보관을 위해 수용액, 동결건조 또는 다른 건조 제제의 형태로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 투여 대상에게 비독성이고, 버퍼, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레졸시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역 글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN(등록상표) PLURONICS(등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원에서 제제는 또한 서로 유해한 영향을 주지 않는 상보 활성을 갖는 것을 포함하고 이로 제한되지 않는, 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 상기 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
지연 방출 제제를 제조할 수 있다. 지연 방출 제제의 적합한 예는 본 발명 의 면역글로불린을 함유하는 소수성 고체 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지연 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능 미세구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예를 들어 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 히드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 면역글로불린이 장기간 동안 신체에서 유지될 때, 이들은 37℃에서 습기에 노출될 때 변성 또는 응집되어 생물학적 활성 및 가능하게는 면역원성의 변경을 야기할 수 있다. 관련되는 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 습기 함량의 조절, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성할 수 있다.
용도
본 발명의 항체는 예를 들어 시험관 내, 생체 외 및 생체 내 치료 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 시험관 내에서, 생체 외에서 및/또는 생체 내에서 특정 항원 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하는 길항제로서 사용될 수 있 다. 더욱이, 본 발명의 항체의 적어도 일부는 다른 종으로부터 항원 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 예를 들어 항원을 함유하는 세포 배양액에서, 인간 대상에서, 또는 본 발명의 항체가 교차-반응하는 항원을 갖는 다른 포유동물 대상 (예를 들어 침팬지, 비비 (baboon), 마모셋, 사이노몰거스 원숭이 (cynomolgus) 및 붉은털원숭이, 돼지 또는 마우스)에서 특정 항원 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명의 항체는, 항체를 항원과 접촉시켜 항원 활성을 억제시킴으로써 항원 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 항원은 인간 단백질 분자이다.
한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 본 발명의 항체를 대상에게 투여하여 대상에서 항원 활성이 억제되도록 하는 것을 포함하는, 항원 활성이 유해한 질환을 앓고 있는 대상에서 항원을 억제하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 항원은 인간 단백질 분자이고, 대상은 인간 대상이다. 별법으로, 대상은 본 발명의 항체가 결합하는 항원을 발현하는 포유동물일 수 있다. 추가의 대상은 (예를 들어 항원의 투여에 의해 또는 항원 트랜스진 (transgene)의 발현에 의해) 항원이 그 내부로 도입되는 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료 목적을 위해 인간 대상에게 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 수의학 목적을 위해 또는 인간 질병의 동물 모델로서, 항체가 교차-반응하는 항원을 발현하는 비-인간 포유동물 (예를 들어 영장류, 돼지 또는 마우스)에 투여될 수 있다. 후자에 있어서, 상기 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는데 (예를 들어 투여량 및 투여의 시간 과정을 시험하는데) 유용할 수 있다. 본 발명의 항체는 세포 증식 질환, 감염, 면역/염증성 질환, 및 다른 인터페론-관련 질환을 포함하고 이로 제한되지 않는 RELT의 비정상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병, 질환 또는 병태의 치료, 억제, 진행의 지연, 재발의 방지/지연, 경감 또는 예방에 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 차단 항체는 RELT에 특이적으로 결합하여, RELT와 하나 이상의 RELT 리간드 사이의 상호작용을 차단하거나 방해하여 대응하는 신호 전달 경로 및 다른 연관된 분자 또는 세포 사건을 억제함으로써 정상적인 RELT 활성을 억제한다.
특정 실시태양에서, 세포독성제와 컨쥬게이팅된 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트가 환자에게 투여된다. 일부 실시태양에서, 그가 결합된 면역컨쥬게이트 및/또는 항원은 세포에 의해 내재화되어, 이것이 결합하는 표적 세포를 사멸시키는 면역컨쥬게이트의 치료 효능을 증가시킨다. 한 실시태양에서, 세포독성제는 표적 세포에서 핵산을 표적화하거나 방해한다. 이러한 세포독성제의 예로는 본원에서 언급된 임의의 화학치료제 (예를 들어 메이탄시노이드 또는 칼리케아미신), 방사성 동위원소, 또는 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제를 들 수 있다.
본 발명의 항체는 요법에서 단독으로 또는 다른 조성물과 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 또다른 항체 및/또는 보강제/치료제 (예를 들어, 스테로이드)와 동시에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 치료 계획에서, 예를 들어 세포 증식 질환, 감염, 면역/염증성 질환, 및 다른 인터페론-관련 질환을 비롯한 본원에 기재된 임의의 질환의 치료에 있어서, 소염제 및/또는 방부제와 조합될 수 있다. 상기 언급된 바와 같은 조합 요법은 조합 투여 (2종 이 상의 물질이 동일한 또는 별개의 제제에 포함될 경우), 및 개별 투여를 포함하며, 이 경우 본 발명의 항체의 투여는 부가 요법제(들)의 투여 전 및/또는 후에 수행될 수 있다.
본 발명의 항체 (및 부가 치료제)는 비경구, 피하, 복막내, 폐내 및 비내, 및 필요할 경우 국소 치료용으로, 병변내 투여를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체는 적합하게는 특히 항체의 감소하는 투여량으로 펄스 주입에 의해 투여된다. 투여량은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로 투여가 간단한지 또는 만성인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해서 수행될 수 있다.
본 발명의 항체의 결합 표적의 위치가 항체 제조 및 투여시에 고려될 수 있다. 결합 표적이 세포내 분자일 때, 본 발명의 특정 실시태양은 결합 표적이 위치하는 세포 내로 도입되는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 세포 내에서 인트라바디 (intrabody)로서 발현될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 용어 "인트라바디"는 문헌 ([Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997)]; [Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004)]; 미국 특허 6,004,940 및 6,329,173; 미국 특허 출원 공개 2003/0104402, 및 PCT 공개 WO2003/077945)에 기재된 바와 같이, 세포 내에서 발현되고 표적 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 의미한다. 인트라바디의 세포내 발현은 목적하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분 (항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 유전자 와 정상적으로 연관되는 야생형 리더 서열 및 분비 시그날이 결핍됨)을 코딩하는 핵산을 표적 세포 내로 도입함으로써 실행된다. 미세주입, 발리스틱 (ballistic) 주입, 전기천공, 인산칼슘 침전, 리포좀, 및 목적하는 핵산을 함유하는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 및 우두 벡터를 사용한 형질감염을 포함하고 이로 제한되지 않는, 핵산을 세포 내로 도입하는 임의의 표준 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 항-RELT 항체의 전부 또는 일부를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 세포 내에서 RELT에 결합하여 하나 이상의 RELT-매개 세포성 경로를 조정할 수 있는 하나 이상의 인트라바디를 발현할 수 있도록 표적 세포에 전달될 수 있다.
다른 실시태양에서, 내재화 항체가 제공된다. 항체는 항체의 세포 내로의 전달을 향상시키는 특정 특성을 가질 수 있거나, 또는 상기 특성을 갖도록 변형될 수 있다. 이를 달성하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체의 양이온화는 그의 세포 내로의 흡수를 용이하게 하는 것으로 알려져 있다 (예를 들어 미국 특허 6,703,019 참조). 또한, 리포펙션 (lipofection) 또는 리포좀은 항체를 세포 내로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제 단편이 일반적으로 유리하다. 예를 들어, 항체의 가변 구역 서열을 기초로 하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 상기 펩티드는 화학적으로 합성되고/되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 7889-7893 (1993)] 참조).
조정자 (modulator) 폴리펩티드의 표적 세포 내로의 도입은 당업계에 공지된 방법에 의해 증강될 수 있다. 예를 들어, HIV Tat 또는 안테나페디아 호메오도메인 (Antennapedia homeodomain) 단백질로부터 유래된 것과 같은 특정 서열은 이종 단백질의 세포막을 가로지른 효율적인 흡수를 유도할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329] 참조).
결합 표적이 뇌 내에 위치할 때, 본 발명의 특정 실시태양은 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 신경변성 질병은 혈액-뇌 장벽의 투과성 증가와 연관되어, 항체 또는 항원 결합 단편은 뇌에 쉽게 도입될 수 있다. 혈액-뇌 장벽이 온전한 상태로 유지될 경우, 물리적 방법, 지질-기반 방법, 및 수용체 및 채널-기반 방법을 비롯하여 장벽을 가로질러 분자를 수송하기 위한 당업계에 공지된 복수의 방법이 존재한다.
항체 또는 항원 결합 단편을 혈액-뇌 장벽을 가로질러 수송하기 위한 물리적 방법은 혈액-뇌 장벽을 완전히 우회하거나, 또는 혈액-뇌 장벽에 개구부를 생성시키는 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 우회 방법은 뇌 내로의 직접 주입 (예를 들어, 문헌 [Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)] 참조) 및 뇌 내에 전달 장치의 이식 (예를 들어, 문헌 [Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); 및 Gliadel Wafers™, 길포드 파마슈티칼 (Guildford Pharmaceutical) 참조)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 장벽에 개구부를 생성시키는 방법은 초음파 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2002/0038086 참조), 삽투압 (예를 들어, 고장성 (hypertonic) 만니톨의 투여에 의해 (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), 예를 들어, 브라디키닌 또는 투과제 (permeabilizer) A-7에 의한 투과 (예를 들어 미국 특허 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206, 및 5,686,416 참조), 및 혈액-뇌 장벽에 걸쳐 있는 신경세포의, 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터를 사용한 형질감염 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2003/0083299 참조)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
항체 또는 항원 결합 단편을 혈액-뇌 장벽을 가로질러 수송하는 지질-기반 방법은 혈액-뇌 장벽의 혈관 내피 상의 수용체에 결합하는 항체 결합 단편에 커플링된 리포좀 내에 항체 또는 항원 결합 단편의 봉입 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 20020025313 참조), 및 저밀도 지단백질 입자 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 20040204354 참조) 또는 아포지단백질 E (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 20040131692 참조)를 사용한 항체 또는 항원 결합 단편의 코팅을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
항체 또는 항원 결합 단편을 혈액-뇌 장벽을 가로질러 수송하기 위한 수용체 및 채널-기반 방법은 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위한 글루코코르티코이드 차단제의 사용 (예를 들어 미국 특허 출원 공개 2002/0065259, 2003/0162695, 및 2005/0124533 참조); 칼륨 채널 활성화 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2005/0089473 참조), ABC 약물 수송제의 억제 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2003/0073713 참조); 트랜스페린을 사용한 항체의 코팅 및 하나 이상의 트랜스페린 수용체의 활성 조정 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2003/0129186 참조), 및 항 체의 양이온화 (예를 들어, 미국 특허 5,004,697 참조)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 조성물은 우수한 의료 실무와 일치하는 방식으로 제제화, 투여량화 및 투여될 것이다. 이러한 측면에서 고려할 인자로는 치료될 특정 질환, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 질환의 원인, 물질의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료인에게 공지된 다른 인자를 들 수 있다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로 해당 질환을 예방하거나 치료하는데 통상적으로 사용되는 1종 이상의 물질과 함께 제제화된다. 이러한 다른 물질의 유효량은 제제 내에 존재하는 본 발명의 항체의 양, 질환 또는 치료의 종류, 및 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 1 내지 99％로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로 또는 화학치료와 같은 다른 물질과 조합으로 사용될 경우)은 치료될 질병의 종류, 항체의 종류, 질병의 심도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 이전의 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 결정에 의존할 것이다. 항체는 적합하게는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 질병의 종류 및 심도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여로든 연속 주입으로든, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어 O.1 mg/kg 내지 1O mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 가지 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그보다 큰 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 상태에 따라 치료는 일반적으로 질병 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 한 가지 예시적인 항체의 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 투여량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투여량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 매 3주마다 (예를 들어 환자가 약 2 내지 20회, 예를 들어 약 6회 투여량의 항체를 투여받도록) 투여될 수 있다. 보다 높은 초기 로딩 투여량 후에 1회 이상의 보다 낮은 투여량이 투여될 수 있다. 예시적인 투여량 처방은 약 4 mg/kg의 항체의 초기 로딩 투여량 후에 약 2 mg/kg의 항체를 매주 유지 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투여량 처방도 유용할 수 있다. 상기 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
제품
본 발명의 또다른 측면에서, 상기 기재된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 제품은 용기, 및 상기 용기 상의 라벨 또는 상기 용기와 결합된 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 들 수 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물을 그 자체로, 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또다른 조성물과 조합하여 포함하며, 멸균 주입구를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 (bag), 또는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개 (stopper)를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 병태를 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 더욱이, 제품은 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시태양에서 제품은 조성물이 특정 병태를 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 제품은 주사용 정균수 (BWFI), 인산염 완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 버퍼, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 비롯하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
이하는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기에 제공된 일반적인 설명을 기초로 하여, 다양한 다른 실시태양이 실시될 수 있음이 이해된다.
실시예 1: 항- RELT 모노클로날 항체의 생산 및 특성화
(a) 라이브러리 스크리닝
인간화 Fab'2 라이브러리를 발현하는 파지 디스플레이 클론을 문헌 ([Lee et al., J. Mol. Biol. 340: 1073-1093 (2004)] 및 미국 특허 출원 공개 2005-0106667)에 기재된 바와 같이 RELT-Fc 융합 단백질에 결합하는 그들의 능력에 대해 스크리닝하였다. 파지 디스플레이 항체 라이브러리는 3개의 모든 중쇄 CDR에 무작위 선발된 아미노산을 포함하였고, 인간화 항체 4D5를 기초로 한 것이었다. 일반적인 중쇄 및 경쇄 가변 구역 컨센서스 프레임워크는 각각 도 1 및 2에 제시하였고, 4D5 항체의 프레임워크 구역은 도 3에 제시하였다. 또한, 4D5 프레임워크 서열의 특정 변이체는 도 4에 도시된 바와 같이 알려져 있다.
4회의 선택 후에, 8개의 양성 클론을 단리하였다. 관련 단편을 PCR에 의해 증폭하고 이를 전체 인간 IgG1을 생산하도록 IgG1 구성체 내로 스플라이싱함으로써 파지 Fab'2 클론을 재설정하였다. 이어서, 8개의 항-RELT mAb를 CHO 세포 상등액으로부터 정제하고, 비오틴 (피어스)으로 표지하였다. 8개의 CHO 세포 균주의 생산성은 약 8,000 ng/mL 내지 약 18,000 ng/mL로 상이하였고, mAb H7이 최저량으로, mAb F4가 최고량으로 생산되었다.
각각의 mAb의 중쇄 및 경쇄의 서열을 결정하였다. 중쇄의 CDR은 도 5에 제시하였다. 각각의 mAb의 경쇄는 변형된 인간 모노클로날 항체 4D5-8 (서열 2)의 경쇄 서열과 동일하였다.
(b) 항- RELT mAb 의 특성화
(1) 세포 표면에서의 결합
세포 표면에서 RELT를 발현하는 세포에 대한 각각의 항체의 결합을 평가하였다. 모의 (대조) 또는 뮤린 RELT cDNA로 형질감염된 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포를 별개로 빙상에서 30분 동안 각각의 항-RELT 항체로 염색하였다. 세포를 인산 염 완충 염수 (PBS)로 세촉한 후, PE-표지된 항-인간 IgG 항체와 함께 인큐베이팅하였다. 세포의 형광 강도를 FACSCalibur (비디 사이언스 (BD Science)), 이어서 Cell Quest (비디 사이언스) 분석으로 평가하였다.
8개의 항체는 모두 대조 BHK 세포에 특이적으로 결합하지 않았지만, 각각의 항체는 RELT cDNA로 형질감염된 BHK 세포에 특이적으로 결합하였다 (도 6 참조). 또한, 8개의 항체 중 5개 (F4, C1O, H7, H9, 및 H11)의 특이적 결합은 상기 BHK 세포의 형질감염 및 결합에 대해 설명한 바와 동일한 프로토콜을 사용하여 RELT를 발현하는 마우스 비장세포에서 관찰되었다 (도 7). 마우스의 RELT-발현 비장세포에 가장 강하게 결합한 3개의 항-RELT mAb (H7, H9, 및 H11)는 relt -/- 마우스로부터의 마우스 비장세포에 결합하지 않았다 (도 7, 맨 아래쪽 열).
(2) 항- RELT 항체의 NF -κB 활성화에 대한 관계
세포에서 NF-κB 활성화에 대한 항-RELT 항체의 효과를 평가하였다. HEK293 세포를 표시된 용량의 RELT-xedar cDNA (뮤린 RELT의 세포외 도메인 및 xedar의 세포질 도메인)로 형질감염시켰다. 12시간 후에, 각각의 항-RELT 항체를 10 ㎍/mL의 농도로 별개의 배양액에 첨가하고, 세포를 추가로 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 루시퍼라제 활성을 이중-리포터 분석 키트 (Dual-Luciferase(등록상표) Reporter Assay Systems) (프로메가 (Promega))에 의해 측정하였다. 각각의 항-RELT 항체는 세포에서 NF-κB 생산을 상이한 수준이지만 용량-의존 방식으로 자극하였다 (도 8). 최소 자극 (5 ng RELT-xedar에 대해 약 7배 및 25 ng RELT-xedar에 대해 약 22배)은 F4 항-RELT 항체에서 관찰되었고, 최대 자극 (5 ng RELT-xedar에 대해 약 20배 및 25 ng RELT-xedar에 대해 약 50-60배)은 C1O, H9, 및 H11 mAb에서 관찰되었다.
(3) 친화도 of 항- RELT 항체 for 뮤린 RELT
각각의 항-RELT 항체의 RELT에 대한 친화도를 결정하기 위해서, 적정된 양의 뮤린 RELT의 존재 하에 각각의 고정된 항-RELT 항체에 대한 파지 기반 경쟁적 결합 ELISA를 각각의 클론에 대해 수행하였다. 96-웰 Maxisorp 면역플레이트 (NUNC)를 PBS 중의 2 ㎍/mL의 농도의 뮤린 RELT로 4℃에서 철야 코팅하고, 0.5% BSA 및 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS ("PBT")로 2시간 동안 실온에서 차단하였다. PBT 중의 항-RELT 항체를 디스플레이하는 파지의 연속 희석액을 항원-코팅된 플레이트 상에서 15분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 0.05% Tween 20 함유 PBS ("PBST")로 세척하였다. 결합된 파지를 PBT 중에 1:5000으로 희석된 양고추냉이 퍼옥시다제 (애머샴 파마시아 (Amersham Pharmacia))로 표지된 항-M13 모노클로날 항체로 검출하고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 기질 (TMB, 키르케가아드 & 페리 랩스 (Kirkegaard & Perry Labs), 미국 메릴랜드주 게이더스버그)을 사용하여 약 5분 동안 현상하고, 1.0 M H3PO4로 켄칭시키고, 450 nm에서 분광광도기로 판독하였다. 항체의 친화도는 표 B에 나타낸 바와 같이 4 nM (mAb H11의 경우) 내지 250 nM (mAb H7의 경우)이었다.
항-RELT 항체 친화도 데이타
클론# Kd (M)
C2 8x10-8
C10 2x10-8
E5/E7 1x10-7
F4 2x10-7
F5 1x10-7
H7 2.5x10-7
H9 4x10-8
H11 4x10-9
(4) BIAcore (등록상표) 분석
RELT에 대한 항-RELT 모노클로날 항체 H11의 친화도를 BIAcore(등록상표) 3000 (비아코아, 인크.)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (SRP) 분석에 의해 추가로 평가하였다. 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코아, 인크.)을 공급사의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시켰다. 항-RELT 항체 H11을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)로 5 ㎍/mL의 농도로 희석하였다. 약 500 응답 단위 (RU)의 항체가 유동 세포 표면에 커플링될 때까지 희석된 H11 항체를 5 ㎕/분의 유속으로 유도체화된 CM5 칩 표면 상에 주입하였다. 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응군을 차단하였다. 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS 중의 뮤린 his-태깅된 RELT (7.5 nM 내지 50O nM)의 연속 희석액을 25 ㎕/분의 유속으로 25℃의 항온에서 H11-고정된 유동 세포 상에 주입하였다. 간단한 일대일 랭그뮈어 결합 모델 (BIAcore Evaluation 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 관찰된 결합 곡선으로부터 회합율 (kon) 및 해리율 (koff)을 유도하였다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로서 계산하였다. 항-RELT 항체 H11-마우스 RELT 상호작용에 대한 비는 다음과 같았다: kon: 1.52 x 105 M-1S-1; koff: 1.24 x 10-3 s-1; 및 Kd: 8.13 x 10-9 M.
(5) 항- RELT 항체의 인간 RELT 와의 교차반응성
인간 RELT를 특이적으로 인식하는 H11 항-RELT 항체의 능력을 평가하였다. HEK293 세포를 대조 벡터 또는 인간 RELT cDNA로 형질감염시켰다. 48시간 동안 인큐베이팅한 후에, 형질감염된 세포를 수거하고, 빙상에서 30분 동안 비오티닐화 항-RELT 항체 H11로 염색하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 아비딘-PE 및 나타낸 FITC- 또는 APC-표지된 항체로 염색하였다. 세포의 형광 강도를 FACS 분석 (FACSCalibur (비디 사이언스), 이어서 CellQuest 분석 (비디 사이언스)으로 평가하였다. 도 1OA 및 1OB에 나타낸 바와 같이, 항체 H11은 인간 RELT를 특이적으로 인식하였다 (도 1OA를 도 10B와 비교함).
실시예 2: 면역 세포 상에서의 RELT 의 발현
T 세포, B 세포, 및 비장세포를 비롯하여 마우스로부터의 상이한 야생형 면역 세포 상에서의 RELT의 발현 정도를 확인하기 위한 도구로서 항-RELT 항체 H11을 사용하였다. 자기 비드 (밀테니이 (Miltenyi))에 의해 C57/BL6 마우스 비장으로부터 T 세포를 정제하고, 항-CD3 및 항-CD28 (10 ㎍/mL), IFN-α (100 ng/mL), IFN-γ (100 ng/mL), IL-2 (100 U/mL), IL-4 (100 ng/mL), IL-6 (100 ng/mL), 또는 IL-12 및 IL- 18 (100 ng/mL)과 함께 48시간 동안 배양하여 상이한 T 세포 서브타입으로의 분화를 유도하였다 (도 11 참조). 이어서, 세포를 빙상에서 30분 동안 비오티닐화 항-RELT 항체 H11과 함께 인큐베이팅하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 아비딘-PE와 함께 인큐베이팅하였다. 세포의 형광 강도는 FACSCalibur (비디 사이언스), 이어서 Cell Quest 분석 (비디 사이언스)으로 평가하였다. 항체 H11은 천연 T 세포 및 각각의 처리된 T 세포 집단에 특이적으로 결합하였고, 이것은 T 세포 및 분화된 T 세포가 RELT를 발현함을 나타낸다.
자기 비드 (밀테니이)에 의해 B 세포를 C57/BL6 마우스 비장으로부터 정제하고, 항-IgM (10 ㎍/mL), 항-CD40 (10 ㎍/mL), LPS (10 ㎍/mL), 또는 IL-4 (100 ng/mL)와 함께 48시간 동안 배양하여 상이한 B 세포 집단으로의 분화를 유도하였다 (도 12 참조). 이어서, 세포를 빙상에서 30분 동안 비오티닐화 항-RELT 항체 H11과 함께 인큐베이팅하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 아비딘-PE와 함께 인큐베이팅하였다. 세포의 형광 강도는 FACSCalibur (비디 사이언스), 이어서 CellQuest 분석 (비디 사이언스)으로 평가하였다. 항체 H11은 천연 B 세포 또는 처리된 임의의 B 세포 집단에 특이적으로 결합하지 않았고, 이것은 B 세포 또는 분화된 B 세포가 RELT를 발현하지 않음을 나타낸다.
비장세포를 C57/BL6 마우스로부터 단리하고, 비오티닐화 항-RELT 항체 H11로 빙상에서 30분 동안 염색하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 아비딘-PE 및 나타낸 FITC- 또는 APC-표지된 항체 (항-CD3, 항-B220, 항-CD11b, 및/또는 항-Gr-1)로 염색하였다. 세포의 형광 강도는 FACSCalibur (비디 사이언스), 이어서 Cell Quest 분석 (비디 사이언스)으로 평가하였다. 그 결과를 도 13에 도시한다. 항체 H11은 T 세포 및 대식세포에 결합하였고, 이것은 그 세포 집단이 RELT를 발현함을 시사한다. H11의 B 세포, NK 세포, 또는 호중구에 대한 강한 결합은 관찰되지 않았고, 이것은 그 세포 집단이 RELT를 발현하지 않음을 시사한다.
실시예 3: 마우스에서 RELT 의 표적화된 파괴 및 면역 세포 발생에 대한 RELT 파괴의 효과
(a) RELT -파괴된 마우스의 생성
RELT의 아미노산 17-210을 코딩하는 엑손 II-V를 제거하도록 설계된 표적화 벡터를 사용하여 RELT-결핍 마우스를 생성시켰다 (도 14A 참조). 표적화 벡터는 129/SvJ 라이브러리 (인사이트 제노믹스 (Incyte Genomics))로부터 단리한 게놈 relt 클론을 사용하여 제조하고, 129 R1 배아 줄기 (ES) 세포 내로 전기천공시켰다. 이종접합성 ES 세포 클론 18B7을 서던 블로팅으로 확인하고, C57BL/6N 포배 내로 미세주입하였다. 키메라 자손체 (offspring)를 C57BL/6N 마우스에 역교배 (backcross)시켰다. 마우스는 PGK-neo 선택 카세트를 보유하였다. 생식선 relt 파괴는 PCR, 서던 블로팅 (도 14B 참조), 및 T 림프구의 유동 세포측정 분석 (도 11C)에 의해 확인하였다. PCR은 제조사의 지시에 따라 Expand Long Template PCR System 키트 (로슈 (Roche)), 5' 프라이머 AGTAGAAGGTGGCGCGAAGG (서열 69), 및 3' 프라이머 CTGCCCACAGACAAGATGGTAATCTC (서열 70)을 사용하여 수행하였다. 서던 블로팅은 SspI- 및 NotI-소화된 DNA를 표적화 구성체의 5' 서열에 결합하는, 도 14A에 도시된 프로브에 혼성화시켜 수행하였다. 도 14B에 제시된 12.9 및 7.1-kb DNA 단편은 각각 야생형 및 돌연변이체 relt 대립유전자에 대응하였다. 유동 세포측정 분석은 상기 실시예 1(b)(1)에서 설명한 바와 같이 수행하였다.
relt-파괴된 마우스는 생존가능하고, 번식능력이 있으며, 예상된 멘델 빈도로 자손을 출산하였다. 모든 후속 실험은 제넨테크 연구 심사 위원회에서 승인된 프로토콜을 이용하여 6 내지 14주령의 relt -/- 및 relt +/+ 마우스를 사용하여 수행하였다.
(b) RELT -파괴된 마우스에서 T, B, 및 NK 세포 발생에 대한 분석
천연 T 림프구는 RELT를 발현하는 것으로 알려져 있다 (도 11, 도 15B 참조). 따라서, relt -/- T 림프구의 특성을 조사하였다. relt -/- 및 relt +/+ 마우스의 비장을 잘게 다진 후, 문헌 [Nakano et al., J. Exp. Med. 194: 1171-1178 (2001)]에 보고된 바와 같이 1 mg/mL의 콜라게나제 A (로슈)로 소화시켰다. 표면 RELT 발현의 유동 세포측정 분석을 위해, 항-RELT mAb 에피토프의 단백질 분해에 의한 분해를 방지하기 위해 30분 동안 20 mM EDTA-PBS와 함께 인큐베이팅함으로써 비장세포를 확보하였다. 세포를 항-CD16/32 (2.4G2)로 차단한 후, 다음 항체의 다양한 조합을 사용하여 2중 또는 3중으로 염색하였다: CD3 (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8 (53-6.7), CD11b (M1/70), CD11c (HL3), CD45RB (16A), CD80 (IG1O), CD86 (GL1), I-Ab (AF6-120.1), B220 (RA3-6B2), 및 DX5 (모두 비디 파밍겐 (BD Pharmingen) 제품). 비오티닐화 항체 결합은 스트렙타비딘-PE (비디 파밍겐)의 첨가에 의해 밝혀졌다. 프로피듐 요오다이드를 사용하여 죽은 세포를 제외하였다. 세포를 FACS Caliber 시스템 (비디 사이언스)을 사용하여 분석하였다. 일반적으로 relt -/- 마우스와 relt +/+ 마우스 사이에서 비장 면역 세포 중의 T 세포 수 또는 그의 비례적인 표시의 분명한 차이가 관찰되지 않았다. 흉선, 림프절, 및 비장 내의 T 세포 수는 relt -/-와 relt +/+ 마우스 사이에서 대등하였다 (도 15A 참조). CD4, CD8, CD25, 및 CD44에 대한 항체로 염색된 세포의 유동 세포측정 분석은 다양한 T-세포 하위세트의 풍부도에서 어떠한 차이도 보이지 않았다 (도 15C 참조).
항-CD3 항체에 반응하여 relt -/- 및 relt +/+ 세포 모두로부터의 T 림프구의 증식을 삼중수소-표지된 티미딘 혼입 분석으로 평가하였다. 야생형 및 relt -/- 마우스로부터의 정제된 T 세포를 표시된 양의 항-CD3 항체 단독과 함께 (도 15D, 좌측 패널), 또는 코팅 용액 중의 10 ㎍/mL의 농도로 플레이트에 적용된 항-CD28 항체와 함께 (도 15D, 우측 패널) 배양하였다. 항체 또는 항체들에 반응한 세포의 증식은 [3H]-티미딘 혼입에 의해 측정하였다 (Coligen et al., eds., Current Protocols in Immunology, New York: Wiley, 1991 참조). 그 결과는 relt -/- T 세포가 야생형 T 세포와 유사하게 증식하였음을 보여주었다. 또한, relt -/- 및 relt +/+ T 림프구는 IL-2 및 IFN-γ의 생산에서 차이를 보이지 않았다. 종합적으로, 상기 모든 분석 결과는 RELT가 정상적인 T 세포 발생 및 증식에 필요하지 않음을 시사하였다.
B 림프구 및 천연 킬러 (NK) 세포는 세포 표면에 RELT를 거의 발현하지 않는다 (도 15B, 중앙 및 우측 패널, 도 12, 및 도 13). B 림프구 및 NK 세포의 수는 유동 세포측정 분석으로 측정할 때 relt -/- 및 relt +/+ 마우스의 비장에서 유사하였다 (도 15A). CD25, CD44, B220, IgM, CD5, CD11b, CD21, CD23, 및 CD43에 대한 항체를 사용한 염색 후에 골수, 비장, 림프절, 및 복막강으로부터의 세포의 광범한 유동 세포측정 분석에 따르면, relt -/-와 relt +/+ 마우스 사이에 어떠한 차이도 보이지 않았다. 이 결과는 RELT가 체액성 면역에서 중요한 역할을 수행하지 않음을 시사하였다.
(c) RELT -파괴된 마우스에서 항체 생산에 대한 분석
하나 이상의 항체 서브타입의 생산이 relt의 파괴에 의해 손상되는지를 결정하기 위해 마우스를 평가하였다. relt -/- 및 relt +/+ 마우스를 T-의존 항원인 2,4-디니트로페놀-컨쥬게이팅된 난알부민 (DNP-OVA)으로 면역화시켰다. 0.1% 수산화알루미늄 흡착 겔 (#8000-01, 인터겐 컴퍼니 (Intergen Company))을 포함하는 2 ml의 주사 용액, 및 PBS 중의 0.09975 mg/mL의 DNP-OVA 용액을 제조하고, 알루미늄에 의한 효과적인 항원 흡착을 보장하기 위해 용액을 30분 동안 혼합하였다. 야생형 및 relt-낙아웃 (knockout) 마우스 (각각 약 20 g)를 0일에 100 ㎕의 주사 용액을 복강 내로 주사하여 면역화시키고, 10일차에 100 ㎕을 다시 주사하여 부스팅하였다. 주사된 마우스로부터의 혈청 샘플을 0일 및 14주에 채취하고, DNP-BSA 코팅된 멀티웰 플레이트 상의 특정 항체 역가를 위한 ELISA 분석에 적용하였다. 동등한 양의 항원-특이적 IgG1, IgG2a, IgG3, IgM, 및 IgE 항체가 두 마우스 집단 모두에서 생산되었고 (도 16A-16E), 이것은 RELT가 체액성 면역의 발생에서 중요한 역할을 수행하지 않음을 시사하였다.
(d) RELT -파괴된 마우스에서 수지상 세포 발생에 대한 분석
RELT의 부재 하에서 T, B, 및 NK 세포 발생에 대한 어떠한 명백한 비정상도 관찰되지 않았다. 따라서, 추가의 면역 세포 집단, 특히 수지상 세포를 조사하였다. relt-/- 및 relt +/+ 마우스의 비장을 잘게 다진 후, 상기한 바와 같이 1 mg/mL의 콜라게나제 A (로슈)로 소화시켰다. 비오티닐화 항-CD11c 및 항-비오틴 MACS 비드 (밀테니이)를 사용하여 수지상 세포를 확인하였다. 콜라게나제-처리된 비장세포를 수지상 세포에 대한 표면 마커인 CD11c에 대한 항체로 염색하면, relt +/+ 한배 새끼 대조물에 비해 relt -/- 마우스에서 유의하게 더 큰 수지상 세포 집단이 나타났다 (도 17A). 또한, relt-/- 마우스에서 수지상 세포 수의 증가는 통계학적 분석에 의해서도 지지되었다 (도 17B).
CD11c+ DC는 CD11b 및 B220의 세포 표면 발현을 기초로 하여 2개의 하위집단, 즉 cDC (CD11b+B220-) 및 pDC (CD11b-B220+)으로 분류될 수 있다 ([Hochrein et al., Hum. Immunol. 63: 1103-10 (2002)]; [Nakano et al., J. Exp. Med. 194: 1171-8 (2001)]; [Asselin-Paturel et al., Nat. Immunol. 2: 1144-50 (2001)]). 상기한 바와 같이 제조한 비장세포를 비오티닐화 항-CD11b 및 항-B220으로 염색하고, MACS 비드 (밀테니이)로 고갈시켜 pDC 및 cDC를 농축하였다. FACSVantage (비디 사이언스) 분류를 사용하여 pDC (CD11c+B220+) 및 cDC (CD11c+B220-) 집단을 추가로 정제하였다. 유동 세포측정 분석 및 세포 계수는 relt -/- 마우스가 relt +/+ 마우스보다 약 2배 더 많은 비장 pDC를 갖는다는 것을 나타내었다 (도 3A 및 3B). relt +/+와 relt -/- 마우스 사이에 비장 cDC의 수는 통계학상 유의한 차이가 없었지만 (도 3A 및 3B), RELT 발현은 유동 세포측정 분석에 의해 pDC 및 cDC 모두에서 검출가능하였다 (도 3C). relt +/+ 마우스에 비해 약 1.8배 더 많은 pDC가 relt -/- 마우스의 흉선에서 관찰되었다.
relt -/- 비장세포에서 확장된 CD11c+B220+CD11b- 집단이 "전형적인" pDC를 나타내는지를 확인하기 위해서, relt -/- 및 relt +/+ CD11c+B220+ 비장세포를 MHC 클래스 II, pDC 마커 CD45RB ([Hochrein et al., Hum. Immunol. 63:1103-10 (2002)]; [Asselin-Paturel et al., Nat. Immunol. 2: 1144-50 (2001)]), 또는 동시-자극 분자, 예를 들어 CD80 또는 CD86에 대한 항체로 염색한 후에 유동 세포측정으로 분석하였다 (도 17D). relt -/- 및 relt +/+ 마우스로부터의 CD11c+B220+ 세포는 유사한 양의 표면 마커를 발현하였고, 이것은 relt -/- 마우스가 증가된 수의 pDC를 갖는다는 것을 시사하였다.
(e) RELT -파괴된 마우스에서 CD11c + MHC II - 세포의 분석
말초혈 CD11c+MHC II- 세포는 pDC로 분화하는 잠재력을 갖는 것으로 밝혀졌다 (del Hoyo et al., Nature 415: 1043-7 (2002)). 따라서, relt -/- 마우스 내의 pDC 전구세포 집단을 조사하였다. 도 18A에 도시한 바와 같이, CD11c+MHC II- 하위세트는 relt+/+ 마우스보다 relt -/- 마우스에서 약 3배 더 풍부하였다. 이 결과는 relt -/- 마우스에서의 pDC 분화가 말초혈 pDC 전구세포 단계에서 또는 이 단계보다 이른 단계에서 영향을 받는다는 것을 시사하였다. 유동 세포측정 분석은 경미하지만 유의한 수준의 RELT가 CD11c+MHC II- 세포 상에서 발현됨을 보여주었다 (도 18B).
실시예 4: RELT -파괴된 마우스에서 IFN -α의 발현
항원-제시 세포로서의 그의 역할에서, 비메틸화 바이러스 또는 세균 DNA와 마주친 pDC는 다량의 IFN-α를 생산한다. 이와 유사하게, 마우스 감염 과정에서, 뮤린 사이토메갈로바이러스 (MCMV)는 pDC 상의 Toll-유사 수용체 9에 우선적으로 결합하고, IFN-α의 생산을 유발한다 ([Dalod et al., J. Exp. Med. 195:517-528 (2002)]; [Asselin-Paturel et al., Nat. Immunol. 2: 1144-1150 (2001)]; [Krug et al., Immunity 21: 107-119 (2004)]). RELT가 정상적인 pDC 기능에 영향을 주는지를 결정하기 위해서, relt -/- 또는 relt +/+ 마우스로부터의 비장세포에 의한 IFN-α 생산을 측정하였다. relt -/- 또는 relt +/+ 마우스로부터의 비장세포를 비메틸화 포스포로티오에이트 백본 D-타입 CpG-ODN (D19, GGTGCATCGATGCAGGGGGG (서열 71)과 함께 배양하고, 문헌 ([Hemmi et al., J. Immunol. 170: 3059-64 (2003)]; [Krug et al., Eur. J. Immunol. 31: 2154-63 (2001)])에 기재된 바와 같이 측정하였다. relt -/- 유래 비장세포는 relt+/+ 유래 비장세포보다 약 4배 더 많은 IFN-α를 분비하였다 (도 19, 좌측 패널). 이러한 IFN-α 분비의 증가는 relt +/+ 배양액에 비해 relt -/- 배양액에서 pDC의 수 증가와 일치하였다 (도 17B 참조). 상기 비장세포 배양액에서의 IFN-α 분비는 수지상 세포에 기인한 것으로서, 이것은 자극 전에 비장세포에 CD11c+ 수지상 세포가 고갈될 경우 IFN-α가 검출될 수 없기 때문이다 (도 19, 좌측 패널). 동일한 수의 pDC를 비교할 때, IFN-α 생산 측면에서 relt -/- 유래 비장세포와 relt +/+ 유래 비장세포 사이에 차이가 존재하지 않았다 (도 19, 우측 패널). 문헌 (Hemmi et al., J. Immunol. 170, 3059-64 (2003))에 보고된 내용과 일치하게, 정제된 CD11c+B220- cDC를 CpG-ODN으로 자극할 경우, IFN-α가 거의 생산되지 않았고 (도 19, 우측 패널), 이것은 pDC가 시토킨의 주 공급원이라는 사실과 일치하는 것이다. 따라서, RELT는 pDC에 의한 정상 IFN-α 생산을 위해 없어도 되는 것으로 보였고, relt -/- 마우스에서 관찰된 확장된 CD11c+B220+ 집단은 IFN-α 생산 pDC를 포함하였다.
실시예 5: RELT -파괴된 골수 세포의 분석
골수 세포에 대한 RELT 결핍의 효과를 조사하였다. 야생형 및 relt -/- 마우스를 1회 10 Gy 선량의 전신 방사선 조사에 노출시켰다. 이어서, 방사선이 조사된 마우스에게 비처리된 relt +/+ 및 relt -/- 마우스로부터의 4 x 106개의 골수 세포를 정맥 내로 주사하였다. 키메라 마우스에서 수지상 세포 집단을 8주 후에 분석하였다. 재구성된 수여 동물에서 비장 pDC 및 말초혈 CD11c+MHC II- 세포를 계수하였다. relt -/- 공여체 골수 세포는 수여자의 유전형 (relt -/- 또는 relt +/+)에 무관하게 항상 relt +/+ 공여체 골수 세포보다 많은 CD11c+MHC II- 세포 및 pDC를 생산하였다 (도 20). 이와 대조적으로, 야생형 공여체 세포를 사용하여 relt -/- 또는 relt +/+ 수여자를 씨딩할 때 pDC 및 CD11c+MHC II- 세포는 동일한 수가 생성되었다 (도 20). 이 결과는 relt -/- 마우스 내의 확장된 pDC 및 CD11c+MHC II- 집단이 relt -/- 골수 유래 세포의 세포 자율적 결함 (cell-autonomous defect)을 반영함을 시사하였다.
이전의 세포 전달 연구에서는 pDC가 골수 내의 림프 전구세포 및 골수 전구세포 모두로부터 분화할 수 있음을 제안하였다 (Shigematsu et al., Immunity 21:43-53 (2004)). 따라서, pDC 및/또는 그 전구세포 집단 상에서 발현되는 RELT는 수지상 세포 개체 발생을 직접 조절할 수 있을 것이다. T 세포는 RELT 리간드를 발현하고 pDC 발생을 억제하기 위한 후보이다. 인간 말초혈 T 세포를 24시간 동안 다양한 자극물질의 존재하에 배양한 후, 인간 IgG1 Fc 구역에 융합된 인간 RELT의 세포외 도메인 (MKPSLLCRPLSCFLMLLPWPLATLTSTTLWQCPPGEEPDLDPGQGTLCRPCPPGTFSAAWGSSPCQPHARCSLWRRLEAQVGMATRDTLCGDCWPGWFGPWGVPRVPCQPCSWAPLGTHGCDEWGRRA (서열 72)의 서열을 갖는 아미노산 1-128) (가용성 RELT-Fc)을 포함하는 표지된 단백질을 사용하는 FACS 분석에 적용하였다. PMA 및 이오노마이신으로 자극된 인간 T 세포는 인간 RELT 융합 단백질에 특이적으로 (약하지만) 결합하였고, 이것은 이전의 보고 (Sica et al., Blood 97: 2702-2707 (2001))와 일치하였다.
<110> Dixit, Vishva Kayagaki, Nobuhiko Wu, Yan <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING RELT <130> P2279R1 US <150> US 60/772,911 <151> 2006-02-13 <160> 141 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 6 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser 20 25 30 <210> 8 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 9 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 11 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 13 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 15 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30 <210> 16 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 18 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30 <210> 19 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 20 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 21 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 1 5 10 15 Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 24 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 25 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu 1 5 10 15 Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 20 <210> 26 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 28 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 20 25 30 Tyr Cys <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 5 10 <210> 30 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 32 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 34 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 36 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 20 25 30 Tyr Cys <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Phe Arg Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 5 10 <210> 38 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 42 Gly Phe Thr Ile Thr Asn Thr Trp Ile His 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 43 Gly Phe Thr Ile Ser Gly Ser Tyr Ile His 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 44 Gly Phe Thr Ile Asn Asn Ser Tyr Ile His 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 45 Gly Phe Thr Ile Ser Asn Asn Trp Ile His 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 46 Gly Phe Thr Ile Ser Ser Thr Trp Ile His 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 47 Gly Phe Thr Ile Thr Gly Ser Ser Ile His 5 10 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 48 Gly Phe Thr Ile Asn Asp Ser Trp Ile His 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 49 Gly Phe Thr Ile Thr Ser Ser Ser Ile His 5 10 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> Misc-feature <222> 5 <223> Xaa = T, S, or N <220> <221> Misc-feature <222> 6 <223> Xaa = N, G, S, or D <220> <221> Misc-feature <222> 7 <223> Xaa = T, S, or N <220> <221> Misc-feature <222> 8 <223> Xaa = W, Y, or S <400> 50 Gly Phe Thr Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Ile His 5 10 <210> 51 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 51 Gly Phe Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 52 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 52 Gly Arg Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 53 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 53 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 54 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 54 Gly Gly Ile Tyr Pro Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 55 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 55 Gly Gly Ile Ser Pro Ala Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 56 <211> 18 <212> PRT 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Xaa Xaa Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 60 Arg Phe Leu Ser Asp Gly Ala Tyr Ala Arg Asp Tyr Ala Met Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 61 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 61 Arg Trp Asp Tyr Ile Asp Gly Tyr Val Tyr Thr Ser Tyr Ala Arg 1 5 10 15 Tyr Val Met Asp Tyr 20 <210> 62 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 62 Arg Ser Leu Ser Leu Asn Met Trp Gly Val Met Asp Tyr 5 10 <210> 63 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 63 Arg Ser Ala Gly Ala Trp Trp Asn His Phe Glu Glu Tyr Ala Val 1 5 10 15 Met Asp Tyr <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 64 Lys Gly Ser Trp Trp Ala Asp Asn Glu Gly Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 65 Arg Leu Asp Ser Val Asp Gly Val Arg Val Tyr Asp Tyr Val Met 1 5 10 15 Asp Tyr <210> 66 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 66 Arg Trp Asp His Val Thr Gly Gly Arg Gly Arg Pro Trp Gly Met 1 5 10 15 Asp Tyr <210> 67 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 67 Arg Asp Arg Tyr Leu His Glu Glu Gly Gly Glu Tyr Val Met Asp 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> Misc-feature <222> 1 <223> Xaa = R or K <220> <221> Misc-feature <222> 2 <223> Xaa = F, W, S, G, L, or D <220> <221> Misc-feature <222> 3 <223> Xaa = L, D, A, S, or R <220> <221> Misc-feature <222> 4 <223> Xaa = S, Y, G, W, or H <220> <221> Misc-feature <222> 5 <223> Xaa = D, I, L, A, W, or V <220> <221> Misc-feature <222> 6 <223> Xaa = G, D, N, W, A, T, or H <220> <221> Misc-feature <222> 7 <223> Xaa = A, G, M, W, D, or E <220> <221> Misc-feature <222> 8 <223> Xaa = Y, W, N, V, G, or E <220> <221> Misc-feature <222> 9 <223> Xaa = A, V, G, H, E, or R <220> <221> Misc-feature <222> 10 <223> Xaa = R, Y, V, F, or G <220> <221> Misc-feature <222> 11 <223> Xaa = D, T, M, E, Y, or R <220> <221> Misc-feature <222> 12 <223> Xaa = Y, S, E, A, D, P or is not present <220> <221> Misc-feature <222> 13 <223> Xaa = A, Y, M, W, V or is not present <220> <221> Misc-feature <222> 14 <223> Xaa = M, A, V, G, or is not present <220> <221> Misc-feature <222> 15 <223> Xaa = R, V, M, D, or is not present <220> <221> Misc-feature <222> 16 <223> Xaa = Y, M or is not present <220> <221> Misc-feature <222> 17 <223> Xaa = V or is not present <220> <221> Misc-feature <222> 18 <223> Xaa = M or is not present <400> 68 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Asp Tyr 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 69 agtagaaggt ggcgcgaagg 20 <210> 70 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 70 ctgcccacag acaagatggt aatctc 26 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 71 ggtgcatcga tgcagggggg 20 <210> 72 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Met Lys Pro Ser Leu Leu Cys Arg Pro Leu Ser Cys Phe Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Pro Trp Pro Leu Ala Thr Leu Thr Ser Thr Thr Leu Trp 20 25 30 Gln Cys Pro Pro Gly Glu Glu Pro Asp Leu Asp Pro Gly Gln Gly 35 40 45 Thr Leu Cys Arg Pro Cys Pro Pro Gly Thr Phe Ser Ala Ala Trp 50 55 60 Gly Ser Ser Pro Cys Gln Pro His Ala Arg Cys Ser Leu Trp Arg 65 70 75 Arg Leu Glu Ala Gln Val Gly Met Ala Thr Arg Asp Thr Leu Cys 80 85 90 Gly Asp Cys Trp Pro Gly Trp Phe Gly Pro Trp Gly Val Pro Arg 95 100 105 Val Pro Cys Gln Pro Cys Ser Trp Ala Pro Leu Gly Thr His Gly 110 115 120 Cys Asp Glu Trp Gly Arg Arg Ala 125 <210> 73 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 5 10 <210> 74 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 1 5 10 15 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 76 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 5 10 <210> 77 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 1 5 10 15 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 79 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 5 10 <210> 80 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 1 5 10 15 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala <210> 81 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 82 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 5 10 <210> 83 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 1 5 10 15 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 85 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 5 10 <210> 86 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 1 5 10 15 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg <210> 87 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 88 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 5 10 <210> 89 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 1 5 10 15 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 91 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 5 10 <210> 92 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 1 5 10 15 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 94 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 5 10 <210> 95 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 1 5 10 15 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 97 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 5 10 <210> 98 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg <210> 99 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 100 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 101 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg <210> 102 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 103 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 104 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala <210> 105 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 106 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 107 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 108 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 109 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 5 10 <210> 110 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ser Arg <210> 111 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 112 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 113 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ser Arg <210> 114 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 115 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 116 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ser <210> 117 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 118 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 5 10 <210> 119 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg <210> 120 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 121 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 122 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg <210> 123 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 124 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 125 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala <210> 126 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 127 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 128 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 129 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 130 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 131 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 20 25 30 Tyr Cys <210> 132 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 5 10 <210> 133 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 134 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 20 25 30 Tyr Cys <210> 135 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 5 10 <210> 136 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 137 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr 20 25 30 Tyr Cys <210> 138 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 5 10 <210> 139 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 140 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 20 25 30 Tyr Cys <210> 141 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 5 10

Claims (48)

  1. RELT에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 각각 서열 42-49, 51-58, 및 60-67 중의 임의의 서열의 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3 중에서 선택된 적어도 하나의 초가변 (HVR) 서열을 포함하는 항체.
  3. 제2항에 있어서, HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 중에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하고, 여기서 HVR-H1은 아미노산 서열 a b c d e f g h i j를 포함하고, 여기서 아미노산 a는 글라이신이고; 아미노산 b는 페닐알라닌이고; 아미노산 c는 트레오닌이고; 아미노산 d는 이소류신이고; 아미노산 e는 트레오닌, 세린, 및 아스파라긴 중에서 선택되고; 아미노산 f는 아스파라긴, 글라이신, 세린, 및 아스파르트산 중에서 선택되고; 아미노산 g는 트레오닌, 세린, 및 아스파라긴 중에서 선택되고; 아미노산 h는 트립토판, 티로신, 및 세린 중에서 선택되고; 아미노산 i는 이소류신이고; 아미노산 j는 히스티딘이고; 여기서 HVR-H2는 아미노산 서열 k l m n o p q r s t u v w x y z a' b'를 포함하고, 여기서 아미노산 k는 글라이신 및 알라닌 중에서 선택되고; 아미노산 l은 페닐알라닌, 아르기닌, 트립토판, 글라이신, 아스파라긴, 및 티로신 중에서 선택되고; 아미노산 m은 이소류신이고; 아미노산 n은 세린, 티로신, 트레오닌, 및 아스파라긴 중에서 선택되고; 아미노산 o는 프롤린 이고; 아미노산 p는 세린, 아스파라긴, 티로신, 및 알라닌 중에서 선택되고; 아미노산 q는 글라이신, 아스파라긴, 아스파르트산, 및 세린 중에서 선택되고; 아미노산 r은 글라이신이고; 아미노산 s는 티로신, 아스파라긴, 아스파르트산, 및 세린 중에서 선택되고; 아미노산 t는 트레오닌이고; 아미노산 u는 아스파라긴, 티로신, 및 아스파르트산 중에서 선택되고; 아미노산 v는 티로신이고; 아미노산 w는 알라닌이고; 아미노산 x는 아스파르트산이고; 아미노산 y는 세린이고; 아미노산 z는 발린이고; 아미노산 a'는 라이신이고; 아미노산 b'는 글라이신이고; 여기서 HVR-H3은 아미노산 서열 c' d' e' f' g' h' i' j' k' l' m' n' o' p' q' r' s' t' u' v'를 포함하고, 여기서 아미노산 c'는 아르기닌 및 라이신 중에서 선택되고; 아미노산 d'는 페닐알라닌, 트립토판, 세린, 글라이신, 류신, 및 아스파르트산 중에서 선택되고; 아미노산 e'는 류신, 아스파르트산, 알라닌, 세린, 및 아르기닌 중에서 선택되고; 아미노산 f'는 세린, 티로신, 글라이신, 트립토판, 및 히스티딘 중에서 선택되고; 아미노산 g'는 아스파르트산, 이소류신, 류신, 알라닌, 트립토판, 및 발린 중에서 선택되고; 아미노산 h'는 글라이신, 아스파르트산, 아스파라긴, 트립토판, 알라닌, 트레오닌, 및 히스티딘 중에서 선택되고; 아미노산 i'는 알라닌, 글라이신, 메티오닌, 트립토판, 아스파르트산, 및 글루탐산 중에서 선택되고; 아미노산 j'는 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 발린, 글라이신, 및 글루탐산 중에서 선택되고; 아미노산 k'는 알라닌, 발린, 글라이신, 히스티딘, 글루탐산, 및 아르기닌 중에서 선택되고; 아미노산 l'는 아르기닌, 티로신, 발린, 페닐알라닌, 및 글라이신 중에서 선택되고; 아미노산 m'는 아스파르트산, 트레오닌, 메티오닌, 글루탐산, 티 로신, 및 아르기닌 중에서 선택되고; 아미노산 n'는 티로신, 세린, 글루탐산, 알라닌, 아스파르트산, 및 프롤린 중에서 선택되거나, 존재하지 않고; 아미노산 o'는 알라닌, 티로신, 메티오닌, 트립토판, 및 발린 중에서 선택되거나, 존재하지 않고; 아미노산 p'는 메티오닌, 알라닌, 발린, 및 글라이신 중에서 선택되거나, 존재하지 않고; 아미노산 q'는 아르기닌, 발린, 메티오닌, 및 아스파르트산 중에서 선택되거나, 존재하지 않고; r'는 티로신 및 메티오닌 중에서 선택되거나, 존재하지 않고; s'는 발린이거나 존재하지 않고; t'는 메티오닌이거나 존재하지 않고; u'는 아스파르트산이고, v'는 티로신인 항체.
  4. 제1항에 있어서, 도 5A 및 5B에서 클론 C21, C10, E5/E7, F4, F5, H7, H9, 및 H11에 대해 제시된 것에 대응하는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3 서열을 포함하는 항체.
  5. 제1항에 있어서, 서열 49의 HVR-H1 서열, 서열 58의 HVR-H2 서열, 및 서열 67의 HVR-H3 서열을 포함하는 항체.
  6. 제2 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 1 및 서열 2 중에서 선택된 경쇄 초가변 서열을 추가로 포함하는 항체.
  7. 제1 내지 6항 중 어느 한 항에 따른 항체와 동일한 RELT 상의 항원 결정자에 결합하는 단리된 항체.
  8. RELT에 대한 결합에 대해 제1 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 항체와 경쟁하는 단리된 항체.
  9. 제1 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 RELT에 특이적으로 결합하는 것인 항체.
  10. 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 RELT의 적어도 하나의 RELT 리간드에 대한 결합을 억제하는 것인 항체.
  11. 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 적어도 하나의 RELT-매개 신호 전달 경로를 억제하는 것인 항체.
  12. 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 적어도 하나의 RELT-매개 신호 전달 경로를 자극하는 것인 항체.
  13. 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 RELT를 발현하는 세포로부터 NF-κB의 생산을 자극하는 것인 항체.
  14. 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 RELT의 작용제인 항체.
  15. 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 RELT의 길항제인 항체.
  16. 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 핵산 분자.
  17. 제16항의 핵산을 포함하는 벡터.
  18. 제17항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  19. 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 따른 항체를 생산할 수 있는 세포주.
  20. 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 항체가 생산되는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 따른 항체를 생산하는 방법.
  21. 유효량의 제1 내지 13항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  22. 샘플을 적어도 하나의 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 따른 항체에 노출시키 고, 적어도 하나의 항체의 샘플 내의 RELT 폴리펩티드에 대한 결합을 검출하는 것을 포함하는, RELT 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플에서 RELT 폴리펩티드의 존재를 결정하는 방법.
  23. 환자에게 유효량의 적어도 하나의 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 따른 항체를 투여하는 것을 포함하는, 환자 내의 IFN-α에 의해 유발되거나, 악화되거나, 연장되는 질병 또는 병태의 치료를 위한 방법.
  24. 제23항에 있어서, 질병 또는 병태가 질병 또는 병태의 부재 하의 IFN-α 수준에 비해 환자에서 감소된 IFN-α 수준에 의해 유발되거나, 악화되거나, 연장되는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 질병 또는 병태가 질병 또는 병태의 부재 하의 IFN-α 수준에 비해 환자에서 증가된 IFN-α 수준에 의해 유발되거나, 악화되거나, 연장되는 것인 방법.
  26. 환자에게 유효량의 가용형의 RELT를 투여하는 것을 포함하는, 환자 내의 IFN-α와 연관된 질병 또는 병태의 치료를 위한 방법.
  27. 제23 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 포유동물 환자인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 환자가 인간인 방법.
  29. 제23 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 질병 또는 병태가 세포 증식 질환, 감염, 면역/염증성 질환, 및 인터페론-관련 질환의 적어도 하나로부터 선택되는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 면역/염증성 질환이 루푸스, 천식, 및 알레르기 비염 중에서 선택되는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 감염이 미생물 감염, 바이러스 감염, 및 진균 감염 중에서 선택되는 것인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 세포 증식 질환이 골수 형성 이상 증후군 (MDS) 및 암 중에서 선택되는 것인 방법.
  33. CD11c+MHC II- 세포에서 RELT 발현을 억제하는 것을 포함하는, 보통 (conventional) 수지상 세포 (cDC)에 비해 CD11c+MHC II- 세포로부터 생산된 형질세포양 (plasmacytoid) 수지상 세포 (pDC)의 비율을 증가시키기 위한 방법.
  34. CD11c+MHC II- 세포에서 RELT 활성을 억제하는 것을 포함하는, 보통 수지상 세포 (cDC)에 비해 CD11c+MHC II- 세포로부터 생산된 형질세포양 수지상 세포 (pDC)의 비율을 증가시키기 위한 방법.
  35. 제33 또는 34항에 있어서, RELT 발현 또는 활성을 억제하는 것이 CD11c+MHC II- 세포에서 RELT를 파괴하는 것을 포함하는 것인 방법.
  36. 제33 또는 34항에 있어서, RELT 발현 또는 활성을 억제하는 것이 RELT에 대해 안티센스인 올리고뉴클레오티드를 CD11c+MHC II- 세포에 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  37. 제33 또는 34항에 있어서, RELT 발현 또는 활성을 억제하는 것이 RELT의 그의 정상 리간드에 대한 결합을 억제하는 항체를 CD11c+MHC II- 세포에 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  38. 제33 내지 37항 중 어느 한 항에 있어서, RELT 발현 또는 활성을 억제하는 것이 생체 내에서 일어나는 것인 방법.
  39. 제33 내지 37항 중 어느 한 항에 있어서, RELT 발현 또는 활성을 억제하는 것이 시험관 내에서 일어나는 것인 방법.
  40. CD11c+MHC II- 세포에서 RELT 발현을 자극하는 것을 포함하는, 보통 수지상 세포에 비해 CD11c+MHC II- 세포로부터 생산된 형질세포양 수지상 세포의 비율을 감소시키기 위한 방법.
  41. CD11c+MHC II- 세포에서 RELT 활성을 자극하는 것을 포함하는, 보통 수지상 세포에 비해 CD11c+MHC II- 세포로부터 생산된 형질세포양 수지상 세포의 비율을 감소시키기 위한 방법.
  42. 제40 또는 41항에 있어서, RELT 발현 또는 활성을 자극하는 것이 RELT를 작용하도록 하는 (agonizing) 항체를 CD11c+MHC II- 세포에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  43. 포유동물에서 RELT 발현을 억제하는 것을 포함하는, 포유동물에서 IFN-α 생 산을 증가시키기 위한 방법.
  44. 포유동물에서 RELT 활성을 억제하는 것을 포함하는, 포유동물에서 IFN-α 생산을 증가시키기 위한 방법.
  45. 포유동물의 CD11c+MHC II- 세포에서 RELT 발현을 자극하는 것을 포함하는, 포유동물에서 IFN-α 생산을 감소시키기 위한 방법.
  46. 포유동물의 CD11c+MHC II- 세포에서 RELT 활성을 자극하는 것을 포함하는, 포유동물에서 IFN-α 생산을 감소시키기 위한 방법.
  47. 포유동물에서 발현된 RELT의 양을 검출하는 것을 포함하는, 포유동물에서 비정상 IFN-α 수준에 관련되는 질병 또는 병태를 진단하기 위한 방법.
  48. 제47항에 있어서, 질병 또는 병태가 세포 증식 질환, 감염, 면역/염증성 질환, 및 인터페론-관련 질환의 적어도 하나로부터 선택되는 것인 방법.
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