TW200804418A - Methods and compositions for targeting relt - Google Patents

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TW200804418A TW096105340A TW96105340A TW200804418A TW 200804418 A TW200804418 A TW 200804418A TW 096105340 A TW096105340 A TW 096105340A TW 96105340 A TW96105340 A TW 96105340A TW 200804418 A TW200804418 A TW 200804418A
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Nobuhiko Kayagaki
Yan Wu
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Description

200804418 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於使用RELT多肽及核酸調節免疫細胞形成 及調節細胞激素產生之方法之領域。本發明亦係關於抗-RELT抗體之領域，且尤其係關於為促進細胞激素自RELT 表現細胞產生之促效劑的抗-RELT抗體。 【先前技術】 I型干擾素（IFN)為對多種細胞類型具有多向性效應的細 胞激素。IFN因其抗病毒活性而為吾人熟知，但其亦具有 抗菌、抗原生動物之免疫調節性及細胞生長調節功能（van den Broek等人，Immunol. Rev. 148:5-18(1995) ; Pfeffer等 人，Cancer Res. 58 : 2489-99 (1998))。I型干擾素包括干 擾素-a(IFN-a)及干擾素-p(IFN-p)。 鼠CDllc+B220+CDllb_CD45RB+漿細胞樣樹突狀細胞 (pDC)(亦稱IFN產生細胞（IPC))，呈現獨特的漿細胞樣形 態，且當暴露於未曱基化之CpG寡脫氧核苷酸或大範圍 DNA或RNA病毒時可大量產生I型IFN(Colonna等人，iVai. ⑽〇/. 5: 1219-26 (2004); Hochrein等人，i/ww. //wmwwo/· 63: 1103_10 (2002); Nakano等人，《/· Md· 194: 1171-8 (2001); Diebold等人，心zena 303: 1529-31 (2004); Dalod 等人，J·五x/7. Md. 195: 517-28 (2002) ; Asselin-Paturel等 人，Nat· Immunol 2: 1144-50 (2001);及 Lund 等人，J. 五 xp· M以· 198: 513-20 (2003))。此 IFN 產生視 Toll 樣受體 7 及9及下游銜接子MyD88而定（Diebold等人，303: 118226.doc 200804418 1529-31 (2004); Lund等人，/·五xp. MW· 198: 513_20 (2003); Krug 等人，21: 107-19 (2004); Hemmi 等 人，J· /mmw⑽/. 170: 3059-64 (2003))。在感染上某些病毒 (諸如鼠細胞巨大病毒（MCMV))的小鼠中，pDC為IFN-α之 主要來源及可能唯一來源（Dalod等人，/· Med. 195: 517-28 (2002); Asselin-Paturel 等人，2: 1144-50 (2001))。pDC及習知 CDllc+B22(TDC(cDC)(引發 抗原特異性初始T細胞之’’專門n抗原呈遞細胞之不同亞型 (Colonna^ A 5 Nat. Immunol. 5:1219-26 (2004) ； Banchereau^ 人，392:245_52 (1998)))之形成及協同作用是對既 定病原體產生適當免疫反應的關鍵。pDC亦意味著在諸如 狼瘡之自體免疫疾病之形成及病理生理學中（參見，例 如，Ronnblom，J. Exp. Med. 194:F59 (2001))、在諸如過敏 性鼻炎及哮喘之免疫病症中（Jahnsen等人，J· /mm·。/· 165: 4062-4068 (2000) ; Matsuda等人，Am. J. Resp. Crit· Care Mei 166:1050-1054 (2002))以及在癌症（例如，卵巢 癌，如Zou等人，Nat. Med. 7:1339-1346 (2001)所述）及骨 髓發育異常症候群（MDS)(如Ma等人，Leukemia 18 (9):1451-1456 (2004)所述）中起關鍵作用。 鼠骨髓内的共同淋巴樣祖（CLP)細胞與共同髓樣祖 (CMP)細胞可產生cDC群與pDC群（Shigematsu等人， 21: 43-53)，而周圍血液内的 CD1 lc+MHC類 ΙΓ亞 型已鑑定為含有pDC及cDC亞型之直接前體的群體（del Hoyo等人，415: 1043-7 (2002))。對小鼠之基因靶 118226.doc 200804418 向研究已鑑定出若干種細胞内信號傳導分子及調節cDC之 形成的轉錄因子；IFN調節因子（IRF)2、IRF4、Ikaros、 RelB、TRAF6及PU.1對於cDC形成各為必不可少的 (Ardavin等人，iVai. 3: 582-90 (2003))。關 於pDC形成則知之甚少。缺失IRF8/IFN—致序列結合蛋白 (ICSBP)之小鼠在pDC形成方面呈現缺點，但在彼等小鼠 中骨髓細胞及cDC形成亦受減損（Tsujimura等人，/· Immunol· 1 70·· 113 1-5 (2003)) 〇 祖細胞分化成 pDC與 cDC係 在小鼠或骨髓細胞培養中由fms相關酪胺酸激酶3配位體 (FLT3L)激發（Vollstedt 等人，/· Exp. Med· 197: 575-84 (2003) ; Gilliet等人，J·五MW· 195·· 953-8(2002))。 某些TNF受體及其配位體已鑑定為樹突狀細胞激活及活 性的重要介體（Anderson 等人，390: 175-179 (1997)。TNF受體超家族（TNFRSF)包含至少29個成員，其 中大部分為I型整體膜蛋白。該等受體具有保守的細胞外 半胱胺酸富集域（CRD)，該等半胱胺酸富集域為通常含有 六個藉由三個二硫鍵橋接之半胱胺酸殘基的偽重複域。 TNFRSF成員當由其同源配位體接合時引起一系列生物結 果，包括細胞存活、細胞死亡、增殖及分化（Locksley等 人，Ce" 104: 487-501 (2001) ; Bodmer等人，7>挪办 Sci. 27: 19-26 (2002)) 〇
在TNFRSF内，存在若干種其特定配位體仍有待鑑定的 孤立受體，包括表現於淋巴組織中之受體（RELT)/TNFRSF19L (Sica等人，97: 2702-7 (2001))。RELT為具有兩個 CRD 118226.doc 200804418 的I型細胞表面蛋白。異位表現時，RELT激活NF-KB(id.)，此 為表現先天免疫性與後天免疫性所需之基因必需的轉錄因 子（Bonizzi等人，7>6/7心 25:280 -8 (2004))。 RELT mRNA表現似乎主要限於淋巴組織，諸如脾及淋巴 結（Sica等人，Blood 97: 2702-7 (2001))。理解RELT在免疫 細胞調節及功能中之作用可提供治療免疫疾病的新穎途 徑。 本文中所引用之全部參考文獻，包括專利申請案及公開 案，皆以引用方式全文併入本文中。 【發明内容】 本發明提供使用RELT多肽及核酸調節某些免疫細胞之 形成及調節細胞激素自某些免疫細胞產生的方法。本發明 亦提供能夠結合RELT及/或調節與RELT關聯之生物活性的 新穎抗體。 在一實施例中，提供特定結合RELT的分離抗體。在一 實施例中，提供包含至少一高變（HVR)序列的分離抗體， 該高變序列選自分別為SEQ ID NO: 42-49、5 1-58及60-67 中任一者之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3。在一態樣中， 該分離抗體特定結合RELT。在其他態樣中，該分離抗體 另外包含選自SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之輕鏈高變序 列。在其他態樣中，該抗體特定結合人類RELT。在其他 態樣中，該抗體抑制RELT與至少一 RELT配位體之結合。 在其他態樣中，該抗體為RELT之拮抗劑。在其他態樣 中，該抗體抑制至少一 RELT介導信號傳導途徑。在其他 118226.doc 200804418 態樣中，該抗體激發NF_kB自表現RELT之細胞中產生。在 其他態樣中，該抗體為RELT之促效劑。在其他態樣中， 該抗體激發至少一 RELT介導信號傳導途徑。 在其他實施例中，提供包含至少一選自HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3之序列的分離抗體，其中HVR-H1包含胺基 酸序列abcdefghij，其中胺基酸a為甘胺酸；胺基酸b 為苯丙胺酸；胺基酸c為羥丁胺酸；胺基酸d為異白胺酸； 胺基酸e係選自羥丁胺酸、絲胺酸及天冬醯胺；胺基酸£係 選自天冬醯胺、甘胺酸、絲胺酸及天冬胺酸；胺基酸g係 選自經丁胺酸、絲胺酸及天冬醯胺；胺基酸h係選自色胺 酸、路胺酸及絲胺酸；胺基酸i為異白胺酸；且胺基酸j為 組胺酸，其中HVR-H2包含胺基酸序列k 1 mn 〇 p qr s tu v w x y z a’ b’，其中胺基酸k係選自甘胺酸及丙胺酸；胺 基酸1係選自苯丙胺酸、精胺酸、色胺酸、甘胺酸、天冬 醯胺及酪胺酸；胺基酸m為異白胺酸；胺基酸n係選自絲胺 酸、絡胺酸、羥丁胺酸及天冬醯胺；胺基酸〇為脯胺酸； 胺基酸ρ係選自絲胺酸、天冬醯胺、酪胺酸及丙胺酸；胺 基酸q係選自甘胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸及絲胺酸；胺 基酸r為甘胺酸；胺基酸s係選自酪胺酸、天冬醯胺、天冬 胺酸及絲胺酸；胺基酸t為羥丁胺酸；胺基酸u係選自天冬 醯胺、酪胺酸及天冬胺酸；胺基酸v為酪胺酸；胺基酸〜為 丙胺酸；胺基酸X為天冬胺酸；胺基酸y為絲胺酸；胺基酸 z為纈胺酸；胺基酸a’為離胺酸；且胺基酸b，為甘胺酸；其 中 HVR-H3 包含胺基酸序列 c，d，e，f，g，h，i，j，k’ Γ m’ n，0, 118226.doc -10- 200804418 p’ q’ I*’ s’ t’ v v，其中胺基酸c’係選自精胺酸及離胺酸； 胺基酸d’係選自苯丙胺酸、色胺酸、絲胺酸、甘胺酸、白 胺酸及天冬胺酸；胺基酸e，係選自白胺酸、天冬胺酸、丙 胺酸、絲胺酸及精胺酸；胺基酸f係選自絲胺酸、酪胺 酸、甘胺酸、色胺酸及組胺酸；胺基酸g，係選自天冬胺 酸、異白胺酸、白胺酸、丙胺酸、色胺酸及纈胺酸；胺基 酸hf係選自甘胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺、色胺酸、丙胺 酸、羥丁胺酸及組胺酸；胺基酸丨，係選自丙胺酸、甘胺 酸、甲硫胺酸、色胺酸、天冬胺酸及麩胺酸；胺基酸j，係 選自赂胺酸、色胺酸、天冬醯胺、纈胺酸、甘胺酸及麩胺 酸；胺基酸k’係選自丙胺酸、纈胺酸、甘胺酸、組胺酸、 麩胺酸及精胺酸；胺基酸1，係選自精胺酸、酪胺酸、纈胺 酸、苯丙胺酸及甘胺酸；胺基酸m，係選自天冬胺酸、羥丁 胺酸、甲硫胺酸、麩胺酸、酪胺酸及精胺酸；胺基酸n，係 選自赂胺酸、絲胺酸、麩胺酸、丙胺酸、天冬胺酸及脯胺 酸或不存在；胺基酸〇’係選自丙胺酸、酪胺酸、曱硫胺 酸、色胺酸及纈胺酸或不存在；胺基酸p，係選自曱硫胺 酸、丙胺酸、纈胺酸及甘胺酸或不存在；胺基酸q，係選自 精胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸及天冬胺酸或不存在；r，係選 自絡胺酸及甲硫胺酸或不存在；V為纈胺酸或不存在；t，為 甲硫胺酸或不存在；u，為天冬胺酸且v，為酪胺酸。在一態 樣中’該分離抗體特定結合RELT。在一態樣中，該分離 抗體另外包含選自SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之輕鏈高 麦序列。在其他怨樣中，該抗體特定結合人類relt。在 118226.doc -11 · 200804418 其他態樣中，該抗體抑制RELT與至少一 RELT配位體之結 合。在其他態樣中，該抗體為RELT之拮抗劑。在其他態 樣中，該抗體抑制至少一 RELT介導信號傳導途徑。在其 他態樣中，該抗體激發NF-κΒ自表現RELT之細胞中產生。 在其他態樣中，該抗體為RELT之促效劑。在其他態樣 中，該抗體激發至少一 RELT介導信號傳導途徑。 在其他實施例中，提供包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3 序列的分離抗體，該等序列與圖5A及5B中對於純系C21、 CIO、E5/E7、F4、F5、H7、H9及H11所列之彼等内容對 應。在一態樣中，該分離抗體特定結合RELT。在一態樣 中，該分離抗體另外包含選自SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2的輕鏈高變序列。在其他態樣中，該抗體特定結合人類 RELT。在其他態樣中，該抗體抑制RELT與至少一 RELT配 位體之結合。在其他態樣中，該抗體為RELT之拮抗劑。 在其他態樣中，該抗體抑制至少一 RELT介導信號傳導途 徑。在其他態樣中，該抗體激發NF-kB自表現RELT之細胞 中產生。在其他態樣中，該抗體為RELT之促效劑。在其 他態樣中，該抗體激發至少一 RELT介導信號傳導途徑。 在其他實施例中，提供包含SEQ ID NO: 49之HVR-H1序 列、SEQ ID NO: 58 之 HVR-H2序列及 SEQ ID NO: 67之 HVR-H3序列的分離抗體。在一態樣中，該分離抗體另外 包含選自SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2的輕鏈高變序列。 在一態樣中，該抗體特定結合人類RELT。在其他態樣 中，該抗體抑制RELT與至少一 RELT配位體之結合。在其 118226.doc -12- 200804418 他悲樣中，該抗體為RELT之抬抗劑。在其他態樣中，該 抗體抑制至少一 RELT介導信號傳導途徑。在其他態樣 中，該抗體激發NF-κΒ自表現RELT之細胞中產生。在其他 態樣中，該抗體為RELT之促效劑。在其他態樣中，該抗 體激發至少一 RELT介導信號傳導途徑。 在其他實施例中’提供如上述任一種抗體、與KELT上 相同抗原決定子結合的分離抗體。在一實施例中，提供與 上述任一種抗體競爭結合RELT的分離抗體。 本發明之抗體可為多種形式。舉例而言，本發明之抗體 可為嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。在一實施例中， 本發明之抗體不為人類抗體，例如，其不為產生於轉基因 小鼠（例如，如WO 96/33735中所述）中的抗體。本發明之 抗體可為全長抗體或其片段（例如，包含抗原結合成分之 片段）。 在一態樣中，提供編碼本發明之抗體的核酸分子。在一 態樣中，提供包含核酸的載體。在一態樣令，提供包含載 體的宿主細胞。在一態樣中，提供能夠產生本發明之抗體 的細胞株。在一態樣中，提供製備本發明之抗體的方法， 該方法包含在其中製備該抗體的條件下培養包含編碼該抗 體之核酸分子的宿主細胞。在一態樣中，提供包含有效量 之本發明之抗體及醫藥學上可接受之載劑的組合物。 在其他實施例中，提供測定疑似含有RELT多肽之樣本 中RELT多肽之存在的方法，該方法包含將該樣本暴露於 本發明之至少一抗體且測定與該樣本中之relt#肽結合 118226.doc -13 - 200804418 之該至少一抗體。 在其他實施例中，提供用於治療一患者中因ιρΝ_α所引 起、加重或延續之疾病或病狀的方法，該方法包含將有效 量之本發明之至少-抗體投與該患者。在一態樣中，該疾 病或病狀係因患者中祕時量降低（相對於無該疾病或病 狀時之IFN-a含量）所引起、加重或延續。在一態樣中，該 疾病或病狀係因患者中胁#量升高（相對於無該疾病或 病狀時之IFN-a含量）所引起、加重或延續。在其他實施例 中，提供用於治療與患者中之IFN_a關聯之疾病或病狀的 方法，該方法包含向該患者投與有效量之可溶形式之 RELT。 在一態樣中，該患者為哺乳動物患者。在其他態樣，該 患者為人類。在其他態樣中，該疾病或病狀係選自細胞增 殖性病症、感染、免疫/炎性病症及干擾素相關病症中之 至 > 一者。在其他態樣中，免疫/炎性病症係選自狼瘡、 哮喘及過敏性鼻炎。在其他態樣中，該感染係選自微生物 感柒病毋感杂及真菌感染。在其他態樣中，該細胞增殖 性病症係選自骨髓發育異常症候群（MDS)及癌症。 在其他實施例中，提供用於提高由CDllc+MHC ΙΓ細胞· 所產生之漿細胞樣樹突狀細胞（pDC)之比例（相對於習知樹 突狀細胞（CDC))的方法，該方法包含抑制RELT在 CD 11 c MHC II細胞中之表現。在其他實施例中，提供用 於提同由CDllcMHC ΙΓ細胞所產生之漿細胞樣樹突狀細 胞（pDC)之比例（相對於習知樹突狀細胞（cDc))的方法，該 118226.doc -14 - 200804418 方法包含抑制RELT在CDllc+MHC ΙΓ細胞中之活性。在一 態樣中，抑制RELT表現或活性包含在CDllc+MHC ΙΓ細胞 中分裂RELT。在其他態樣中，抑制RELT表現或活性包含 將與RELT反義之寡核苷酸投與CDllc+MHC ΙΓ細胞。在其 他態樣中，抑制RELT表現或活性包含將抑制RELT結合其 正常配位體之抗體投與CDllc+MHC ΙΓ細胞。在其他態樣 中，抑制RELT表現或活性係在活體内發生。在其他態樣 中，抑制RELT表現或活性係在活體外發生。 在其他實施例中，提供用於降低由CDllc+MHCII_細胞 所產生之漿細胞樣樹突狀細胞之比例（相對於習知樹突狀 細胞）的方法，該方法包含激發RELT在CDllc+MHCII_細胞 中之表現。在其他實施例中，提供用於降低由 CDllc+MHCir細胞所產生之漿細胞樣樹突狀細胞之比例 (相對於習知樹突狀細胞）的方法，該方法包含激發RELT在 CDllc+MHCir細胞中之活性。在一態樣中，激發RELT表 現或活性包含將刺激RELT之抗體投與CDllc+MHCir細 胞。 在其他實施例中，提供增強一哺乳動物中IFN-α之產生 的方法，該方法包含抑制RELT在該哺乳動物中之表現。 在其他實施例中，提供用於增強一哺乳動物中IFN-a之產 生的方法，該方法包含抑制RELT在該哺乳動物中之活 性。 在其他實施例中，提供用於減少一哺乳動物中IFN-a之 產生的方法，該方法包含激發RELT在該哺乳動物之 118226.doc -15- 200804418 CD 11 c+MHCir細胞中之表現。在其他實施例中，提供用 於減少一哺乳動物中IFN-α之產生的方法，該方法包含激 發RELT在該哺乳動物之CD 11 c+MHCir細胞中之活性。 在其他實施例中，提供診斷一哺乳動物中與異常IFN-a 含量有關之疾病或病狀的方法，該方法包含偵測表現於該 哺乳動物中之RELT之量。在一態樣中，該疾病或病狀係 選自細胞增殖性病症、感染、免疫/炎性病症及干擾素相 關病症中之至少一者。 【實施方式】 通用技藝 除非另有說明，否則本發明可利用屬於該項技術中之熟 練技藝之分子生物學（包括重組技藝）、微生物學、細胞生 物學、生物化學及免疫學之習知技藝實施。該等技藝詳細 說明於諸如以下文獻中："Molecular Cloning: A Laboratory Manual”，第 3 版（Sambrook 等人，2001); ’Oligonucleotide Synthesis”（M. J· Gait，編，1984); "Animal Cell Culture”（R. I. Freshney，編，1987); ’’Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.) ； ’’Current Protocols in Molecular Biology”（F. M. Ausubel 等人編，1987，且定期更新）； ”PCR: The Polymerase Chain Reaction1，，（Mullis等人編，1994); PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames 及 G. R. Taylor 編（1995)); Harlow 及 Lane 編（1988) Antibodies，A Laboratory Manual; ’’A Practical Guide to Molecular Cloning"(Perbal Bernard V·，1988);及 ’’Phage 118226.doc -16- 200804418
Display: A Laboratory Manual’’（Barbas等人，2001)。 定義 如本文中所使用，術語"表現於淋巴樣組織中之受體f，及 "RELT”定義為RELT之所有種類之天然及合成多肽，包括 但不限於全長RELT多肽、其中信號序列已經移除之RELT 多肽之成熟形式及RELT多肽之可溶形式。 ”分離’’抗體為一種已經鑑定且與其自然環境之成分分離 且/或自其回收的抗體。其自然環境之污染物成分為干擾 抗體研究、診斷性或治療性使用的物質，且可包括酶、激 素及其他蛋白性溶質或非蛋白性溶質。在一實施例中，該 抗體（1)被純化至抗體之95重量％以上，如藉由例如Lowry 方法所測定，且在有些實施例中為99重量％以上；（2)被純 化至足以藉由使用例如旋杯式序列測定儀獲得N—末端或内 部胺基酸序列之至少15個殘基的程度；或（3)使用例如考馬 斯藍（Coomassie blue)或銀染劑、在還原或非還原條件下藉 由SDS-PAGE純化至同種。由於抗體自然環境之成分沒有 一種存在’因此分離抗體包括重組細胞内部的原位抗體。 然而’分離抗體通常藉由至少一純化步驟來製備。 如本文中所使用，術語，，抗-RELT抗體，，係指能夠特定結 合RELT的抗體。 如本文中所用’短語’’大體上類似，，、”大體上相同，，、，，相 當’’或’’大體上相當"係表示兩個數值之間的相似程度足夠 大（例如，一數值與一種分子相關而另一數值與參考/對比 分子相關），以致熟習該項技術者認為兩數值之間的差異 118226.doc -17- 200804418 在藉由該等數值（例如Kd值）所量測之生物學特徵之範圍内 幾乎沒有生物學及/或統計顯著性。該兩個數值之間的差 異作為參考/對比分子之數值的函數例如小於約5 0 %、小於 約40%、小於約30%、小於約20%及/或小於約10%。 如本文中所用，短語，，大體上減少”或”大體上不同”係表 示兩個數值之間的差異程度足夠大（通常，一數值與一種 分子相關而另一數值與參考/對比分子相關），以致熟習該 項技術者認為兩數值之間的差異在藉由該等數值（例如Kd 值）所量測之生物學特徵之範圍内具有統計顯著性。該兩 個數值之間的差異作為參考/對比分子之數值的函數例如 大於約10%、大於約20%、大於約30%、大於約40%及/或 大於約50%。 π結合親和力”泛指一分子（例如抗體）與其結合夥伴（例如 抗原）之單個結合位點之間非共價相互作用力的總和。除 非另有說明，否則如本文中所用之”結合親和力”係指表現 結合對成員（例如抗體與抗原）之間之1 : 1相互作用的内在結 合親和力。分子X對其夥伴Υ之親和力一般可藉由解離常 數（Kd)表示。親和力可藉由該項技術中已知之普通方法 (包括本文中所述之彼等方法）量測。低親和力抗體結合抗 原一般較慢且易傾向於解離，而高親和力抗體結合抗原一 般較快且傾向於更持久地結合。各種量測結合親和力之方 法在該項技術中係已知的，其中任一種方法可用於本發 明。具體的說明性實施例描述於下文中。 在一實施例中，本發明之"Kd"或"Kd值”係藉由放射性標 118226.doc -18- 200804418 記抗原結合性檢定（RIA)量測，該檢定利用所研究之抗體 之Fab形式及其抗原執行，如以下檢定所述。Fab對抗原之 溶液結合親和力可藉由在滴定系列之非標記抗原之存在下 用最小濃度之（1251)-標記抗原平衡Fab、接著用塗有抗-Fab 抗體之孔板捕獲結合抗原來量測（Chen等人，（1999) Mo/ 293:865-881)。為建立檢定條件，用50 mM碳酸鈉（pH 9.6)中之5 pg/ml捕獲抗-Fab抗體（cappel Lab)將微量滴定板 (Dynex)塗佈隔夜，且隨後在室溫下（約23°C)用PBS中之2% (w/v)牛血清白蛋白阻斷兩至五小時。在非吸附性孔板 (Nunc #269620)中，將 100 pM或26 pM [1251]·抗原與所研究 之Fab之連續稀釋液混合（例如，按照presta等人，（1997) Cancer Res. 57:4593-4599 中對抗 _VEGF 抗體、Fab-12 之評 價）。接著將所研究之Fab培育隔夜；然而該培育可持續更 長的時期（例如65個小時）以確保達成平衡。其後，將混合 物轉移入捕獲孔板以便在室溫下培育（例如一小時）。接著 移除溶液且用PBS中之0.1% Tween-20將孔板洗滌八次。當 孔板乾燥時，添加150微升/孔之閃爍體（MicroScint-20; Packard)，且用Topcount伽瑪計數器（Packard)對孔板計數 十分鐘。選擇產生小於或等於最大結合之20%的各Fab濃 度用於競爭性結合檢定。根據另一實施例’使用 BIAcoreTM-2000 或 BIAcoreTM，3000(BIAcore，Inc ·，Pis cat away， NJ)，使用表面電漿共振檢定，在25°C下，以〜l〇個響應單 元（RU)之固定抗原CM5晶片量測Kd或Kd值。簡而言之， 根據供應商說明書，用N-乙基-Nf-(3-二甲基胺基丙基）·碳 118226.doc -19- 200804418 化二醯亞胺鹽酸鹽（EDC)及N-羥基丁二醯亞胺（NHS)將羧 甲基化聚葡糖生物感應器晶片（CM5，BIAcore Inc.)激活。 用1〇111]^乙酸鈉（卩114.8)稀釋抗原至5 08/1111(〜〇.2 0]^)，再 以5微升/分鐘之流速注射，以獲得約10個響應單元（RU)之 偶合蛋白。繼注射抗原之後，注射1 Μ乙醇胺以阻斷未反 應基團。對於動力學量測，在25°C下、以約25 μΐ/min之流 速注射 Fab(0.78 nM至 500 nM)於具有 0.05% Tween 20之 PBS(PBST)中之兩倍連續稀釋液。締合速率（kon)及解離速 率（k〇ff)使用簡單的一比一朗繆爾（Langmuir)結合模型 (BIAcore Evaluation Software版本 3.2)、藉由同時擬合締合 與解離感測圖來計算。平衡解離常數（Kd)按比率 算。參見，例如，Chen，Y·等人，（1999) J· M?/ 293:865- 881。藉由以上表面電漿共振檢定，若締合速率超過106 NT1 s_1， 則締合速率可使用螢光淬滅技藝量測，該技藝係在如光譜 儀（諸如具有攪拌式比色管之止流裝備型光譜儀（Aviv Instruments)或 8000 -系列 SLM_Aminco光譜儀（ThermoSpectronic)) 中所量測之濃度增大之抗原存在下、在25 °C量測PBS (pH 7.2)中之20 nM抗-抗原抗體（Fab形式）之螢光發射強度（激發 =295 nm ;發射=340 nm，16 nm帶通）之增或減。 根據本發明，"締合速率’’或nk〇n"亦可在25 °C、使用 BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc·，Piscataway，NJ)、 以〜10個響應單元（RU)之固定抗原CM5晶片、利用上述相 同的表面電漿共振技藝測定。簡而言之，根據供應商說明 書，用N-乙基_N’-(3-二甲基胺基丙基）-碳化二醯亞胺鹽酸 118226.doc -20- 200804418 鹽（EDC)及N-羥基丁二醯亞胺（NHS)將羧甲基化聚葡糖生 物感應器晶片（CM5，BIAcore Inc.)激活。用10 mM乙酸鈉 (pH 4.8)將抗原稀釋至5 pg/ml(〜0.2 μΜ)再以5微升/分鐘之 流速注射，以獲得約10個響應單元（RU)之偶合蛋白。繼抗 原注射之後，注射1 Μ乙醇胺以阻斷未反應基團。對於動 力學量測，在25°C下，以約25 μΐ/min之流速注射Fab(0.78 nM至 500 nM)於具有 0.05% Tween 20之 PBS(PBST)中之兩 倍連續稀釋液。締合速率（kj及解離速率（kQff)使用簡單的 一比一朗缪爾（Langmuir)結合模型（BIAcore Evaluation Software版本3.2)、藉由同時擬合締合與解離感測圖來計 算。平衡解離常數（Kd)按比率kc^/l^n計算。參見，例如， Chen，Y·等人，（1999)义 Mo/ 心/ 293:865-881。然而，藉 由以上表面電漿共振檢定，若締合速率超過li^M·1 s·1，則締合 速率可使用螢光淬滅技藝測定，該技藝係在25°C、在如光 譜儀（諸如具有授拌式比色管之止流裝備型光譜儀（Aviv Instruments)或 8000 系 列 SLM-Aminco 光譜儀 (ThermoSpectronic))中所量測之濃度增大之抗原存在下量 測PBS(pH 7.2)中之20 nM抗-抗原抗體（Fab形式）之螢光發 射強度（激發=295 nm ;發射=340 nm，16 nm帶通）之增或 減。 如本文中所使用，術語”載體π欲指一種核酸分子，其能 夠輸送已與其連接之另一核酸。一類型之載體為"質體”， 其係指可接合其他DNA片段的環狀雙股DNA環。另一類型 之載體為噬菌體載體。另一類型之載體為病毒載體，其中 118226.doc •21- 200804418 可將其他DNA片段接合入疝盖A m Λ 、 m入病毋基因組内。某些載體能夠在 其所導入之宿主細胞中自主游制〃 複Μ例如，具有細菌性複製 起點之細讀載體及游離型嗔乳動你 土用孔動物載體）。其他載體（例 如’非游離型哺乳動物載體)可經導入宿主細胞内而整合 入宿主細胞之基因組内，且從而隨同該宿主基因組—起複 製。此外’某些載體能夠引導與其操作性連接之基因的表 現。該等載體在本文中稱為"重組表現载體"（或簡稱"重組 載m而言’重組DNA技藝中應用之表現載體常為 質體之形式。由於質體為載體之最常用形式，因此在本說 明書中，，，質體”與”载體”可互換使用。 如本文中可互換使用之”多核芽酸"或”核酸π係指任意長 度之核苦酸之聚合物’且包括0>^八及11^^八。核苷酸可為脫 氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基，及/ 或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應 整合入聚合物内的任意底物。多核苷酸可包含經修飾之核 苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在聚 合物成型之前或之後對核苷酸結構加以修飾。核苷酸序列 中可插有非核苷酸成分。多核苷酸可在合成之後進一步修 飾’諸如與標記結合。其他類型之修飾包括：例如，一或 多種天然存在之核苷酸經類似物之”帽”取代；核苷酸間修 飾’諸如具有不荷電鍵之彼等物（例如膦酸甲酯、碟酸三 酯、磷醯胺酸、胺基甲酸酯等）及具有荷電鍵之彼等物（例 如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）、含有懸垂部分之彼等 物（諸如蛋白（例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、ply-L_ 118226.doc -22- 200804418 離胺酸等）、具有嵌入劑之彼等物（例如吖啶（acridine)、補 骨脂素（psoralen)等）、含有螯合劑之彼等物（例如金屬、放 射性金屬、硼、氧化性金屬等）、含有烷化劑之彼等物、 具有經修飾之鍵之彼等物（例如α變旋異構體核酸等）以及 多核苷酸之未修飾形式。此外，通常存在於糖中之任一羥 基可置換為例如藉由標準保護基所保護之膦酸酯基、磷酸 基’或加以活化以製備與其他核苷酸之其他鍵聯，或可與 固體或半固體支持物結合。5,端及3,端〇Η可磷酸化或經胺 或1至20個碳原子之有機封端基團部分取代。其他羥基亦 可衍生為標準保護基。多核苷酸亦可含有該項技術中通常 已知之核糖或脫氧核糖的類似形式，其例如包括2，_〇_甲 基-核糖、2，-〇-烯丙基核糖、2，_氟-核糖或2，_疊氮基核 糖、碳環形糖類似物、α_變旋異構體糖、差向異構體糖 (諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖（lyX〇ses)、旅喃糖、咬喃 糖、景天庚嗣糖（sedoheptuloses))、非環形類似物及基本 核普類似物，諸如甲基核糖核苷。可將一或多個磷酸二酯 鍵置換為替代鍵聯基團。該等替代鍵聯基團包括但不限於 如下實施例，其中磷酸酯基置換為P(0)S("硫代酸酯”）、 P(S)S(” 二硫代酸酯 ’’）、（〇)NR2(，，醯胺化物，，）、p(〇)R、 P(C〇〇R’、CO或CH2("甲縮醛"），其中各R或R’獨立地為Η 或視需要含有醚鍵芳基、烯基、環烷基、環烯基或 芳盤基之經取代或未經取代的烷基（1-20 C)。多核苷酸中 並非所有的鍵聯必需相同。以上說明適用於本文中所述之 所有多核苷酸，包括RNA及DNA。 118226.doc -23- 200804418 如本文中所使用，，，寡核苷酸”泛指通常為單股、通常為 合成的短多核苷酸，其長度通常（但不一定）小於約2〇〇個核 苷酸。術語’’寡核皆酸”及"多核普酸”並非互不相容的。以 上對於多核苷酸之說明同樣完全適用於募核苷酸。 抗體n(Ab)與"免疫球蛋白”(Ig)為具有相同結構特性的醣 蛋白。雖然抗體呈現與特異性抗原之特定結合，但免疫球 蛋白包括抗體與通常缺乏抗原特異性的其他抗體樣分子。 後者型式之多肽例如由淋巴系統在低含量下及由骨髓瘤在 高含量下產生。 術語，，抗體”及”免疫球蛋白"在廣義上可互換使用且包括 單株抗體（例如全長或完整單株抗體）、爹株抗體、單價抗 體、多價抗體、多特異性抗體（例如，雙特異性抗體，只 要其呈現所要生物活性）且亦可包括某些抗體片段（如本文 中之更詳細描述）。抗體可為嵌合抗體、人類抗體、人源 化抗體及/或親和力成熟抗體。 抗體之，，可變區"或"可變域”係指抗體之重鏈或輕鏈之胺 基末端域。該等域通常為抗體之最.易變部分且含有抗原結 合位點。 術語”可變”係指如下事實：可變域之某些部分在各抗體 之間、在序列上廣泛不同且可用於各特定抗體對其特定抗 原的結合及特異性。然而，可變性並非在整個抗體可變域 内均勻分佈。主要為輕鏈可變域與重鏈可變域中之三個稱 為互補性確定區（CDR)或高變區的片段。可變域之更非常 保寸邛分稱為框架（FR)。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含 118226.doc -24- 200804418 四個藉由三個CDR所連接（形成環連接）、主要採用卜片狀 構型（而在有些狀況中形成β_片狀結構之部分）的FR區。各 鏈中之CDR以及其他鏈中之CDR藉由FR區緊密結合在一 起’從而形成抗體之抗原結合位點（參見Kabat等人， Sequences of pr0teins of Immun〇1〇gical Imerest，第五 版，National lnstitute of Heahh，Bethesda，MD (1991))〇 恆定域雖不直接參與抗體結合抗原，但呈現各種效應功 能，諸如抗體參與依賴型細胞毒性。 抗體之木瓜酶消化產生兩種相同的抗原結合片段，稱作 nFab”片段（各具有單個抗原結合位點）與殘餘的，，片段， 其名稱體現其易結晶的能力。胃蛋白酶處理可產生具有兩 個抗原結合位點且仍能夠聯結抗原的以讣％片段。 為3有元整抗原識別位點與結合位點的最小抗體片 &。在雙鏈Fv種類中，此區域包含一重鏈可變域與一輕鏈 可變域以非共價緊密締合之二聚物。在單鏈以種類中，一 重鏈可變域與-輕鏈可變域可藉由柔性肽連接子以共價鍵 聯結，以使得該輕鏈與該重鏈以與雙鏈…種類中之彼結構 類似之"二聚物”結構締合。在此構型中，各可變域中之三 個CDR相互作用以限定VH_VL二聚物表面上的抗原結合^ 點:六個CDR共同使抗體具有抗原結合特異性。然而，甚 至單個可變域（或包♦僅三個對抗原特異之咖之^的一 半）具有識別及結合抗原的能力，儘管親和力比完士 合位點低。 恆定域
Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第 118226.doc •25· 200804418 (CH1)。Fab·片段與Fab片段不同之處為重鏈CH1域之羧基 末端處增加幾個殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半 胱胺酸。Fab’-SH在本文中為其中該等恆定域之半胱胺酸 殘基帶有自由硫醇基的Fab’命名。F(ab，)2抗體片段最初係 作為Fab’片段對（其之間具有鉸鏈半胱胺酸）產生。其他化 學偶合之抗體片段亦已知。 來自任何脊椎動物種之抗體（免疫球蛋白）之”輕鏈”基於 其恒定域之胺基酸序列可歸類為兩種明顯不同類型（稱作κ 及λ)之^^。 抗體（免疫球蛋白）視其重鏈之恆定域之胺基酸序列而定 可歸為不同類。免疫球蛋白主要存在五類：IgA、IgD、 IgE、IgG及IgM，而該等類中若干種又可分為亞類（同種 型），例如，IgG〗、IgG2、IgG3、IgG4、IgAi 及 IgA2。對應 於不同類免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱作α、p、ε、γ及 μ。不同類免疫球蛋白之次單位結構及三維構型已熟知且 通常描述於例如，Abbas等人，Cellular and Mol. Immunology，第4版（2000)中。一種抗體可為由該抗體與一 或多種其他蛋白質或肽共價或非共價締合所形成之較大融 合分子之部分。 術語π全長抗體”、”完整抗體"及，，整個抗體”在本文中可 互換地使用’其係指大體上為完整形式的抗體而非如下定 義之抗體片段。該等術語尤其係指具有含有Fc區之重鏈的 抗體。 ”抗體片段”僅包含完整抗體之一部分，其中該部分保留 118226.doc -26- 200804418 與彼部分當其存在於完整抗體中時正常相關之功能中 τ 主 夕 功月b，及大部分或全部功能。在一實施例中，抗體片 段包含完整抗體之抗原結合位點且從而保留結合抗原的A 力。在其他實施例中，抗體片段（例如，包含以區的抗體 片段）保留與該Fc區當存在於完整抗體中時正常相關之生 物功能中之至少一功能，諸如FcRn結合、抗體半衰期調 節、ADCC功能及互補結合。在一實施例中，抗體片段為 具有與完整抗體大體上相似之活體内半衰期的單價抗體。 舉例而言，該抗體片段可包含一連接^序列之抗原結合 臂，Fc序列能夠使該片段具有活體内穩定性。 如本文中所使用之術語”單株抗體”係指獲自大體上同源 抗體群的抗體，亦即，組成該群的個別抗體一致，除少量 存在之可能天然發生突變之外。因此，修飾語，，單株”表= 抗體當不為離散抗體之混合物時的特性 包括包含結一多狀序列的抗體，其中獲 合多肽序列的方法包括自複數個多肽序列中選擇單個乾向 結合多肽序列。舉例而言，選擇方法可為自複數個純系 (諸如融合瘤純系庫、嗟菌體純系庫或重組舰純系庫）中 選擇獨特純系。應瞭解’所選靶向結合序列可經進一步修 改成例如改良對乾物之親和力、使乾向結合序列人源化、 改良其在細胞培養中之產生、減少其活體内免疫原性、形 成多特異性抗體等，且包含所修改之乾向結合序列的抗體 亦為本發明之單株抗體。與通常包括針對不同決定子（抗 原決定基）之不同抗體的多株抗體製劑相比，單株抗體製 118226.doc -27- 200804418 劑中之各單株抗體係針對抗原上之單個決定子。除其特異 性之外，單株抗體製劑有利之處亦在於其通常未被其他免 疫球蛋白污染。修飾語”單株”表示抗體當獲自大體上同源 之抗體群時的特性，且不應理解為需要藉由任何特定方法 產生抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可由各 種技藝製付，該專技藝包括·例如，融合瘤方法（例如， Kohler 等人，Nature，256: 495 (1975) ; Harlow 等人， Antibodies: A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2版 1988) ; Hammerling等人，於： Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 中 (Elsevier，Ν·Υ·，1981));重組DNA方法（參見，例如，美國 專利第4,816,567號）；噬菌體顯示技術（參見，例如， Clackson等人，Nature, 352: 624-628 (1991) ; Marks等人， J· Mol· Biol· 222: 581-597 (1992) ; Sidhu等人，J. Mol· Biol. 338 (2) : 299-310 (2004) ; Lee 等人，J. Mol. Biol. 340 (5): 1073-1093 (2004) ； Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (34): 12467-12472 (2004);及 Lee 等人，J· Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004))，以及在具 有編碼人類免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因座或基 因之部分或全部的動物中產生人類或人類樣抗體的技術 (參見，例如，WO 98/24893 ; WO 96/34096 ; WO 96/33735 ; WO91/10741 ; Jakobovits等人，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 90: 2551 (1993) ; Jakobovits等人，Nature 362: 255-258 (1993) ; Bruggemann等人，Year in Immunol· 7:33 (1993); 118226.doc -28 - 200804418 美國專利第 5,545,807 號、第 5,545,806 號、第 5,569,825 號、第 5,625，126 號、第 5,633,425 號、第 5,661，016 號； Marks等人，Bio. Technology 10: 779-783 (1992) ; Lonberg 等人，Nature 368: 856-859 (1994) ; Morrison，Nature 368: 812-813 (1994) ; Fishwild 等人，Nature Biotechnol· 14: 845-851 (1996) ; Neuberger，Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及 Lonberg及 Huszar，Intern. Rev. Immunol. 13: 65_93 (1995)) 〇 本文中之單株抗體具體包括：n嵌合”抗體（其中重鏈及/ 或輕鏈中之一部分與源自特定種類或屬於特定抗體類或亞 類之抗體中的相應序列一致或同源，而該（等）鏈之剩餘部 分與源自其他種類或屬於其他抗體類或亞類之抗體中的相 應序列一致或同源）以及該等抗體中之片段，只要其呈現 所要的生物活性（美國專利第4,816,567號·，及Morrison等 人，Proc· Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。 非人類（例如鼠）抗體之”人源化”形式為含有最少之源自 非人類免疫球蛋白之序列的嵌合抗體。在一實施例中，人 源化抗體為人類免疫球蛋白（受體抗體），其中將獲自接受 者之高變區的殘基置換為獲自具有所要特異性、親和力及/ 或容量之非人類種（供體抗體）（諸如小鼠、大鼠、兔或非人 類靈長類動物）之高變區的殘基。在有些情況中，人類免 疫球蛋白之框架區（FR)殘基置換為相應的非人類殘基。此 外’人源化抗體可包含未見於受體抗體或供體抗體中的殘 基。進行該等修飾可進一步改進抗體效能。一般而言，人 118226.doc -29- 200804418 源化抗體包含大體上不少於至少一個、而通常兩個可變 域，其中全部或大體上全部之高變環對應於非人類免疫球 蛋白之彼等環，且全部或大體上全部之FR為人類免疫球蛋 白序列之FR。人源化抗體視需要亦包含免疫球蛋白（通常 為人類免疫球蛋白）恆定區（Fc)之至少一部分。欲知詳情， 請參見 Jones等人，Λ^ίι/re 321:522-525 (1986) ; Riechmann 等人，332:323-329 (1988);及 Presta，Cwrr. Ορ· 5/(9/. 2:593-596 (1992)。亦參見以下評論文章及其 中所引用之參考文獻：Vaswani及Hamilton，d⑽
Asthma & Immunol. 1:105-1 15 (1998) ； Harris, Biochem. 7Va似acizcms 23:1035-1038 (1995) ; Hurle 及 Gross， Cwr· 5:428-433 (1994)。 術語n高變區n、"HVR”或’’HV”當在本文中使用時，係指 抗體可變域中為序列高變且/或在結構上形成限定環之的 區域。通常，抗體包含六個高變區；三個在VH中（H1、 H2、H3)且三個在VL中（LI、L2、L3)。很多高變區描述可 通用且涵蓋於本文中。Kabat互補確定區（CDR)係基於序列 可變性且最常用（Kabat等人，〇/ ZVoie/似〇/ Immunological ，第 5 版，Public Health Service，
National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991))。冠於 術語”CDR"前的字母”HC”及”LC"係分別指重鏈及輕鏈之 CDR。相反，Chothia係指結構性環之位置（Chothia及Lesk， J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。AbM 高變區表示 Kabat CDR與Chothia結構性環之間的折中，且被Oxford 118226.doc -30- 200804418
Molecular’s AbM抗體建模軟體利用。”接觸"高變區係基於 對可利用之複晶結構的分析。獲自該等各高變區的殘基註 解如下。
Loop Kabat AbM Chothia Contact LI L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 HI H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Kabat編號） HI H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia編號） H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 高變區可包含如下’’擴展高變區n ·· VL中之24-36或24-34(L1)、46-56 或 50-56(L2)及 89-97 或 89-96(L3)以及 VH 中 之 26·35(Η1)、50-65 或 49-65(H2)及 93-102、94-102 或 95-102(H3)。可變域殘基根據Kabat等人（同上）針對該等各定 義所述加以編號。 ，，框架”或nFR”殘基為除如本文中所定義之高變區殘基以 外的彼等可變域殘基。 術語’，按照Kabat編號之可變域殘基π或π按照Kabat編號之 胺基酸位置編號”及其變化形式，均係指Kabat等人之 Sequences of Proteins of Immunological Interest » 第 5版， 118226.doc -31 - 200804418
Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD· (1991)中用於編繪抗體之重鏈可變域或輕鏈 可變域的編號系統。使用該編號系統，實際的線性胺基酸 序列可含有更少或其他胺基酸，相當於簡化或插入可變域 之FR或HVR。舉例而言，重鏈可變域可包括H2之殘基52 後面的單胺基酸插入殘基（根據Kabat為殘基52a)及重鏈FR 殘基82後面的的插入殘基（根據Kabat例如為殘基82a、82b 及82c等）。指定抗體之殘基之Kabat編號可藉由將該抗體序 列之同源區與”標準"Kabat編號序列對準來確定。 ”單鏈Fv1’或nscFvn抗體片段包含抗體之VH域及VL域， 其中該等域存在於單個多肽鏈中。通常，scFv多肽另外包 含能夠使scFv形成抗原結合所要結構、介於VH域與VL域 之間的多肽連接子。欲回顧scFv，請參見Pluckthun，於 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies j 第 113 卷中， Rosenburg及 Moore編，Springer-Verlag，New York，第 269-315頁（1994) 〇 術语’雙功能抗體’係指具有兩個抗原結合位點的小抗體 片段，該等片段包含與同一多肽鏈中之輕鏈可變域（VL)連 接的重鏈可變域（VH)(VH_VL)。藉由使用太短而使同一鏈 上之兩個域無法配對的連接子，可迫使該等域與另一鏈中 之互補域配對且形成兩個抗原結合位點。雙功能抗體更多 描述於例如 EP 404,097 ; WO 93/11161 ;及 Hollinger 等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90:6444-6448 (1993)中。 π人類抗體n為一種具有與人類所產生之抗體之胺基酸序 118226.doc -32- 200804418 列對應之胺基酸序列的抗體，且可利用如本文中所揭示之 任一種製備人類抗體之技藝製得。人類抗體之此定義明確 地不包括包含非人類抗原結合殘基的人源化抗體。 π親和力成熟π抗體為一種在其一或多個HVR中具有一或 多處可使得抗體對抗原之親和力改良（與不具有彼等修改 之親本抗體相比）之修改的抗體。在一實施例中，親和力 成熟抗體具有對乾抗原之奈莫耳（nanomolar)或甚至皮莫耳 (picomolai*)親和力。親和力成熟抗體可由該項技術中已知 之私序製備。Marks 專人之 Bio/Technology 10.779-783 (1992)描述藉由VH及VL域改組之親和力成熟。cdR及/或 框架殘基之隨機突變誘發描述於：Barbas等人，
Ad· &ζ·，ί/Μ 91:3809-3813 (1994); Schier等人，^加 169:147-155 (1995); Yelton等人，乂 加則⑽ 155:1994_ 2004 (1995)，Jackson等人 ’/· ⑽154(7):3310-9 (1995) ,·及 Hawkins 等人，j· 5,226:889 896 (1992)〇 ”阻斷”抗體或”拮抗劑”抗體為一種抑制或降低其所結合 之抗原之生物活性的抗體。某些阻斷抗體或拮抗劑抗體大 體上或完全地抑制抗原之生物活性。 如本文中所使用之”促效劑抗體"為一種模擬所研究之多 肽之至少一種功能活性的抗體。 ”病症”為經本發明之抗體治療可好轉的任何病狀。此包 括慢性及急性病症或疾病，包括易使哺乳動物感染所述病 症的病理性病狀。本文中待治療之病症的非限制實例包括 118226.doc -33 - 200804418 感染、細胞增殖性病症、免疫/炎性病症（包括作不卩卩於 體免疫病症）及其他干擾素相關病症。 < 自 術語"感染”係指因一或多種其他有機體侵入或影響經歷 該感染之哺乳動物之正常生理所引起的疾病。感染之 包括但不限於病毒感染、細菌傳染、寄生蟲感染(例如，J 螺蟲及線嘉所引起的感染）及真菌感染。 術語”細胞增殖性病症”及，，增殖性病症”係指與某種程度 之異常細胞增殖相關的病症。在一實施例中，細胞增殖性 病症為癌症。術語”癌症，，及"癌變”係指或描述哺乳動物甲 通常以無限制細胞生長/增殖及例如腫瘤形成為特徵的生 理性病狀。癌症之實例包括但不限於癌瘤、淋巴瘤（例如 霍奇金氏淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤）、胚細胞瘤、肉瘤 及白血病。該等癌症之更具體實例包括鱗狀細胞癌、小細 胞肺癌、非小細胞肺癌、肺之腺癌、肺之鱗狀癌、腹膜 癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤、子宮頸 癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳癌、結腸癌、結腸 直腸癌、子宮内膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、 前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、白血病及其他淋巴 組織增生性病症’以及各種類型之頭頸癌。細胞增殖性病 症亦包括但不限於白血病前期病症，諸如骨髓發育異常症 候群（MDS)。 如本文中所使用之，，腫瘤”係指所有的贅生性細胞生長及 增殖（無論惡性或良性），以及所有的癌變前及癌變細胞及 組織。如本文中所引述，術語，，癌症””癌變”、”細胞增殖性 118226.doc -34- 200804418 病症、增殖性病症"及"腫瘤"並非互相排斥的。 術語"干擾素相關病症，I係指或描述通常以一或多種干擾 素之量或活性異常為特徵或造成的病症。干擾素相關病症 之實例包括但不限於， 〆術語，，炎性病症”及，，免疫病症，，係指或描述因錢機制異 =及/或細胞激素信號傳導異常（例如，干擾素信號傳導異 丰)所引起的病症。炎性病症及免疫病症之實例包括但不 限於自體免疫疾病、免疫缺乏症候群及過敏症。本文 中，’自體免疫疾病”為由個體自身組織所產生且不利於其組 織的非惡性疾病或病症。本文中自體免疫疾病明確地不包 括惡性或癌變疾病或病狀，尤其不包括B細胞淋巴瘤、急 生淋巴母細胞性白血病（ALL)、慢性淋巴細胞性白血病 (CLL)、毛細胞白血病及慢性骨髓母細胞白血病。自體免 疫疾病或病症之實例包括但不限於··炎性反應，諸如炎性 皮膚疾病（包括牛皮癖及皮膚炎（例如異位性皮膚炎））；系 統性硬皮病及硬化症；炎症性腸病相關反應（諸如克羅恩 氏病（Crohn’s diSease)及潰瘍性結腸炎）；呼吸窘迫症候群 (包括成人呼吸窘迫症候群ARDS);皮膚炎；腦膜炎，·腦 义，葡萄膜炎，結腸炎；絲球體性腎炎；諸如濕疹及哮喘 之過敏性病狀及與T細胞滲濾及慢性炎性反應相關的其他 病狀；動脈粥樣硬化症；白細胞黏著缺乏症；類風濕性關 筇炎，系統性紅斑狼瘡（SLEX包括但不限於狼瘡腎炎、皮 膚狼瘡）；糖尿病（例如，1型糖尿病或胰島素依賴型糖尿 病），多發性硬化症；Reynau(J氏症候群；自體免疫甲狀腺 118226.doc -35- 200804418 炎；Hashnnoto氏甲狀腺炎；變應性腦脊髓炎；sj〇gr⑶氏 症候群；幼年發作型糖尿病；及與由細胞激素及淋巴細 胞介導之急性過敏性及遲發過敏性相關之免疫反應，通常 見於肺結核、類肉瘤病、多肌炎、肉芽腫病及血管炎；惡 性貧血（Addison氏疾病）；白細胞滲出相關之疾病；中樞神 經系統（CNS)炎性病症；多_官損傷症候群；溶血性貧血 (包括但不限於冷球蛋白血症（ery〇gl〇binemia)或c⑽㈤心陽 性貧血）；重症肌無力；抗原抗體複合物介導之疾病；抗_ 腎絲球基膜疾病；抗磷脂症候群，·過敏性神經炎； 氏疾病；Lambert-Eatcm肌無力症候群；天疱瘡樣大皰；天 癌瘡’自體免疫多内分泌腺病；Reiter氏疾病；全身肌僵 直症候群；Behcet病；巨細胞性動脈炎；免疫複合物性腎 炎；IgA腎病；IgM多神經病；免疫性血小板減少性紫癜 GTP)或自體免疫性血小板減少症等。 免疫缺乏症候群之實例包括但不限於共濟失調毛細血管 擴張、白細胞黏著缺乏症候群、淋巴細胞減少症、異常γ 球蛋白血症、HIV或δ反轉錄病毒感染、常見變異性免疫缺 乏、嚴重聯合免疫缺陷、巨噬細胞殺菌功能異常、無γ球 蛋白血症、DiGeorge症候群及Wisk〇tt_AldHch氏症候群。 過敏症之實例包括但不限於變態反應、哮喘、皮膚炎、麻 疹、過敏症、Wissler氏症候群及血小板減少性紫癜。 如本文中所使用，"治療"係指臨床介入以求改變所治療 之個體或細胞之自然過程，且可為預防而執行或在臨床病 理期間執行°理想的治療效果包括防止疾病發作或復發、 118226.doc -36- 200804418 減輕症狀、減少疾狀任何直接或間接病理性後果、防止 或減緩炎症及/或組織/器官傷害、降低疾病行進速度、改 善或減緩疾病狀態及症狀緩解或預後改良。在有些；施例 中，本發明之抗體係用於抑制疾病或病症之形成。 "個體"為脊椎動物。在某些實施例中，脊椎動物為哺乳 動物。哺乳動物包括但不限於農畜(諸如牛）、運動型動 物、寵物(諸如貓、狗及馬）、靈長類動物、、鼠及大鼠。 在某些實施例中，脊椎動物為人類。 用於治療之"哺乳動物"係指歸類為哺乳動物的任何動 物’包括人類、家畜及農畜，及動物園、運動會或玩賞動 物，諸如狗、馬、貓、牛等。在某些實施例中，哺乳動物 為人類。 ·’有效量”係指以所需劑量及期限有效獲得所要治療結果 或預防結果的量。 本發明之物質/分子之”治療有效量，，可根據諸如以下因素 而變：個體之疾病狀態、年齡、性別及體重，以及該物質/ 分子在個體中誘發所要反應的能力。治療有效量亦為一種 治療有益效應超過該物質/分子之任何毒性或有害效應的 量。”預防有效量”係指以所需劑量及期限有效獲得所要預 防結果的量。由於預防劑量係在患病之前或在患病早期之 受檢者中使用，因此預防有效量通常（但不一定）小於治療 有效量。 如本文中所使用之術語π細胞毒性劑"係指一種抑制或防 止細胞功能且/或促使細胞毀壞的物質。該術語意欲包括 118226.doc -37- 200804418 放射性同位素（例如，At211、I131、I125、γ90、Re186、 Re188、Sm153、Bi212、Ρ32、Pb212 及 Lu之放射性同位素）； 化學治療劑’例如甲胺蝶呤、阿黴素（adriamicin)、長春生 物鹼類（vinca alkaloids)(長春新鹼（vincristine)、長春花驗 (vinblastine)、依託泊苷（et〇poside)、阿黴素（dox〇rubicin)、 美法命（melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮 芬（chlorambucil)、道諾黴素（daunorubicin)或其他插入 劑、酶及其片段（諸如核酸分解酶、抗生素及毒素，諸如 細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒 素，包括其片段及/或變體），以及下文所揭示之各種抗瘤 劑或抗癌劑。其他細胞毒性劑在下文中描述。殺腫瘤劑可 促使腫瘤細胞毁壞。 π化學治療劑”為適用於治療癌症的化合物。化學治療劑 之實例包括：烷化劑，諸如硫替派（thiotepa)及CYTOXAN® 壞構酿胺；烧基績酸鹽類，諸如白消安（busu 1 fan)、英丙 舒凡（improsulfan)及哌泊舒凡（piposuifan);氮丙啶類，諸 如苯唑多巴（benzodopa)、卡巴醌（carb〇qU〇ne)、米特多巴 (meturedopa)及尤利多巴（uredopa);伸乙基亞胺類及甲基 密胺類，包括六甲蜜胺（altretamine)、三伸乙基密胺 (triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺 (trietylenephosphoramide)、三伸乙基硫代磷醯胺 (triethiylenethiophosphoramide)及三甲密胺 (trimethylolomelamine);多聚乙醯類（acet〇genins)(尤其布 拉他辛（bullatacin)及布拉他辛酮（bullatacinone)) ; Δ-9-四 118226.doc •38- 200804418 氫大麻酚（delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚 (dronabinol，MARINOL®)) ; β-拉帕酮（beta-lapachone);拉 帕醇（lapachol);秋水仙驗（colchicine);樺木酸（betulinic acid);喜樹鹼（camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康 (topotecan)(HYCAMTIN®)、CPT-11(伊諾替康（irinotecail ; CAMPTOSAR®)、乙醯基喜樹驗（acetylcamptothecin)、斯 考普萊叮（scopolectin)及9_胺基喜樹鹼）；苔蘚蟲素 (bryostatin);卡利斯塔叮（callystatin); CC-1065(包括其阿 多來新（adozelesin)、卡折來新（carzelesin)及比折來新合成 類似物）；足葉草毒素（podophyllotoxin);足葉草酸 (podophyllinic acid);替尼泊甙（teniposide);念珠藻環肽 (cryptophycin)(尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8);海兔毒 素（dolastatin);多卡米辛（duocarmycin)(包括合成類似物， KW-2189 及 CB1-TM1);艾榴素（eleutherobin);盤克斯塔叮 (pancratistatin);沙考的汀（sarcodictyin);海綿素 (spongistatin);氮芥類，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥 (chlornaphazine)、環填醯胺、雌氮芥（estramustine)、異環 磷醯胺、二氯甲二乙胺、鹽酸二氯甲二乙胺氧化物 (mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖、新氮芥 (novembichin)、膽固醇苯乙酸氮芥（phenesterine)、松龍苯 芥（prednimustine)、氣乙環填酿胺（trofosfamide)、尿鳴咬 氮芥（uracil mustard);頌基脲，諸如亞硝脲氮芥 (carmustine)、氣脲黴素（chlorozotocin)、福莫司汀 (fotemustine)、環己亞石肖脲（lomustine)、哺唆亞石肖脲 118226.doc -39- 200804418 (nimustine)及拉甯司汀（ranimnustine);抗生素，諸如婦二 快抗生素（例如’刺孢徽素（calicheamicin)，尤其刺孢黴素 γΐ及刺孢徽素ω1(參見’例如，Agnew，Chem Inti. Ed. Engl” 33: 183-186 (1994));達米辛（dynemicin)，包括達米 辛A;艾斯帕米辛（esperamicin);以及新製癌菌素 (neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色 團）、克拉斯米辛（aclacinomysins)、放線菌素 (actinomycin)、奥斯拉米辛（authramycin)、重氮絲胺酸 (azaserine)、博萊黴素（bleomycin)、放線菌素 (cactinomycin)、卡拉比辛（carabicin)、洋紅黴素 (carminomycin)、嗜癌黴素（carzinophilin)、克羅米辛 (chromomycinis)、放線菌素（dactinomycin)、道諾黴素、 地托比星（detorubicin)、6 -重氮基-5-側氧-L-正白胺酸、 ADRIAMYCIN㊣阿撤素（包括嗎琳幷-阿徽素（morpholino-doxorubicin)、氰基嗎啉幷-阿黴素（cyanomorpholino-doxorubicin)、2_吡咯幷·阿黴素及去氧阿黴素 (deoxydoxorubicin)、表柔比星（epirubicin)、依索比星 (esorubicin)、伊達比星（idarubicin)、麻西羅黴素 (marcellomycin)、絲裂黴素（mitomycins)(諸如絲裂黴素 C)、黴酚酸（mycophenolic acid)、諾加黴素（nogalamycin)、 橄欖黴素（olivomycins)、培洛黴素（peplomycin)、潑非黴 素（pot Hr 〇 my cin)、嘌呤黴素（pur 〇 my cin)、奎那黴素 (quelamycin)、羅多比星（rodorubicin)、鏈黑菌素 (streptonigrin)、鏈脲黴素（streptozocin)、殺結核菌素 118226.doc -40- 200804418 (tubercidin)、烏苯美司（ubenimex)、淨司他丁（zinostatin)、 佐柔比星（zoirubicin);抗代謝物，諸如甲胺蝶呤及5_氟尿 嘧啶（5-fluorouracil)(5-FU);葉酸類似物，諸如傣諾特呤 (denopterin)、甲胺蝶呤、蝶羅呤（pteropterin)、三甲曲沙 (trimetrexate);嘌呤類似物，諸如氟達拉濱（nudarabine)、 6-酼基嘌呤（6-mercaptopurine)、噻咪嘌呤（thiamiprine)、 硫鳥嘌呤（t h i 〇 g u a n i n e );嘧啶類似物，諸如環胞普 (ancitabine)、阿紮胞苷（azacitidine)、氮尿苷（6-azauridine)、 卡莫氟（carmofur)、阿糖胞苷（cytarabine)、雙脫氧尿苦 (dideoxyuridine)、去氧氟尿苷（doxiHuridine)、依諾他濱 (enocitabine)、氟尿核苷（floxuridine);雄性激素，諸如二 甲睾酮（calusterone)、屈他雄酮丙酸酯（dromostanolone propionate)、環硫雄醇（epitiostanol)、美雄烧（mepitiostane)、 睾内酯（testolactone);抗腎上腺劑，諸如胺基苯乙旅咬酮 (aminoglutethimide)、米托坦（mitotane)、曲洛司坦 (trilostane);葉酸補充劑，諸如夫羅林酸（frolinic acid); 醋葡内酯（aceglatone);駿填醯胺葡糖甙（aldophosphamide glycoside);胺基果糖酸（aminolevulinic acid);伊利盧拉 (eniluracil);胺苯吖咬（amsacrine);倍思塔布（bestrabucil); 比生群（bisantrene);艾達曲克（edatraxate);得弗伐胺 (defofamine);秋水仙胺（demecolcine);地 °丫 g昆（diaziquone); 艾弗利散（elfornithine);依利醋銨（elliptinium acetate);埃 坡黴素（epothilone);乙環氧啶（etoglucid);硝酸鎵（galliurn nitrate);羧基脲（hydroxyurea);香益糖（lentinan);羅尼達 118226.doc -41 - 200804418 寧（lonidainine);美登素類（maytansinoids)，諸如美登素 (maytansine)及胺沙托辛（ansamitocins);丙脉月宗 (mitoguazone);米托蒽酉昆（11111:〇父&111：1：〇116);莫比達摩 (mopidanmol);硝拉維林（nitraerine);喷司他丁 (pentostatin);凡那明（phenamet);比柔比星 (pirarubicin);洛索蒽醌（i〇soxantrone) ; 2-乙基醯肼（2-ethylhydrazide);普魯苄肼（procarbazine); pSK®多醣複合 物(JHS Natural Products，Eugene，OR);丙亞胺（razoxane);根 黴菌素（rhizoxin);西佐糖（siZ0firan);螺鍺（spir〇gerrnaniunl); 細交鏈孢菌_酸（tenuazonic acid);三亞胺西昆 (triaziquone) ; 2,2’，2”-三氯三乙基胺；單端孢黴烯族毒素 (trichothecenes)(尤其T-2毒素、弗納庫林A(verracurin A)、 桿孢菌素A(roridin A)及胺癸叮（anguidine));烏拉坦 (urethan);去乙醢長春醯胺（vindesine)(ELDISINE®， FILDESIN®);氮烯嗤胺（dacarbazine);甘露酵氮芥 (mannomustine)；二溴甘露醇（mitobronitol);二溴衛矛醇 (mitolactol);雙漠丙基旅唤（pipobroman);甲托辛 (gacytosine);阿糖胞普（arabinoside)("Ara-C");硫替派 (thiotepa);紫杉酵（taxoids)，例如TAXOL®太平洋紫杉醇 (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)； ABRAXANETM無Cremophor-太平洋紫杉醇之白蛋白設言十 奈米微粒調配物（American Pharmaceutical Partners， Schaumberg，111 i η o i s )及 T A X Ο T E R E ® 多西他賽 (doxetaxel)(Rh0ne-Poulenc Rorer，Antony，France);克羅南 118226.doc -42- 200804418 布（chloranbucil);吉西他濱（gemcitabine)(GEMZAR⑧）；6-硫鳥嘌呤（6-thioguanine);酼基嘌呤（mercaptopurine);甲胺 蝶呤；鉑類似物，諸如順鉑（cisplatin)及卡鉑（carboplatin); 長春花鹼（vinblastine)(VELBAN®);鉑；依託泊苷（νΡ-ΐ 6) ; 異環填 醯胺； 米 托蒽酿^ (mitoxantrone) ; 長 春新驗 (vincristine)(ONCOVIN®);奥沙利鉑（oxaliplatin);盧考 弗文（leucovovin);長春瑞賓（vinorelbine)(NAVELBINE®); 諾凡特龍（novantrone);依達曲沙（edatrexate);道諾黴 素；胺基蝶呤；伊班膦酸鹽（ibandronate);拓撲異構酶抑 制劑 RFS 2000 ;二氣曱基鳥胺酸（difluorometlhylornithine) (DMFO);類視色素類，諸如視黃酸（retinoic acid);卡培他 濱（capecitabine)(XELODA®);以上任一種治療劑之醫藥 學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及以上兩種或兩種以上 治療劑之組合，諸如CHOP(環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼 與潑尼松龍（prednisolone)之混合治療之縮寫）及FOLFOX(奥 沙利鉑（oxaliplatin)(ELOXATINTM)與5-FU及盧考弗文組合 治療方案之縮寫）。 該定義中亦包括具有調節、減少、阻斷或抑制可促進癌 生長之激素之效應之作用的抗激素劑，該等抗激素劑通常 為系統性或全身性治療之形式。其可為激素本身。實例包 括抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑（SERM)，例如包 括它莫西芬（tamoxifen)(包括NOLVADEX®它莫西芬）、 EVISTA® 雷洛西芬（raloxifene)、屈洛昔芬（droloxifene)、 4-經基它莫西芬（4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬 118226.doc -43- 200804418 (trioxifene)、雷洛昔芬鹽酸鹽（keoxifene)、LY117018、歐 納氏酮（onapristone)及FARESTON®托瑞米芬（toremifene);抗 黃體酮；雌激素受體減量調節劑（ERD);具有抑制或制止 卵巢之功能的藥劑，例如黃體素釋放激素（LHRH)促效 劑，諸如LUPRON®及ELIGARD®醋酸亮丙瑞林（leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林（goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林 (buserelin acetate)及曲特瑞林（tripterelin);其他抗雄性激 素，諸如I他胺（flutamide)、尼魯米特（nilutamide)及必卡 他胺（bicalutamide);以及抑制芳香酶的芳香酶抑制劑（芳 香酶可調節腎上腺中之雌激素產生），諸如4(5)-17米嗤、胺 基苯乙旅σ定酮（aminoglutethimide)、MEGASE®酷酸甲地孕 酮（megestrol acetate)、AROMASIN®依西美坦（exemestane)、弗 米斯坦（formestanie)、法倔嗤（fadrozole)、RIVISOR® 伏氣 吐（vorozole)、FEMARA® 來曲嗤（letrozole)及 ARIMIDEX® 瑞寧德（anastrozole)。此外，該定義之化學治療劑包括： 雙膦酸鹽，諸如氣屈膦酸鹽（clodronate)(例如，BONEFOS® 或 OSTAC®)、DIDROCAL® 依替膦酸鹽（etidronate)、NE-58095、ZOMETA®唑來膦酸/唑來膦酸鹽、FOSAMAX®阿 侖膦酸鹽（alendronate)、AREDIA® 帕米膦酸鹽（pamidronate)、 SKELID®替魯膦酸鹽（tiludronate)或ACTONEL®利塞膦酸鹽 (risedronate);以及曲沙他濱（troxacitabine)(l，3_二氧戊環 核苷胞嘧啶類似物）；反義寡核苷酸，尤其抑制基因在與 異常細胞增殖相關之信號傳導途徑中之表現的彼等物，諸 如PKC_cx、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體（EGF-R);疫 118226.doc -44- 200804418 苗’諸如THERATOPE®疫苗及基因治療疫苗’例如 ALLOVECTIN® 疫苗、LEUVECUN® 疫苗及 VAXID® 疫 苗；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH ;拉帕替尼對甲苯石黃酸鹽（lapatinib ditosylate)(ErbB-2與EGFR二元酪胺酸激酶小分子抑制劑，亦稱 GW572016);及以上任一治療劑之醫藥學上可接受之鹽、 酸或衍生物。 組合物及其製備方法 本發明提供特定結合RELT的抗體。在一態樣中，本發 明提供包含HVR-H1區的抗體，該HVR-H1區包含SEQ ID NO: 42-49中至少一者之序列。在一態樣中，本發明提供 包含HVR-H2區的抗體，該HVR-H2區包含SEQ ID NO: 51-5 8中至少一者之序列。在一態樣中，本發明提供包含 HVR-H3區的抗體，該HVR-H3區包含SEQ ID NO: 60-67中 至少一者之序列。 在一態樣中，本發明提供包含HVR-H1區及HVR-H2區的 抗體，該HVR-H1區包含SEQ ID NO·· 42_49中至少一者之 序列，且該HVR-H2區包含SEQ ID NO: 51-58中之至少一 者之序列。在一態樣中，本發明提供包含HVR-H3區的抗 體，該HVR-H3區包含SEQ ID NO: 60-67中至少一者之序 列。在一態樣中，本發明提供包含HVR-H1區及HVR-H3區 的抗體，該HVR-H1區包含SEQ ID NO: 42-49中至少一者 之序列，且該HVR-H3區包含SEQ ID NO: 60-67中之至少 一者之序列。在一態樣中，本發明提供包含HVR-H2區及 118226.doc -45- 200804418 HVR-H3區的抗體，該HVR-H2區包含SEQ ID NO: 51-58中 至少一者之序列，且該HVR-H3區包含SEQ ID NO: 60-67 中之至少一者之序列。 在一態樣中，本發明提供包含以下序列中之至少一者、 至少兩者或至少三者的抗體： i 包含SEQ ID NO: 42-49中之至少一序列的HVR-H1序 列； ϋ 包含SEQ ID NO: 51-58中之至少一序列的HVR-H2序 列； iii包含SEQ ID NO: 60_67中之至少一序列的HVR-H3序 列； 如圖 5A及 5B 中所示，SEQ ID NO: 42-49、5 1-58及 60-67 之胺基酸序列係針對個別HVR(亦即，HI、H2、H3)編 號，該編號符合如下所述之Kabat編號系統。在一實施例 中，本發明之抗體包含以上（i)_(iii)HVR序列中之一、兩或 三種序列以及如SEQ ID NO: 1或2中所述之輕鏈高變區。 在一態樣中，本發明提供包含如圖5A及5B中所描繪之 重鏈HVR序列的抗體。在一實施例中，該等抗體另外包含 如SEQ ID NO: 1或2所示之輕鏈HVR序列。 本發明之抗體之某些實施例包含人源化4D5抗體 (huMAb4D5-8)(HERCEPTIN®, Genentech，Inc·，South San Francisco，CA，US A)之輕鏈可變域（亦參見美國專利第 6,407,213號及Lee等人，J. Mol· Biol· (2004)，340 (5):1073-93)， 如以下SEQ ID NO: 1中所示。 118226.doc -46- 200804418 1 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly
Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 107 (SEQ ID NO: 1)(HVR殘基標有下劃線） 在一實施例中，huMAb4D5-8輕鏈可變域序列在位置 30、66及91中之一或多處（如以上以粗體/斜體分別所示之 Asn、Arg及His)經修飾。在一實施例中，經修飾之 huMAb4D5-8序列包含位置30中之Ser、位置66中之Gly及/ 或位置91中之Ser。因此，在一實施例中，本發明之抗體 包含包括如以下於SEQ ID NO: 2中所示之序列的輕鏈可變 域： 1 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe_Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 118226.doc -47- 200804418
Cys Gin Gin Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 107 (SEQ ID NO: 2) (HVR殘基標有下劃線） 相對於huMAb4D5-8經取代之殘基在上文中係以粗體/斜 體表示。 若與RELT之結合活性大體上保持，則本發明之抗體可 包含任何適當的框架可變域序列。舉例而言，在有些實施 例中，本發明之抗體包含人類亞群III重鏈框架一致序列。 在該等抗體之一實施例中，該框架一致序列包含位置71、 73及/或78處之取代。在該等抗體之某些實施例中，位置 71為A，73為T且/或78為A。在一實施例中，該等抗體包 含 huMAb4D5-8(HERCEPTIN®，Genentech, Inc·，South San Francisco, CA，USA)之重鏈可變域框架序列（亦參見美國專 利第 6,407,213 號及第 5,821，337 號，及 Lee 等人，J. Mol. Biol. (2004)，340 (5):1073-93)。在一實施例中，該等抗體 另外包含人類κΐ輕鏈框架一致序列。在一實施例中，該等 抗體包含huMAb4D5-8之輕鏈HVR序列，如美國專利第 6,407,213號及第5,821，337號中所述。在一實施例中，該等 抗體包含 huMAb4D5-8(SEQ ID NO: 1 及 2)(HERCEPTIN®， Genentech，Inc·，South San Francisco，CA，USA)之輕鏈可 變域序列（亦參見美國專利第6,407,213號或第5,821，337 號，及Lee等人，J. Mol. Biol. (2004)，340 (5):1073-93)。 在一實施例中，本發明之抗體包含一重鏈可變域，其中 該框架序列包含SEQIDNO:3_21、30-33、38-41及73-129 118226.doc -48- 200804418 中至少一者之序列，且HVR HI、H2及H3序列係分別選自 SEQ ID NO: 42-50、5 1-59 及 60-68 中之至少一者。在 _實 施例中，本發明之抗體包含一輕鏈可變域，其中該框架序 列包含8£(^1〇]^〇:22_25、26_29、34-3 7及13 0-141中之至 少一者之序列，且高變區係選自SEQ ID NO: 1及2。 在一實施例中，本發明之抗體包含一重鏈可變域，其中 該框架序列包含SEQ ID NO: 3-21及73-129中之至少一序 列，且HVR HI、H2及H3序列分別為 SEQ ID NO·· 49、58 及67(純系HI 1)。類似地，在其他實施例中，各純系〇21、 CIO、E5/E7、F4、F5、H7及H9之抗體包含一重鏈可變 域’其中框架序列包含SEQ ID NO: 3 - 21及73 - 129中之 至少一序列，且HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3序列為圖5A 及5B甲針對各純系或Fab所具體羅列的彼等序列。 在一實施例中，本發明之抗體經親和力成熟以獲得所要 的靶結合親和力。 在一態樣中，本發明提供與上述任一種抗體競爭結合 RELT的抗體。在一態樣中，本發明提供與上述任一種抗 體結合RELT上相同抗原決定子的抗體。 本發明提供包含至少一種抗-RELT抗體或至少一種包含 編碼抗-RELT抗體之序列之多核苷酸的組合物。在某些實 施例中，組合物可為醫藥組合物。如本文中所使用，組合 物包含一或多種結合RELT的抗體及/或一或多種包含編碼 一或多種結合RELT之抗體之序列的多核苷酸。該等組合 物另外可包含該項技術中熟知之適當載劑，諸如醫藥學上 118226.doc -49- 200804418 可接文之賦形劑（包括緩衝劑）。 本I月亦^^供分離抗體及多核苦酸。在某些實施例中， 5亥等分離抗體及多核苷酸為大體上純的。 在一實施例中，抗_RELT抗體為單株抗體。在其他實施 例中’提供抗-RELT抗體之片段（例如，Fab、Fab，-SH及 F(ab*)2片段）。該等抗體片段可藉由傳統方式（諸如酶促消 化）製得’或藉由重組技藝產生。該等抗體片段可為嵌 合、人源化或人類抗體片段。該等片段適用於下述診斷性 及治療性目的。 使用嗟菌體呈現文庫產生抗_RELT抗體 產生噬菌體呈現文庫、自其獲得所研究之抗體的各種方 法在该項技術中係已知的。一種產生所研究之抗體的方法 係利用如 Lee等人，J· Mol· Biol· (2004)，340 (5):1073_93 中 所述之噬菌體抗體文庫。 本發明之抗-RELT抗體可利用組合文庫篩選具有所要活 性之合成抗體純系來獲得。原則上，合成抗體純系係藉由 篩選含有可呈現與噬菌體外被蛋白所融合之抗體可變區 (Fv)之各種片段之嗤菌體的嗤菌體文庫來選定。該等嗟菌 體文庫可藉由親和層析法、針對所要抗原來全面篩選。表 現能夠結合所要抗原之Fv片段的純系被吸附至抗原，且從 而與文庫中之非結合純系分離。接著將結合純系自抗原溶 離，且可藉由其他輪之抗原吸附/溶離進一步富集。本發 明之任一種抗-RELT抗體可藉由設計適當的抗原篩選程序 以選定所研究之噬菌體純系、再使用獲自所研究之噬菌體 118226.doc -50- 200804418 純系之Fv序列及描述於以下文獻中之適當恆定域（Fc)序列 建構全長抗RELT抗體純系來獲得：Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991)，第 1-3卷。 抗體之抗原結合域係由兩個各來自輕鏈（VL)與重鏈（VH) 之約110個胺基酸之可變（V)區形成，該等輕鏈與重鏈均存 在三個高變環或互補性確定區（CDR)。可變域可如單鏈 Fv(scFv)片段（其中VH與VL經由柔性短肽以共價鍵聯結）或 如Fab片段（其中VH與VL各與恆定域融合且以非共價鍵相 互作用），功能性地呈現於嗤菌體上，如Winter等人，」別· Rev. Immunol·, 12: 433-455(1994)中所述0 如本文中所使 用，編碼嗤菌體純系之scFv以及編碼嗤菌體純系之Fab統 稱為nFv噬菌體純系”或"Fv純系π。 VH與VL基因庫可藉由聚合酶鏈反應（PCR)分別選殖，且 在噬菌體文庫中隨機重組，接著可搜尋抗原結合純系，如 Winter 等人，Ann. Rev. Immunol·，12: 433-455(1994)中所 述。獲自免疫來源之文庫可向免疫原提供高親和力抗體， 而無需建構融合瘤。或者，天然文庫經選殖可向廣範圍之 非自體抗原以及自體抗原提供單一來源之人類抗體而無需 任何免疫作用，如Griffiths等人，五乂 12: 725-734 (1993)所述。最後，天然文庫亦可藉由自幹細胞選殖未經 重排之V-基因片段並使用含有隨機序列之PCR引子編碼高 變CDR3區及完成活體外重排來合成獲得，如Hoogenboom 及 Winter，J. Mo/· 227: 3 81-388 (1992)所述。 118226.doc -51- 200804418 可使用絲狀噬菌體、藉由與少量外被蛋白pIII融合來呈 現抗體片段。該等抗體片段可作為單鏈Fv片段呈現，其中 VH域與VL域藉由柔性多肽間隔基連接於同一多肽鏈上， 例如，如Marks等人，J. Mol. Biol·，222: 581-597(1991)中 所述；或作為Fab片段呈現，其中一鏈與pIII融合而另一鏈 分泌進入細菌性宿主細胞周質内，在周質内藉由置換野生 型外被蛋白中之一部分組裝呈現於噬菌體表面上的Fab_外 被蛋白結構’例如，如Hoogenboom等人，Nucl· Acids Res·，19·· 4133-4137(1991)中所述。 一般而言，編碼抗體基因片段之核酸可自獲自人類或動 物之免疫細胞中得到。若需要偏重於抗_RELT純系的文 庫’則以RELT使受檢者免疫以產生抗體反應，且回收脾 細胞及/或循環B細胞及其他周圍血液淋巴細胞（pbl)用於 文庫建構。在一實施例中，偏重於抗-人類rELT純系之人 類抗體基因片段文庫可藉由在攜有功能性人類免疫球蛋白 基因陣列（且缺乏功能性内源抗體產生系統）之轉殖基因小 鼠中產生抗-人類RELT抗體反應以使得RELT免疫作用產生 生成抗RELT之人類抗體的B細胞來獲得。產生人類抗體之 轉殖基因小鼠之繁殖描述於以下（III)部分（b)中。 抗-RELT反應性細胞群之另外富集可藉由利用適當的篩 選程序分離表現RELT-特異性膜結合抗體之b細胞來獲 得’例如，利用親和層析法或使細胞吸附螢光染料標記之 RELT、再藉由流式活化細胞分選（FacS)來分離細胞。 或者，利用獲自未免疫供體之脾細胞及/或B細胞或其他 118226.doc •52- 200804418 PBL可提供可能抗體文庫之良好表述，且亦可利用其中 RELT不為抗原性之任何動物（人類或非人類）種類建構抗體 文庫。對於包括活體外抗體基因結構的文庫，可自受檢者 收穫幹細胞以提供編碼未重排之抗體基因片段的核酸。所 研究之免疫細胞可獲自各種動物種類，諸如人類、小鼠、 大鼠、兔、狼（luprine)、犬、貓、豬、牛、馬及禽種類 編碼抗體可變基因片段（包括VH及VL片段）的核酸可自 所研究之細胞中獲得且擴增。在重排VH及VL基因文庫之 狀況中，所要DNA可藉由自淋巴細胞中分離基因組〇ΝΑ或 mRNA、再利用與重排VH及VL基因之5胃端及3,端匹配之引 子、藉由聚合酶鏈反應（PCR)獲得，如〇rlandi等人，尸 A^i/· Ad· (USA)，86·· 3 83 3-3 837 (1989)中所述，從而 獲得用於表現之各種V基因文庫。V基因可利用編碼成熟 V-域之外顯子之5’端處的後向引子以及定位於片段内部 的前向引子、自cDNA及基因組DNA擴增，如Orlandi等人 (1989)及 Ward等人，iVaiwre，341: 544-546 (1989)中所述。 然而，對於自cDNA擴增，亦可使後向引子定位於前導外 顯子中’如J0nes等人，价Wee六⑽/，9: 88-89 (1991)中所 述’而前向引子亦可定位於恆定區内部，如Sastry等人， 尸~口· iVa"· &z· (usa)，86: 5728-5732 (1989)中所 述。為使互補性最大化，可將簡併整合入該等引子中，如 〇rlandl等人（1989)或Sastry等人（1989)中所述。在某些實施 例中’文庫多樣性可藉由使用乾向各V—基因家族的pcR引 118226.doc -53- 200804418 子最大化，以便增加存在於免疫細胞核酸樣本中之所有可 利用的VH與VL排列，例如，如Marks等人，《/· Mo/· 5^/.， 222·· 5 81-597 (1991)之方法中所述，或如Orum等人， TVwc/ez·。21: 4491-4498 (1993)之方法中所述。 對於將經擴增之DNA選殖入表現載體，可在一端處作為標 記之PCR引子内引入稀少的限制性位點，如Orlandi等人 (1989)中所述；或利用標記引子進行其他PCR擴增，如 Clackson等人，iVaiwre，352: 624-628 (1991)中所述。 合成性重排之V基因之文庫可活體外獲自V基因片段。 人類VH-基因片段中的大部分已經選殖且定序（報導於 Tomlinson等人，J· Mo/· 5b/·，227: 776-798 (1992)中），且 已繪出圖譜（報導於Matsuda等人，TVa/wre Gewei·，3: 88-94 (1993)中）；可使用該等選殖片段（包括HI與H2環之所有主 要構形）以及編碼各種序列及長度之H3環的PCR引子產生 各種 VH基因文庫，如 Hoogenboom 及 Winter，X Mo/. ， 227: 381-3 88 (1992)中所述。亦可獲得所有的序列多樣性 集中於單倍長之長Η3環的VH文庫，如Barbas等人，Proc. Natl· Acad· Sci· USA，89: 4457-4461 (1992)中所述。人類 Vk及νλ片段已經選殖且定序（報導於Williams及Winter， jBwr· J· /mmwwo/·，23: 1456-1461 (1993)中）且可用於獲得合 成性輕鏈文庫。合成性V基因文庫（基於VH與VL折疊之範 圍及L3與H3長度）可編碼大量結構多樣性的抗體。擴增編 碼DNA之V-基因之後，生殖系V-基因片段可根據 Hoogenboom及 Winter, J. Mol· Biol·，227: 381-388 (1992)之 118226.doc -54- 200804418 方法，在活體外重排。 抗體片段之文庫可藉由以若干方式將VH與VL基因文庫 組合在一起來建構。各種文庫可建立於不同載體中，例如 活體外重組載體，如Hogrefe等人，Ge«e，128: 119-126 (1993)中所述；或活體内組合感染之载體，例如， Waterhouse等人，及以·，21: 2265-2266 (1993)中 所述之ΙοχΡ系統。該活體内重組方法係利用Fab片段之雙 鏈性質來克服大腸桿菌轉化效率對文庫大小所施加的限 制。天然VH文庫及VL文庫分開選殖，一個選殖入噬粒而 另一個選殖入噬菌體載體。該兩個文庫接著藉由噬菌體感 染含有噬粒之細菌來組合，以使得各細胞含有不同組合且 文庫大小僅由細胞存在數目（約1012個純系）限制。兩載體 均含有活體内重組信號以使得VH基因及VL基因重組於單 個複製子上且共封裝入噬菌體病毒粒子内。該等龐大文庫 可提供大量具良好親和力（約10_8 Μ之Kef1)的各種抗體。 或者，該等文庫可依序選瘦入同一載體，例如，如 Barbas等人，Proc. 5W· USA，88: 7978-7982 (1991)中所述；或藉由PCR組裝在一起且接著選殖，例 如，如 Clackson 等人，352: 624-628 (1991)中所 述。PCR組裝亦可用於將VH DNA及VL DNA與編碼柔性肽 間隔基之DNA接合在一起以形成單鏈Fv(scFv)文庫。在又 一技藝中，"在細胞PCR組裝中"係用於藉由PCR在淋巴細 胞内組合VH基因及VL基因且接著選殖連鎖基因文庫，如 Embleton等人，Acids Res·, 20: 3831-3837 (1992)中 118226.doc -55- 200804418 所述。 篩選文庫藉由該項技術已知的任何技藝來完成。舉例而 言，可使用RELT塗佈吸附板之孔，可使RELT表現於附著 吸附板的宿主細胞上或用於細胞分選，或結合生物素以便 利用塗有抗生蛋白鏈菌素之珠粒捕集，或用於該項技術已 知的其他任何方法中以便全面篩選噬菌體呈現文庫。 利用吸附劑使噬菌體文庫樣本在適於結合噬菌體顆粒之 至少一部分的條件下接觸固著RELT。通常，選擇模仿生 理狀況的條件，包括pH值、離子濃度、溫度及類似條件。 將結合固相之噬菌體洗滌且接著藉由酸溶離，例如，如
Barbas等人，i USA，88: 7978-7982 (1991)中所述，或猎由驗溶離，例如，如Marks等人，j
Mo/· 5z(9/·，222: 581-597 (1991)中所述；或藉由 RELT抗原 競爭（例如，以與Clackson等人，⑶π，352: 624-628 (1991)之抗原競爭方法類似之程序）溶離。噬菌體在一輪選 擇後可§集20-1，000倍。此外，所富集之嗤菌體可培養於 細菌培養液中且經受其他輪之選擇。 選擇效率視很多因素而定，包括洗滌期間之解離動力學 及單1_體上之多抗體片段是否可同時與抗原結合。利用 短時洗滌可持留具有快速解離動力學（及弱結合親和力）的 抗體。高密度不僅經由多價相互作用穩定噬菌體，而且有 利於已解離之嗟菌體之再結合。可利用長時間洗務及單價 嘱卤體呈現（如 Bass 等人，/V (9 M *y，8: 309-314 (1990)及 WO 92/09690中所述）及抗原之低塗履密度（如Marks等人， 118226.doc -56- 200804418 —.，Η): 779-783 (1992)中所述）來促進具有慢 離動力學（及優良結合親和力）之抗體之選擇。 可在對RELT親和力不同之耗體抗體之間選擇，即使 親和力稍微不同。然而，所選抗體之隨機突變（例如，當 以上述某些親和力成熟技藝執行時）有可能產生很多突: 體，大部分結合抗原且少量具有更高親和力。在限制 RELT下，可淘汰稀少的高親和力噬菌體。為保留所有的 較高親和力突變體，噬菌體可利用過量的經結合生物素之 RELT培育，只是經結合生物素之祖了的莫耳濃度在比粗 物對RELT之莫耳親和常數更低。高親和力結合喔菌體接 著可藉由塗有抗生蛋白鏈菌素之順磁珠粒捕集。該"平衡 捕集"容許抗體根據其結合親和力被選定，其敏感度容許 自顯著過量之具有較低親和力之噬菌體中分離僅兩倍高親 和力的突變體純系。亦可基於解離動力學判別控制用於洗 滌結合固相之噬菌體的條件。 抗-RELT純系可根據活性選擇。在一實施例中，本發明 提供當活體内投藥時或當活體外添加至MHC ΙΓ DC前體細 胞培養液中時可增強（相對於cDC)pDC產生的抗-RELT抗 體。在其他實施例中，本發明提供當活體内投藥時可增大 IFN-α之血清濃度或當活體外添加至mhc ΙΓ DC前體細胞 培養液中時可增強IFN-a分泌的抗-RELT抗體。對應於該 抗-RELT抗體之Fv純系可藉由如下步驟選擇··（〗）自噬菌體 文庫中分離抗-RELT純系，如以上B部分（1)(2)中所述，且 視需要藉由在適當的細菌宿主中培養該群體來擴大噬菌體 118226.doc -57- 200804418 純系之分離群體；（2)針對分別需要阻斷活性及非阻斷活性 選擇RELT及第二蛋白；（3)使抗-RELT噬菌體純系吸附至 固著RELT ; (4)使用過量的第二蛋白溶離可識別與第二蛋 白之結合決定子重疊或共有之RELT結合決定子的任何非 所要純系；及（5)溶離步驟（4)之後仍吸附的純系。視需 要，具有所要阻斷/非阻斷特性之純系可進一步藉由將本 文中所述之選擇程序重複一或多次來富集。 編碼本發明之Fv純系的DNA易使用習知程序分離且定序 (例如，使用設計成能自融合瘤或噬菌體DNA模板特定擴 增編碼感興趣區之重鏈及輕鏈的寡核苷酸引子）。DNA — 旦分離，則可置於表現載體内，接著轉染入諸如大腸桿菌 細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢（CHO)細胞或骨髓瘤細 胞之宿主細胞内（否則不產生免疫球蛋白），以在重組宿主 細胞中獲得所要單株抗體之合成。關於在細菌中重組表現 編碼抗體之DNA的評論文章包括Skerra等人，Cz/rr. Opinion in Immunol·，5: 256 (1993) Pluckthun, Immunol· 7?，，130: 151 (1992)。 編碼本發明之Fv純系得DNA可與已知之編碼重鏈恆定區 及/或輕鏈恆定區的DNA序列（例如，可獲自Kabat等人（同 上）的適當DNA序列）組合，以形成編碼全長或部分長度重 鏈及/或輕鏈的純系。應瞭解，任何同種型之恆定區（包括 IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恒定區）可用於此目的，且該等 恆定區可獲自任何人類或動物種類。如本文中所使用之 ”嵌合”及”雜交”定義包括自一動物（諸如人類）種之可變域 118226.doc -58- 200804418 DNA獲得Fv純系且接著與其他動物種之恆定區DNA融合以 形成”雜交”全長重鏈及/或輕鏈的編碼序列。在一實施例 中，源自人類可變DNA的Fv純系係與人類恆定區DNA融合 以形成所有人類全長或部分長度重鏈及/或輕鏈的編碼序 列。 由天然文庫所產生之抗體（天然的或合成的）可具有中度 的親和力（約106至ΙΟ7 M-1之Kd·1)，但親和力成熟亦可藉由 •建構第二文庫及從中再選擇來模仿，如Winter等人 (1994)(同上）中所述。舉例而言，在Hawkins等人，j. 价〇/·，226: 889_896 (1992)之方法中，或在Gram等人， dead/· 5W tASj，89: 3576-3580 (1992)之方法 中，藉由使用易出錯聚合酶（報導於Leung等人， 1: 11-15 (1989)中）在活體外隨機導入突變。此 外，親和力成熟可藉由在選定之個別F v純系中使一或多個 CDR隨機突變（例如，使用引子攜有跨越所研究之CDR2 隨機序列的PCR)且篩選較高親和力純系來進行。w〇 9607754(1996年3月14日公佈）描述一種誘導免疫球蛋白輕 鏈之互補性確定區發生突變以建立輕鏈基因文庫的方法。 其他有效方法係將藉由噬菌體呈現所選擇的VH域或▽1域 與獲自未免疫供體之天然發生v域變異體文庫重組且以數 輪之鍵改組篩選較高親和力，如跑如等人，心⑽邮厂， 10· 779-783 (1992)中所述。此技藝可產生親和力在ι〇·9 μ 範圍内的抗體及抗體片段。 產生抗-RELT抗體的其他方法 118226.doc •59 200804418 產生及評價抗體親和力的其他方法已熟知於該項技術中 且描述於，例如，Kohler等人，Nature 256: 495 (1975); 美國專利第 4,816,567號；Goding，Monoclonal Antibodies: Principles and Practice，第 59-103 頁（Academic Press， 1986 ; Kozbor，J· /mmw如/·，133:3001 (1984) ; Brodeur等 人，Monoclonal Antibody Production Techniques and 似，第 51-63 頁（Marcel Dekker，Inc·，New York， 1987; Munson 等人，」即/·价107:220 (1980); Engels 等人 » Agnew. Chem. Int. Ed. Engl·，28: 716-734 (1989) ; Abrahmsen 等人，五乂，4: 3901 (1985);
Mei/zoc/s ，第 44卷（1976) ; Morrison 等人，
Proc. dead· 5W· /7以，81: 6851-6855 (1984)。 一般方法 一般而言，本發明提供適用於治療Relt介導病症（其中 需要阻抑一或多種RELT活性中之部分或全部活性）的抗-RELT抗體。在一實施例中，本發明之抗-RELT抗體係用於 治療細胞增殖性病症。在其他實施例中，本文中所提供之 抗-RELT抗體係用於治療感染。在其他實施例中，本文中 所提供之抗-RELT抗體係用於治療免疫病症、諸如上述彼 等病症。在其他實施例中，本文中所提供之抗-RELT抗體 係用於治療炎性病症、諸如上述彼等病症。在其他實施例 中，本文中所提供之抗-RELT抗體係用於治療其他干擾素 相關病症。 如本文中所展示，RELT為針對CDll+B220 + CDllb· 118226.doc -60- 200804418 CD45RB+漿細胞樣樹突狀細胞（npDCn)而非針對習知 CD11C+B220·樹突狀細胞（”cDCn)的陰性調節劑。因此，本 發明之抗-RELT抗體可拮抗RELT之正常功能（從而增強 IFN-α-分泌pDC自前體細胞中產生），或者可刺激RELT之 正常功能（從而減少IFN-a-分泌pDC自前體細胞中產生）， 此視抗體結合之抗原決定基而定。阻斷RELT結合其一或 多個天然配位體的抗-RELT抗體有可能拮抗RELT活性。穩 定或增強RELT結合其一或多個天然配位體（亦即，阻斷 RELT結合一或多個RELT抑制因子，或阻止RELT P爷解而不 減弱RELT結合其天然配位體之能力）的抗-RELT抗體有可 能促進RELT活性。本發明涵蓋促效抗體與拮抗抗體，且 從而提供利用本發明之抗-RELT抗體在活體外與在活體内 增強（拮抗）或減弱（促效）相對pDC及IFN-a含量的方法。 在其他態樣中，本發明之抗-RELT抗體可用作用於偵測 及分離RELT(諸如偵測各種細胞類型及組織中的RELT)的 試劑，包括測定RELT密度及在細胞群體中及給定細胞内 部之分佈以及基於RELT之存在或量之細胞分選。 在又一態樣中，該等拮抗性抗-RELT抗體適用於形成具 有與本發明之該等抗體之彼等型式類似之阻斷活性型式的 RELT拮抗劑。舉例而言，本發明之拮抗性抗-RELT抗體可 用於鑑定具有相同RELT結合特性及/或阻斷RELT介導途徑 之能力的其他抗體。又舉例而言，本發明之抗_RELT拮抗 性抗體可用於鑑定如同本文中所例示之抗體般結合RELT 之大體上相同之抗原決定子（包括線性抗原決定基及構形 118226.doc -61 - 200804418 抗原決定基）的其他抗-RELT抗體。 本發明之抗-RELT抗體可用於基於涉及RELT之生理途徑 的檢定，以篩選RELT之小分子拮抗劑，該等小分子拮抗 劑在阻斷一或多個結合夥伴結合RELT中呈現類似的藥理 學效果。如本文中所展示，小鼠缺失relt會使IFN-α-分泌 pDC之群體增加，且從而導致彼等小鼠中IFN-a之血清含 量全面升高。因此，在篩選中可使用阻斷抗-RELT抗體鑑 定RELT-介導抑制pDC形成的小分子拮抗劑。舉例而言， 在抑制pDC自MHC ΙΓ DC前體細胞中形成時可將一或多種 潛在小分子拮抗劑之活性與拮抗性抗-RELT抗體之活性對 比。 如本文中所展示，relt在小鼠中之裂解會增加 CDllc+MHC ΙΓ細胞所產生之pDC的量（相對於cDC)。因 此，在其他實施例，本發明提供藉由抑制CDllc+MHC ΙΓ 細胞中之RELT表現及/或活性調節CD 11 c+MHC ΙΓ細胞所產 生之pDC對cDC之比例的方法。在一態樣中，RELT表現及/ 或活性藉由分裂relt來抑制。在其他態樣中，RELT表現及/ 或活性藉由投與與RELT DNA或RNA反義之寡核苷酸來抑 制。在其他態樣中，RELT表現及/或活性藉由投與一或多 種拮抗RELT的抗體來抑制。在其他態樣中，RELT表現及/ 或活性藉由投與本發明之一或多種抗體來抑制。在其他態 樣中，RELT表現及/或活性藉由投與抗體HI 1來抑制。在 其他態樣中，RELT表現及/或活性在活體外抑制。在其他 態樣中，RELT表現及/或活性在活體内抑制。 118226.doc -62- 200804418 類似地’本發明提供減少由CDiic+MHC ΙΓ細胞所產生 之pDC相對於cDC細胞之比例的方法，包含激發 CDllc+MHC ΙΓ細胞中之RELT表現及/或活性。在一態樣 中，RELT表現及/或活性藉由投與一或多種刺激RELT的抗 體來激發。在其他態樣中，RELT表現及/或活性在活體内 激發。在其他態樣中，REUr表現及/或活性在活體外激 發。 IFN-α已知主要係由pDC產生，且如本文中所展示，活 體内之系統性IFN-a含量主要可歸因於IFN-a係因pDC產 生。因此，本發明提供藉由抑制RELT表現及/或活性增強 IFN-ct產生的方法。在一態樣中，RELT表現及/或活性藉由 分裂relt來抑制。在其他態樣中，RELT表現及/或活性藉由 投與與RELT DNA或RNA反義之寡核苷酸來抑制。在其他 態樣中，RELT表現及/或活性藉由投與一或多種拮抗relt 的抗體來抑制。在其他態樣中，rELT表現及/或活性藉由 投與本發明之一或多種抗體來抑制。在其他態樣中， RELT表現及/或活性藉由投與抗體Hii來抑制。在其他態 樣中，RELT表現及/或活性係在活體外抑制。在其他態樣 中，RELT表現及/或活性係在活體内抑制。 類似地，本發明提供藉由激發RELT表現及/或活性減少 IFN-cc產生的方法。在一態樣中，RELT表現及/或活性藉由 投與一或多種刺激RELT的抗體來激發。在其他態樣中， RELT表現及/或活性係在活體内激發。在其他態樣中， RELT表現及/或活性係在活體外激發。 118226.doc -63· 200804418 候選抗體之產生可使用該項技術中熟知之常識（包括本 文中所述彼等方法）來達成，諸如融合瘤技藝及黏合劑分 子之嗤菌體呈現文庫之_選。該等方法已良好確立於該項 技術中。 簡而。之本發明之抗-RELT抗體可利用組合文庫篩選 具有所要活性之合成抗體純系來獲得。原則上，合成抗體 純系係藉由篩選含有可呈現與噬菌體外被蛋白所融合之抗 體可變區（Fv)之各種片段之噬菌體的噬菌體文庫來選定。 該4噬菌體文庫可藉由親和層析法、針對所要抗原來全面 篩選。表現旎夠結合所要抗原之Fv片段的純系被吸附至抗 原，且從而與文庫中之非結合純系分離。接著將結合純系 自抗原溶離’且可藉由其他輪之抗原吸附/溶離進一步富 集。本發明之任一種抗RELT抗體可藉由設計適當的抗原 篩選程序以選定所研究之噬菌體純系、再使用獲自所研究 之嗤菌體純系之Fv序列及描述於以下文獻中之適當恆定域 (Fc)序列建構全長抗RELT抗體純系來獲得：Kabat等人，
Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版， NIH Publication 91-3242，Bethesda MD (1991)，第 1-3卷。 亦參見PCT公開案wo 03/102157，及其中所引用的參考文 獻。 在一實施例中，本發明之抗-RELT抗體係單株抗體。本 文所提供抗-RELT抗體之抗體片段，諸如Fab、Fab，、Fab，-SH及？（&1)，）2片段及其變異體，亦涵蓋於本發明之範疇内。 該等抗體片段可藉由傳統方式（諸如酶促消化）製得，或藉 118226.doc • 64- 200804418 由重組技藝產生。該等抗體片段 a仅J為甘欠合抗體片段、人類 抗體片段或人源化抗體片段。該犛 x忑寺片段適用於本文中文所 述之實驗性目的、診斷性目的及治療性目的。 早株抗體可獲自大體上同源抗體之群體，亦即組成該群 體之個別抗體相同，除少量存在之可能天然發生之突變之 夕卜因此，修飾語"單株"表示抗體t不為離散抗體之混合 物時的特性。 本發明之抗-RELT單株抗體可使用該項技術中已知的各 種方法獲得，該等方法包括最先由K〇hler等人，心仏 256:495 (1975)所述的融合瘤方法，或其可藉由重組^^八 方法獲得（例如，美國專利第4,816,567號）。 載體、宿主細胞及重組方法 對於重組產生本發明之抗體，可將編碼其之核酸分離且 插入可複製载體中以便進一步選殖（擴增DNA)或表現。編 碼該抗體之DNA易使用習知程序分離及定序（例如，使用 能夠特定結合編碼該抗體之重鏈及輕鏈之基因的募核普酸 探針）。很多載體可利用。載體之選擇部分地視待用宿主 細胞而定。宿主細胞包括但不限於原核生物來源或真核生 物來源（通常哺乳動物）的細胞。應瞭解，任何同種型之恆 定區（包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區）可用於此目 的，且該等恆定區可獲自任何人類或動物種類。 使用原核宿主細胞產生抗體 載體建構 編碼本發明之抗體之多肽成分的多核苷酸序列可使用標 118226.doc -65- 200804418 準的重組技藝獲得。所要客 夕核音酉夂序列可自諸如融合瘤細 胞之抗體產生細胞中分離 雕且疋序。或者，多核苷酸可使用 核苷酸合成儀或PCR技蓺人士 冰佐办 a 口成。編碼多肽之序列一旦獲 得，則插入能夠在原核宿φ 伯主中複製且表現異源多核苷酸的 重組載體中。可利用且兮馆山 ^項技術中已知的多種載體可用於 本發明。適當載體之選擇主 评王要視待插入載體中之核酸尺寸 及待經該載體轉化之特定宿幸&的& ~ ^ 饤疋佰主細胞而定。各種載體含有各 種成分’此視其功能（擴増或表現異源多核㈣，或擴增 且表現異源多核苦酸）及其與其所駐留之特定宿主細胞之 相令f生而定。載體成分一般包括但不限於：複製起點、選 擇柘忑基因、啟動子、核糖體結合位點（rbs)、信號序 列、異源核酸插入序列及轉錄終止序列。 一般而S，源自與宿主細胞相容種之含有複製子及控制 序列的質體載體可配合該等宿主使用。該載體通常攜有複 製位點，以及能夠在所轉化之細胞中提供表型選擇的標記 序列。舉例而言，大腸桿菌通常使用PBR322(源自大腸桿 菌種的質體）轉化。PBR322含有編碼安比西林（Amp)及四 裱素（Tet)抗性之基因且從而提供鑑定所轉化之細胞的便捷 方式。PBR322、其衍生物或其他微生物質體或噬菌體亦 可含有或經修飾成含有啟動子，該等啟動子可被微生物有 機體利用於表現内源性蛋白。用於表現特定抗體之 pBR322衍生物之實例詳述於Carter等人之美國專利第 5,648,237號中。 此外，與宿主微生物相容之含有複製子及控制序列的噬 118226.doc -66- 200804418 菌體載體可作為轉化載體配合該等宿主使用。舉例而言， 可利用諸如UJEM.TM._n之噬菌體製備可用於轉化諸：大 腸桿菌LE392之易感宿主細胞的重組載體。 本發明之表現載體可包含兩對或兩對以上之編碼各多肽 成分的啟動子-順反子對。啟動子為位於調節其表現之順 反子上游(5，)的末轉譯調控序列。原核啟動子通常分成兩 類：可誘導類及組成類。可誘導啟動子為—種在其控制下 啟動順反子轉錄水準遞增以回應培養條件之變化（例如， 有或無營養或溫度變化）的啟動子。 可由各種潛在宿主細胞識別的很多啟動子已為人熟知。 所選啟動子可經由限制酶消化自源DNA中移除啟動子且將 所为離之啟動子序列插入本發明之載體中來操作性連接至 編碼輕鏈或重鏈的順反子DNA。可使用天然啟動子序列與 諸多異源啟動子直接擴增及/或表現靶基因。在有些實施 例中，可利用異源啟動子，因為與天然靶多肽啟動子相 比，其一般容許所表現之靶基因之更多轉錄及更高產量。 適於配合原核宿主使用的啟動子包括ph〇 A啟動子、半 乳糖酶及乳糖啟動子系統、色胺酸（trp)啟動子系統及雜交 啟動子（諸如tac或trc啟動子）。然而，其他在細菌中起作用 的啟動子（諸如其他已知的細菌啟動子或嗟菌體啟動子）亦 適用。其核苷酸序列已公開，從而可使熟習工人能夠使用 連接子或銜接子將其與編碼輕輕鍵及重鍵的順反子操作性 接合（Siebenlist等人，（1980) Cell 20:269)以提供任何需要 的限制性位點。 118226.doc -67- 200804418 在本發明之一態樣中，重組載體内的各順反子包含引導 所表現之多肽遷移跨越膜的分泌信號序列成分。一般而 言，信號序列可為載體之成分，或可為插入載體中之靶多 肽DNA的一部分。選用於本發明之信號序列應為可藉由宿 主細胞識別及處理（亦即藉由信號肽酶裂解）的信號序列。 對於不識別及處理異源多肽之天然信號序列的原核宿主細 胞，信號序列可經選自例如由以下物組成之群的原核信號 序列取代：鹼性磷酸酶、青黴素酶、lpp或熱穩定腸毒素 II(STII)引子、LamB、PhoE、PelB、OmpA 及 MBP。在本 發明之一實施例中’用於表現系統之兩順反子的信號序列 為STII信號序列或其變體。 在另一態樣中，根據本發明，免疫球蛋白之產生可發生 於宿主細胞之細胞質中，因此各順反子内部不需要存在分 泌信號序列。從而’免疫球蛋白輕鏈及重鏈經表現、折疊 且組裝可在細胞質内形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌 株（例如大腸桿鹵trxB菌株）提供有利於二硫鍵形成的細胞 質條件，從而容許所表現之蛋白質次單位的適當折疊及組 裝。Proba及 Pluckthun 似，159:203 (1995) 〇 本發明之抗體亦可使用其中所表現之多肽成分之數量比 可调卽的表現糸統來產生’以使本發明之經分泌及適當組 裝之抗體的產量最大化。該調節可至少部分地藉由同時調 節多肽成分之轉譯強度來完成。 用於調節轉譯強度之一技藝揭示於Simmons等人，美國 專利第5,840,523號。其利用順反子内之轉譯起始區（TJR) 118226.doc -68 - 200804418 之變異體。對於既^ TIR，▼以_系列轉譯強度形成一系 列胺基酸或核酸序列變異體，從而提供針對特定鏈之所要 表現含里據以調節此因子的便利方式。TIR變異體可藉由 習知突㈣發技#產生，該等技藝產生可改變胺基酸序列 之密碼子修改。在某些實施例中，核苷酸序列修改為靜默 的。™修改可包括例如Shine_Dalgarn〇序狀編號或間隔 修改，以及信號序列修改。一產生突變體信號序列之方法 為在不修改信號序列之胺基酸序列的編碼序列起始處產生 ”密碼子庫”（亦即，修改靜默）。此可藉由修改各密碼子之 第三核苷酸位置來完成；此外有些胺基酸，諸如白胺酸、 絲胺s文及精胺酸具有多個可增加制庫複雜性的第一及第二 位置。此犬變誘發方法詳述於Yansura等人，（1992) METHODS: A Companion to Methods in EnzymoL 4:151-158 中。 在一實施例中’可以一系列針對其中之各順反子的TIR 強度產生一組載體。此有限組載體可提供各鏈之表現量對 比以及各種TIR強度組合下所要抗體產品的產量。tir強度 可藉由量化報導基因之表現量來測定，如simm〇ns等人之 美國專利第5,840,523中所詳述。基於轉譯強度對比，可選 擇所要的個別TIR以組合於本發明之表現載體建構中。 適於表現本發明之抗體的原核宿主細胞包括古細菌 (Archaebacteria)及真細菌（Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性 (Gram-negative)或革蘭氏陽性（Gram-positive)有機體。適 用細菌之實例包括埃希氏桿菌屬（Escherichia)(例如大腸桿 118226.doc -69- 200804418 菌）、桿菌屬（例如枯草芽孢桿菌（凡μ办川以））、腸道細菌、 假單胞菌屬種類（例如銅綠假單胞菌（户· aerwgMwa)、鼠傷 寒沙門氏桿菌（Salmonella typhimurium)、黏質沙雷菌 (Serratia marcescans)、克雷伯氏菌屬（Klebsiella)、變形桿 菌屬（Proteus)、志贺桿菌屬（Shigella)、根瘤菌屬（Rhizobia)、 透明顫菌（Vitreoscilla)或副球菌屬（Paracoccus)。在一實施 例中，使用革蘭氏陰性細胞。在一實施例在中，使用大腸 桿菌細胞作為用於之本發明之宿主。大腸桿菌株之實例包 括菌株 W3110(Bachmann，Cellular and Molecular Biology， 第 2 卷（Washington，D.C.: American Society for Microbiology， 1987)，第1190_1219頁；ATCC寄存第27,325號）及其衍生 物，包括具有基因型 W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΑοπιρΤΔ (nmpc-fepE) degP41 kanR之菌株 33D3(美國 專利第5,639,635號）。其他菌株及其衍生物（諸如大腸桿菌 294(ATCC 31，446)、大腸桿菌 B、大腸桿菌 λ 1776(ATCC 31，537)及大腸桿菌RV308(ATCC 31，608))亦為適用的。該 等實例為說明性的而非限制性的。具有限定基因型之上述 任一種細菌之衍生物的建構方法已知於該項技術中且描述 於例如，Bass等人，Proteins，8:309-314 (1990)中。考慮複 製子在細菌之細胞中的複製性，一般需要選擇適當的細 菌。舉例而言，當使用諸如pBR322、pBR325、pACYC177 或pKN410之熟知質體提供複製子時，可適當地使用大腸 桿菌、沙雷氏菌屬或沙門氏菌屬種類作為宿主。宿主細胞 通常應分泌最小量之蛋白水解酶，且可能需要將其他蛋白 118226.doc -70- 200804418 酶抑制劑併入細胞培養中。 抗體產生 宿主細胞可經上述表現载體轉化，且視需要培養於經改 質習知培養基中以便誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼 所要序列之基因。 轉化意謂將DNA引入原核宿主以使得DNA可作為染色體 外成分或染色體成分複製。視所用宿主細胞而定，轉化可 使用適用於該等細胞之標準技術進行。使用氯化約之約處 理一般係用於含有實質性細胞壁障壁的細菌細胞。另一種 轉化方法係㈣聚乙二_MS◦。又—種使用技藝為電穿 孑L 。 用於產生本發明之多肽的原核細胞係培養於該項技術已 知且適於培養所選擇之宿主細胞的培養基中。適當培養基 之實例包括蛋白脒培養基（LB)外加必需的營養補充物。在 有些實施例中’該培養基亦含有基於表現載體之結構所選 之選擇劑，以選擇性地容許含有表現載體之原核細胞的生 長。舉例而言，將安比西林添加至培養基以便表現安比西 林抗藥性基因之細胞的生長。 除碳、氮及無機磷酸鹽源外，亦可包括適當濃度之單獨 導入或作為與其他補充物或培養基（諸如複合物氮源）之混 合物導入的任何必要補充物。培養基視需要可含有一或多 種選自由麵胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、硫乙醇酸鹽、二硫 赤藻糖醇及二硫蘇糖醇組成之群的還原劑。 原核宿主細胞在適當溫度下培養。舉例而言，對於大腸 118226.doc -71 · 200804418 桿菌培養，培養係在如下溫度範圍内進行：包括但不限於 約2(TC至約39°C、約25°C至約37。(：及約3(TC。培養基ipH 值可為約5至約9範圍内的任一PH值，此主要視宿主有機體 而定。對於大腸桿菌，pH值可為約6.8至約7.4或約7·〇。 若本發明之表現載體中使用可誘導啟動子，則蛋白質表 現係在適於激活該啟動子的條件下誘導。在本發明之一態 樣中，PhoA啟動子係用於控制多肽轉錄。因此，所轉化之 宿主細胞可培養於磷酸鹽限制培養基中以便誘導。在一實 施例中，該磷酸鹽限制培養基為C.ReA.p培養基（參見，例 如，Simmons等人，J· /mmw⑽/· 心（2〇〇2)，263·133_ 147)。如該項技術甲已知，可根據所使用之載體結構使用 其他各種誘導物。 在一實施例中，本發明之所表現之多肽分泌進入宿主細 胞之周質内且自其回收。蛋白質回收通常包括分裂微生 物，一般藉由諸如滲透性衝擊、超音波處理或溶解之方式 分裂微生物。細胞一旦分裂，則可藉由離心作用或過濾移 除細胞碎片或整個細胞。蛋白質例如可藉由親和樹脂層析 法進一步純化。或者，可將蛋白質輸送入培養基内且於其 中分離。細胞可自培養液及培養上清液中移除，培養液及 培養上清液可經過濾且濃縮以便進一步純化所產生之蛋白 質。所表現之多肽可使用常見方法（諸如聚丙烯醯胺凝膠 電泳（PAGE)及西方墨點法檢定）進一步分離及鑑定。 在本發明之一態樣中，抗體產生係藉由醱酵方法大量進 行。可利用各種大型分批饋入醱酵程序產生重組蛋白。大 118226.doc -72- 200804418 型醱酵具有至少1000公升之容量，例如約1，000至100,000 公升容量。該等醱酵器使用攪拌器葉輪分配氧及營養物， 尤其葡萄糖（普通碳/能量來源）。小型醱酵一般係指體積容 量不超過約100公升且可在約1公升至約100公升範圍内之 醱酵器中的醱酵。 在一醱酵方法中，蛋白質表現之誘導通常在細胞在適宜 條件下培養至所要密度（例如，約180-220之OD55〇)之後開 始，在該階段，細胞處於早期靜止期。如該項技術中已知 及以上所述，可根據所用載體結構使用各種誘導物。細胞 可培養較短時期後再誘導。細胞一般誘導約12-50個小 時，儘管可使用更長或更短的誘導時間。 為改良本發明之多肽之產量及品質，可修改各種醱酵條 件。舉例而言，為改良所分泌之抗體多肽之適當組裝及折 疊，可使用過度表現伴隨蛋白（諸如Dsb蛋白（DsbA、 DsbB、DsbC、DsbD及/或DsbG)或FkpA(具有伴隨活性的 肽基脯胺醯基順反-異構酶）的其他載體共轉彳宿主原核細 胞。伴隨蛋白已經證明可促進細菌宿主細胞中所產生之異 源蛋白質的適當折疊及溶解性。Chen等人（1999)
Chem 274:19601 -19605 ; Georgiou 等人，美國專利第 6,083,715 號；Georgiou等人，美國專利第 6,027,888 號； Bothmann&Pluckthun(2000)t/.5/6>/.C/^m.275:17100_17105; Ramm及Pluckthun (2000) ·/·及W. C/zem· 275:17106-17113; Arie等 人(2001) Μο/. ΜίπΜ/ο/· 39:199-210 〇 為使所表現之異源蛋白質（尤其對蛋白質裂解敏感的彼 118226.doc -73- 200804418 等異源蛋白質)之蛋白質水解作用降至最小，本發明可使 用某些缺乏蛋白水解酶的宿主菌株。舉例而言，宿主細胞 菌株可經修飾以在編碼已知細菌蛋白酶（諸如蛋白酶η工、
OmpT DegP Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶ν、蛋 白酶VI及其組合）之基因中實現遺傳突變。有些大腸桿菌 蛋白酶無效菌株可獲得且描述於例如，Joly等人（1998)， 同上；Georgiou等人，美國專利第5,264,365號；Ge〇rgi〇u 等人’美國專利第5,5〇8192號；Hara等人，Micr〇bial
Drug Resistance，2:63-72 (1996)中 〇 在一實施例中，缺乏蛋白水解酶且經過度表現一或多種 伴隨蛋白之質體所轉化的大腸桿菌菌株在本發明之表現系 統中用作宿主細胞。 抗體純化 在一實施例中，本文中所產生之抗體蛋白質可進一步純 化以獲得適用於其他檢定及使用的大體同質製劑。可使用 該項技術中已知的標準蛋白質純化方法。以下程序可舉例 為適當的純化程序：免疫親和柱或離子交換柱上之分顧、 乙醇沉澱、逆相HPLC、二氧化矽層析或陽離子交換樹脂 (诸如DEAE)層析、色層焦集、SDS-PAGE、硫酸錢沉澱及 使用例如SephadexG_75之凝膠過濾、。 在一態樣中’使用固相上固著之蛋白質A免疫親和純化 本發明之抗體產物。蛋白質A為來自金黃色葡萄球菌 {Staphylococcus aureas)^] 41 kD細胞壁蛋白，其可以高親 和力結合抗體之Fc區。Lindmark等人，（1983) «/.〜廳如/. 118226.doc -74- 200804418 抓汍62:1-13。固著蛋白質a之固相可為包含玻璃或二氧 化矽表面之柱，或可控小孔玻璃柱或矽酸柱。在有些應用 中，將該柱塗上試劑，諸如甘油，以盡可能防止污染物之 非特定黏著。 作為純化之第一步驟，可將如上所述獲自細胞培養之繁 :塗施於蛋白質A固著之固相上以容許所研究之抗體較 合蛋白質A。接著絲固相以移除非特定結合固相的污 染物。所研究之抗體最後藉由溶離自固相中回收。 使用真核宿主細胞產生抗艘 载體成分一般包括但不限於以下物中之一或多者··信號 序列、複製起點、一或多個標記基因、增強子成分、二 子及轉錄終止序列。 Q)信號序列成分 用於真核宿主細胞中的載體亦可含有信號序列或在所研 究之成熟蛋白質或多肽之N末端具有特^分裂位點的直他 多肽。所選異源信號序列通常為可藉由宿主細胞識別及處 理（亦即，藉由信號肽酶裂解）的信號序列。在哺乳動物細 胞表現中，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌引子， 例如單純性疱疹gD信號。 該前導區之DNA係在閱讀框中與編碼抗體之Dna接合。 (ii) 複製起點 哺乳動物表現載體一般不需要複製成分之起點。舉例而 言，通常使用SV40起點僅係因為其含有早期啟動子。 (iii) 選擇基因成分 118226.doc -75- 200804418 表現載體及選殖載體可含有選擇基因，亦稱可選擇標 5己。典型的選擇基因編碼如下蛋白質：⑷賦予對於抗生素 戍其他毋素（例如’安比西枯^ 杯新锨素、甲胺蝶呤或四環 素）之抗藥性的蛋白質；（b)補充營養不足的蛋白質（若適 當）；或（C)提供複合培養基未提供之關鍵營養物。 選擇方案之-實例係利用藥物中斷宿主細胞之生長。可 以異源基因成功轉化的彼等細胞可產生賦予抗藥性的蛋白 質，且因此自選擇方案中倖存。該主導選擇之實例係使用 新黴素、黴酚酸及潮黴素藥物。 適用於哺乳動物細胞之可選擇標記的另一實例為能夠鑑 別旎容納抗體核酸之細胞的彼等物，諸如DHFR、胸苷激 酶、金屬硫蛋白-I及-π(例如，靈長類動物金屬硫蛋白基 因）、腺苷脫胺酶、鳥胺酸脫羧酶等。 舉例而言，經DHFR選擇基因轉化的細胞可首先藉由在 含有甲胺蝶呤（Mtx)、DHFR之競爭性拮抗劑的培養基中培 養所有轉化體來鑑別。適當的宿主細胞（當使用野生型 DHFR時）例如包括缺乏dHfr活性的中國倉鼠卵巢（CHO)細 胞株（例如，ATCCCRL-9096)。 或者’可藉由在含有針對可選擇標記之選擇劑（諸如胺 基糖苷抗生素，例如卡那黴素、新黴素或G418)的培養基 中培養細胞來選擇經編碼抗體、野生型DHFR蛋白及另一 種可選擇標記（諸如胺基糠苷3，_磷酸轉移酶（ΑΡΗ))之DNA 序列所轉化或共轉化的宿主細胞（尤其含有内源性DHFR的 野生型宿主）。參見美國專利第4,965，199號。 118226.doc -76- 200804418 (iy)啟動子成分 表現載體及選殖载體一般含有可由宿主有機體識別且與 編碼所研究之多肽（例如抗體）的核酸操作性連接的啟動 T。真核細胞的啟動子序列已知。實際上所有的真核基因 皆具有位於轉錄啟動位置之上游約25至3〇鹼基處的at_富 集區。發現於多種基因之轉錄起始處上游70至80個鹼基處 的另-序列為CNCAAT區，其中Ν可為任何核㈣。大部 分真核基因的3’端處為ΑΑΤΑΑΑ序列，該序列可為編碼序 列之3,端增加poly a尾的信號。該等所有序列均可適當地 插入真核表現載體中。 在哺乳動物宿主細胞中自載體轉錄抗體多肽例如可藉由 如下啟動子控制：獲自病毒（諸如多形瘤病毒、傳染性上 皮瘤病毒、腺病毒（諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、鳥肉 瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、肝炎_B病毒及猿猴病 毒40(SV40))之基因組的啟動子、異源哺乳動物啟動子（例 如，肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子）或熱休克啟動 子，條件是該等啟動子與宿主細胞系統相容。 SV40病毒之早期及晚期啟動子可方便地作為亦含有 SV40病毒之複製起點的SV40限制性片斷獲得。人類細胞 巨大病毒之直接早期啟動子可方便地作為HindIII E限制性 片斷獲得。使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體表現哺乳動物宿 主中之DNA的系統揭示於美國專利第4,419,446號中。該系 統之修飾描述於美國專利第4,601，978號中。關於小氣細胞 中之人類-β干擾素cDNA在獲自單純疱疹病毒之胸苷激酶 118226.doc -77- 200804418 啟動子控制下之表現，亦參見Reyes等人，Nature 297:598-601 (1982)。或者，可使用勞斯肉瘤病毒（R〇us Sare〇ma Virus)長末端重複作為啟動子。 00增強子要素成分 由向級真核細胞轉錄編碼本發明之抗體多肽的Dna通常 藉由將増強子序列插入載體内來增強。現已知很多種源自 哺乳動物基因（球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、心胎蛋白 及胰島素）的增強子序列。然而，通常可使用源自真核細 胞病毒的增強子。實例包括複製起點（bp 1〇〇_27〇)後側的 SV40增強子、細胞巨大病毒早期啟動子增強子、複製起點 後側的多形瘤增強子及腺病毒增強子。關於激活真核啟動 子的增強要素，亦參見Yaniv，Nature 297:17_18(1982)。增 強子可在抗體多肽編碼序列之位置5,或3,處接入載體内， 但通常定位於啟動子之5,位點處。 (W)轉錄終止成分 用於真核宿主細胞中的表現載體通常亦含有為終止轉錄 及為穩定mRNA所需要的序列。該等序列一般獲自真核或 病毒DNA或cDNA之5’及偶然3,未轉譯區。該等區在編碼抗 體之mRNA之未轉譯部分中含有作為多聚腺嘌呤化片段轉 錄的核苷酸片段。一種適用的轉錄終止成分為牛生長激素 多聚腺嘌呤區。參見WO 94/11026及其中所揭示之表現載 體。 (vii)選擇及轉化宿主細胞 適於選殖或表現本文中之载體中之DNA的宿主細胞包括 118226.doc -78- 200804418 本文中所述之高級真核細胞，包括脊椎動物宿主細胞。在 培養液（組織培養液）中繁殖脊椎動物細胞已成為常規程 序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為：藉由8乂40((：〇8-7，ATCC CRL 165 1)所轉化的猴腎CV1細胞株；人類胚腎細 胞株（經次選殖用於懸浮培養液中生長的293或293細胞， Graham等人，J· Gen Virol· 36:59 (1977));幼倉鼠腎細胞 (BHK，ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO, Urlaub等人，Proc. Natl. Acad· Sci· USA 77:4216 (1980)); 小鼠支持細胞（TM4，Mather，Biol· Reprod· 23:243-251 (1980));猴腎細胞（CV1，ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞 (VERO-76，ATCC CRL-1587);人類宮頸癌細胞（HELA， ATCC CCL 2);犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34);水牛大 鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442);人類肺細胞（W138, ATCC CCL 75);人類肝細胞（Hep G2，HB 8065);小鼠乳 腺腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51); TRI 細胞（Mather 等 人，Annals Ν·Υ· Acad. Sci· 383:44-68 (1982)) ; MRC 5細 胞；FS4細胞；及人類肝瘤細胞株（Hep G2)。 宿主細胞經上述用於抗體產生之表現載體或選殖載體轉 化，且培養於視需要經改質之習知營養物培養基中以便誘 導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所要序列之基因。 (viii)培養宿主細胞 用於產生本發明之抗體的宿主細胞可培養於各種培養基 中。市購培養基，諸如Ham氏FlO(Sigma)、最低必需培養 基（MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及 Dulbecco氏修飾之 118226.doc -79- 200804418
Eagle氏培養基（DMEM)(Sigma)，適用於培養宿主細胞。此 外，以下文獻中所述之任一種培養基可用作宿主細胞之培 養基·· Ham等人，五仏 58:44 (1979); Barnes等人， Αα/· ㈣.102:255 (1980);美國專利第 4,767,7〇4 號、 第 4,657,866 號、第 4,927,762 號、第 4,56〇,655 號或第 5，122,469號；WO 90/03430 ; WO 87/00195 ·，或美國專利 參考案3〇,985。該等任一種培養基可視需要補充激素及/或 其他生長因子（諸如胰島素 '運鐵蛋白或表皮生長因子）、 鹽（諸如氯化鈉、氯化鈣、氣化鎂及磷酸鹽）、緩衝劑（諸如 HEPES)、核苷（諸如腺皆及胸苷）、抗生素（諸如 GENTAMYCIN™藥）、痕量元素（定義為一般以微莫耳範圍 内之最終濃度存在的無機化合物）及葡萄糖或相當能量來 源。亦可包括熟習該項技術者已知之適當濃度的其他任何 必要補充物。培養條件（諸如溫度、ρΗ值及類似條件）為前 述配合選用於表現之宿主細胞使用的彼等培養條件且對普 通熟習者顯而易見。 (k)抗體純化 當使用重組技藝時，抗體可在細胞内產生，或直接分泌 進入培養基。若抗體係在細胞内產生，則作為第一步驟， 一般將微粒碎片（宿主細胞或溶解片段）例如藉由離心作用 或超濾作用移除。若抗體分泌進入培養基，則一般首先使 用市講蛋白質濃縮過濾器（例如Amicon或Millipore Pellieon 超遽裝置）濃縮獲自該等表現系統的上清液。以上任一步 驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白質水 118226.doc 200804418 解，且可包括抗生素以防止偶生污染物之滋長。 由細胞所製備的抗體組合物可使用例如羥基磷灰石層 析、凝膠電泳、滲析及親和層析加以純化，親和層析法一 般為可接受之純化技藝。親和試劑（諸如蛋白質A)作為親 和配位體的適用性視存在於抗體中之任何免疫球蛋白^域 的種類及同種型而定。蛋白質A可用於純化基於人類〇、 γ2或γ4重鏈的抗體（Lindmark等人，/如則⑽/输汍 62 ·1 13 (1983))。蛋白質g推薦用於所有小鼠同種型及人 類 y3(Guss等人，EMBO J· 5:15671575 (1986))。親和配位 體附著之基質最通常為瓊脂糖，但可利用其他基質。機械 性穩定的基質，諸如控制小孔玻璃或聚（苯乙烯二乙烯基） 笨’與瓊脂糖相比可獲得更快的流動速率及更短的處理時 間 右抗體包含Ch3域’則Bakerbond ABXTM樹脂（J· τ· Baker，Phillipsburg，NJ)適用於純化。視待回收之抗體而 定，亦可使用其他蛋白質純化技藝，諸如離子交換柱上之 分餾、乙醇沉澱、逆相HPLC、二氧化石夕上之層析、肝素 SEPHAROSEtm上之層析、陰離子或陽離子交換樹脂（諸如 聚天冬胺酸柱）上之層析、色層焦集、SDS-PAGE及硫酸銨 沉澱。 任何初步純化步驟之後，若需要，則使用pH值在2.5-4.5 之間之溶離緩衝劑，使包含所研究之抗體及污染物的混合 物經受其他純化步驟（例如，低pH值疏水性相互作用層析 法）’ 一般在低鹽濃度下（例如，約0-0·25 Μ鹽）執行。 應瞭解，一般而言，製備供研究、測試及臨床用途中使 118226.doc -81 - 200804418 用之抗體的技藝及η、符合上述及/或熟習該項技術者 認為對所研究之特定抗體適當的技藝及方法已良好確i、 該項技術中。 ' 活性檢定 本發明之抗體之物理/化學性質及生物功能可藉由該項 技術中已知之各種檢定來鑑定。 、 純化抗體可藉由一系列檢定進一步鑑定，該等檢定包括 但不限於N-末端定序、胺基酸分析、非變性尺寸排除高壓 液相層析法（HPLC)、質譜分析法、離子交換層析法及木瓜 酶消化法。 需要時，可分析抗體的生物活性。在有些實施例中，測 XX式本發明之抗體的抗原結合活性。該項技術中已知且本文 中可使用的抗原結合檢定包括（不限於）任何直接或競爭性 結合檢定，該等檢定使用諸如以下技術：西方墨點法、放 射免疫檢定、ELISA(酶聯免疫吸附檢定）、，，夾心，，免疫檢 疋、免疫沉澱檢定、螢光免疫檢定及蛋白質A免疫檢定。 在一實施例中，本發明涵蓋一種具有部分而非全部效應 功旎的修改抗體’該等功能使其成為諸多應用的理想候選 者’其中抗體在活體内之半衰期係重要的，然而某些效應 功能（諸如互補性及ADCC)為不必要的或有害的。在某些 實施例中，可量測抗體之以活性以確保僅維持所要特性。 可進行活體外及/或活體内細胞毒性檢定以確認CDC及/或 ADCC活性之降低/減少。舉例而言，可進行以受體（FCR) 結合檢定，以確保抗體缺乏FcyRj#合能力（從而可能缺乏 118226.doc -82 - 200804418 ADCC活性），但保留FcRn結合能力。介導ADCC之初級細 胞、NK細胞僅表現FcyRIII，而單核細胞表現FcyRI、 FcyRII及FcyRIII。FcR在造血細胞上之表現總結於Ravetch 及 Kinet，Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)之第 464 頁上 的表3中。活體外檢定評價所研究之分子之ADCC活性的實 例描述於美國專利第5,500,362號或第5,821，337號中。適用 於該等檢定的效應細胞包括周圍血液單核細胞（PBMC)及 天然殺手（NK)細胞。或者，或此外，所研究之分子之 ADCC活性例如可在動物模型（諸如Clynes等人尸见〇/5為) 95:652-656 (1998)中所揭示之彼動物模型）中活體内評定。 亦可進行Clq結合檢定以確認抗體無法結合Clq且從而缺 乏CDC活性。為評價補體激活，可執行CDC檢定，例如 Gazzano-Santoro 等人，《/· Immunol· Methods 202:163 (1996)中所述之檢定。FcRn結合及活體内廓清/半衰期測定 亦可使用該項技術中已知的方法執行。 抗體片段 本發明包括抗體片段。在某些情況中，存在使用抗體片 段而非完整抗體的優點。更小尺寸之片段可快速廓清，且 可使實心腫瘤之診斷得以改良。 已開發各種用於產生抗體片段的各種技藝。傳統上，該 等片段可經由完整抗體之蛋白水解消化獲得（參見，例如 Morimoto 等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992);及 Brennan 等人，Science， 229:81 (1985))。然而，該等片段現可直接藉由重組宿主細 118226.doc -83 - 200804418 胞產生。Fab、Fv及ScFv抗體片段皆可表現於大腸桿菌中 且由大腸桿菌分泌’從而可易產生大量該等片段。抗體片 段可自上述抗體噬菌體文庫中分離。或者，Fab，-SH片段 可自大腸桿菌中直接回收且在經化學偶合以形成F(ab，)2片 段（Carter等人，Bio/Technology 10:163-167 (1992))。根據 另一方法，F(ab’）2片段可直接自重組宿主細胞培養中分 離。包含補救受體結合抗原決定基殘基、具有活體内長半 衰期的Fab及F(ab*)2片段描述於美國專利第5,869,〇46號 中。其他產生抗體片段的技藝對於熟習者而言顯而易見。 在其他實施例中，所選抗體為單鏈Fv片段（SCFV)。參見WO 93/16185 ;美國專利第5,571，894號及第5,587,458號。Fv及 sFv為具有完整結合位點、無恆定區的唯一種類，因此， 其適於活體内使用期間之弱非特定結合。sFv融合蛋白可 建構成使效應蛋白在sFv之胺基末端或羧基末端融合。參 見 Antibody Engineering，Borrebaeck編，同上。抗體片段 例如亦可為"線性抗體，，，如美國專利第5,641，87〇中所述。 5亥專線性抗體片段可為單特異性的或雙特異性的。 人源化抗艘 本發明包括人源化抗體。用於人源化非人類抗體的各種 方法已知於該項技術中。舉例而言，人源化抗體可具有一 或多個引入其内部、來自非人類來源的胺基酸殘基。該等 非人類胺基酸殘基常稱為”輸入”殘基，其通常獲自”輸入” 可變域。人源化主要可按照Winter及其同事之方法（J〇nes 等人（1986) 321:522-525; Riechmann 等人（1988) 118226.doc -84 - 200804418
Nature 332:323-327; Verhoeyen 等人（1988) 239:1534-1536)、藉由用高變區序列取代人類抗體之相應 序列來進行。因此，該等”人源化”抗體為嵌合抗體（美國專 利第4,816,567號），其中大體上近似完整之人類可變域已 經源自非人類種類的相應序列取代。實際上，人源化抗體 通常為其中有些高變區殘基及可能有些FR殘基經源自鼠類 抗體中之類似位點處之殘基取代的人類抗體。 用於產生人源化抗體之人類可變域（輕鏈與重鏈）之選擇 對於減少抗原性極其重要。根據所謂的”最佳擬合”方法， 鼠類抗體之可變域之序列可對照已知人類可變域序列之完 整文庫篩選。接著將與鼠類序列最近之人類序列當作人源 化抗體之人類框架（Sims等人（1993) /m卿如/· 151:2296;
Chothia 等人（1987) 乂 Mo/· J5M/· 196:901)。另一方法係使 用源自輕鏈或重鏈之特定亞群之所有人類抗體之一致序列 的特定框架。相同的框架可用於數種不同的人源化抗體 (Carter 等人（1992) Proc. iVa"· scz·· t/M, 89:4285; Presta等人（1993) /mmwwo/·，151:2623)。 通常更需要使抗體在保持對抗原之高親和力及其他良好 的生物特性下人源化。為達成此目標，根據一種方法，人 源化抗體可使用親本序列及人源化序列之三維模型、藉由 親本序列及各種概念化人源化產物的分析方法來產生。三 維免疫球蛋白模型一般可利用且為熟習該項技術者所熟 悉。可利用說明及呈現所選候選免疫球蛋白序列之大致三 維構型結構的電腦程式。對該等呈現之檢驗可分析殘基在 118226.doc -85- 200804418 候選免疫球蛋白序列之功能運作中的可能作用，亦即分析 影響候選免疫球蛋白與其抗原之結合能力的殘基。FR殘基 可以此方法自受體及輸入序列中選擇且組合，以便獲得所 要的抗體特性，諸如對靶抗原之強親和力。一般而言，高 變區殘基直接且最顯著地參與影響抗原結合。 人類抗艘 本發明之人類抗-RELT抗體可藉由將選自人類源噬菌體 呈現文庫之Fv純系可變域序列與如上所述之已知人類恆定 域序列組合來建構。或者，本發明之人類單株抗-RELT抗 體可藉由融合瘤方法產生。用於產生人類單株抗體之人類 骨髓瘤細胞株及小鼠-人類雜合骨髓瘤細胞株例如已描述 於 Kozbor J· 133: 3001(1984); Brodeur 等人，
Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications » 第 51_63 頁（Marcel Dekker，Inc·，New York，1987);及 Boerner 等人，J. 147:86 (1991)中0 現可產生轉殖基因動物（例如小鼠），其經免疫能夠在無 内源性免疫球蛋白產生下產生人類抗體之完整文庫。舉例 而言，其描述了嵌合及生殖系突變體小鼠中抗體重鏈接合 區（JH)基因之同型結合缺失導致内源性抗體產生之完全抑 制。人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移於該等生殖系突 變體小鼠中會導致人類抗體在抗原攻擊下產生。參見，例 如，Jakobovits等人，/Voc· TVa". 90: 2551 (1993);
Jakobovits等人，TVaiwre，362: 255 (1993); Bruggermann 等 人，Tear ζ·π /mmwwo/·，7: 33 (1993) 〇 118226.doc -86 - 200804418 基因改組亦可係用於由非人類（例如鼠類）抗體導出人類 抗體’其中人類抗體具有與初始非人類抗體類似的親和性 及特異性。根據此方法（其亦稱”抗原決定基印記法"），藉 由如上所述之％囷體呈現技術所獲得之非人類抗體片段之 重鏈或輕鏈可變區可以人類v域基因之文庫置換，形成非 人類鏈/人類鏈scFv或Fab嵌合體之群。經抗原選擇可使非 人類鏈/人類鏈嵌合scFv或Fab分離，其中在初級噬菌體呈 現純系中之相應非人類鏈移除後，人類鏈修復所破壞的抗 原結合位點，亦即抗原決定基決定（印記）人類鏈夥伴之選 擇。當重複該方法以便置換剩餘非人類鏈時，可獲得人類 抗體（參見1993年4月1日公佈的PCT WO 93/06213)。與傳 統之藉由CDR移植使非人類抗體人源化不同，該技術可提 供不具非人類來源之FR或CDR殘基的完全人類抗體。 雙特異性抗艘 雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原具有結合特異性的 單株抗體。在某些實施例中，雙特異性抗體為人類或人源 化抗體。在某些實施例中，結合特異性之一係針對RELT 而另一個係針對其他任何抗原。雙特異性抗體可製備為全 長抗體或抗體片段（例如，F(ab’)2雙特異性抗體）。 雙特異性抗體製備方法已知於該項技術中。傳統上，重 組製備雙特異性抗體係基於兩對免疫球蛋白重鏈_輕鏈對 之共表現’其中該兩個重鏈具有不同特異性（Milstein& Cuello，Λ^ζ/re，305:537 (1983))。由於免疫球蛋白重鏈及 輕鏈係隨機分配，因此該等融合瘤（四源融合瘤）可產生i 〇 118226.doc -87- 200804418 種不同抗體分子的可能混合物’其中僅一種具有恰當的雙 特異性結構。純化恰當分子(其一般藉由親和層：：驟進 行）相當麻煩，且產物產量低。類似程序揭示於1993年5月 13日公開的WO 93/08829中及Traunecker等人，五乂， 10: 3655 (1991)中。 ’ 根據不同實施例，具有所要結合特異性(抗體-抗原結合 位點）的抗體可變域係與免疫球蛋白恆定域序列融合。此 融合例如係對於免疫球蛋白重鏈恒定域，包含鉸鏈、 及CH3區之至少部分在某些實施例中，含有為輕鍵結合 所需之位點的第-重鏈怪定區（CH1)存在於該等融合體中 之至少-者中。編碼免疫球蛋白重鏈融合體及(若需幻免 疫球蛋白輕鏈的DNA可插人單獨表現載體中且共轉毕入適 當宿主有機體内。此舉在實施中為調節三種多肽片段之相 互比例提供很大諸性’㈣用於建構之三種多肽鍵之不 等比率可提供最佳產量。“，t至少兩㈣㈣之多狀 鏈之表現導致高產量時或當該等比率不具有料意義時， 可在-表現載體中插人兩種或所有三種多肽鏈之編碼序 在5亥方法之—實施例中，雙特異性抗體由在-臂中且有 第一結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈盥 、 供第一結合特異性）之雜交 /、 #中（提 兒反球蛋白重鏈-輕鏈對組成。 由於免疫球蛋白輕鏈僅以雙特異性分子之一 分離提供便捷方法，因此該不對稱結構有利於自非 免疫球蛋白鏈組合中分離所要雙特異性化合物。此方 118226.doc -88 - 200804418 法揭示於WO 94/04690中。欲知雙特異性抗體製備詳情， 多見例如，Suresh4 人，五；gj;, 121:210 (1986) 〇 根據另一方法，一對抗體分子之間的界面可設計成使自 重組細胞培養中所回收之雜二聚物的百分比最大化。該界 面抗體怪定域之CH3域之至少一部分。來自第一抗體分子 介面之一或多個小的胺基酸側鏈可以此方法置換為更大侧 鍵（例如酷胺酸或色胺酸）。尺寸與大側鏈相同或類似之互 補腔”藉由將大胺基酸側鏈置換為更小胺基酸側鏈（例如丙 胺酸或經丁胺酸）而形成於第二抗體分子界面上。此舉提 供了增大雜二聚物而非其他非所需終產物（諸如同源二聚 物）之產量的機制。 雙特異性抗體包括交聯抗體或"雜共軛”抗體。舉例而 言’雜共軛中之一抗體可與抗生物素蛋白偶合，另一抗體 與生物素偶合。該等抗體據稱例如可使免疫系統細胞靶向 不需要細胞（美國專利第4,676,980號）且可用於治療HIV感 染（WO 91/00360、WO 92/00373及 EP 03089)。雜共輛抗體 可使用任何便利的交聯方法獲得。適當的交聯劑以及諸多 父聯技藝已熟知於該項技術中，且揭示於美國專利第 4,676,980 號。 由抗體片段產生雙特異性抗體的技藝亦描述於文獻中。 舉例而言，雙特異性抗體可使用化學鍵聯製備。Brennan 等人，Science，229: 81 (1985)描述一種其中完整抗體經蛋 白質裂解可產生F(ab，）2片段的程序。該等片段在雙硫醇錯 118226.doc -89- 200804418 合劑亞石申酸納存在中被還原以穩定鄰近的雙硫醇且防止分 子間二硫鍵形成。接著使所產生之Fab，片段轉化為硫硝基 苯甲酸鹽（TNB)衍生物。接著使Fab，_TNB衍生物其中一者 藉由疏基乙胺還原再轉化為Fab’-硫醇，且與等莫耳量之另 一 Fab^TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產生之雙 特異性抗體可用作選擇性固著酶的藥劑。 最新進展促成Fab’-SH片段自大腸桿菌中直接回收， Fab’-SH片段可經化學偶合而形成雙特異性抗體。ShaUby 等人，J· Exp· Med·，175: 217-225 (1992)描述了完全人源 化雙特異性抗體F(ab )2分子之製備。各Fajy片段自大腸桿 菌中單獨分泌且經受活體外導向化學偶合以形成雙特異性 抗體。由此所形成之雙特異性抗體能夠結合過度表現 HER2受體之細胞及正常人τ細胞，而且引發人類細胞毒性 淋巴細胞對人類乳房腫瘤乾物產生分解活性。 由重組細胞培養直接製備及分離雙特異性抗體片段的各 種技藝亦有描述。舉例而言，雙特異性抗體可使用白胺酸 拉鍵製備。Kostelny專人，j. ⑽厂，Mg (5):1547-1553 (1992)。源自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽藉由基因融合 與兩種不同抗體之Fab’部分連接。抗體同源二聚物在絞鏈 區被還原以形成單體且接著再氧化以形成抗體雜二聚物。 該方法亦可用於製備抗體同源二聚物。H〇出nger等人， iVw· iVai/· 心/· t/以，90:6444-6448 (1993)所述之’’雙 功能抗體π技術為製備雙特異性抗體片段提供了替代機 制。該等片段包含重鏈可變域（VH)，該重鏈可變域（VH)藉 118226.doc -90- 200804418 由太短而無法使同一鏈上之兩個域之間配對的連接子與輕 鏈可變域（VL)連接。因此，一片段之VH域及vl域被迫與 另一片段之互補性VL域及VH域配對，從而形成兩個抗原 結合位點。利用單鏈Fv(sFv)二聚物製備雙特異性抗體片段 的另一種策略亦有報導。參見Gruber等人，j. ImmunQl， 152:5368 (1994)。 具有兩價以上的抗體亦考慮在内。舉例而言，可製備三 特異性抗體。Tutt 等人，J. Immunol. 147:60 (1991)。 多價抗艘 夕4貝抗體可由表現該抗體所結合抗原的細胞以較二價抗 體更快之速度内化（及/或分解代謝）。本發明之抗體可為具 有二個或以上抗原結合位點的多價抗體（其係非IgM類）（例 如，四價抗體），其可藉由重組表現編碼該抗體之多肽鏈 的核酸而輕易製備。多價抗體可包含二聚域及三個或以上 的抗原結合位點。該二聚域包含，例如，Fc區或鉸鏈區 (或係由其組成）。在此狀況中，該抗體將包含以區及位於 該Fc區胺基末端之三個或以上之抗原結合位點。在一實施 例中，多價抗體包含，例如，三個至約八個或四個抗原結 合位點（或係由其組成）。多價抗體包含至少一個多肽鏈（例 如’兩個多肽鏈），其中該（等）多肽鏈包含兩個或以上的可 變域。舉例而言，該（等）多肽鏈可包含VD1_(xl)n_VD2_ (X2)n-Fc，其中VD1為第一可變域，VD2為第二可變域， 卜為卜區之一多肽鏈，χ1及X2表示胺基酸或多肽，且n為 〇或1。舉例而吕，該（等）多肽鏈可包含：柔性連 118226.doc •91 - 200804418 接子 _VH-CH1-Fc 區鏈；或 VH-CH1_VH-CH1-Fc 區鏈。本文 中之多價抗體可另外包含至少兩個（而較佳四個）輕鏈可變 域多肽。本文中之多價抗體例如可包含約兩個至約八個輕 鏈可變域多肽。此處所述之輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變 域，且視需要另外包含CL域。 抗體變異髏 在有些實施例中，可考慮本文中所述之抗體之胺基酸序 列修飾。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/ 或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當 的核苷酸修改導入抗體核酸或藉由肽合成來製備。該等修 飾例如包括抗體之胺基酸序列内之殘基的缺失及/或插入 及/或取代。可形成缺失、插入與取代之任一組合以獲得 最終建構物，條件是該最終建構物具有所要特性。胺基酸 之修改可在序列形成時導入該抗體之胺基酸序列内。 其中一種適用於鑑別抗體之某些殘基或區域為突變發生 之較佳位置的方法稱作"丙胺酸掃描誘變"，如Cunningham 及 Wells (1989) 244··1081_1085 所述。此處，殘基 或靶殘基組經鑑別（例如，荷電殘基，諸如arg、asp、 his、lyS及glu)且置換為中性或荷負電胺基酸（例如，丙胺 酸或聚丙胺酸）以影響該等胺基酸與抗原之相互作用。接 著藉由在取代之位點處或適於取代之位點處導入更多或其 他變異體，以進一步經修顯示對於該等取代具有功能敏感 性的彼等胺基酸位置。因此，儘管導入胺基酸序列變異的 位點係經預先確定，但突變本身的性質並不須經預先確 118226.doc -92- 200804418 定。舉例而言，為分析指定位點處突變之行為，可在靶密 碼子或靶區進行ala掃描或隨機誘變，且篩選具有所要活性 之經表現免疫球蛋白。 胺基酸序列插入片段包括長度範圍為一個殘基至含有一 百個或以上之殘基之多肽的胺基及/或羧基末端融合體， 以及單或多胺基酸殘基的序列間插入片段。末端插入片段 之實例包括具有N-末端甲硫胺醯基殘基的抗體或與細胞毒 性多肽融合的抗體。抗體分子之其他插入型變異體包括可 增加抗體之血清半衰期之酶（例如，ADEPT)或多肽與抗體 之N -末端或C -末端之融合。 另一類型變異體為胺基酸取代變異體。該等變異體在抗 體分子中具有至少一個可由不同殘基置換的胺基酸殘基。 用於取代性突變誘發之最關注位點包括高變區，但亦包括 FR修改。表A中以”較佳取代”為題展示了保守性取代。若 該等取代導致生物活性變化，則可導入更多實質性修改 (如表1定名為”例示性取代’’，或下文參考胺基酸類進一步 所述），且篩選產物。
表A 原始殘基 例示性取代 較佳取代 Ala (A) Val; Leu; lie Val Arg(R) Lys; Gin; Asn Lys Asn (N) Gin; His; Asp，Lys; Arg Gin Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gin (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gin Asp Gly (G) Ala Ala 118226.doc -93- 200804418 原始殘基 例示性取代 較佳取代 His (Η) Asn; Gin; Lys; Arg Arg lie (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 正白胺酸 Leu Leu (L) 正白胺酸;lie; Val; Met; Ala; Phe lie Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; lie Leu Phe(F) Trp; Leu; Val; lie; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Val; Ser Ser Trp(W) Tyr; Phe Tyr Tyr⑺ Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) lie; Leu; Met; Phe; Ala; 正白胺酸 Leu 抗體生物特性之實質性修改可藉由選擇對維持（a)取代區 域内多肽主鏈之結構，例如，為片狀或螺旋狀構型；（b)分 子在靶點處之電荷性或疏水性或（c)側鏈之松密度之作用顯 著不同的取代來實現。胺基酸可根據其侧鏈特性之相似性 分類（於 A. L. Lehninger，於 Biochemistry，第 2版，第 73-75 頁，Worth Publishers，New York (1975)): (1) 非極性：Ala (A)，Val (V)，Leu (L)，lie (I)，Pro (P)，Phe (F)， Trp (W)5 Met (M) (2) 不荷電極性：Gly (G)，Ser (S)，Thr (T)，Cys (C)，Tyr (Y)，Asn (N)，Gin (Q) (3) 酸性：Asp (D)，Glu (E) (4) 鹼性：Lys (K)，Arg (R)，His (H) 或者，天然存在殘基可基於共同的側鏈特性分類： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、lie; 118226.doc -94· 200804418 (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln; (3) 酸性：Asp、Glu; (4) 驗性：His、Lys、Arg; (5) 影響鍵取向的殘基：Gly、pro; (6) 方族· Trp、Tyr、phe。 非保守性取代需要將該等類中一類之成員置換為另一 類。該等經取代之殘基亦可導入保守性取代位點或導入剩 餘（非保守）位點中。 一類型之取代變異體包含取代親本抗體（例如，人源化 抗體或人類抗體）中之一或多個高變區殘基。通常，所得 選用於進一步開發之變異體相對於產生其之親本抗體具有 經改良的生物特性。產生該等取代變異體的便捷方法包括 使用嗤菌體呈現之親和力成熟。簡而言之，若干高變區位 點（例如，6-7個位點）經突變可在各位點產生所有可能的胺 基酸取代。由此所產生之抗體可作為封裝於各顆粒内部之 噬菌體外被蛋白（例如M13之基因in產物）之融合體自絲狀 噬菌體顆粒中呈現。接著如本文中所揭示，按照其生物活 性（例如結合親和力）篩選噬菌體呈現變異體。為鑑別用於 修飾之候選高變區位點，可執行掃描誘變（例如，丙胺酸 掃描）以鑑別對抗原結合作用顯著的高變區殘基。或者， 或此外，可有利地分析抗原·抗體複合物之晶體結構以鑑 別抗體與抗原之間的接觸點。根據該項技術中已知之技藝 (包括本文中詳述之彼等技藝），該等接觸殘基及鄰近殘基 可候選用於取代。一旦產生該等變異冑，則使用該項技術 118226.doc -95- 200804418 中已知之技藝（包括本文中所述之彼等技藝）使一組變異體 經受篩選，且在一或多個相關檢定中可選擇具有優良特性 的抗體用於進一步開發。 編碼抗體之胺基酸序列變異體的核酸分子可藉由該項技 術中已知的各種方法製備。該等方法包括但不限於··自天 然源中分離（在天然存在之胺基酸序列變異體之狀況中）或 藉由抗體之早先製備變異體型或非變異體型之寡核普酸介 導（或定點）誘變、PCR誘變及暗匣誘變來製備。 可能需要將一或多個胺基酸修飾導入本發明之免疫球蛋 白多肽之Fc區，從而產生Fc區變體。Fc區變異體可包含包 括一或多個胺基酸位置處之胺基酸修飾（例如，取代）的人 類Fc區序列（例如，人類][gG]l、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區）， 該等胺基酸位置包括鉸鏈半胱胺酸之位置。 根據此描述及該項技術之教示，可推想在有些實施例 中’本發明之抗體與野生型相應抗體相比可包含例如Fc區 中之一或多處修改。但該等抗體與野生型相應抗體相比大 體上仍保持治療應用所需要之相同特性。舉例而言，吾人 認為’某些修改可在產生經更改（亦即，經改良或經減弱） 之Clq結合性及/或互補依賴細胞毒性（Cdc)的Fc區中作 出，例如，如WO 99/51642中所述。關於Fc區變異體之其 他實例，亦參見Duncan & Winter Wiwre 322:738-40 (1988); 美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。 在一態樣中，本發明提供的抗體包含Fc多肽（包含Fc區） 118226.doc -96- 200804418 之界面中之修飾，其中該等修飾促進及/或促成雜二聚 化。該等修飾包含將突起導入第一Fc多肽以及將空腔導入 第二Fc多肽，其中該突起可定位於該空腔中以便促進第一 Fc多肽與第二Fc多肽之複合。產生具有該等修飾之抗體的 方法已知於該項技術中，例如，如美國專利第5,731，168號 所述。 免疫結合物 在另一態樣中，本發明提供免疫結合物或抗體-藥物結 合物（ADC)，包含抗體與細胞毒性劑（諸如化學治療劑、藥 物、生長抑制劑、毒素（例如細菌、真菌、植物或動物來 源之酶促活性毒素，或其片段））之結合或與放射性同位素 之結合（亦即，放射性結合物）。 利用抗體-藥物結合物局部傳遞細胞毒性劑或細胞抑制 劑，亦即，在癌症治療中殺死或抑制腫瘤細胞的藥物 (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614 ; Niculescu-Duvaz 及 Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172;美國專利第4,975,278號）可使藥物部分 靶向傳遞至腫瘤且於其中累積於細胞内，其中全身性投與 該等未結合藥劑可能導致正常細胞以及設法去除之腫瘤細 胞之無法接受之毒性水準（Baldwin等人，（1986) Lancet (1986 年 3 月 15 曰）第 603-05 頁；Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review，" in Monoclonal Antibodies f84: Biological And Clinical Applications，A· Pinchera 等人（編），第 475-506頁）。因此應 118226.doc -97- 200804418 設法使毒性最小而功效最大。經報導，多株抗體與單株抗 體均適用於該等策略（Rowland等人，（1986) Cancer Immunol. Immunother·，21:183-87)。該等方法中使用的藥 物包括道諾黴素、阿黴素、甲胺蝶呤及長春地辛（Rowland 等人，（1986)同上）。抗體-毒素結合物中使用的毒素包括 細菌毒素，諸如白喉毒素、植物毒素（諸如篦麻毒素）、小 分子毒素（諸如格爾德黴素（geldanamycin)(Mandler等人 (2000) Jour, of the Nat. Cancer Inst. 92 (19): 1 573-158 1; Mandler 等人（2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler 等人（2002) Bioconjugate Chem· 13:786-791))、美登素類（maytansinoids)(EP 1391213; Liu 等人，（1996) Proc. Natl· Acad. Sci· USA 93:8618-8623)及 刺孢黴素（Lode 等人（1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman 等 人（1993) Cancer Res. 53:33 3 6-3342))。該等毒素可藉由包 括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制來實 現其細胞毒性及細胞抑制效應。有些細胞毒性藥物當與大 抗體或蛋白質受體配位體結合時易變成非活性的或弱活性 的0 ZEVALIN®(替伊莫單抗替烏克坦（ibritumomab tiuxetan， BiogenAdec)為抗體-放射性同位素結合物，其由抗CD20抗 原（見於正常及惡性B淋巴細胞之表面上）之鼠IgGl κ單株抗 體與nlIn或9GY放射性同位素藉由硫脲連接子·螯合劑結合 而成（Wiseman 等人（2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27 (7) :766-77; Wiseman等人（2002) Blood 99 (12) ..4336 _42; 118226.doc -98 - 200804418
Witzig等人（2002) J. Clin. Oncol· 20 (10) :2453 -63; Witzig 等人（2002) J· Clin· Oncol. 20 (15) :3262-69)。儘管 ZEVALIN具有抗B細胞非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)的活性， 但在大多數患者中投藥會導致嚴重及長期性血細胞減少 症。MYLOTARGtm(吉妥珠單抗奥唾米星（gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)，一種由 hu CD33抗 體與刺孢黴素聯結而成的抗體藥物結合物，於2000年獲准 用於注射治療急性骨髓性白血病（Drugs of the Future (2000) 25 (7):686 ;美國專利第 4970198 號、第 5079233 號、第 5585089 號、第 5606040 號、第 5693762 號、第 5739116號、第5767285號、第5773001號）。康圖單抗美坦 辛（Cantuzumab mert an sine) (Immunogen, Inc.)，一 種由 huC242抗體與類美登素藥物部分DM1經由二硫化物連接子 SPP聯結而成的抗體藥物結合物，經測試用於治療表現 CanAg之癌症，諸如結腸癌、胰腺癌、胃癌及其他癌。 MLN-2704(Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.)，一種由抗-前列腺特定膜抗原（PSMA)單株抗體與類 美登素藥物部分DM1聯結而成的抗體藥物結合物，經測試 用於前列腺腫瘤之潛在治療。奥利斯坦叮（auristatin)肽、 奥利斯坦叮E(AE)及單甲基奥利斯坦叮（monomethylauristatin; MMAE)，海兔毒素之合成類似物，可與嵌合單株抗體 cBR96(特異於癌科中之Lewis Y)及cAC 10(特異於惡性血液 腫瘤上之 CD30)結合（Doronina 等人（2〇〇3) Nature Biotechnology 21 (7):778-784)且正在治療性開發中 〇 118226.doc -99- 200804418 適用於產生免疫結合物的化學治療劑描述於本文中（上 述）。可使用的酶促活性毒素及其片段包括··白喉A鏈、白 喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈（獲自綠膿假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素八鏈、相思豆毒素A 鏈、鋪蓮根毒蛋白A鏈、α-帚麴菌素（alpha_sarcin)、油桐 (Aleurites fordii)蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸（phyt〇laca americana)蛋白（PAPI、PAPII 及 PAp_s)、苦瓜（m〇m〇rdica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白（curcin)、巴豆毒蛋白 (crotin)、肥皂草（sapaonaria 0fficinaHs)抑制劑、重組植物 毋素（gelonm)、有絲分裂素（mit〇geiiin)、侷限麴菌素 (restrictocin)、酚黴素、伊諾黴素（en〇mycin)及黴菌毒素 (tncothecene)。參見例如1993年1〇月28日公開的w〇 93/21232。各種放射性核素可用於產生放射性結合物抗 體。實例包括212Bi、⑴卜π、、⑼γ及mRe。抗體與細胞 毒性劑之結合物可使用各種雙官能蛋白質-偶合劑製備， 該等偶合劑諸如N-琥珀醯亞胺基_3-(2_吡啶基二硫醇）丙酸 鹽（SPDP)、亞胺硫煉（IT)、亞胺基酯之雙官能衍生物（諸如 乙二醯亞胺二甲酯鹽酸鹽）、活性酯（諸如二琥珀醯亞胺基 辛二酸酯）、醛（諸如戊二醛）、雙疊氮基化合物（諸如雙（對 璺氮基苯甲醯基）己二胺）、雙重氮衍生物（諸如雙（對重氮 苯甲醯基）_乙二胺）、二異氰酸鹽（諸如甲苯2,6-二異氰酸 鹽）及雙活性氟化合物（諸如二氟-2，‘二硝基苯）。舉例 而言，篦麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science， 238:1098 (1987)中所述加以製備。碳」4標記之卜異硫氮基 118226.doc -100- 200804418 节美 3 审I 一 土 暴二乙烯三胺五乙酸（MX-DTPA)為用於放射性核 苦酸與抗體結合的例示性螯合劑。參見WO 94/11026。 本文中亦可考慮抗體與一或多種小分子毒素（諸如刺孢 徽素、類美登素、海兔毒素、奥利斯坦叮、黴菌毒素及 CC1065 ’及具有毒素活性之該等毒素之衍生物）的結合 物。 美登素與類美登素 在有些實施例中，免疫結合物包含本發明之抗體與一或 多個類美登素分子之結合。 類美登素為有絲分裂（mit〇totic)抑制劑，其藉由抑制微 管蛋白聚合而起作用。美登素最初係自東非灌木齒葉美登 木（Maytenus serrata)中分離而得（美國專利第3,896，111 號）。後來發現某些微生物亦可產生類美登素，諸如美登 醇（maytansinol)及C-3美登醇酯（美國專利第4，151，042號）。 合成美登醇及其衍生物及類似物揭示於例如美國專利第 4，137,230 號、第 4,248,870 號、第 4,256,746 號、第 4,260,608 號、第 4,265,814 號、第 4,294,757 號、第 4,307,016 號、第 4,308,268 號、第 4,308,269 號、第 4,309,428 號、第 4,313,946 號、第 4,315,929 號、第 4,317,821 號、第 4,322,348 號、第 4,331，598 號、第 4,361，650 號、第 4,364,866 號、第 4,424,219 號、第 4,450,254號、第 4,362,663號及第 4,371，533號中。 類美登素藥物部分在抗體藥物結合物中為吸引人的藥物 部分，原因在於··（i)相對易可藉由醱酵或醱酵產物之化學 118226.doc -101- 200804418 仏飾衍生作用製備；（Η)易經適合經由非二硫化物連接 子、°曰抗體的B能基團衍生化；（Πί)在血漿中穩定；及 (iv)有效抗擊各種腫瘤細胞株。 類美登素藥物部分之例示性實施例包括·· DM丨；及 DM4。含有類美登素之免疫結合物、製備其之方法及其治 療用途揭示於例如美國專利第5,2〇8,〇2〇號、第5,416,〇64號
及歐洲專利EP 〇 425 235 B1中，其揭示内容以引用方式特 別併入本文中。Liu等人，Pr〇c Natl. Acad Sci USA 93:8618-8623 (1996)描述包含與抗人類結腸直腸癌之單株 抗體C242聯結之類美登素（命名為DM1)的免疫結合物。結 合物經發現對所培養之結腸癌細胞為高度細胞毒性的，且 在活體内腫瘤生長檢定中展示抗瘤活性。Chari等人，
Cancer Research 52:127-131 (1992)描述其中類美登素經由 一石瓜化物連接子與結合人類結腸癌細胞株上之抗原之鼠抗 體A7結合或與結合HER-2/neu致癌基因之另一種鼠單株抗 體ΤΑ· 1結合的免疫結合物。測試活體外τα· 1 -類美登素於 合物對人類乳癌細胞株SK-BR-3的細胞毒性，該細胞株每 個細胞表現3xl〇5個HER-2表面抗原。該藥物結合物獲得與 純類美登素藥物類似的細胞毒性度，細胞毒性度可藉由辦 加每抗體分子之類美登素分子數目來增大。A7-類美登素 結合物在小鼠中展示低的全身性細胞毒性。 抗體-類美登素結合物可藉由使抗體與類美登素分子化 學聯結而製備，而不會顯著減弱抗體或類美登素分子之生 物活性。參見，例如，美國專利第5,208,020號（其揭示内 118226.doc -102- 200804418 容以引用方式特別併入本文中）。每個抗體分子平均結合3_ 4個類美登素分子展示對靶細胞之強細胞毒性的功效，而 不會對抗體之功能或溶解性產生不利影響，即使甚至一分 子毒素/抗體預計比使用裸抗體可增強細胞毒性。類美登 素熟知於該項技術中，且可藉由已知技術合成或自天然源 中分離。適當的類美登素揭示於例如美國專利第5,2〇8,〇2〇 遽中及上文中所參考之其他專利及非專利公開案中。類美 登素包括但不限於美登醇及在美登醇分子之芳環中或其他 位置處所修飾的美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。 該項技術中已知之用於製備抗體·類美登素結合物的多 種聯結基團包括，例如，美國專利第5,2〇8,〇2〇號或Ep專利 0 425 235 Bl，Chari 等人，Cancer Research 52:127· 131(1992)及美國專利申請案第1〇/96〇,6〇2(2〇〇4年1〇月8曰 申請）中所揭示的彼等聯結基團，其揭示内容以引用方式 特別併入本文中。包含連接子成分SMCC的抗體-類美登素 結合物可如美國專利申請案第1〇/96〇,6〇2(2〇〇4年1〇月8曰 申明）中所揭示加以製備。如上述專利中所揭示，聯結基 團包括二硫基、硫醚基、酸不穩定基團、光不穩定基團、 狀酶不穩定基團或酯酶不穩定基團。本文中描述且例示了 其他鍵聯基團。 抗體與類美登素之結合物可使用各種雙官能蛋白質偶合 劑製備’該等偶合劑諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二 硫基）丙酸鹽（SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺 甲基）環己烷-1_羧酸酯（SMCC)、亞胺硫竦（IT)、亞胺基 118226.doc 200804418 酉曰之雙B月b《亍生物（諸#乙二醯亞胺二甲醋鹽酸鹽）、活性 酯（諸如二琥轴醯亞胺基辛二酸酯）、醛（諸如戊二醛）、雙 疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苯甲醯基）己二胺）、雙重 氮衍生物（諸如雙（對重氮苯甲醯基）_乙二胺）、=異氮酸鹽 (諸如甲苯2,6-二異氰酸鹽）及雙活性氣化合物（諸如以二 氟-2,4-二硝基苯）。偶合劑包括但不限於n_琥珀醯亞胺基_ 3-(2_吡啶基二硫基）丙酸鹽（spDpKCariss〇n等人， Biochem· J· 173:723_737 (1978))及冰琥抬醯亞胺基 _4_(2_ 吼咬基硫基）戊酸鹽（SPP)以提供二硫鍵。 連接子可在各種位置與類美登素分子連接，此視連接類 型而定。舉例而言，酯鍵可藉由使用習知偶合技術與羥基 反應而形成。該反應可發生於具有羥基之C_3位置處、經 羥曱基修飾之C_ 14位置處、經羥基修飾之15位置處及具 有經基之C-20位置處。在一較佳實施例中，該鍵可在美登 畔或美登醇類似物之C-3位置處形成。 奥利斯坦叮及海兔毒素 在有些實施例中，免疫結合物包含本發明之抗體與海兔 毒素或海兔毒素肽類似物及衍生物、奥利斯坦叮之結合物 (美國專利第5635483號、第5780588號）。海兔毒素及奥利 斯坦叮經證明可干擾微管體動力學、GTP水解及核分裂及 細胞分裂（Woyke 等人（2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12):3580-3584)且具有抗癌活性（US 5663149)及抗真菌活性（Pettit 等人（1998) Antimicrob. Agents Chemother· 42:2961-2965)。海兔毒素或奥利斯坦叮 118226.doc -104- 200804418 藥物部分可經由肽藥物部分之N(胺基）末端或C(羧基）末端 與抗體連接（WO 02/088172)。 例示性奥利斯坦叮實施例包括’’Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands’’，U.S. Ser. No. 10/983,340(2004年11月5曰申請，其揭示内容特別以引 用方式全文併入本文中）中所揭示的N-末端連接單甲基奥 利斯坦叮藥物部分DE及DF。 例示性奥利斯坦叮實施例包括MMAE及MMAF。包含 MM AE或MM AF及各種連接子成分（本文中另外描述）的其 他例示性實施例包括Ab_MC-vc-PAB-MMAF、Ab-MC-vc-PAB-MMAE、Ab-MC-MMAE及 Ab_MC-MMAF。 基於肽之藥物部分通常可藉由在兩個或兩個以上的胺基 酸及/或肽片段之間形成肽鍵而製備。該等肽鍵例如可根 據肽化學領域中熟知之液相合成方法（參見E. Schr6der及K. Lubke，"The Peptides”，第 1 卷，第 76-136 頁，1965, Academic Press)製備。奥利斯坦叮/海兔毒素藥物部分可根 據如下文獻中之方法製備：U.S· 5,635,483 ; U.S· 5,780,588 ; Pettit等人（1989) J. Am. Chem. Soc· 111:5463-5465 ; Pettit 等人（1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277 ; Pettit, G.R·等人 Synthesis，1996，719-725 ;及 Pettit 等人（1996) J· Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863。亦參見 Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784 ； MMonomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands1* 5 U.S. Ser. No· 10/983,340，2004年11月5曰申請，其以引用方式全文併 118226.doc -105- 200804418 入本文中（例如揭示連接子及製備與連接子結合之單甲基 纈胺酸化合物（諸如MMAE及MMAF)的方法）。 刺孢黴素 在其他實施例中，免疫結合物包含本發明之抗體與一或 多個刺孢黴素分子之結合。抗生素之刺孢黴素家族能夠產 生亞皮莫耳（sub-picomolar)濃度的雙股DNA斷裂。對於刺 孢黴素家族之結合物之製備，參見美國專利第5,712,374 號、第 5,714,586號、第 5,739，116號、第 5,767,285 號、第 5,770,701號、第 5,770,710號、第 5,773,001 號、第 5,877,296 號（皆屬於American Cyanamid Company)。可使用之刺孢黴 素之結構類似物包括但不限於：γ/、（X21、a/、 Ν-乙醯 基-γι1、PSAG 及 Q^Hinman 等人，Cancer Research 53:3336-3342 (1993)，Lode等人，Cancer Research 58:2925-2928 (1998)及 American Cyanamid之上述美國專利）。另一種可結合抗體的 抗腫瘤藥物為QFA，其為抗葉酸物。刺孢黴素與QFA均具 有細胞内作用位點且不易跨越質膜。因此，細胞經由抗體 介導内在化吸收該等藥劑大大增強了其細胞毒性效應。 其他細胞毒性劑 其他可結合本發明之抗體的抗腫瘤劑包括BCNU ;斯曲 普托辛（streptozoicin);長春新驗及5-氟尿哺咬；美國專利 5,053,3 94、5,770,710中所述、統稱為LL-E3 3288複合物之 藥劑家族；以及艾斯帕米辛（esperamicins)(美國專利 5,877,296) 〇 可使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒 118226.doc -106- 200804418 素之非結合活性片段、外毒素A鏈（獲自綠膿假單胞菌）、 篦麻毋素A鏈、相思豆毒素a鏈、莫迪素（m〇deccin)A鏈、 α-帚麴菌素、油桐蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸蛋白 (ΡΑΡΙ、ΡΑΡΙΙ及PAP_S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴 豆毋蛋白、肥皂草（sapa〇naria 〇fficinaiis)抑制劑、重組植 物t素、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及 黴菌毒素。參見，例如，1993年10月28日所公開之w〇 93/21232 。 本發明此外涵蓋在抗體與具有核酸分解活性之化合物 (例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，諸如脫氧核糖核 酸8#，DNase)之間所形成的免疫結合物。 為選擇性破壞腫瘤，抗體可包含強放射性原子。各種放 射性同位素可用於製備放射性結合抗體。實例包括Αρη、 I131、I125、Y9G、Re⑻、Rem、Sml53、趴212、p32、pb212 及Lu之放射性同位素。當結合物係用於偵測時，其可包含 用於閃爍造影研究的放射性原子，例如“^或im ;或用 於核磁共振（NMR)成像（亦稱磁共振成像，MRI)之自旋標 記物’又諸如峨·123、^_131、銦_lu、氟_19、碳-Η、 氮-15、氧_ 17、釓、錳或鐵。 放射性標記或其他標記可以已知方式併入結合物中。舉 例而言，此肽可經生物合成’或可使用適當胺基酸前驅物 (包括，例如，氟-19而非氫）ι由化學胺基酸合成法合 成。諸如 1\:99111或1123、Re186、lu
Ke及1nUl之標記可經由肽 中之半胱胺酸殘基附著。紀_ 9 〇可奴山 ϋ Τ經由離胺酸殘基連接。 118226.doc -107- 200804418 可使用 IODOGEN 方法（Fraker 等人（1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)併入埃-123。"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy"(Chatal，CRC Press 1989)詳細地描 述了其他方法。 可使用各種雙官能蛋白質偶合劑製備抗體與細胞毒性劑 之結合物，該等偶合劑諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基 二硫基）丙酸鹽（SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞 胺基甲基）環己烷-1-羧酸酯（SMCC)、亞胺硫煉（IT)、亞胺 基酯之雙官能衍生物（諸如乙二醯亞胺二甲酯鹽酸鹽）、活 性酯（諸如二琥珀醯亞胺基辛二酸酯）、醛（諸如戊二醛）、 雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苯甲醯基）己二胺）、雙 重氮衍生物（諸如雙（對重氮苯曱醯基）-乙二胺）、二異氰酸 鹽（諸如甲苯2,6-二異氰酸鹽）及雙活性氟化合物（諸如1，5-二氟_2,4_二硝基苯）。舉例而言，篦麻毒素免疫毒素可如 Vitetta 等人，Science，238:1098 (1987)中所述加以製備。 碳-14標記之1-異硫氰基苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸 (MX-DTPA)為用於放射性核苷酸與抗體結合的例示性螯合 劑。參見WO 94/11026。連接子可為有利於在細胞中釋放 細胞毒性藥物的”可分裂連接子’’。舉例而言，可使用酸不 穩定連接子、狀酶敏感連接子、光不穩定連接子、二甲基 連接子或含二硫鍵連接子（Chari等人，Cancer Research 52:127-131 (1992);美國專利第 5,208,020號）。 本發明之化合物特別涵蓋但不限於經以下交聯試劑所製 備之ADC : BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC - SMCC、 118226.doc -108- 200804418 MBS、ΜΡΒΗ、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、 SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB，及可市購 (例如，購自 Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL·， U.S.A)之SVSB(琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基颯）苯甲酸鹽）。參 見 2003-2004 Applications Handbook and Catalog第 467-498 頁。 抗體藥物結合物之製備 在本發明之抗體藥物結合物（ADC)中，抗體（Ab)經由連 接子（L)與一或多個藥物部分（D)結合，例如每個抗體約1至 約20個藥物部分。式I之ADC可藉由若干途徑、使用熟習 該項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑製備，包 括··（1)抗體之親核基團與二價連接子試劑反應，以經由共 價鍵形成Ab-L，繼之與藥物部分D反應；及（2)藥物部分之 親核基團與二價連接子試劑反應，以經由共價鍵形成D-L，繼之與抗體之親核基團反應。本文中描述ADC的其他 製備方法。
Ab-(L-D)p I 連接子可由一或多種連接子成分組成。例示性連接子成 分包括6-順丁烯二醯亞胺己醯基（”MCn)、順丁烯二醯亞胺 丙醯基（ΠΜΡΠ)、纈胺酸-瓜胺酸（”val-citn)、丙胺酸-苯丙胺 酸（"ala-phe”）、對胺基苄基氧基羰基（"PAB”）、N_琥珀醯亞 胺基4-(2-吡啶基硫基）戊酸鹽（"SPP")、N-琥珀醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺甲基）環己烷-1羧酸鹽（"SMCC”）及N-琥 118226.doc -109- 200804418 珀醯亞胺基（4-碘基_乙醯基）胺基苯甲酸鹽（，，SIABn)。其他 連接子成分已知於該項技術中且有些描述於本文中。亦參 見 ’’Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands' U.S· Ser. N〇.10/983,340，2004年 11月 5 日申 請，其内容以引用方式全文併入本文中。 在有些實施例中，連接子可包含胺基酸殘基。例示性胺 基酸連接子成分包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性二 肽包括·結I胺酸-瓜胺酸（vc^val-cit)、丙胺酸_苯丙胺酸 (af或ala-phe)。例示性三肽包括：甘胺酸纈胺酸_瓜胺酸 (gly val cit)及甘胺酸_甘胺酸_甘胺酸（giy_giy_giy)。包含 胺基酸連接子成分的胺基酸殘基包括天然存在的彼等物， 以及次要的胺基酸及非天然存在的胺基酸類似物，諸如瓜 胺酸。胺基酸連接子成分在其對藉由特定酶（例如腫瘤相 關蛋白酶、組織蛋白酶B、C及d或纖溶酶蛋白酶）之酶促 分裂之選擇性方面可最優化設計。 例示性連接子成分結構展示如下（其中波狀線表示與 ADC之其他成分的共價連接位點）：
118226.doc -110 200804418
NIH
其他例示性連接子成分及簡化體包括（其中描繪了抗體 (Ab)及連接子，且p為1至約8):
Val-cit
b A
D I
P C I 11 a V I c Μ
118226.doc -Ill - 200804418 抗體上之親核基團包括但不限於：（i)N_末端胺基；（ϋ) 側鏈胺基，例如離胺酸；（iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺 酸’及（iv)糖羥基或胺基，其中抗體經糖基化。胺、硫醇 及經基為親核性的且能夠與連接子部分及連接子試劑上之 親電子基團反應以形成共價鍵，連接子部分及連接子試劑 包括：（i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵曱酸酯及醯 基鹵；（ii)烷基鹵及苄基鹵，諸如鹵乙醯胺；（丨⑴醛、酮、 叛基及順丁烯二醯亞胺基團。某些抗體具有可還原之鏈間 二硫鍵’亦即半胱胺酸橋鍵。抗體可藉由以還原劑（諸如 DTT(二硫蘇糖醇））處理獲得與連接子試劑結合的反應性。 因此各半胱胺酸橋鍵理論上形成兩個反應性硫醇親核體。 其他親核基團可經由離胺酸與2_亞胺硫竦（Traut氏試劑）之 反應導入抗體，從而使胺轉化成硫醇。反應性硫醇基可藉 由導入一、二、三、四或四個以上的半胱胺酸殘基而導入 抗體（或其片段）(例如，製備包含一或多個非天然半胱胺酸 胺基酸殘基的突變株抗體）。 本發明之抗體藥物結合物亦可藉由修飾抗體而製備，以 導入可與連接子試劑或藥物上之親核取代基反應的親電子 部分。糖基化抗體中之糖可經例如過碘酸鹽氧化劑氧化， 以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應的醛基或酮 基。所產生之亞胺希夫鹼（Schiff base)基團可形成穩定的 鍵’或例如藉由硼氫化物試劑還原以形成穩定的胺鍵。在 貝施例中，糖基化抗體中之碳水化合物部分與半乳糖氧 化酶或偏過碘酸鈉之反應可在能與藥物上之適當基團反應 118226.doc -112- 200804418 之蛋白負中產生‘基（駿基及g同基）(Hermans〇n，
Bi〇C〇njugate Techniques)。在另一實施例中，含有n_末端 絲胺酸或羥丁胺酸殘基之蛋白質可與偏過碘酸鈉反應，從 而產生醛而非第一胺基酸（Geoghegan & Stroh，（1992)
Bioconjugate Chem· 3:138-146; US 5362852)。該醛可與藥 物部分或連接子親核體反應。 同樣，藥物部分上之親核基團包括但不限於能夠與連接 子部分及連接子試劑上之親電子基團反應以形成共價鍵的 胺、硫醇、經基、醯肼H、硫半卡（thiosemicarbaz〇ne)、 叛酸骄及芳基酿肼基團，連接子部分及連接子試劑包括： ⑴活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及醯基鹵； (11)烷基鹵及苄基鹵，諸如鹵乙醯胺；（iii)醛基、酮基、羧 基及順丁烯二醯亞胺基團。 或者，包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白例如可藉由重 組技藝或肽合成法製備。DNA長度可包含編碼結合物之彼 此相鄰之兩部分的各自區域，或編碼結合物中由編碼連接 子肽（其不破壞結合物之所要性質）之區域所分隔之兩部分 的各自區域。 在另一實施例中，抗體可與用於預靶向腫瘤中的”受體"（諸 如抗生蛋白鏈菌素）結合，其中將抗體_受體結合物投與患 者，繼之使用廓清劑將未結合之結合物自循環系統中移 除，且接著投與與細胞毒性劑（例如，放射性核苷酸）結合 的π配位體”（例如，抗生物素蛋白）。 抗體（Ab)-MC-MMAE可如下藉由使本文中所提供之任一 118226.doc -113 · 200804418 種抗體與MC-ΜΜΑΕ結合來製備。將在pH 8.0下溶於500 mM硼酸鈉及500 mM氣化鈉中的抗體用過量的100 mM二硫 蘇糖醇（DTT)處理。在37°C培育約30分鐘後，將缓衝劑藉 由經Sephadex G25樹脂溶離來置換且以具有1 mM DTPA之 PBS溶離。硫醇/Ab值係藉由自該溶液之280 nm吸光率測定 還原後抗體濃度以及藉由與DTNB(Aldrich，Milwaukee， WI)反應測定硫醇濃度以及測定412 nm之吸光率來檢驗。 將溶於PBS中的還原抗體置於冰上冷卻。將藥物連接子試 劑（溶於DMSO中的順丁烯二醯亞胺己醯基-單甲基奥利斯 坦叮E(MMAE)，亦即，MOMMAE))以已知濃度稀釋於乙 腈及水中，且添加至PBS中之冷還原抗體2H9中。約一小 時後，添加過量的順丁浠二醯亞胺中止反應且將任何未反 應的抗體硫醇基封端。反應混合物藉由離心超濾作用濃 縮，且使2H9-MC-MMAE經由PBS中之G25樹脂、藉由溶離 來純化及脫鹽，在無菌條件下經由〇·2 μηι過濾器過濾，且 經冷凍以待儲存。 抗體-MC-MMAF可藉由使本文中所提供之任一種抗體與 MC-MMAF按照為Ab-MC_MMAE製備所提供之方案結合來 製備。 抗體-MC-val-cit-PAB-MMAE可藉由使本文中所提供之 任一種抗體與 MC-val-cit-PAB-MMAE按照為 Ab-MC-MMAE 製備所提供之方案結合來製備。
抗體-MC-val-cit-PAB_MMAE可藉由使本文中所提供之 任一種抗體與 MC-val-cit-PAB-MMAF按照為 Ab-MC-MMAE 118226.doc •114- 200804418 製備所提供之方案結合來製備。 抗體-SMCC-DM1可如下藉由使本文中所提供之任—種 抗體與SMCC-DM1結合來製備。純化抗體可經琥轴醯亞胺 基4-(N-順丁烯二醯亞胺甲基）環己烷緩酸鹽（SMCC，
Pierce Biotechnology，Inc)衍生化以導入SMCC連接子。具 體而言，將20 mg/mL之抗體於具有7·5莫耳舍量之 SMCC(20 mM 於 DMSO 中，6.7 mg/mL)之 5〇 mM 磷酸卸/5〇 mM氯化鈉/2 mM EDTA(pH 6.5)中處理。在環境溫度下、 在氬氛圍下擾拌2小時後’將反應混合物經由以5〇 mM填 酸鉀/50 mM 氯化鈉/2 mM EDTA(pH 6.5)所平衡2Sephadex G25柱過濾。收集且檢定含有抗體的溶離份。 將如此所製備之抗體- SMCC用50 mM碟酸鉀./5〇 mM氯化 鈉/2 mM EDTA(pH 6.5)稀釋至約10 mg/mi之最後濃度，且 與DM1於二甲基乙醯胺中之10 mM溶液反應。將反應物在 環境溫度下、在氬氛圍下攪拌16.5個小時。將結合反應混 合物經由具有lxPBS(pH 6.5)之Sephadex G25凝膠過濾柱 (1·5χ4·9 cm)過濾。DM1藥物與抗體比率（p)可為約2至5， 如藉由252 nm及280 nm之吸光率所量測。
Ab-SPP-DMl可如下藉由使本文中所提供之任一種抗體 與SPP-DM1結合來製備。純化抗體經N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫基）戊酸鹽衍生化以導入二硫吡啶基。將44·7 mL之含有NaCl(50 mM)及EDTA(1 mM)之50 mM磷酸鉀缓 衝劑（pH 6.5)中之抗體（376.0 mg，8 mg/mL)用 SPP(2.3 mL 乙 醇中之5·3莫耳當量）處理。在環境溫度下、在氬氛圍下培 118226.doc -115- 200804418 育90分鐘後，將反應混合物經由以35 mM檸檬酸納、154 mM NaC卜2 mM EDTA缓衝劑所平衡之Sephadex G25柱凝 膠過濾。收集且檢定含有抗體的溶離份。抗體修飾之程度 如上所述測定。 抗體-SPP-Py(約1〇微莫耳之可釋放2·硫ϋ比啶基團）用上述 35 mM檸檬酸鈉緩衝劑（pH 6.5)稀釋至約2·5 mg/mL之最後 濃度。接著將3.0 mM二曱基乙醯胺（DMA，3% v/v於最終反 應混合物中）中之DM1(1.7當量，17微莫耳）添加至抗體溶 液中。使反應在環境溫度下、在氬氛圍下進行約20個小 時。將反應物裝載於經35 mM檸檬酸鈉、154 mM NaCl(pH 6·5)所平衡的 Sephacryl S300凝膠過渡柱（5.0 cm><90.0 cm， 1.77 L)上。流速可為約5.0 mL/min且收集65個溶離份（各 20.0 mL)。每個抗體分子連接的DM1藥物分子數目（p’）可藉 由量測252 nm及280 nm之吸光率來測定，且可為每個2H9 抗體約2至4個DM1藥物部分。 抗體-BMPEO-DM1可如下藉由使本文中所提供之任一種 抗體與BMPEO-DM1結合來製備。將抗體以雙順丁烯二醯 亞胺試劑BM(PEO)4(Pierce Chemical)修飾，從而在抗體表 面上剩留一未反應的順丁烯二醯亞胺基團。此舉可藉由將 BM(PEO)4於50%乙醇/水混合物中溶解至10 mM之濃度且 將十倍莫耳過量添加至含有約1·6 mg/ml(10微莫耳）濃度之 於磷酸鹽緩衝鹽水中之抗體的溶液中且使其反應1小時以 形成抗體·連接子中間物（2H9-BMPEO)來實現。過量 BM(PEO)4藉由在具有150 mM NaCl緩衝劑之30 mM檸檬酸 118226.doc •116- 200804418 鹽（PH 6)中凝膠過濾（HiTrap c〇lumn，pharmacia)來移除。 將約1〇倍莫耳過量DM1溶於二甲基乙醯胺（DMA)中且添加 至2H9-BMPEO中間物。二甲基甲醯胺（DMF)亦可用於溶解 藥物。卩为5式劑。讓反應混合物反應隔夜再凝膠過濾或滲析 入PBS中以移除未反應的DMl。使用中之柱凝膠 過濾來移除面分子量聚集物且提供純化2H9_BMpE〇_ DM1。 抗髏衍生物 本發明之抗體可另外修飾成含有該項技術中已知且易獲 的其他非蛋白部分。在一實施例中，適於衍生化抗體的 部分為水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制實例包括但 不限於：聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲 基纖維素葡H聚乙烯H、聚乙烯吼洛咬酮、聚.Μ· 二氧戊環、聚-1，3,6-三喝、院、乙稀/順丁烯三酸酐共聚物、 聚胺基酸（均聚物或無規共聚物）及葡聚糖或聚（正乙稀基吼 嘻定酮）聚乙—醇、聚丙二醇均聚物、環氧丙烧/環氧乙烧 “聚物f氧乙婦化多疋醇（例如，甘油）、聚乙稀醇及其 混合物。m㈣由於其在水中的敎性而具有製造 優勢4合物可具有任—分子量，且可為分枝的或無分枝 的。與抗體連接之聚合物的數目可改變，且若連接__種以 上的聚合物’則該等聚合物可為相同或不同分子。一般而 言，用於衍生作用之聚合物的數目 考慮較，包括但不限於：欲改良之抗體之特定性質或功 能；抗體衍生物是否用於限定條件下之治療等。 118226.doc -117- 200804418 在另-實施例中’提供抗體與可藉由暴露於輻射來選擇 性加熱之非蛋白部分的結合物。在一實施例中，非蛋白部 分為奈米碳管（Kam等人，Proc. Natl Acad ^ 1〇2: 11600-11605 (2005))。此輻射可具有任一波長，且包括但 不限於不損傷-般細胞但能將非蛋白部分加熱至可殺死抗 體-非蛋白部分近側之細胞之溫度的波長。 醫藥調配物 包含本發明之抗體的治療性調配物藉由將具有所要純度 之抗體與任選生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑 (Remington’s Pharmaceutical Sciences，第 U版，0sQl, Α· 編（1980))混合、以水溶液、束乾型或其他乾燥型調配物之 形式製備。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及 /辰度下對X者無毋性，且包括：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸 檬酸鹽、組胺酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸 及甲硫胺酸；防腐劑（諸如十八基二甲基节基氯化銨；氯 化/、k季叙（hexamethonium chloride);氯化苯甲烴錄 (benzalkonium chloride)，节索氯銨（benzeth〇nium chloride); 苯酚；丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷基酯，諸如對羥苯甲 酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚（catech〇1);間苯二酚 (resorcinoi);環己醇；3_戊醇；及間甲酚）；低分子量（小 於約10個殘基）多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或 免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基 酉文，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸 或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、 118226.doc -118- 200804418 甘路糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA ;糖，諸如蔗糖、甘 路醇、海藻糖或山梨糖醇；鹽形成抗衡離子，諸如鈉離 子，金屬錯合物（例如鋅蛋白質錯合物）；及/或非離子型界 面活性劑，諸如tween™、pluronicstm或聚乙二醇（peg)。 本文中之調配物亦可含有一種以上為治療特定適應症所 需的活性化合物，包括但不限於具有彼此無不利影響之補 充活性的彼等物。該等分子以有效實現預定目標之量組合 存在適宜。 該等活性成分亦可例如藉由團聚技藝或藉由界面聚合 法刀別以膠狀藥物傳遞系統（例如，脂質體、白蛋白微 球體、微乳狀液、奈米顆粒及奈米囊）或以巨乳狀液捕集 於所製備之微囊中，例如羥甲基纖維素或明膠微囊及聚 (甲基丙烯酸甲酯）微囊。該等技藝揭示於及 P/mr卿cewAWSczhca 第 16版，〇s〇l，A.編（1980)中。 用於活體内投藥的調配物必須為無菌的。此易經由無菌 過濾膜、藉由過濾來實現。 可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適當實例包 括含有本發明之免疫球蛋白之固體疏水性聚合物之半透性 基質’該等基質為成形物品之形式，例如，膜或微囊。持 續釋放型基質之實例包括聚酯、水凝膠（例如，聚經基 乙基-甲基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚乳酸交酯（美國專利 第3,773,919號）、L-麩胺酸與乙基_l_麩胺酸酯之共聚物、 不可降解性乙稀·乙酸乙烯酯、可降解性乳酸·乙醇酸共聚 物（諸如LUPRON DEPOT™(由乳酸-乙醇酸共聚物與亮丙瑞 118226.doc -119- 200804418 :…且成之可注射微球體))及聚_d_㈠_3_ :些水凝膠釋放蛋白質的期限較短，而諸如乙婦-乙酸乙 烯醋及乳酸·乙醇酸之聚合物卻能使分子釋放逾⑽天。當 囊封免疫球蛋白在躯體中長久保持時，其可能因在抓 下、暴露於潮濕而變性或聚集，導致生物活性降低及可能 :免疫原性變化。視所涉及之機制而定，可設計出用於穩 疋的。理策略。舉例而t，若發現聚集機制為經由硫基_ 二硫化物互換之分子間s_s鍵形成，則可藉由修飾氣硫基 殘基、自酸性溶液柬乾、控制濕含量、使用適當添加劑及 開發特定聚合物基質組合物而獲得穩定性。 用途 本發明之抗體例如可用於活體外、離體及活體内治療方 法中。本發明之抗體可用作部分地或完全地阻抑活體外、 離體及/或活體内特定抗原活性的拮抗劑。此外，本發明 之抗體中之至少一部分可中和獲自其他種之抗原活性。因 此，本發明之抗體可用於例如在含有抗原之細胞培養中、 在具有可與本發明之抗體交又反應之抗原的人類受檢者或 其他哺乳動物受檢者（例如黑猩猩、狒狒、狨猴、食蟹猴 及恆河猴、豬或小鼠）中抑制特定活性抗原。在一實施例 中’本發明之抗體可藉由使該抗體與抗原接觸以致抗原活 性被抑制而用來抑制抗原活性。在一實施例中，抗原為人 類蛋白質分子。 在一實施例中，本發明之抗體可用於抑制患抗原活性為 有害之病症之受檢者中之抗原的方法，該方法包含將本發 118226.doc -120- 200804418
該等動物模型可適用於 交叉反應之抗原的非人類哺乳動物（例如，靈長 類動物、豬或小鼠）。關於後者， 評價本發明之抗體之治療功效（例如，劑量測試及投藥時 間進权）。本發明之抗體可用於治療、抑制與之異常 表現及/或活性相關之疾病、病症或病狀，延緩其進行、 、病症或病狀， 免疫/炎性病症及 防止/延緩其復發’改善或預防該等疾病、 包括但不限於細胞增殖性病症、感染、免 其他干擾素相關病症。 在一態樣中，本發明之阻斷抗體特定結合RELT以使得 其藉由阻斷或妨礙RELT與一或多個RELT配位體之間相互 作用來抑制正常的RELT活性，從而抑制相應信號傳導途 徑及其他相關分子事件或細胞事件。 在某些實施例中’將包含結合有細胞毒性劑之抗體的免 疫結合物投與患者。在有些實施例中，免疫結合物及/或 結合其之抗原係藉由細胞内在化，從而增強免疫結合物殺 死結合其之乾細胞的治療功效。在一實施例中，細胞毒性 劑乾向或干擾靶細胞中之核酸。該等細胞毒性劑之實例包 118226.doc • 121 - 200804418 括本文中所註明之任一種化學治療劑（諸如類美登素或刺 孢黴素）、放射性同位素或核糖核酸酶或〇]^八核酸内切 酶。 本發明之抗體在治療中可單獨或者與其他組合物組合使 用。舉例而言，本發明之抗體可與其他抗體及/或佐劑/治 療劑（例如，甾類）共投藥。舉例而言，在治療方案中，例 如在治療本文中所述之任一種疾病（包括細胞增殖性病 症、感染、免疫/炎性病症及其他干擾素相關病症）的治療 方案中，本發明之抗體可與消炎藥及/或抗菌劑組合。上 述該等組合療法包括組合投藥（其中將兩種或兩種以上的 藥劑歸併入同一調配物或單獨調配物中）及分開投藥（此狀 況中，本發明之抗體可在辅助治療或治療之投藥之前及/ 或之後進行投藥）。 本發明之抗體（及輔助治療劑）可藉由任一適當方式（包括 非經腸、皮下、腹膜内、肺内及鼻内）投藥，且若需要局 部治療，則為疾病部位内投藥。非經腸輸注包括肌肉内、 靜脈内、動脈内、腹膜内或皮下投藥。此外，抗體可適當 地藉由脈動輸注投藥’尤其輸注遞減劑量之抗體。給藥可 藉由任一適當途徑，例如藉由注射，諸如靜脈内注射或皮 下注射’此部分地視投樂疋否為短期或長期而定。 在抗體製備及投藥中可考慮本發明之抗體之結合靶之位 置。當結合乾為細胞内分子時，本發明之某些實施例提供 可導入結合靶位置所在之細胞中的抗體或其抗原結合片 段。在一實施例中，本發明之抗體可作為胞内抗體表現於 118226.doc -122- 200804418 細胞内。如本文中所使用之術語”胞内抗體•’係指如以下文 獻中所述之可細胞内表現且能夠選擇性結合靶分子的抗體 或其抗原結合部分：Marasco，Gene Therapy 4: 11-15 (1997) ; Kontermann, Methods 34 : 163-170 (2004)；美國 專利第6,004,940號及第6,329，173號；美國專利申請公開案 第 2003/0104402號及 PCT公開案第 WO 2003/077945號。胞 内抗體之細胞内表現藉由將編碼所要抗體或其抗原結合部 分之核酸（缺野生型前導序列及一般與編碼彼抗體或抗原 結合片段之基因相關的分泌信號）導入靶細胞内來實現。 可使用任一種將核酸導入細胞内的標準方法，包括但不限 於：微量注射、彈道注射、電穿孔、磷酸鈣沉澱、脂質體 及用反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒及攜有所研究之核 酸的牛痘載體轉染。一或多種編碼本發明之抗-RELT抗體 之全部或部分的核酸可傳遞至乾細胞，以便表現一或多種 能夠細胞内結合RELT且調節一或多個RELT介導細胞途徑 的胞内抗體。 在其他實施例中，提供内在化抗體。抗體可具有增強抗 體遞送入細胞内的某些特性，或經修飾可具有該等特性。 實現此之技藝已知於該項技術中。舉例而言，將抗體陽離 子化已知可有利於其吸收入細胞内（參見，例如，美國專 利第6,703,019號）。脂質轉染或脂質體亦可用於將抗體遞 送入細胞内。當使用抗體片段時，特定結合靶蛋白之結合 域的最小抑制片段通常為有利的。舉例而言，可基於抗體 之可變區序列設計保持結合靶蛋白序列能力的肽分子。該 118226.doc -123- 200804418 等肽可化學合成及/或藉由重組DNA技術產生。參見，例 如，Marasco等人，Proe· Natl· Acad· Sci. USA，90: 7889-7893 (1993) 〇 調節劑多肽進入靶細胞内可藉由該項技術中已知的方法 增強。舉例而言，某些序列（諸如源自HIV Tat或果蠅觸角 蛋白同源結構域蛋白的彼等序列）能夠有效引導異源蛋白 跨越細胞膜吸收。參見，例如，Chen等人，Proc· Natl· Acad. Sci. USA (1999)，96:4325-4329。 當結合靶位於腦内時，本發明之某些實施例提供可穿越 血腦障壁的抗體或其抗原結合片段。某些神經變性疾病與 血腦障壁之通透性增大相關，以便易將抗體或抗原結合片 段導入腦内。當血腦障壁保持完整時，存在幾種輸送分子 穿越血腦障壁、該項技術已知的方法，包括但不限於物理 方法、基於脂質之方法以及基於受體及通道的方法。 輸送抗體或抗原結合片段穿越血腦障壁的物理方法包括 但不限於完全規避血腦障壁法或在血腦障壁内形成開孔。 規避方法包括但不限於直接注入腦内（參見，例如， Papanastassiou等人，Gene Therapy 9: 398-406 (2002))及將 輸送裝置植入腦内（參見，例如，Gill等人，Nature Med· 9: 589_595 (2003);及 Gliadel Wafers™，Guildford Pharmaceutical)。 在障壁内形成開孔的方法包括但不限於超音波法（參見， 例如，美國專利公開案第2002/0038086號）、滲透壓法（例 如，投與高張性甘露糖醇（Neuwelt，Ε· A·，Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation，第 1及 2卷， 118226.doc -124- 200804418
Plenum Press，Ν.Υ· (1989)))、藉由例如舒缓激肽或滲透劑 Α-7之滲透法（參見，例如，美國專利第5，112,596號、第 5,268，164號、第5,506,206號及第5,686,416號），以及用含 有編碼抗體或抗原結合片段之基因的載體轉染跨立於血腦 障壁的神經元（參見，例如，美國專利公開案第 2003/0083299號）° 輸送抗體或抗原結合片段穿越血腦障壁的基於脂質之方 法包括但不限於：將抗體或抗原結合片段囊封於脂質體 内，該等脂質體係與結合血腦障壁之血管内皮上之受體的 抗體結合片段偶合（參見，例如，美國專利申請公開案第 20020025313)，以及以低密度脂蛋白顆粒（參見，例如，美 國專利申請公開案第20040204354號）或脫脂蛋白Ε(參見， 例如，美國專利申請公開案第20040131692號）包覆抗體或 抗原結合片段。 輸送抗體或抗原結合片段穿越血腦障壁的基於受體及通 道之方法包括但不限於··使用糖皮質激素阻斷劑增強血腦 障壁之通透性（參見，例如，美國專利申請公開案第 2002/0065259 號、第 2003/0162695 號及第 2005/0124533 號）；激活鉀通道（參見，例如，美國專利申請公開案第 2005/0089473號）、抑制ABC藥物輸送劑（參見，例如，美 國專利申請公開案第2003/0073713號）；以運鐵蛋白包覆抗 體且調節一或多個運鐵蛋白受體之活性（參見，例如，美 國專利申請公開案第2003/0129186號），以及使抗體陽離子 化（參見，例如，美國專利第5,004,697號）。 118226.doc -125- 200804418 本發明之抗體組合物以符合良好醫療實踐之方式調酉己 配量及投藥。本上下文中應考慮的因素包括所治療之具體 病症、所治療之具體哺乳動物、單個患者之臨床病狀、病 症之病因、藥劑傳遞位置、投藥方法、投藥進度及執業^ 師已知的其他因素。抗體不一定而是視需要與一或多種目 前所使用之藥劑調配以預防或治療所述病症。該等其他藥 劑之有效量視本發明之抗體存在於調配物中的量、病症或 治療類型及上述其他因素而定。該等藥劑通常以相同S量 且利用本文中所述之投藥途徑使用，或以本文中所述劑量 之約1❶/〇至99%使用，或以任意劑量且憑經驗/臨床上確定 為適當的任何途徑使用。 對於預防或治療疾病，本發明之抗體（當單獨使用或與 諸如化學治療劑之其他劑組合使用時）之適當劑量視待治 療之疾病類型、抗體類型、疾病嚴重程度及病程、抗體投 藥是否為預防性或治療性目的、過去治療、患者臨床史及 對抗體之反應及主沴醫師之判斷而定。抗體一次性或經一 系列治療投與患者適宜。無論藉由一或多次分開投藥，或 藉由連續輸注，視疾病類型及嚴重程度而定，抗體投與患 者的初始候選劑量例如為約丨叩/4至15 mg/kg(例如， mg/kg-lO mg/kg)。一種典型的日服劑量範圍可為約1 gg/kg至100 mg/kg*1〇〇 mg/kg以上，此視上述因素而定。 對於歷經數天或更長時間的重複投藥，治療視病狀而定通 常可持續至疾病症狀之所要抑制發生為止。抗體之一例示 性劑里的範圍為約〇·05 mg/kg至約1〇 mg/kg。因此，可向 118226.doc -126- 200804418 患者投與約 o·5 mg/kg、2·0 mg/kg、4 〇 mg/kg 或 ι〇 mg/kg(或其任一組合）之一或多種劑量。該等劑量可間歇 地技與，例如，隔週或隔三週（例如，以使得患者接受约 二至約二十或例如約六個劑量的抗體）。初始可投與較高 負荷的劑量，繼之投與一或多種較低的劑量。例示性給藥 方案包含初始投與負荷約4 mg/kg之劑量、繼之投與約2 mg/kg之每週維持劑量的抗體。然而，可使用其他給藥方 案。此治療之進行易藉由習知技藝及檢定監視。 製品
在本發明之另一態樣中，提供含有適用於治療、預防及/ 或診斷上述病症之物質的製品。該製品包含一容器及與該 容器關聯之標記或内頁說明。適當的容器例如包括瓶子、 小瓶、庄射器等。容器可由諸如玻璃或塑料之各種材料形 成。容器容納單獨或當與另一種組合物組合時有效治療、 預防及/或診斷病狀的組合物，且可具有無菌接觸孔（例 如，容器可為靜脈内溶液包或具有可藉由皮下注射針刺透 之瓶塞的j瓶）。組合物中至少一種活化劑為本發明之抗 體°己或内頁說明書係指示該組合物用於治療所選病 狀。此外，該製品可包含（&)内含組合物的第一容器，其中 該、、且a物包§本發明之抗體；及（b)内含組合物的第二容 器其中忒組合物包含另一種細胞毒性劑或治療劑。本發 明之實施例中的製品可另外包含内頁說明書，該内頁說明 曰才g示、、且a物可用於治療特定病狀。或者，或此外，該製 品可另外包含第二（或第三）容器，該容器可包含醫藥學I 118226.doc -127- 200804418 可接受之緩衝劑，諸如注射用之抑菌水（BWFI)、磷酸鹽緩 衝鹽水、Ringer氏溶液及葡萄糖溶液。它另外可包括商業 上及使用者所需要的其他物質，包括其他缓衝劑、稀釋 劑、過濾器、針及注射器。 如下為本發明之方法及組合物的實例。應瞭解，結合上 文所提供之一般說明，可實施其他各種實施例。 實例 實例1 :抗-RELT單株抗體之產生及特徵鑑定 (a)文庫篩選 如上所述篩選能夠結合RELT-Fc融合蛋白的表現人源化 Fab’2文庫之嗤菌體呈現純系（Lee等人，J· Mol. Biol· 340 : 1073-1093 (2004)及美國專利申請公開案第2005-0106667)。 噬菌體呈現抗體文庫在所有三個重鏈CDR中含有隨機化胺 基酸，且係基於人源化抗體4D5。一般重鏈及輕鏈可變區 一致框架分別闡述於圖1及2中，且4D5抗體之框架區闡述 於圖3中。4D5框架序列之某些變異體亦已知，如圖4中所 示。 四輪選擇之後，分離八個陽性純系。噬菌體Fabf2純系藉 由PCR擴增有關片段且將其接合入IgGl結構以產生完整人 類IgGl來重組。接著自CHO細胞上清液中純化八個抗_ RELT mAb且以生物素（Pierce)標記。八個CHO細胞株產量 大小不等（約 8,000 ng/mL至約 18,000 ng/mL)，mAb H7產生 量最低而mAb F4產生量最高。 各mAb之重鏈及輕鏈已經定序。重鏈之CDR呈現於圖5 118226.doc -128 - 200804418 中。各mAb之輕鏈與經修飾之人類單株抗體4D5_8(SEQ ID NO: 2)之輕鏈序列一致。 (b)抗-RELT mAb之特徵鑑定 (1) 在細胞表面結合 評價各種抗體在細胞表面與表現RELT之細胞的結合。 將經模擬物（對照物）或鼠RELT cDNA轉染的幼小倉鼠腎 (BHK)細胞分別用各種抗-RELT抗體在冰上著色30分鐘。 將細胞用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)洗滌且隨後用PE標記之抗-人類IgG抗體培育。藉由FACSCalibur(BD Science)、繼之 用Cell Quest(BD Science)分析法評價細胞的螢光強度。 八種抗體沒有一種特定結合對照BHK細胞，而是各種抗 體特定結合經RELT cDNA轉染的BHK細胞（參見圖6)。亦 使用上文針對BHK細胞轉染及結合所述之相同方案觀測八 種抗體中五種（F4、CIO、H7、H9及H11)與表現RELT之小 鼠脾細胞的特定結合（圖7)。該三種最強結合小鼠RELT表 現脾細胞的抗-RELT mAb(H7、H9及H11)不結合獲自μ" _八 小鼠的小鼠脾細胞（圖7，底列）。 (2) 抗-RELT抗體與NF-kB激活的關係 評價抗-RELT抗體對NF-κΒ激活於細胞中的作用。將
HEK293細胞用指定劑量之RELT-xedar cDNA轉染（鼠RELT 之細胞外域及xedar之細胞質域）。12小時後，將各種抗-RELT抗體添加至濃度為1〇 pg/mL的各別培養液中，且將 細胞進一步培育24小時。螢光素酶活性藉由雙報導檢定套 組（Dual-Luciferase® Reporter Assay Systems)(Promega)s： 118226.doc -129- 200804418 測。每種抗-RELT抗體均以劑量依賴方式刺激NF-κΒ產生 於細胞中（圖8)，儘管程度不同。對F4抗-RELT抗體觀測到 最小激活（對於5 ng RELT-xedar為約7倍，且對於25 ng RELT-xedar為約22倍），且對CIO、H9及Hll mAb觀測到最 強激活（對於5 ng RELT-xedar為約20倍且對於25 ng RELT- xedar 為約 50-60 倍） (3)抗-RELT抗體對鼠RELT的親和力 為測定各種抗-RELT抗體對RELT的親和力，在滴定量之 鼠RELT存在下，對各個純系執行基於噬菌體之競爭性結 合各種固著抗-RELT抗體的ELISA檢定。將96孔Maxisorp 免疫滴定板（NUNC)在4°C下用濃度為2 pg/mL之鼠RELT(於 PBS中）塗佈隔夜，且在室溫下用含有0.5% BSA及0.05% Tween 20(’’ΡΒΤΠ)的PBS阻斷2小時。在室溫下，將於PBT 中連續稀釋之噬菌體呈現抗-RELT抗體在塗有抗原之孔板 上培育15分鐘。將該等孔板用含有0.05% Tween 20("PBST”）的PBS洗滌。結合嗤菌體用1:5000稀釋於PBT中 之經辣根過氧化酶（Amersham Pharmacia)標記的抗-Ml3單 株抗體偵測，且用3,3’，5,5’_四甲基聯苯胺底物（TMl Kirkegaard & Perry Labs，Gaithersburg，MD)培育約 5 分 鐘，用1.0 Μ H3PO4中止，且用450 nm分光光度計讀取。 抗體親和力的範圍為4 nM(對於mAb H11)至250 nM(對於 mAb H7)，如表B中所示。 118226.doc -130- 200804418 表B :抗-RELT抗體親和力數據 純系# Kd(M) C2 8xl〇·8 C10 2xl〇·8 E5/E7 1 x ΙΟ-7 F4 IxW1 F5 1 x ΙΟ*7 H7 2.5 x ΙΟ"7 H9 4χ ΙΟ'8 H11 4χ1〇·9 (4) BIAcor,分析 抗-RELT單株抗體H11對RELT的親和力另外藉由表面電 漿共振（SRP)分析、使用 BIAcore⑧ 3000(BIAcore，Inc·， Piscataway，NJ)評價。根據供應商說明書，用N-乙基-Ν’-(3-二甲基胺基丙基）-碳化二醯亞胺鹽酸鹽（EDC)及Ν-羥基 丁二醯亞胺（NHS)將羧甲基化葡聚糠生物感應器晶片（CM5, BIAcore Inc.)激活。抗-RELT抗體 Η11 用 10 mM 乙酸鈉（pH 4.8)稀釋至5 pg/mL之濃度。將所稀釋之H11抗體以5微升/ 分鐘之流速注射在衍生化之CM5晶片表面上，直至約500 個響應單元（RU)之抗體與流動細胞表面偶合。未反應基團 藉由注射1 Μ乙醇胺阻斷。在25 °C恆溫下，將連續稀釋於 含有 0.05% Tween 20 之 PBS 中之鼠his 標記 RELT(7.5 nM 至 5 00 nM)以25微升/分鐘之流速注射在固著H11之流動細胞 上。締合速率（kon)及解離速率（koff)可使用簡單的一比一朗 缪爾（Langmuir)結合模型（BIAcore Evaluation Software 3.2 版）由所觀測之結合曲線獲得。平衡解離常數（Kd)按比率 k0ff/kon計算。抗-RELT抗體H11-小鼠RELT相互作用之速率 118226.doc -131 - 200804418 係如下·· kon ·· 1.52x105 M-Y1 ; kQff ·· 1.24xl(T3 s·1 ;及 Kd : 8·13χ10·9 Μ。 (5)抗-RELT抗體與人類RELT之交叉反應性 評價HI 1抗-RELT抗體特定識別人類RELT的能力。將 HEK293細胞用對照載體或人類RELT cDNA轉染。培育48 小時後，收穫所轉染之細胞且用經結合生物素之抗-RELT 抗體H11在冰上著色30分鐘。將細胞用PBS洗滌，且用抗 生物素蛋白_PE及指定FITC-標記抗體或APC-標記抗體著 色。細胞之螢光強度藉由FACS分析（FACSCalibur(BD Science))、繼之藉由 CellQuest 分析（BD Science)來評價。 如圖10A及10B中所示，抗體H11特定識別人類RELT(將圖 10八與圖1〇]3對比）。 實例2 :免疫細胞上RELT之表現 抗-RELT抗體HI 1可用作鑑定RELT在獲自小鼠之不同野 生型免疫細胞（包括T細胞、B細胞及脾細胞）上表現之程度 的工具。將獲自C57/BL6小鼠脾之T細胞藉由磁粒 (Miltenyi)純化，且用抗-CD3及抗_(：〇28(10畔/111[)、1卩1^ a(100ng/mL)、IFN-y(1〇〇ng/mL)、IL-2(100U/mL)、IL-4(100 ng/mL)、iL_6(1〇〇 ng/mL)或 IL-12 及 IL-18(100 ng/mL)培養钟小時以誘導分化成不同τ細胞亞型（參見圖 U) °接著將細胞用經結合生物素之抗-RELT抗體H11在冰 上培育30分鐘。將細胞用PBS洗滌且用抗生物素蛋白-PE培 、、、跑的螢光強度藉由FACSCalibur(BD Science)、繼之 CeU Quest分析（BD Science)來評價。抗體H11特定結合天 118226.doc -132- 200804418 然T細胞及各種經處理之T細胞群，表明T細胞及分化T細 胞表現RELT。 將獲自C57/BL6小鼠脾的Β細胞藉由磁粒（Miltenyi)純化 且用抗-IgM(10 pg/mL)、抗-CD40(10 pg/mL)、LPS(10 pg/mL)或IL-4(100 ng/mL)培養48小時以誘導分化成不同Β 細胞群（參見圖12)。接著將該等細胞用經結合生物素之抗-RELT抗體H11在冰上培育30分鐘。將細胞用PBS洗滌且用 抗生物素蛋白-PE培育。細胞之螢光強度藉由 FACSCalibur(BD Science)、繼之 CellQuest 分析（BD Science)來評價。抗體H11並未特定結合天然B細胞或任一 種經處理之B細胞群，表明B細胞以及分化B細胞皆不表現 RELT。 自C5 7/BL6小鼠中分離出脾細胞，且用經結合生物素之 抗-RELT抗體H11在冰上著色30分鐘。將該等細胞用PBS洗 滌且用抗生物素蛋白-PE以及指定FITC-標記抗體或APC-標 記抗體（抗-CD3、抗-B220、抗-CDllb及/或抗-Gr-Ι)著色。 細胞之螢光強度藉由FACSCalibur(BD Science)、繼之Cell Quest分析（BD Science)來評價。該等結果展示於圖13中。 抗體HI 1結合T細胞及巨噬細胞，說明彼等細胞群表現 RELT。經觀測，H11對B細胞、NK細胞或嗜中性白細胞之 結合並不強，說明彼等細胞群不表現RELT。 實例3 : RELT在小鼠中之靶向分裂及RELT分裂對免疫細 胞形成的影響 (a)繁殖RELT分裂小鼠 118226.doc -133- 200804418 用設計成能移除外顯子II-V、編碼RELT之胺基酸17-210 的靶向載體繁殖缺RELT小鼠（參見圖14A)。靶向載體使用 自129/SvJ文庫（Incyte Genomics)中分離的基因組relt純系 建構且電穿孔送入129 R1胚幹（ES)細胞。雜合ES細胞純系 18B7藉由南方墨點法鑑別且微注射入C57BL/6N胚囊中。 將嵌合後代與C57BL/6N小鼠逆代雜交。小鼠保留PGK-neo 選擇卡匣。生殖系relt分裂藉由PCR、南方墨點法（圖14B) 及流式細胞分析T淋巴細胞（圖11C)來確認。PCR使用 Expand Long Template PCR System套組（Roche)、5’引子 AGTAGAAGGTGGCGCGAAGG(SEQ ID NO: 69)及 3,引子 CTGCCCACAGACAAGATGGTAATCTC(SEQ ID NO: 70) > 按照製造商說明書執行。南方墨點法藉由將經Ssp I-消化 之DNA及經Not I-消化之DNA與圖14A中展示之探針雜 交、使序列5’結合靶向結構來執行。圖14B中所觀測之12.9 及7.1-kb DNA片段分別對應於野生型等位基因及突變體 relt等位基因。流式細胞分析如以上實例1(b)(1)中所述來 執行。 relt分裂小鼠能生存、能繁瘦及以期望Mendelian頻率生 育。所有後續實驗使用Genentech機構審查委員會 (Genentech institutional review board)所批准之方案、使用 6週齡至14週齡relt-Λ及relt+/+小鼠執行。 (b)對T細胞、B細胞及NK細胞形成於RELT分裂小鼠 中的分析 天然T淋巴細胞已知可表現RELT(參見圖11、圖15B)。 118226.doc -134- 200804418 因此調查relt-/- T淋巴細胞的特性。將relt-/-小鼠及relt+/+ 小鼠之脾切碎且用1 mg / mL之膠原酶A(Roche)消化，如先 前所報導（Nakano 等人，J. Exp. Med. 194: 1171-1178 (2001))。對於表面RELT表現之流式細胞分析，脾細胞係 藉由用20 mM EDTA-PBS培育30分鐘以避免蛋白水解作用 降解抗-RELT mAb抗原決定基來製備。將細胞用抗-CD16/32(2.4G2)阻斷，接著用以下抗體之各種組合雙重或 三重著色·· CD3(145-2C11)、CD4(RM4-5)、CD8(53-6.7)、 CDllb(Ml/70)、CDllc(HL3)、CD45RB(16A)、CD80(IG10)、 CD86(GL1)、Ι-Αϊ)(ΑΡ6·120·1)、B220(RA3-6B2)及DX5(全部獲自 BD PharMingen)。經結合生物素之抗體結合係藉由添加抗 生蛋白鏈菌素-PE(BD Pharmingen)來揭示。蛾化丙唆係用 於除去死細胞。細胞係使用FACS Caliber系統（BD Science) 分析。 未觀測到在relt-/-小鼠與relt+/+小鼠之間，脾免疫細胞 中T細胞的數量或其比例表述有明顯差異。在relt-/-小鼠與 relt+/+小鼠之間，胸腺、淋巴結及脾中的T細胞數量係可 比較的（參見圖15A)。流式細胞分析經CD4、CD8、CD25 及CD44抗體著色的細胞揭示各種大量的T細胞亞型沒有差 異（參見圖15C)。 藉由氚標記胸腺啶結合檢定來評價relt-Λ細胞與relt+/+ 細胞中T淋巴細胞增殖響應抗-CD3。獲自野生型小鼠及 relt-Λ小鼠之經純化之T細胞單獨用指定量之抗-CD3抗體 培養（圖15D，左圖），或用指定量之抗-CD3抗體連同塗於 118226.doc -135- 200804418 孔板之濃度為10 i^g/mL之抗-CD28抗體（於塗潰溶液中）培 養（圖15D，右圖）。細胞響應抗體或諸抗體之增殖係藉由 [3H]-胸腺咬結合（參見 Coligen等人編，Current Protocols in Immunology，New York: Wiley，1991)量測。該等結果展示 relt·/- T細胞與野生型T細胞的增殖類似。該等relt-Λ及 relt+/+ Τ淋巴細胞在IL-2及IFN-γ之產生中亦未呈現差異。 綜合而言，以上所有檢定之結果說明正常T細胞形成及增 殖不需要RELT。 .B淋巴細胞及天然殺手（NK)細胞在細胞表面幾乎不表現 RELT(若有）（圖15B中間圖及右圖、圖12及圖13)。如藉由 流式細胞分析量測，relt-/-小鼠及relt+/+小鼠之脾中的B淋 巴細胞與NK細胞數目相似（圖15A)。對獲自骨髓、脾、淋 巴結及腹膜腔、經 CD25、CD44、B220、IgM、CD5、 CDllb、CD21、CD23及CD43抗體著色後之細胞的廣泛流 式細胞分析揭示，在relt-Λ與relt+/+小鼠之間無差異。該 等結果說明RELT在體液免疫中不起關鍵作用。 (c)對RELT-分裂小鼠中產生抗體的分析 評價小鼠以判定一或多種抗體亞型之產生是否因relt分 裂減弱。將Relt-Λ及relt+/+小鼠用T細胞依賴型抗原2,4-二 硝基酚結合卵清蛋白（DNP-OVA)免疫。製備兩毫升含有 0.1% 氫氧化鋁吸附凝膠（#8000-01，Intergen Company)及 PBS中之0.09975 mg/mL DNP-OVA溶液的注射溶液，且將 溶液混合30分鐘以確保抗原被鋁有效吸附。在第0日用1〇〇 μί注射溶液腹膜内使野生型小鼠及relt敲出小鼠（各體重約 118226.doc -136- 200804418 20 g)免疫，且在第10日用第二次100 pL注射液激發。在第 0曰及第14週自所注射之小鼠中採集血清樣本，且在塗有 DNP-BSA多孔板上使其經受ELISA分析以便獲得具體的抗 體效價。抗原特異性IgGl、IgG2a、IgG3、IgM及IgE抗體 之當量係由兩小鼠群產生（參見圖16A-16E)，說明RELT在 體液免疫形成中不起關鍵作用。 (d)對RELT分裂小鼠中樹突狀細胞形成之分析 未觀測到缺少RELT時T細胞、B細胞及NK細胞形成有明 顯異常。因此，檢查其他的免疫細胞群，尤其樹突狀細 胞。如同上述，將relt-/-及relt+/+小鼠之脾切碎且用1 mg/mL膠原酶A(Roche)消化。使用經結合生物素之抗 CD1 lc及抗生物素MACS珠粒（Miltenyi)鑑別樹突狀細胞。 膠原酶處理之脾細胞經CD 11c抗體著色（樹突狀細胞之表面 標記）揭示，與relt+/+同窩對照小鼠相比，relt_/_小鼠中之 樹突狀細胞群明顯更大（圖17A)。relt-/-小鼠中之樹突狀細 胞數多亦可藉由統計分析來證明（圖17B)。 0011〇+0(：基於00111}及8220之細胞表面表現可分為兩 類亞群：cDC(CDllb+B22(T)及 pDC(CDllb-B220+)(Hochrein 等 人，Hum. Immunol· 63: 1103-10 (2002) ; Nakano等人，了· Exp· Med· 194: 1171-8 (2001); Asselin-Paturel等人，Nat· Immunol· 2: 1144-50 (2001))。如上所述製備之脾細胞用經 結合生物素之抗-CDllb及抗-B220著色，且用MACS珠粒 (Miltenyi)排除以富集 pDC 及 cDC。使用 FACS Vantage(BD Science)分選器進一步純化pDC(CDllc+B220+)群及 118226.doc -137- 200804418 cDC(CDllc+B220_)群。流式細胞分析及細胞計數表明relt-/-小鼠具有的脾pDC數目是relt+/+小鼠的約兩倍（圖3A及 3B)。relt+/+小鼠脾cDC數目與relt-/-小鼠脾cDC數目之間 不存在統計學上顯著差異（圖3A及3B)，儘管pDC與cDC上 的RELT表現可藉由流式細胞分析偵測到（圖3C)。發現relt-/-小鼠胸腺中的pDC比relt+/+小鼠中多約1.8倍。 為證明所擴展之CD1 lc+B220+CDl lb·群在relt-/-脾細胞中 代表’’典型flpDC，將 relt·/-及 relt+/+ CD11C+B220 +脾細胞在 經 MHC II 類抗體（pDC 標記 CD45RB)(Hochrein等人，Hum. Immunol. 63 :1103-10 (2002) ; Asselin-Paturel 等人，Nat. Immunol. 2: 1144-50 (2001))或共激活分子（諸如 CD80 或 CD86)著色之後藉由流式細胞術分析（圖17D)。獲自relt-/-小 鼠及relt+/+小鼠的CD11C+B220+細胞表現相似量之彼等表 面標記’說明relt_/_小鼠確實具有大量pDC。 (e)對RELT分裂小鼠中CDllc+MHCir細胞之分析 周圍血液CDllc+MHCir細胞經證明具有分化成pDC的潛 能（del Hoyo等人，Nature 415: 1043-7 (2002))。因此調查 relt-/-小鼠中的彼pDC前體群。如圖18A中所示，relt·/-小 鼠中的CDllc+MHC ΙΓ亞型比relt+/+小鼠多約3倍。此結果 說明relt-Λ小鼠中之pDC分化在周圍血液pDC前體階段或比 周圍血液pDC前體階段更早受到影響。流式細胞分析揭示 CDllc+MHC ΙΓ細胞上之微量而顯著之RELT表現（圖 18B)。 118226.doc -138- 200804418 實例4 : RELT分裂小鼠中IFN-α之表現 在作為抗原呈遞細胞之角色中，pDC在遇到未甲基化病 毒或細菌DNA時會產生大量IFN-α。類似地，在感染小鼠 的過程中，鼠細胞巨大病毒（MCMV)優先結合pDC上之Toll 樣受體9，且導致IFN-a之產生（Dalod等人，J· Exp· Med· 195:517-528 (2002) ; Asselin-Paturel等人，Nat. Immunol· 2 ： 1144-1150(2001) ; Krug 等人，Immunity 21:107-119 (2004))。為判定RELT是否影響正常的pDC功能，量測獲自 relt-/-或relt+/+小鼠之脾細胞所產生的IFN-α。將獲自relt-/-小鼠或relt+/+小鼠岛脾細胞用未甲基化之硫代磷酸酯主鏈 D-型 CpG-ODN(D19, GGTGCATCGATGCAGGGGGG(SEQ ID NO : 71))培養且如先前所述量測（Hemmi等人，J· Immunol. 170: 3059-64 (2003) ; Krug 等人，Eur. J·
Immunol· 31: 2154-63 (2001)) 0 源自 relt>/-之脾細胞分泌的 IFN-α比源自relt+/+之脾細胞的多4倍（圖19，左圖）。與 relt+/+培養物相比，IFN-α分泌增多與relt-/-培養物中之 pDC數量增加一致（參見圖17B)。由於在刺激之前，脾細胞 被耗盡CD1 lc+樹突狀細胞而無法偵測到IFN-a，因此IFN-a 分泌於彼等脾細胞培養物中係歸因於樹突狀細胞（圖19， 左圖）。當比較相等數量的pDC時，就IFN-(x產生而言，在 源自relt-/-之脾細胞與源自relt+/+之脾細胞之間不存在差 異（圖19，右圖）。按照上述報導（Hemmi等人，J. Immunol· 170，3059-64 (2003))，用 CpG-ODN 刺激經純化之 CDllc+B220_cDC可產生極少的IFN-a(圖19，右圖），此與 118226.doc •139- 200804418 為彼細胞激素之主要來源的pDC —致。因此，RELT對於藉 由pDC之正常IFN-α產生似乎為不必要，且在relt-/-小鼠中 所觀測之擴展CD11C+B220+群包含IFN-a-產生pDC。 實例5 : RELT分裂之骨髄細胞之分析 調查RELT缺乏對骨髓細胞的影響。使野生型小鼠及relt-/-小鼠暴露於單次10 Gy劑量之完全軀體輻射。接著給所照 射之小鼠靜脈内注射4xl06個獲自未處理之relt+/+小鼠及 relt-/-小鼠的骨髓細胞。8週之後分析嵌合小鼠中的樹突狀 細胞群。計算重組受體動物中脾pDC數及周圍血液 CDllc+MHC ΙΓ細胞數。不論受體（relt-Λ或relt+/+)之基因 型，Relt-/-供體骨髓細胞總是產生比relt+/+供體骨髓細胞 更多的CDllc+MHCir細胞及pDC(圖20)。相比之下，當野 生型供體細胞用於接種relt-Λ或relt+/+受體時，產生等數 量的pDC及CDllc+MHC ΙΓ細胞（圖20)。該等結果說明relt-/-小鼠中經擴展之pDC及CDllc+MHC ΙΓ群反映了 骨 髓衍生細胞中的細胞自主缺陷。 先前細胞轉移研究說明pDC可由淋巴樣祖細胞與骨髓内 之體樣祖細胞分化而來（Shigematsu等人， (2004)) 。 因此， pDC上所 表現之RELT及 /或彼等 祖細胞 群可直接調節樹突狀細胞個體發生。T細胞為表現RELT配 位體及抑制pDC形成的候選者。將人類周圍血液T細胞在 各種刺激劑存在下培養24小時，且接著利用標記蛋白使其 經受FACS分析，該標記蛋白包括與人類IgGl Fc區（可溶性 RELT_Fc)融合之人類RELT的細胞外域（胺基酸1-128，具有 118226.doc -140- 200804418 如下序列： MKPSLLCRPLSCFLMLLPWPLATLTSTTLWQCPPGEEPDLD PGQGTLCRPCPPGTFSAAWGSSPCQPHARCSLWRRLEAQV GMATRDTLCGDCWPGWFGPWGVPRVPCQPCSWAPLGTH GCDEWGRRA (SEQ ID NO: 72))。經 PMA 及離子黴素 (ionomycin)刺激之人類T細胞特定（儘管較弱）結合人類 RELT融合蛋白，與先前報導一致（Sica等人，Blood 97: 2702-2707 (2001)) ° 【圖式簡單說明】 圖1A及圖1B及圖2描繪用於實施本發明之例示性受體人 類一致性框架序列，序列識別符係如下： 重鏈可變區（VH)—致性框架（圖1A及圓1B) 缺Kabat CDR之人類VH亞群I一致性框架（SEQ ID NO: 3、73、74、75) 缺擴展高變區之人類VH亞群I一致性框架（SEQ ID NO: 4-6 、 76-78 、 79-81及82-84) 缺Kabat CDR之人類VH亞群II一致性框架（SEQ ID NO: 7 ' 85 ' 86 、 87) 缺擴展高變區之人類VH亞群II 一致性框架（SEQ ID NO: 8-10 、 88-90 、 91-93 、 94-96) 缺Kabat CDR之人類VH亞群III 一致性框架（SEQ ID NO: 11 、 97 、 98 、 99) 缺擴展高變區之人類VH亞群III 一致性框架（SEQ ID NO: 12-14、 100-102、 103-105、 106-108) 118226.doc -141- 200804418 缺Kabat CDR之人類VH受體框架（SEQ ID NO: 15、 109 、 110 、 111) 缺擴展高變區之人類VH受體框架（SEQ ID NO: 16-17、 112-114 、 115-117) 缺Kabat CDR之人類VH受體2框架（SEQ ID NO: 18、 118 、 119 、 120) 缺擴展高變區之人類VH受體2框架（SEQ ID NO: 19-21、 121-123 、 124-126 、 127-129) 輕鏈可變區（VL)—致性框架（囷2) 人類 VL κ亞群 I一致性框架（SEQ ID NO: 22、130、131、 132) 人類VL κ亞群II 一致性框架（SEQ ID NO: 23、133、 134 、 135) 人類VL κ亞群III一致性框架（SEQ ID NO: 24、136、 137 、 138) 人類VL κ亞群IV—致性框架（SEQ ID NO: 25、139、 140 、 141) 圖3描繪huMAb4D5-8輕鏈及重鏈之框架區序列。上標/ 粗體編號表示根據Kabat之胺基酸位置。 圖4描繪huMAb4D5-8輕鏈及重鏈之經修飾/變異框架區 序列。上標/粗體編號表示根據Kabat之胺基酸位置。 圖5A及5B展示如實例1(A)中所述之抗-RELT抗體分子之 重鏈HVR環序列。該等圖式展示重鏈HVR序列HI、H2及 H3。胺基酸位置係根據如下所述之Kabat編號系統編號。 118226.doc -142- 200804418 圖6展示抗-RELT抗體與不表現（"BHK”）或表現 ("mRELT/ΒΗΚ’，）小鼠RELT之幼小倉鼠腎（ΒΗΚ)細胞在細胞 表面結合之FACS分析結果，如實例1(b)(1)中所述。 圖7展示抗-RELT抗體與不表現（”-Λ”）或表現（”+/+”）小鼠 RELT之脾細胞在細胞表面結合之FACS分析結果，如實例 1(b)(1)中所述。 圖8描繪NF-κΒ激活在經relt-xedar轉染且經各種抗-RELT 抗體處理之細胞中之激活度，如實例1(b)(2)中所述。 圖9描繪在高解析度BIAcore®分析期間所觀測之各種濃 度之抗-RELT抗體HI 1與小鼠RELT之間的結合作用，如實 例1(b)(4)中所述。 圖10描繪證明抗-RELT抗體H11與293細胞表面處所表現 之人類RELT特定結合的FACS分析，如實例1(b)(5)中所 述。 圖11描繪結合不同T細胞群之抗-RELT抗體H11之FACS 分析結果，證明各T細胞群在細胞表面表現RELT，如實例 2中所述。 圖12描繪結合不同B細胞群之抗-RELT抗體H11之FACS 分析結果，證明B細胞群中沒有一個被H11抗體結合，如 實例2中所述。 圖13描繪結合脾細胞之抗-RELT抗體Η11之FACS分析結 果，證明Τ細胞及巨噬細胞在細胞表面表現RELT，如實例 2中所述。 圖14A-C描繪RELT缺乏小鼠之產生，如實例3(a)中所 118226.doc •143- 200804418 述。圖14A展示侧面為MxiM立點的PGK-neo選擇卡匣，該 等/似戶位點用於置換小鼠RELT外顯子II至V(編碼胺基酸 17-209)。圖14Β描繪獲自〜/i+/+、八及re/i-八小鼠之 基因組DNA之南方墨點法分析，如實例3(a)中所述。圖 14C展示表面RELT表現於獲自N/i+/+(f，WT，’）及reb八小鼠 之T細胞上之流式細胞分析結果。兩圖中之最左邊曲線（粗 體）表示藉由對照抗體著色，而最右邊曲線表示藉由RELT-特異性mAb H11著色。 圖15A-15D描繪設計成可判定RELT是否為小鼠中之正常 T細胞、B細胞及NK細胞形成所需之實驗的結果，如實例 3(b)中所述。圖15A展示獲自10週齡野生型及rW/V-小鼠之 脾細胞之流式細胞分析結果。數值表示各基因型之10隻小 鼠之平均土標準偏差。T細胞經鑑定為CD3+IgM-B22(TDX5-細胞。B細胞經鑑定為CD31gM+B220+DX5_細胞。NK細胞 經鑑定為CD3-IgNTB22(rDX5 +細胞。圖15B描繪RELT在如 圖15 A中所鑑定之T細胞、B細胞及NK細胞上之表現。各 圖中之最左邊曲線（粗體）表示藉由對照mAb著色，而最右 邊曲線表示藉由RELT-特異性mAb H11著色。圖15C描繪獲 自野生型（"WT")及re/i-/-小鼠之胸腺細胞之流式細胞分 析。陽性細胞之百分比展示於各象限内且代表各基因型之 五隻小鼠。圖15D之圖描繪對純化T細胞之[3H]-胸苷結合 檢定之結果，該等純化T細胞獲自暴露於單獨抗-CD3抗體 (左圖）或暴露於抗-CD3抗體與抗-CD28抗體之野生型及 π/ί-/-小鼠，證明RELT並非為T細胞增殖所必需的。 118226.doc -144- 200804418 圖16A-16G描繪判定分裂小鼠中reh對彼等小鼠在經免疫 原激發後產生抗體亞型之作用的實驗結果，如實例3(幻中 所述。 圖17A-D描繪判定REL 丁去除對小鼠中之樹突狀細胞群之 作用的實驗結果，如實例3(d)中所述。圖17A展示1〇週齡 野生型及π/ί-八小鼠中之脾樹突狀細胞亞型之流式細胞分 析結果。繪圖表示全部脾細胞之CDllc著色（左圖）或在電 子選通選定CDllc+細胞後之CDllb&B22〇著色（右圖）。該 等結果代表各基因型之10隻小鼠。圖173按照總細胞數與 百分比展示每組10隻小鼠中之pDC(CDllc+B220+CDllb·) 及cDC(CDllc B220 CDllb+)之平均土標準偏差。圖17c展 示pDCs及cDCs上之RELT表現之流式細胞分析結果。各圖 中之最左邊曲線（粗體）表示藉由對照mAb之結合，而最右 邊曲線表示藉由抗-RELT抗體HI 1之結合。圖17D描繪結合 獲自野生型（最左邊曲線）或re"-/-(最右邊粗體曲線）小鼠之 CDllc B220+細胞之抗- CD45RB、I_A、CD80 或 CD86 抗體 的流式細胞分析結果。實心直方圖描緣與對照抗體之結 合。 圖18A及18B描繪評價RELT分裂對CDllc+MHC ΙΓ pDC 祖細胞群之作用的實驗結果，如實例3(e)中所述。圖18A 描繪獲自10週齡野生型及八小鼠之周圍血液之流式細 胞分析結果。所示為各基因型之1〇隻小鼠中之CD 11 c+1-A-細胞之平均百分比土標準偏差。圖18b描繪MHC ΙΓ DC前體 細胞上之細胞表面RELT表現之流式細胞分析結果。最左 118226.doc •145- 200804418 邊曲線（粗體）表示對照抗體之結合，而最右邊曲線表示抗-RELT抗體H11之結合。 圖19描繪評價由野生型及〜卜八細胞群產生ΙρΝ_α的實驗 結果，如實例4中所述。圖19展示IFN_a自獲自1〇週齡野生 型及re/i-八小鼠之脾細胞（左圖）或純化pDC及cDC(右圖）產 生’ δ亥4小鼠經指示劑量之CpG-〇DN培養24小時。數值表 示各基因型之七隻小鼠的平均士標準偏差。 圖20描繪評價RELT缺失對骨髓源細胞之影響的實驗結 果’如實例5中所述。給經致死性照射之野生型及reh_"小 鼠靜脈内注射未處理之野生型及八骨髓。八週後，藉 由流式細胞術分析獲自嵌合小鼠的脾細胞及血細胞。資料 表示獲自各基因型之七隻小鼠之脾pDC(CDllc+B220+CDllb·) 及周圍血液MHC ΙΓ DC前體細胞（CDllc+Ι-Α-)的平均百分 比士標準偏差。 118226.doc 146-

Claims (1)

  1. 200804418 十、申請專利範圍： 1· 一種特定結合rELT的分離抗體。 2·如睛求項1之抗體，包含至少一種分別選自seq id NO: 42-49、51-58 及 60-67 中任一者之 HVR-H1、HVR-H2 及 HVR-H3中的高變（HVR)序列。 3·如睛求項2之抗體，包含至少一種選自HVR-H1、HVR-H2、HVR_H3中的序列，其中HVR_H1包含胺基酸序列a bcdefghij，其中胺基酸a為甘胺酸；胺基酸b為苯丙 胺酸；胺基酸c為羥丁胺酸；胺基酸d為異白胺酸；胺基 酸e係選自羥丁胺酸、絲胺酸及天冬醯胺；胺基酸f係選 自天冬醯胺、甘胺酸、絲胺酸及天冬胺酸；胺基酸g係 選自經丁胺酸、絲胺酸及天冬醯胺；胺基酸匕係選自色 胺酸、酪胺酸及絲胺酸；胺基酸i為異白胺酸；且胺基酸 j為組胺酸，其中HVR-H2包含胺基酸序列k 1 m η 〇 p qr S t u V w x y z a’ b’，其中胺基酸k係選自甘胺酸及丙胺 酸；胺基酸1係選自苯丙胺酸、精胺酸、色胺酸、甘胺 酸、天冬醯胺及酪胺酸；胺基酸m為異白胺酸；胺基酸η 係選自絲胺酸、酿胺酸、經丁胺酸及天冬醯胺；胺基酸 〇為脯胺酸；胺基酸ρ係選自絲胺酸、天冬醯胺、酪胺酸 及丙胺酸；胺基酸q係選自甘胺酸、天冬醯胺、天冬胺 酸及絲胺酸；胺基酸r為甘胺酸；胺基酸s係選自酿胺 酸、天冬醢胺、天冬胺酸及絲胺酸；胺基酸t為經丁胺 酸；胺基酸u係選自天冬醯胺、酪胺酸及天冬胺酸；胺 基酸V為絡胺酸；胺基酸W為丙胺酸；胺基酸X為天冬胺 118226.doc 200804418 酸；胺基酸y為絲胺酸；胺基酸z為纈胺酸；胺基酸a，為 離胺酸；且胺基酸b，為甘胺酸；其中HVR-H3包含胺基酸 序列 c’ d’ e’ f’ g，h，i，j，k’ Γ πι’ η，〇, p，q，r« s，t，u，v，，其 中胺基酸c’係選自精胺酸及離胺酸；胺基酸d，係選自苯 丙胺酸、色胺酸、絲胺酸、甘胺酸、白胺酸及天冬胺 酸；胺基酸e’係選自白胺酸、天冬胺酸、丙胺酸、絲胺 酸及精胺酸；胺基酸f係選自絲胺酸、酪胺酸、甘胺 酸、色胺酸及組胺酸；胺基酸g’係選自天冬胺酸、異白 胺酸、白胺酸、丙胺酸、色胺酸及纈胺酸；胺基酸h，係 選自甘胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺、色胺酸、丙胺酸、 羥丁胺酸及組胺酸；胺基酸Γ係選自丙胺酸、甘胺酸、 甲硫胺酸、色胺酸、天冬胺酸及麩胺酸；胺基酸係選 自酪胺酸、色胺酸、天冬醯胺、纈胺酸、甘胺酸及麩胺 酸；胺基酸k’係選自丙胺酸、纈胺酸、甘胺酸、組胺 酸、麩胺酸及精胺酸；胺基酸1，係選自精胺酸、酪胺 酸、纈胺酸、苯丙胺酸及甘胺酸；胺基酸m，係選自天冬 胺酸、羥丁胺酸、甲硫胺酸、麩胺酸、酪胺酸及精胺 酸；胺基酸η1係選自酪胺酸、絲胺酸、麵胺酸、丙胺 酸、天冬胺酸及脯胺酸或不存在；胺基酸〇，係選自丙胺 酸、酷胺酸、甲硫胺酸、色胺酸及纈胺酸或不存在；胺 基酸ρ’係選自甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸及甘胺酸或不 存在；胺基酸q’係選自精胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸及天 冬胺酸或不存在；r，係選自酪胺酸及甲硫胺酸或不存 在；s’為顯胺酸或不存在；t，為甲硫胺酸或不存在；u，為 118226.doc 200804418 天冬胺酸且V’為路胺酸。 4·如請求項1之抗體，包含HVR-H1、HVR-H2及HVR_H3序 列’該等序列對應於圖5A及5B中對於純系C21、C10、 E5/E7、F4、F5、H7、H9及H11所述之彼等序列。 5·如請求項1之抗體，包含SEq id NO: 49之HVR-H1序 列、SEQ id NO: 58之HVR-H2序列及 SEQ ID NO: 67之 HVR-H3 序列。 6·如請求項2-5中任一項之抗體，另外包含選自SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2中的輕鏈高變序列。 7· 一種與如請求項1-6中任一項之抗體結合RELT上相同抗 原決定子的分離抗體。 8* 一種與如請求項1至7中任一項之抗體競爭結合RELT的分 離抗體。 9·如請求項1至5、7及8中任一項之抗體，其中該抗體特定 結合人類RELT。 I 0 ·如凊求項1至5、7及8中任一項之抗體，其中該抗體抑制 RELT與至少一種reLT配位體的結合。 II ·如请求項1至5、7及8中任一項之抗體，其中該抗體抑制 至少一種RELT介導之信號傳導途徑。 12·如請求項1至5、7及8中任一項之抗體，其中該抗體刺激 至少一種RELT介導之信號傳導途徑。 13 ·如请求項1至5、7及8中任一項之抗體，其中該抗體刺激 nf-kB自表現RELT之細胞中產生。 14·如請求項！至5、7及8中任一項之抗體，其中該抗體為 118226.doc 200804418 RELT之促效劑。 15·如明求項丨至5、7及8中任一項之抗體，其中該抗體為 RELT之拮抗劑。 16· —種編碼如請求項丨至9中任一項之抗體的核酸分子。 17· —種包含如請求項16之核酸的載體。 18· —種包含如請求項17之載體的宿主細胞。 19· 一種能夠產生如請求項丨至9中任一項之抗體的細胞株。 20· —種製備如請求項丨至9中任一項之抗體的方法，包含在 製備該抗體之條件下培養一包含編碼該抗體之核酸分子 的宿主細胞。 21· —種包含有效量之如請求項丨至13中任一項之抗體及醫 藥學上可接受之載劑的組合物。 22. —種在疑似含有RELT多肽之樣本中測定relt多肽之存 在的方法，包含將該樣本暴露於至少一種如請求項丨至9 中任一項之抗體以及測定該至少一種抗體與該樣本中之 RELT多肽的結合。 23· 一種至少一如請求項1至9中任一項之抗體在製備用於治 療患者體内因IFN_a所引起、加重或延續之疾病或病狀 之藥物中的用途。 24·如請求項23之用途，其中該疾病或病狀係因該患者體内 IFN-a含量較未患該疾病或病狀時之IFN_a含量低所引 起、加重或延續。 25·如請求項23之用途，其中該疾病或病狀係因該患者體内 IFN-a含量較未患該疾病或病狀時之IFN_a含量高所引 118226.doc 200804418 起、加重或延續。 26. —種可溶形式之RELT在製備用於治療患者之iFN_a相關 疾病或病狀之藥物中的用途。 27. 如請求項23-26中任一項之用途，其中該患者為哺乳動物 患者。 28·如請求項27之用途，其中該患者為人類。 29.如請求項23_26中任一項之用途，其中該疾病或病狀係選 自細胞增殖性病症、感染、免疫/炎性病症及干擾素相關 病症中之至少一者。 3〇_如請求項29之用途，其中該免疫/炎性病症係選自狼瘡、 哮喘及過敏性鼻炎。 31·如請求項29之用途，其中該感染係選自微生物感染、病 毒感染及真菌感染。 32·如請求項29之用途，其中該細胞增殖性病症係選自骨髓 餐月異常症候群（MDS)及癌症。 33. —種於活體外增大由CDllc+MHC π·細胞所產生之漿細 胞樣樹突狀細胞（pDC)相對於習知樹突狀細胞（cDC)之比 例的方法，包含抑制該等CDllc+MHC ΙΓ細胞中RELT之 表現。 34· —種於活體外增大由CD11c+mHC ΙΓ細胞所產生之漿細 胞樣樹突狀細胞（pDC)相對於習知樹突狀細胞（CDC)之比 例的方法’包含抑制該等CDllc+MHC ΙΓ細胞中RELT之 活性。 35·如請求項33或34之方法，其中抑制RELT表現或活性包含 118226.doc 200804418 破壞該等CDllc+MHC ΙΓ細胞中之RELT。 36·如請求項33或34之方法，其中抑制RELT表現或活性包含 將與RELT反義之寡核苷酸投與該等CDllc+MHC ΙΓ細 胞。 3 7·如請求項33或34之方法，其中抑制RELT表現或活性包含 將可抑制RELT結合其正常配位體之抗體投與該等 CDllc+MHC ΙΓ細胞。 3 8· —種於活體外降低由CD 11C+MHCII·細胞所產生之漿細胞 樣樹突狀細胞相對於習知樹突狀細胞之比例的方法，包 含刺激RELT在該等CD 11 c+MHCir細胞中之表現。 39. —種於活體外降低由CD 11 c+MHCir細胞所產生之漿細胞 樣樹突狀細胞相對於習知樹突狀細胞之比例的方法，包 含刺激RELT在該等CD 11 c+MHCir細胞中之活性。 40. 如請求項38或39之方法，其中刺激RJELT表現或活性包含 將激發RELT之抗體投與該等CD 11 c+MHCII·細胞。 41· 一種至少一種如請求項1至11及15中任一項之抗體在製 備一藥物中的用途，該藥物藉由抑制RELT在一哺乳動物 中之表現來增強該哺乳動物中IFN-α之產生。 42· —種至少一種如請求項1至11及15中任一項之抗體在製 備一藥物中的用途，該藥物藉由抑制RELT在一哺乳動物 中之活性來增強該喷乳動物中產生。 43·種至少一種如請求項1至9及12至14中任一項之抗體在 製備一藥物中的用途，該藥物藉由刺激RELT在一哺乳動 物之CDllc+MHC„-細胞中之表現來減弱該哺乳動物中 118226.doc 200804418 44. 45. 46. IFN-ct之產生。 一種至少一種如請求項1至9及12至14中任一項之抗體在 製備一藥物中的用途，該藥物藉由刺激RELT在一哺乳動 物之CDllc+MHCir細胞中之活性來減弱該哺乳動物中 IFN_a之產生。 :種至少一種如請求項1至15中任一項之抗體在製備一 某物中的用途，該藥物用於藉由彳貞測RELT在-哺乳動物 中之表現量來診斷與該哺乳動物中汀心含量異常相關 的疾病或病狀。 如月求項45之用途，其中該疾病或病狀係選自細胞增瘦 性病症、感染、免疫/炎性病症及干擾素相關病症中之至 少一者。 118226.doc 200804418 序列表 <11〇>美商建南德克公司 <120>用於靶向RELT之方法及組合物 <130> P2279R1 US <140> 096105340 <141> 2007-02-13 <150〉 US 60/772,911 <151> 2006-02-13 <160〉 141 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213>人類 <400> 1 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15 Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Asn 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75 Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 . 100 105 He Lys <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213>人類 <400〉 2 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15 Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75 Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90 Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 lie Lys 118226-seq.doc 200804418 PRT 人類 <210> 3 <211> 30 <212> <213> <400〉 3 Gin Val Gin Leu Val Gin Set Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 4 <211〉 25 <212> PRT 人類 <400> 4 Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213>人類 <400〉 5 Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210〉 6 <211> 25 <212> PRT <213>人類 <400> 6 Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 15 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 7 <211> 30 <212〉 PRT <213>人類 <400> 7 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser 20 25 30 <2J0> 8 <211> 25 <212> PRT <213>人類 <400> 8 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 15 10 15 Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 9 <211> 25 -2- 118226-seq.doc 200804418 <212> PRT <213>人類 <400〉9 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 15 10 15 Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213>人類 <400> 10 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 15 10 15 Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210〉 11 <211> 30 <212> PRT <213>人類 <400> 11 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213>人類 <400> 12 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 13 <211> 25 <212> PRT <213〉人類 <400> 13 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213>人類 <400> 14 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210〉 15 <211> 30 <212> PRT <213>人類 118226-seq.doc 200804418 <400〉 15 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys 20 25 30 <210> 16 <211〉 25 <212> PRT <213>人類 <400〉 16 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213>人類 <400> 17 Glu Val Gin Leu Va! Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210〉 18 <211〉 30 <212> PRT <213>人類 <400〉 18 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys 20 25 30 <210> 19 <211> 25 <212〉 PRT <2Π>人類 <400〉 19 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Giy 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Scr 20 25 <210> 20 <211> 25 <212> PRT <213>人類 <400> 20 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 21 <211> 25 <212> PRT <213>人類 <400〉 21 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 -4- 118226-seq.doc 200804418 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 22 <211> 23 <212〉 PRT <213>人類 <400> 22 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Scr Ala Ser Val 15 10 15 Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 20 PRT 人類 <210> 23 <211> 23 <212> <213> <400〉 23 Asp lie Va! Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 15 10 15 Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys 20 <210> 24 <211> 23 <212> PRT <213〉人類 <400〉 24 Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 25 <211> 23 <212> PRT <213>人類 <400> 25 Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu 15 10 15 Gly Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys 20 <210> 26 <211> 23 <212> PRT <213>人類 <400> 26 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Scr Ala Ser Val 15 10 15 Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 20 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213>人類 <400> 27 Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr 1 5 10 15 <210> 28 <211〉 32 118226-seq.doc 200804418 <212> PRT <213>人類 <400〉 28 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe 15 10 15 Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 20 25 30 Tyr Cys <210> 29 <211〉 10 <212> PRT <213〉人類 <400> 29 Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 5 10 <210> 30 <211> 25 <212〉 PRT <213>人類 <400> 30 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210〉 31 <211> 13 <212> PRT <213〉人類 <400> 31 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 10 <210> 32 <211> 30 <212> PRT <213>人類 <400〉 32 Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 15 10 15 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 PRT 人類 <210〉 33 <211> 11 <212> <213> <400〉 33 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 34 <211> 23 <212> PRT <213〉人類 <400> 34 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 10 15 GlyAspArg Val^rIlel.r Cys 6- 118226-seq.doc 200804418 <210〉 35 <211> 15 <212> PRT <2Π>人類 <400〉 35 Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr 1 5 10 15 <210〉 36 <211> 32 <2】2> PRT <2i 3> xm <400〉 36 Gly Val Pro Ser Arg Phc Set Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 15 10 15 Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 20 25 30 Tyr Cys <210> 37 <211> 10 <212> PRT <2】3>人類 <400〉 37 Phe Arg Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 5 10 <210〉 38 <211> 25 <212> PRT <213>人類 <400> 38 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210〉 39 <211> 13 <212〉 PRT <213>人類 <400〉 39 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 40 <21】> 30 <212> PRT <2B>人類 <400> 40 Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 15 10 15 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210〉 41 <211> 11 <212> PRT <213>人類 <400〉 41 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 118226-seq.doc 200804418 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成肽 <400> 42 Gly Phe Thr lie Thr Asn Thr Trp lie His 5 10 <210〉 43 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉合成肽 <400> 43 Gly Phe Thr lie Ser Gly Ser Tyr lie His 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213〉人工序列 艺δ合成狀 <400〉 44 Gly Phe Thr lie Asn Asn Ser Tyr lie His 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成肽 <400> 45 Gly Phe Thr lie Ser Asn Asn Trp lie His 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成肽 <400> 46 Gly Phe Thr lie Ser Ser Thr Trp lie His 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成肽 <400> 47 Gly Phe Thr lie Thr Gly Ser Ser lie His 5 10 <210> 48 <211> 10 118226-seq.doc 200804418 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成肽 <400> 48 Gly Phe Thr lie Asn Asp Ser Trp lie His 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成肽 <400> 49 Gly Phe Thr lie Thr Ser Ser Ser lie His 5 10 <210> 50 <211> 10 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223〉合成肽 <220> <221> Misc-feature <222> 5 <223> Xaa = T, S,或 N <220〉 <221> Misc-feature <222> 6 <223> Xaa = N, G, S,或 D <220> <221> Misc-feature <222〉 7 、 <223〉Xaa = T, S,或 N <220> <221> Misc-feature <222〉 8 _ <223〉 Xaa = W, Y,或 S <400〉 50 Gly Phe Thr lie Xaa Xaa Xaa Xaa lie His 10 <210> 51 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成肽 <400〉 51 Gly Phe lie Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser 15 10 15 Val Lys Gly <210> 52 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> 118226-seq.doc 200804418 <223>合成肽 <400> 52 Gly Arg lie Tyr Pro Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 15 10 15 Val Lys Gly <210> 53 <211> 18 <212> PRT <213〉人工序列 <22?> <400〉 53 Ala Trp lie Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser 15 10 15 Val Lys Gly <210> 54 <211> 18 <212> PRT <213〉人工序列 <223〉合成肽 <400> 54 Gly Gly lie Tyr Pro Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 15 10 15 Val Lys Gly <210> 55 <211> 18 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成肽 <400> 55 Gly Gly lie Ser Pro Ala Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 15 10 15 Val Lys Gly <210〉 56 <211> 18 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成肽 <400〉 56 Gly Phe lie Tyr Pro Asn Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 -10- 118226-seq.doc 200804418 <223>合成肽 <400> 57 Gly Asn lie Thr Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 15 10 15 Val Lys Gly <210> 58 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成肽 <400〉 58 Ala Tyr lie Asn Pro Ser Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser 15 10 15 Val Lys Gly <210> 59 <211> 18 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成肽 <220> <221> Misc-feature <222> 1 , <223> Xaa = G 或 A <220> <221> Misc-feature <222> 2 <223> Xaa = F， R, W, G, N 或 Y <220> <221> Misc-feature <222> 4 <223〉Xaa = S, Y, T,或 N <220> <221> Misc-feature <222> 6 <223> Xaa = S, N, Y,或 A <220> <221> Misc-feature <222> 7 <223> Xaa = G, N, D,或 S <220> <221> Misc-feature <222> 9 <223> Xaa = Y, N, D,或 S <220〉 <221> Misc-feature <222> 11 <223〉 Xaa = N, Y,或 D <400〉 59 Xaa Xaa lie Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 60 118226-seq.doc -11 - 200804418 <211> 16 <212> PRT <2U>人工序列 <220〉 <223>合成肽 <400> 60 Arg Phe Leu Ser Asp Gly Ala Tyr Ala Arg Asp Tyr Ala Met Asp 15 10 15 Tyr <210> 61 <211> 20 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉合成肽 <400> 61 Arg Trp Asp Tyr lie Asp Gly Tyr Val Tyr Thr Ser Tyr Ala Arg 15 10 15 Tyr Val Met Asp Tyr 20 <210> 62 <211> 13 <212〉 PRT <213〉人工序列 <223>合成肽 <400> 62 Arg Ser Leu Ser Leu Asn Met Trp Gly Val Met Asp Tyr 5 10 <210> 63 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成肽 <400> 63 Arg Ser Ala Gly Ala T卬丁rp Asn His Phe Glu Glu Tyr Ala Val 15 10 15 Met Asp Tyr <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成肽 <400> 64 Lys Gly Ser Trp Trp Ala Asp Asn Glu Gly Tyr Ala Met Asp Tyr 15 10 15 <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 合成肽 -12- 118226-seq.doc 200804418 <400〉 65 Arg Leu Asp Ser Val Asp Gly Val Arg Val Tyr Asp Tyr Val Met 15 10 15 Asp Tyr <210> 66 <211> 17 <212> PRT <2】3>人工序列 <220> <223>合成肽 <400> 66 Arg Trp Asp His Val Thr Gly Gly Arg Gly Arg Pro Trp Gly Met 1 5 10 15 Asp Tyr <2)0> 67 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成肽 <400> 67 Arg Asp Arg Tyr Leu His Glu Glu Gly Gly GIu Tyr Va! Met Asp 15 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成肽 <220> <221> Misc-feature <222> 1 <223> Xaa = R 或 K <220> <221> Misc-feature <222> 2 <223> Xaa = F, R S, G, L，或 D <220> <221> Misc-feature <222〉 3 _ <223> Xaa = L, D, A, S，或 R <220〉 <221> Misc-feature <222> 4 <223> Xaa = S, Y， G， W,或 H <220> <221> Misc-feature <222> 5 <223> Xaa = D， I， L， A， W，或 V <220〉 <221> Misc-feature <222〉 6 <223〉 Xaa = G， D, N, W, A, 了，或 H 13- 118226-seq.doc 200804418 <220〉 <221> Misc-feature <222> 7 <223> Xaa = A, G, M, W, D,或 E <220〉 <221> Misc-feature <222〉8 <223> Xaa = Y, W、 N, V, G、或 E <220> <22l> Misc-feature <222> 9 <223> Xaa = A, V， G, Η, E，或 R <220〉 <22]> Misc-feature <222> 10 <223> Xaa = R, Y, V, F，或 G <220〉 <221> Misc-feature <222> 11 <223> Xaa = D, T, Μ, E, Y,或 R <220> <221> Misc-feature <222〉 12 <223> Xaa = Y, S, E, A, D, P 或不存在 <220> <221> Misc-feature <222> 13 <223〉Xaa = A, Y，M, W、V 或不存在 <220〉 <221> Misc-feature <222> 14 十 了女— <223> kaa = M，A, V，G,或不存在 <220> <221> Misc-feature <222> 15 十卞女和 <223> Xaa = R，V，M，D，或不存在 <220〉 <22]> Misc-feature <222> 16 _ <223> Xaa = Y, M或不存在 <220> <221> Misc-feature <222> 17 _ <223> Xaa = V或不存在 <220〉 <221> Misc-feature <222> 18 <223〉Xaa = M或不存在 <400> 68 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 Xaa Xaa Xaa Asp Tyr 20 <210> 69 <2U> 20 <212> DNA 〈犯> 人工序列 <220> <223>合成肽 14- 118226-seq.doc 200804418 <400> 69 agtagaaggt ggcgcgaagg 20 <210> 70 <211> 26 <212> DNA <213>人工序列 <223>合成肽 <400〉 70 ctgcccacag acaagatggt aatctc 26 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213>人工刺 <220> <223>合成肽 <400> 71 ggtgcatcga tgcagggggg 20 <210〉 72 <211> 128 <212> PRT <213>人類 <400> 72 Met Lys Pro Ser Leu Leu Cys Arg Pro Leu Ser Cys Phe Leu Met 15 10 15 Leu Leu Pro Trp Pro Leu Ala Thr Leu Thr Ser Thr Thr Leu Trp 20 25 30 Gin Cys Pro Pro Gly Glu Glu Pro Asp Leu Asp Pro Gly Gin Gly 35 40 45 Thr Leu Cys Arg Pro Cys Pro Pro Gly Thr Phe Ser Ala Ala Trp 50 55 60 Gly Ser Ser Pro Cys Gin Pro His Ala Arg Cys Ser Leu Trp Arg 65 70 75 Arg Leu Glu Ala Gin Val Gly Met Ala Thr Arg Asp Thr Leu Cys 80 85 90 Gly Asp Cys Trp Pro Gly Trp Phe Gly Pro Trp Gly Val Pro Arg 95 100 105 Val Pro Cys Gin Pro Cys Ser Trp Ala Pro Leu Gly Thr His Gly 110 115 120 Cys Asp Glu Trp Gly Arg Arg Ala 125 <210> 73 <211> 14 <212〉 PRT <213>人類 <400〉 73 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly 5 10 <210〉 74 <211> 32 <212> PRT <213>人類 <400> 74 Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 15- 118226-seq.doc 200804418 15 10 15 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg <210> 75 <211> 11 <212〉 PRT <213>人類 <400> 75 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210〉 76 <211> 13 <212> PRT <2】3>人類 <400> 76 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 5 10 <210> 77 <211> 32 <212> PRT <213>人類 <400> 77 Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 15 10 15 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg <210> 78 <21l> 11 <212> PRT <213>A^ <400> 78 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210〉 79 <211> 13 <212> PRT <213>人類 <400> 79 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 5 10 <210> 80 <211> 31 <212> PRT <213>人類 <400> 80 Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 10 15 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala <210〉 81 16- 118226-seq.doc 200804418 <211> 11 <212> PRT <213>人類 <400> 81 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 82 <211> 13 <212> PRT <213>人類 <400〉 82 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 5 10 <210> 83 <211> 30 <212> PRT <213>人類 <400> 83 Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 15 10 15 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213>人類 <400> 84 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210〉 85 <211> 14 <212> PRT <213>人類 <400〉 85 Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly 5 10 <210> 86 <211> 32 <212> PRT <213〉人類 <400> 86 Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 15 10 15 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg <210〉 87 <211〉 11 <212> PRT <213>人類 <400> 87 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Vai Ser Ser 5 10 <210> 88 <211> 13 <212> PRT <213>人類 -17· 118226-seq.doc 200804418 <400> 88 Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 5 10 <210〉 89 <2il> 32 <212> PRT <213>人類 <400> 89 Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 15 10 15 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213>人類 <400> 90 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 91 <2U> 13 <212> PRT <213>人類 <400> 91 Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 5 10 <210> 92 <211> 31 <212> PRT <213>鳩 <400> 92 Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 15 10 15 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213>人類 <400〉 93 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 94 <211> 13 <212〉 PR丁 <213>人類 <400> 94 Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie <210> 95 <211> 30 <212> PRT <213>人類 -18 - 118226-seq.doc 200804418 <400〉 95 Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 15 10 15 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210〉 96 <211> 11 <212> PRT <213>人類 <400> 96 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 97 <211〉 14 <212> PRT <213>人類 <400〉 97 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 5 10 <210> 98 <211> 32 <212> PRT <213>人類 <400> 98 Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 15 10 15 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg <210> 99 <211> 11 <212> PRT <213>人類 <400> 99 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 100 <211> 13 <212> PRT <213>人類 <400> 100 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 101 <211> 32 <212> PRT <213>人類 <400> 101 Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 15 10 15 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg <210> 102 19- 118226-seq.doc 200804418 <211> 11 <212> PRT <213>人類 <400> 102 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 103 <211> 13 <212> PRT <213>人類 <400> 103 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 4 T類 4Th 0 1R ^ o e 13PA^ lh )7777}> SI 1 1 lx n Ki 2222 4 A < < < < < As Me Π Gl r 5 uo e C2 s L c Γ 1 6 I s 6 s n As p As r8 A As! u Gl oa rg A TyTy u r LeTy Γ 1 Thva n a s 1 A A so Γ 5 LylTh2 U5 so <210> 105 <211> 11 <212> PRT <213>人類 <400> 105 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 106 <211〉 13 <212> PRT <2】3>鳩 <400> 106 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 107 <211> 30 <212> PRT <213〉人類 <400> 107 Arg Phc Thr lie Scr Arg Asp Asn Scr Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 15 10 15 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 108 <211〉 11 <212〉 PRT <213>人類 <400> 108 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 109 <211> 14 <212> PRT <213>人類 •20· 118226-seq.doc 200804418 <400> 109 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 5 10 <210> 110 <211> 32 <212> PRT <213>人類 <400> 110 Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 15 10 15 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ser Arg <210> 111 <211> 11 <212> PRT <213>人類 <400> 111 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 112 <211> 13 <212> PRT <213>人類 <400> 112 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val <210> 113 <211> 32 <212> PRT <213>人類 <400> 113 Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 】0 15 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ser Arg <210> 114 <211> 11 <212> PRT <213>人類 <400> 114 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210〉 115 <211> 13 <212> PRT <213>規 <400> 115 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210〉 116 <211> 31 <212> PRT <213〉人類 -21 - 118226-seq.doc 200804418 <400> 116 Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 15 10 15 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ser <210> 117 <211> 11 <212〉 PRT <213>人類 <400〉 117 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 118 <211> 14 <212> PRT <213>人類 <400> 118 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 5 10 <210> 119 <211> 32 <212> PRT <2]3>人類 <400> 119 Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 15 10 15 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg PRT λΜ <210> 120 <211> 11 <212> <213> <400> 120 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 121 <211> 13 <212> PRT <213>人類 <400> 121 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 丁rp Val 5 10 <210> 122 <211> 32 <212> PRT <213>A^ <400> 122 Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 15 10 15 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Arg 22· 118226-seq.doc 200804418 <210> 123 <211> 11 <212〉 PRT <213>人類 <400> 123 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 124 <211> 13 <212> PRT <213>人類 <400> 124 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 125 <211> 31 <212> PRT <213>人類 <400> 125 Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 15 10 15 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala <210〉 126 <211> 11 <212> PRT <213>人類 <400> 126 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 PRT 人類 <210〉 127 <211> 13 <212> <213〉 <4〇〇> 127 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 128 <211> 30 <212> PRT <213>人類 <400> 128 Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 15 10 15 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 129 <211> 11 <212> PRT <213>人類 <400> 129 Trp G!y Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210〉 130 -23- 118226-seq.doc 200804418 <211> 15 <212〉 PRT <213>人類 <400〉 130 Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 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